高强度多级微纳结构硅基骨修复支架材料、其制备方法及应用 |
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| 申请号 | CN201310723815.8 | 申请日 | 2013-12-24 | 公开(公告)号 | CN104368047B | 公开(公告)日 | 2019-08-09 |
| 申请人 | 华东理工大学; | 发明人 | 刘昌胜; 袁媛; 唐为; 林丹; 牛浩一; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及高强度多级微纳结构 硅 基 骨修复 支架 材料、其制备方法及应用。本发明以介孔硅基 干凝胶 为基质，加入介孔 氧 化硅微球增强剂，制备出具有优异 力 学性能的多级结构支架材料。本发明所制备的硅基骨修复支架材料兼具高度连通的200‑500μm、微米级大孔和2‑22nm纳米介孔，孔隙率高达60～90%，且力学性能可达10MPa。本发明的多级微纳结构硅基骨修复支架材料可以用作骨组织工程支架和药物缓释载体等。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种具有微米-纳米多级孔结构的硅基骨修复支架材料，所述的支架材料中具有 |
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| 说明书全文 | 高强度多级微纳结构硅基骨修复支架材料、其制备方法及应用 技术领域背景技术[0002] 疾病、创伤、人口老龄化及自然灾害等均可导致人体骨组织损伤，临床上对骨修复材料需求巨大。而作为黄金法则的自体骨移植手术由于其来源受限和对患者二次手术痛苦使其远远无法满足现状。异体骨移植手术也存在生物安全隐患问题，可能对患者留下终生免疫排斥反应和带来未知疾病。因此，人工制备骨修复材料在临床上受到了越来越多的关注。 [0003] 由于具有良好的生物活性、生物降解性和生物相容性，硅基材料，如生物活性玻璃等，被广泛用作骨组织修复材料。特别是介孔生物玻璃体系，高的比表面积和孔体积使其表现出更佳的生物矿化、生物降解和药物/蛋白的控释能力，从而在体内外具有更好的成骨性能(Science,2002;295:1014-1017)。为了进一步满足成骨过程营养物质、代谢物产物的交换以及血管、组织的长入的需要、促进成骨活性，研究者模拟天然骨的结构构建出具有大孔和微孔多级结构支架材料，有效地改善了材料的体内外成骨活性。然而，由于材料本身的特点，兼具微米大孔和介孔的多级结构支架材料在以下方面存在显著缺陷：①脆性大，生物力学性能差，②成型难，可塑性差，③材料降解快、导致体系pH升高［Microporous.Mesoporous Materials143(2011)311–319,Acta Biomaterialia7(2011)2644–2650］。因此，在保持/改善微米-纳米多级孔结构硅基骨修复支架材料优点的同时，提高支架材料的力学强度是该领域目前面临的最大挑战。 [0004] 目前，制备多孔支架的常用方法主要有三类：①硬模板法：NaCl颗粒、PMMA/PS微球，无法得到理想连通大孔是限制其运用的关键问题，②3D打印技术，可精确控制大孔结构和形貌，但成型过程须复合一定比例高分子添加剂， 在一定程度上影响其介孔结构和生物学性能，③聚氨酯泡沫法，尽管过程经济易操作并可得到高连通孔隙率的多孔结构，但采用目前多次浸渍-挤压-热处理制备的支架力学性能不佳、孔均匀性较差，这直接影响其使用效果。 发明内容[0005] 本发明的目的在于提供一种高力学强度、多级结构的硅基复合骨修复支架材料及其制备方法和应用。 [0006] 在本发明的第一方面，提供一种具有微米-纳米多级孔结构的硅基骨修复支架材料，所述的支架材料中具有200-500μm微米级大孔和2-22nm纳米介孔，所述的支架材料包括： [0007] 介孔硅基干凝胶材料100重量份；和 [0009] 在一个优选例中，所述的硅基骨修复支架材料基本上由介孔硅基干凝胶材料100重量份和介孔氧化硅微球5-40重量份组成。 [0010] 在另一优选例中，所述的支架材料如下制备： [0011] (1)将介孔硅基干凝胶材料100重量份和介孔氧化硅微球5-40重量份(较佳地为5-30重量份，更佳地为5-20重量份)混合； [0012] (2)将(1)的混合物以0.3-0.8g/1cm3(即1cm3海绵浇注0.3-0.8g；更佳地如0.7g/3 3 3 1cm 、0.6g/1cm、0.5g/1cm)的质量体积比浇注在聚氨酯海绵上，陈化、烘干、煅烧、得到所述支架材料。 [0013] 在另一优选例中，所述的介孔氧化硅微球包括(但不限于)：MCM-41、SBA-15、生物玻璃微球。 [0014] 在另一优选例中，所述的介孔氧化硅微球如下制备：将表面活性剂1-10重量份(较佳地4-8重量份)加入到水性溶剂(如水或乙醇；较佳地50-170重量份，更佳地80-120重量份)中，盐酸调节pH小于2(较佳地盐酸为0.1-30重量份；更佳地0.1-20重量份)中，待表面活性剂溶解后加入四水硝酸钙0.5-10重量份(较佳地0.5-5重量份)、磷酸三乙酯0.1-10重量份(较佳地0.4-5重量份)、正硅酸乙酯3-50重量份(较佳地5-20重量份)；35±5℃下搅拌24±1h。 [0015] 在另一优选例中，所述的介孔硅基干凝胶材料如下制备：将表面活性剂1-15重量份(较佳地4-10重量份)加入水性溶剂(如乙醇；较佳地40-150重量份， 更佳地40-120重量份)，盐酸调节pH小于2(较佳地盐酸为0.1-5重量份；更佳地0.1-4重量份)中，待表面活性剂完全溶解后，加入四水硝酸钙0.3-5重量份(较佳地0.5-3重量份)、磷酸三乙酯0.1-4重量份(较佳地0.2-2重量份)和正硅酸乙酯3-50重量份(较佳地5-20重量份)；35±5℃下搅拌24±1h后陈化至黏度为(4-7)×104MPa。 [0016] 在另一优选例中，所述的表面活性剂选自：十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，国药)、P123(EO20PO70EO20，西格玛)、F127(EO106PO70EO106，西格玛)。 [0017] 在本发明另一方面，提供所述的硅基骨修复支架材料的制备方法，所述方法包括： [0018] (1)将介孔硅基干凝胶材料100重量份和介孔氧化硅微球5-40重量份(较佳地为5-30重量份，更佳地为5-20重量份)混合； [0019] (2)将(1)的混合物以0.3-0.8g/1cm3(即1cm3海绵浇注0.3-0.8g；更佳地如0.7g/1cm3、0.6g/1cm3、0.5g/1cm3)的质量体积比浇注在聚氨酯海绵上，陈化、烘干、煅烧、得到所述支架材料。 [0020] 在一个优选例中，所述的硅基骨修复支架材料如下制备：5-40重量份(较佳地为5-30重量份，更佳地为5-20重量份)介孔无机微球通过物理掺杂的方式均匀的分散在100重量份介孔硅基干凝胶材料中，将所得的复合溶胶以0.3-0.8g/1cm3(如0.7g/1cm3、0.6g/1cm3、 0.5g/1cm3)的质量体积比在浇注在聚氨酯海绵上，室温陈化并60±5℃烘干48±6h，600± 100℃煅烧6±2h得到所述支架材料。 [0021] 在本发明另一方面，提供所述的硅基骨修复支架材料的用途，用于制备骨组织工程(包括骨修复、骨移植)支架；用于制备药物、蛋白、生长因子的控释载体；或用于制备细胞培养支架。 [0022] 在本发明另一方面，提供介孔氧化硅微球的用途，用于制备具有微米-纳米多级孔结构的硅基骨修复支架材料；所述的介孔氧化硅微球包括(但不限于)：MCM-41、SBA-15、生物玻璃微球；较佳地，所述的介孔氧化硅微球如下制备：将表面活性剂1-10重量份(较佳地4-8重量份)加入到溶剂(如水或乙醇；较佳地50-170重量份，更佳地80-120重量份)中，盐酸调节pH小于2(较佳地盐酸为 0.1-30重量份；更佳地0.1-20重量份)中，待表面活性剂溶解后加入四水硝酸钙0.5-10重量份(较佳地0.5-5重量份)、磷酸三乙酯0.1-10重量份(较佳地 0.4-5重量份)、正硅酸乙酯3-50重量份(较佳地5-20重量份)；35±5℃下搅拌24±1h。 [0024] 图1、高强度多级结构复合支架照片(煅烧后)：实施例6-9。图中所示为复合溶胶以0.6g/1cm3的质量体积比在浇注于聚氨酯海绵后及后续加工后获得的支架。 [0025] 图2、高强度多级结构复合支架(0.6g/1cm3的质量体积比浇注)SEM图。(A)实施例8；(B)实施例13。 [0026] 图3、高强度多级结构复合支架(0.6g/1cm3的质量体积比浇注)TEM图。(A)实施例8；(B)实施例13。 [0027] 图4、高强度多级结构复合支架(0.6g/1cm3的质量体积比浇注)在模拟体液中浸泡3d后表面羟基磷灰石沉积SEM图。(A)实施例8；(B)实施例16。 [0028] 图5、鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)在多级结构复合支架(0.6g/1cm3的质量体积比浇注)表面的细胞相容性。(A)实施例6-9；(B)实施例11-14。其中，Control表示无材料空白孔板上所接种细胞的活力。 [0029] 图6、鼠骨髓间充质干细胞在多级结构复合支架(0.6g/1cm3的质量体积比浇注)表面粘附铺展SEM图。(A)实施例8；(B)实施例13。 [0030] 图7、鼠骨髓间充质干细胞在多级结构复合支架(0.6g/1cm3的质量体积比浇注)表面的细胞粘附铺展和渗透。(A1-A3)实施例8、(B1-B3)实施例13。 [0031] 图8、兔桡骨中段15mm临界缺损为模型，术后2周(2W)、12周(12W)缺损骨的X-ray图，使用实施例8制备的支架材料。 具体实施方式[0032] 本发明公开了一种具有高力学强度、兼具微米-纳米多级孔结构的硅基骨修复支架材料。本发明以介孔硅基干凝胶材料为基质，采用溶胶-凝胶-多孔聚氨酯泡沫法，通过物理掺杂介孔氧化硅微球并控制溶胶的粘度，一次浇注便制备 出具有优异力学性能的多级结构支架材料。本发明所制备的硅基骨修复支架的力学性能高达10MPa以上，且具有微米大孔(200-500μm)和纳米介孔(2-22nm)、高连通孔隙率50-95%。 [0033] 微米-纳米多级孔结构的硅基骨修复支架材料及其制备 [0034] 本发明以介孔硅基干凝胶材料(介孔生物玻璃)为基质，本领域中已知的介孔硅基干凝胶材料也可被应用于本发明中，如一些溶胶-凝胶法介孔生物玻璃体系。作为本发明的优选方式，所述的介孔硅基干凝胶材料可以是如下制备的：以乙醇为溶剂；盐酸调节pH在2以下；十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、P123(EO20PO70EO20)、F127(EO106PO70EO106)均可作为表面活性剂，通过溶胶凝胶法以及不同的水热处理过程制备出2-22nm介孔硅基干凝胶材料。正硅酸乙酯(TEOS)、四水硝酸钙(Ca(NO3)24H2O)、磷酸三乙酯(triethyl phosphate，TEP)分别用做介孔硅基干凝胶材料中硅、钙、磷的来源。不同钙、磷硅含量所设计的溶胶-凝胶产物组分可分别为：100%SiO2、90%SiO2-5%CaO-5%P2O5、85%SiO2-10%CaO-5%P2O5以及80%SiO2-15%CaO-5%P2O5(质量分数)。 [0035] 作为本发明的优选实施方式，所述的介孔硅基干凝胶材料如下制备：将表面活性剂加入酸性条件下的乙醇溶剂中，待表面活性剂完全溶解后，加入四水硝酸钙、磷酸三乙酯和正硅酸乙酯；35±5℃下搅拌24h后陈化至黏度为(4-7)×104Pa.s。 [0036] 作为本发明的优选实施方式，所述的介孔硅基干凝胶材料由含有表1所示组分的材料制备而成。 [0037] 表1 [0038] 重量份 较佳的重量份 表面活性剂 1-15重量份； 4-10重量份 水性溶剂(如乙醇) 40-150重量份 40-120重量份 盐酸 0.1-5重量份 0.1-4重量份 四水硝酸钙 0.3-5重量份 0.5-3重量份 磷酸三乙酯 0.1-4重量份 0.2-2重量份 正硅酸乙酯 3-50重量份 5-20重量份 [0039] 本发明的材料中，添加了介孔氧化硅微球以增强支架的力学性能。所述的 介孔氧化硅微球包括MCM-41、SBA-15、生物玻璃微球等。可将无机增强剂均匀分散在介孔硅基干凝胶材料中。较佳地，所述的介孔无机微球如下制备：将表面活性剂加入酸性条件下的水性溶剂中，搅拌待表面活性剂完全溶解后，加入四水硝酸钙、磷酸三乙酯和正硅酸乙酯，35±5℃下搅拌24h。 [0040] 作为本发明的优选实施方式，所述的介孔氧化硅微球由含有表2所示组分的材料制备而成。 [0041] 表2 [0042] 重量份 较佳的重量份 表面活性剂 1-10重量份 4-8重量份 水 50-170重量份 80-120重量份 浓盐酸(氨水) 0.1-30重量份 0.1-20重量份 四水硝酸钙 0.5-10重量份 0.5-5重量份 磷酸三乙酯 0.1-10重量份 0.4-5重量份 正硅酸乙酯： 3-50重量份 5-20重量份 [0043] 根据本发明的优选方式，所述介孔硅基质与介孔氧化硅微球的质量比在100：5-40。 [0044] 本发明还提供了所述的具有微米-纳米多级孔结构的硅基骨修复支架材料的制备方法，包括：将介孔硅基干凝胶材料100重量份和介孔氧化硅微球5-40重量份混合；将介孔硅基干凝胶材料和介孔氧化硅微球的混合物以0.3-0.8g/1cm3的质量体积比在浇注在聚氨酯海绵上，陈化、烘干、煅烧、得到所述支架材料。 [0045] 其中，不同的增强剂含量、不同的增强剂类型、聚氨酯泡沫密度和溶胶黏度这一系列参数均可调控制备出不同力学强度的骨修复复合支架；同时调控合成条件(如：溶剂、pH、模板剂、温度)可制备出多种具有不同比表面积、孔径的介孔材料。 [0046] 材料陈化、充分烘干后高温煅烧除去双模板(表面活性剂和聚氨酯海绵)，最终形成以硅和钙、磷为主要成分的多级结构(微米大孔、纳米介孔)支架材料。 [0047] 微米-纳米多级孔结构的硅基骨修复支架材料的性能 [0048] 本发明制备获得的具有微米-纳米多级孔结构的硅基骨修复支架材料，其力学性能表现为：复合支架的力学性能与增强剂含量成正比，高孔隙率时其力学强度最高可达10MPa。 [0049] 本发明制备获得的具有微米-纳米多级孔结构的硅基骨修复支架材料，其多级孔结构表现为：微米级大孔：200-500μm；可调纳米级介孔：2-22nm。 [0050] 本发明制备获得的具有微米-纳米多级孔结构的硅基骨修复支架材料，其连通大2 孔孔隙率50-95%可控；同时其比表面积高，可达到150-600m/g。 [0051] 微米-纳米多级孔结构的硅基骨修复支架材料的用途 [0052] 本发明获得的具有微米-纳米多级孔结构的硅基骨修复支架材料，具有良好的生活活性和细胞响应，并有利于营养物质和代谢物产物的交换流通，为血管、组织的长入提供充分的空间。具有良好的体外生物活性和细胞相容性。 [0053] 本发明获得的具有微米-纳米多级孔结构的硅基骨修复支架材料，可作为蛋白、药物和生长因子的缓释体系。可实现生长因子的高活性装载和控释；同时支架的三维结构利于细胞的粘附、迁移和渗透。 [0054] 本发明获得的具有微米-纳米多级孔结构的硅基骨修复支架材料，具有良好的可塑性和机械强度，无机增强剂具有显著提高复合支架力学强度的作用，使其抗压强度提高到10MPa以上，是其它相关报道的聚氨酯泡沫模板法制备的硅基支架100倍以上(Micropor.Mesopor.Mater,2011;143:311–319)。 [0055] 与传统的陶瓷类多孔支架相比，本发明制备的复合骨修复支架具有更优异的力学性能以及可控的多级结构和合适降解率，不仅能为新生组织提供支撑，并保持一定时间直至新生组织具有自身生物力学特性；且连通宏观大孔能为营养传输、血管生长、细胞迁移和组织长入提供空间，支持细胞的生长和功能的表达，同时纳米级介孔能有效控制药物、蛋白和生长因子的释放，促进细胞的增殖和定向分化。本发明的硅基高强度多级结构骨修复支架可以用作骨组织工程支架和药物缓释载体等。 [0056] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。 [0057] 评价方法 [0058] (1)材料的表征 [0059] 采用扫描电子显微电镜(SEM，JSM-6360LV，JEOL，Japan)观察制备材料的宏观结构、沉积矿化以及细胞铺展。采用透射电子显微镜(HRTEM，JEM-2100,Japan)观察材料的介孔结构。采用氮气等温吸附-脱附(Micromeritics，USA)测定材料的微孔结构，并通过BET计算材料的比表面积和孔容，根据Barrett-Joyner-Helen(BJH)公式计算平均孔径。采用激光共聚焦(CLSM,Leica Microsystems,Heidelberg,Germany)观察材料表面的细胞形貌和渗透。采用X-射线仪检测骨缺损处新骨生成情况。 [0060] (2)材料的力学性能测试 [0061] 将支架制成10mm×10mm×10mm的矩形条样，然后在万能材料试验机上(AG-2000A，Shimadzu，Japan)进行抗压测试，压缩速度为1mm/min。 [0062] (3)体外细胞培养 [0063] 鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)培养于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的α-MEM培养液中，于37℃、5%CO2培养箱内传代培养。将大孔支架高温灭菌后置于24孔细胞培养板中，rBMSCs分别接种到材料表面，加入培养基；孵育至培养结束后使用MTT测定法检测细胞活性和细胞增殖，向每孔加入100μL的四甲基偶氮唑盐试剂，37℃继续孵育4h后，吸弃上清液，加入1mL DMSO，轻轻震荡20min，使结晶物溶解，使用连续光谱酶标仪在490nm处测定溶液的光吸收值。 [0064] 通过SEM观察细胞形貌：将细胞接种在材料上6h后PBS清洗三次，2.5%戊二醛固定15min后乙醇逐级脱水：50%、70%、80%、90%、95%、100%，每次5min；用乙酸异戊酯置换10min； 37℃烘箱干燥4小时后喷金再将经过处理后的培养有细胞的材料在扫描电镜下进行观察。 [0065] 通过激光共聚焦(confocal laser scanning microscopy)观察细胞在实施例8和13的支架上的渗透和铺展：将2*104个/孔的细胞培养在材料上24h后PBS清洗三次，2.5%戊二醛固定15min后用异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽(FITC-Phalloidin)染色40分钟，PBS清洗5次、每次5min，再用DAPI染色10min后PBS清洗5次、每次5min，封片液封片后激光共聚焦下进行三维观 察。 [0066] (4)体内成骨修复 [0067] 采用的动物模型是兔桡骨中段15mm临界缺损。将硅基高强度多级微纳结构复合支架制成长度为1.5cm，直径4mm，然后辐射灭菌。实验在无菌的手术室进行。术前用3%(w/w)戊巴比妥钠按30mg/kg静脉注射麻醉动物，在右前肢桡骨中段取约30mm的纵行切口，逐层分离软组织显露桡骨，在桡骨中段用牙科钻造成15mm缺损，立即用生理盐水冲洗后填入材料，再逐层严密缝合创口。术后不同时间点取出缺损桡骨及其连接的尺骨，X-射线检测骨缺损处新骨生成情况。 [0068] 实施例1、介孔硅微球增强剂1的制备 [0069] 称量4.8g P123加入120mL H2O和20mL的浓盐酸(12mol/L)中。剧烈搅拌待表面活性剂(P123)完全溶解至透明后，加入3.75g四水硝酸钙、0.62g磷酸三乙酯和7.42g正硅酸乙酯。35℃下搅拌24h。得到介孔硅微球增强剂1。 [0070] 若所制备的材料烘干、烧结可测得粉末的平均介孔孔径为：3.5nm，BET计算结果表明材料的比表面积为829m2/g。 [0071] 实施例2、介孔硅微球增强剂2的制备 [0072] 称量4.8g P123加入120mL H2O和20mL的浓盐酸(12mol/L)中。剧烈搅拌待表面活性剂(P123)完全溶解后，加入3.75g四水硝酸钙、0.62g磷酸三乙酯和7.42g正硅酸乙酯。35℃下搅拌24h后100℃水热处理24h。得到介孔硅微球增强剂2。 [0073] 若所制备的材料烘干、烧结可测得粉末的平均介孔孔径为：8.2nm，BET计算结果表明材料的比表面积为781m2/g。 [0074] 实施例3非介孔硅基微球3的制备 [0075] 量取50mL乙醇调节pH至2以下，加入0.76g四水硝酸钙、0.23g磷酸三乙酯和5.2g正硅酸乙酯。35℃搅拌24h后陈化并球磨24h。若所制备的材料烘干、烧结后，BET计算结果表明材料的比表面积为46m2/g。 [0076] 实施例4、介孔硅基干凝胶材料1的制备 [0077] 称量4g F127加入50mL乙醇和1g浓度为0.5M的盐酸中。待表面活性剂(F127)完全溶解至透明后，加入0.76g四水硝酸钙、0.23g磷酸三乙酯和5.2g正硅酸乙酯。40℃下搅拌24h后陈化至黏度为5×104MPa，得到介孔硅基干凝胶材料1。 [0078] 若所制备的材料烘干、烧结、碾磨后可测得平均介孔孔径为：7.2nm，BET计算结果表明材料的比表面积为352.5m2/g。 [0079] 实施例5、介孔硅基干凝胶材料2的制备 [0080] 称量4g P123加入50mL乙醇和1g浓度为0.5M的盐酸中。待表面活性剂(P123)完全溶解后，加入0.96g四水硝酸钙、0.28g磷酸三乙酯和6.70g正硅酸乙酯。30℃搅拌24h后陈化至黏度为5×104MPa。得到介孔硅基干凝胶材料2。 [0081] 若所制备的材料烘干、烧结、碾磨后可测得平均介孔孔径为：4.3nm，BET计算结果表明材料的比表面积为312.7m2/g。 [0082] 实施例6、硅基多级微纳结构支架材料的制备――7MBG [0083] 将实施例4制备孔径为7.2nm、黏度为5×104MPa的介孔硅基干凝胶材料1分别以0.7g/1cm3(可获得孔隙率≈65%的支架材料)、0.6g/1cm3(可获得孔隙率≈75%的支架材料)、 0.5g/1cm3(可获得孔隙率≈85%的支架材料)的质量体积比(质量指介孔硅基干凝胶材料质量，体积指海绵体积，后同)在浇注在预先裁剪好尺寸的聚氨酯海绵上(聚氨酯海绵使用质量分数为20%的NaOH预处理20min后去离子水冲洗并烘干，后同)，室温陈化并60℃烘干48h， 600℃煅烧6h得到所需支架材料。 [0084] 按照0.6g/1cm3浇注获得的支架材料，若所制备的支架材料碾磨后可测得平均介孔孔径为：7.2nm，BET计算结果表明材料的比表面积为352.5m2/g。 [0085] 实施例7、硅基高强度多级微纳结构复合支架材料的制备――7MBG-5MP[0086] 将实施例2制备的介孔硅微球增强剂2通过物理掺杂的方式均匀的掺入实施例4制备的孔径为7.2nm、黏度为5×104MPa的介孔硅基干凝胶材料1，介孔硅基干凝胶材料1：介孔硅微球增强剂2的质量比为100：5。将所得的复合溶胶分别以0.7g/1cm3(可获得孔隙率≈3 3 65%的支架材料)、0.6g/1cm (可获得孔隙 率≈75%的支架材料)、0.5g/1cm (可获得孔隙率≈85%的支架材料)的质量体积比在浇注在预先裁剪好尺寸的聚氨酯海绵上，室温陈化并60℃烘干48h，600℃煅烧6h得到支架材料7MBG-5MP。 [0087] 按照0.6g/1cm3浇注获得的支架材料，若所制备的支架材料碾磨后可测得平均介2 孔孔径为：7.5nm，BET计算结果表明材料的比表面积为389.5m/g。 [0088] 实施例8、硅基高强度多级微纳结构复合支架材料的制备――7MBG-10MP[0089] 将实施例2制备的介孔硅微球增强剂2通过物理掺杂的方式均匀的掺入实施例4制备孔径为7.2nm的黏度为5×104MPa的介孔硅基干凝胶材料1，介孔硅基干凝胶材料1：介孔硅微球增强剂2质量比为100：10。将所得的复合溶胶分别以0.7g/1cm3(可获得孔隙率≈65%的支架材料)、0.6g/1cm3(可获得孔隙率≈75%的支架材料)、0.5g/1cm3(可获得孔隙率≈85%的支架材料)的质量体积比在浇注在预先裁剪好尺寸的聚氨酯海绵上，室温陈化并60℃烘干48h，600℃煅烧6h得到支架材料7MBG-10MP。 [0090] 按照0.6g/1cm3浇注获得的支架材料，若所制备的支架材料碾磨后可测得平均介孔孔径为：7.4nm，BET计算结果表明材料的比表面积为402.4m2/g。 [0091] 实施例9、硅基高强度多级微纳结构复合支架材料的制备――7MBG-20MP[0092] 将实施例2制备的介孔硅微球增强剂2通过物理掺杂的方式均匀的掺入实施例4制备孔径为7.2nm的黏度为5×104MPa的介孔硅基干凝胶材料1，介孔硅基干凝胶材料1：介孔硅微球增强剂2质量比为100：20。将所得的复合溶胶分别以0.7g/1cm3(可获得孔隙率≈65%3 3 的支架材料)、0.6g/1cm (可获得孔隙率≈75%的支架材料)、0.5g/1cm (可获得孔隙率≈85%的支架材料)的质量体积比在浇注在预先裁剪好尺寸的聚氨酯海绵上，室温陈化并60℃烘干48h，600℃煅烧6h得到支架材料7MBG-20MP。 [0093] 按照0.6g/1cm3浇注获得的支架材料，若所制备的支架材料碾磨后可测得平均介2 孔孔径为：7.4nm，BET计算结果表明材料的比表面积为425.4m/g。 [0094] 实施例10、硅基高强度多级微纳结构复合支架材料的制备――7MBG-40MP[0095] 将实施例2制备的介孔硅微球增强剂2通过物理掺杂的方式均匀的掺入实施例4制备孔径为7.2nm的黏度为5×104MPa的介孔硅基干凝胶材料1，介孔 硅基干凝胶材料1：介孔硅微球增强剂2质量比为100：40。将所得的复合溶胶分别以0.7g/1cm3(可获得孔隙率≈65%的支架材料)、0.6g/1cm3(可获得孔隙率≈75%的支架材料)、0.5g/1cm3(可获得孔隙率≈85%的支架材料)的质量体积比在浇注在预先裁剪好尺寸的聚氨酯海绵上，室温陈化并60℃烘干48h，600℃煅烧6h得到支架材料7MBG-40MP。 [0096] 实施例11、硅基多级微纳结构支架材料的制备――4MBG [0097] 将实施例5制备孔径为4.3nm的黏度为5×104MPa的介孔硅基干凝胶材料2与聚氨酯海绵分别以0.7g/1cm3(可获得孔隙率≈65%的支架材料)、0.6g/1cm3(可获得孔隙率≈75%的支架材料)、0.5g/1cm3(可获得孔隙率≈85%的支架材料)的质量体积比在浇注在预先裁剪好尺寸的聚氨酯海绵上，室温陈化并60℃烘干48h，600℃煅烧6h得到所需支架材料。 [0098] 按照0.6g/1cm3浇注获得的支架材料，若所制备的支架材料碾磨后可测得平均介孔孔径为：4.3nm，BET计算结果表明材料的比表面积为312.7m2/g。 [0099] 实施例12、硅基高强度多级微纳结构复合支架材料的制备――4MBG-5MP[0100] 将实施例1制备获得的介孔硅微球增强剂1通过物理掺杂的方式均匀的掺入实施4 例5制备的孔径为4.3nm的黏度为5×10MPa的介孔硅基干凝胶材料2，介孔硅基干凝胶材料 2：介孔硅微球增强剂1质量比为100：5。将所得的复合溶胶分别以0.7g/1cm3(可获得孔隙率≈65%的支架材料)、0.6g/1cm3(可获得孔隙率≈75%的支架材料)、0.5g/1cm3(可获得孔隙率≈85%的支架材料)的质量体积比在浇注在预先裁剪好尺寸的聚氨酯海绵上，室温陈化并60℃烘干48h，600℃煅烧6h得到所需支架材料4MBG-5MP。 [0101] 按照0.6g/1cm3浇注获得的支架材料，若所制备的支架材料碾磨后可测得平均介孔孔径为：4.2nm，BET计算结果表明材料的比表面积为315.8m2/g。 [0102] 实施例13、硅基高强度多级微纳结构复合支架材料的制备――4MBG-10MP[0103] 将实施例1制备获得的介孔硅微球增强剂1通过物理掺杂的方式均匀的掺入实施例5制备的孔径为4.3nm的黏度为5×104MPa的介孔硅基干凝胶材料2，介孔硅基干凝胶材料2：介孔硅微球增强剂1质量比为100：10。将所得的复合溶胶分别以0.7g/1cm3(可获得孔隙率≈65%的支架材料)、0.6g/1cm3(可获得孔 隙率≈75%的支架材料)、0.5g/1cm3(可获得孔隙率≈85%的支架材料)的质量体积比在浇注在预先裁剪好尺寸的聚氨酯海绵上，室温陈化并60℃烘干48h，600℃煅烧6h得到所需支架材料4MBG-10MP。 [0104] 按照0.6g/1cm3浇注获得的支架材料，若所制备的支架材料碾磨后可测得平均介孔孔径为：4.2nm，BET计算结果表明材料的比表面积为346.3m2/g。 [0105] 实施例14、硅基高强度多级微纳结构复合支架材料的制备――4MBG-20MP[0106] 将实施例1制备获得的介孔硅微球增强剂1通过物理掺杂的方式均匀的掺入实施4 例5制备制备孔径为4.3nm的黏度为5×10MPa的介孔硅基干凝胶材料2，介孔硅基干凝胶材料2：介孔硅微球增强剂1质量比为100：20。将所得的复合溶胶分别以0.7g/1cm3(可获得孔隙率≈65%的支架材料)、0.6g/1cm3(可获得孔隙率≈75%的支架材料)、0.5g/1cm3(可获得孔隙率≈85%的支架材料)的质量体积比在浇注在预先裁剪好尺寸的聚氨酯海绵上，室温陈化并60℃烘干48h，600℃煅烧6h得到所需支架材料4MBG-20MP。 [0107] 按照0.6g/1cm3浇注获得的支架材料，若所制备的支架材料碾磨后可测得平均介孔孔径为：4.2nm，BET计算结果表明材料的比表面积为362.8m2/g。 [0108] 实施例15、硅基高强度多级微纳结构复合支架材料的制备――4MBG-10NMP[0109] 将实施例3制备获得的非介孔硅微球增强剂3通过物理掺杂的方式均匀的掺入实施例5制备孔径为4.3nm的黏度为5×104MPa的介孔硅基干凝胶材料2，介孔硅基干凝胶材料2：非介孔硅微球增强剂1质量比为100：10。将所得的复合溶胶分别以0.7g/1cm3(可获得孔隙率≈65%的支架材料)、0.6g/1cm3(可获得孔隙率≈75%的支架材料)、0.5g/1cm3(可获得孔隙率≈85%的支架材料)的质量体积比在浇注在预先裁剪好尺寸的聚氨酯海绵上，室温陈化并60℃烘干48h，600℃煅烧6h得到所需支架材料4MBG-10NMP。 [0110] 按照0.6g/1cm3浇注获得的支架材料，若所制备的支架材料碾磨后可测得平均介孔孔径为：4.2nm，BET计算结果表明材料的比表面积为206.5m2/g。 [0111] 实施例16、硅基高强度多级微纳结构复合支架材料的制备――7MBG-10NMP[0112] 将实施例3制备的非介孔硅微球增强剂3通过物理掺杂的方式均匀的掺入 实施例4制备孔径为7.2nm的黏度为5×104MPa的介孔硅基干凝胶材料1，介孔硅基干凝胶材料1：非介孔硅微球增强剂2质量比为100：10。将所得的复合溶胶分别以0.7g/1cm3(可获得孔隙率≈65%的支架材料)、0.6g/1cm3(可获得孔隙率≈75%的支架材料)、0.5g/1cm3(可获得孔隙率≈85%的支架材料)的质量体积比在浇注在预先裁剪好尺寸的聚氨酯海绵上，室温陈化并60℃烘干48h，600℃煅烧6h得到支架材料7MBG-10NMP。 [0113] 按照0.6g/1cm3浇注获得的支架材料，若所制备的支架材料碾磨后可测得平均介孔孔径为：7.4nm，BET计算结果表明材料的比表面积为221.4m2/g。 [0114] 实施例17、硅基高强度多级微纳结构复合支架材料力学性能 [0115] 实施例6-9的高强度多级结构复合支架材料的照片如图1。实施例8、13的高强度多级结构复合支架材料的SEM图如图2。实施例8、13的高强度多级结构复合支架材料的TEM图如图3。可见，所述的支架材料中具有200-500μm微米级大孔和2-22nm纳米介孔。 [0116] 硅基高强度多级微纳结构复合支架材料制备成10mm×10mm×10mm的矩形样条，然后在万能材料试验机上(AG-2000A，Shimadzu，Japan)进行抗压测试，压缩速度为1mm/min。以实施例6-16为例，结果如表3和表4所示。无机增强剂的引入，可以极其显著地提高多孔支架材料的力学强度。 [0117] 多孔支架材料的孔隙率根据排水法测定，孔隙率P=(W2-W3+WS)/(W1-W3)，其中WS为样品质量，W1为称量充满无水乙醇的比重瓶的质量；W2为将样品放入比重瓶中的总质量；W3为将样品取出后，比重瓶的质量。) [0118] 表3、实施例6-10,16复合支架材料抗压强度 [0119] [0120] [0121] 表4、实施例11-15复合支架材料抗压强度 [0122] [0123] 实施例18、硅基高强度多级微纳结构复合支架材料的体外生物活性 [0124] 将硅基高强度多级微纳结构复合支架材料浸泡在人体模拟体液(采用电子分析天平准确称取试剂并严格按照以下顺序以及用量：7.996g NaCl，0.353gNaHCO3,0.224g KCl,0.228g K2HPO43H2O,0.305g MgCl26H2O,0.045g HCl,0.278g CaCl20.071g Na2SO4,6.057g CNH2(CH2OH)3)中，由于介孔硅基干凝胶材料的表面能迅速发生一系列的物理化学反应，导致其表面形成一层与人体骨骼无机相相似的碳羟基磷灰石(HAP)，从而能与人体硬、软组织如胶原蛋白和细胞进一步成键联结。以本实施例8和实施例16获得的支架材料为例，通过SEM可以表征分析HAP在实施例8的支架材料表面的沉积情况，如图4。可以发现，与非介孔硅基微球增强的7MBG-10NMP相比，采用本发明制备的7MBG-10MP具有更加优良的体外矿化能力和生物活性。 [0125] 实施例19、硅基高强度多级微纳结构复合支架材料的细胞相容性 [0126] 以鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)(1、大鼠100g左右，脱颈处死，75%酒精泡10min。2、无菌剥离股骨、胫骨，再用纱布剥尽骨头上的肌肉。3、剪断干骺端，用5ml注射器吸取含 10%胎牛血清(没灭活)L-DMEM培养基冲洗骨髓腔，吹打制的单细胞悬液。4、离心1000r/min、离心5min。5、弃上清，培养基重悬细胞，吹打成细胞悬液，接种在培养瓶中培养。)为模型，使 4 用MTT法检测实施例6-9、实施例11-14制备的支架材料的细胞活性：向接种有细胞(2*10个/孔)的支架材料培养于24孔板内，每孔加入100μL的四甲基偶氮唑盐试剂，37℃继 续孵育4h后，吸弃上清液，加入1mL DMSO，轻轻震荡20min，使结晶物溶解，离心后使用连续光谱酶标仪在490nm处测定溶液的光吸收值。MTT法测得的细胞活性和细胞增殖如图5，可见随着时间的增加，细胞活性良好，具有良好的生物相容性。 [0127] 通过扫描电镜SEM观察细胞在实施例8和13的支架材料表面的形貌：将2*104个/孔细胞接种在材料上12h后PBS清洗三次，2.5%戊二醛固定15min后乙醇逐级脱水：50%、70%、80%、90%、95%、100%，每次5min；用乙酸异戊酯置换10min；37℃烘箱干燥4小时后喷金再将经过处理后的培养有细胞的材料在扫描电镜下进行观察。结果如图6，可见细胞在支架材料表面具有很好的粘附和铺展。 [0128] 通过激光共聚焦(confocal laser scanning microscopy)观察细胞在实施例8和13的支架材料上的渗透和铺展：将2*104个/孔的细胞培养在材料上24h后PBS清洗三次， 2.5%戊二醛固定15min后用异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽(FITC-Phalloidin)染色40分钟，PBS清洗5次、每次5min，再用DAPI染色10min后PBS清洗5次、每次5min，封片液封片后激光共聚焦下进行三维观察。结果如图7,可见多孔支架材料有利于细胞的渗透和长入，并表现出良好的细胞粘附和相容性。 [0129] 实施例20、硅基高强度多级微纳结构复合支架材料植入动物体内分析[0130] 通过X光观察支架材料在植入体内后的骨修复作用：本研究采用的动物模型是兔桡骨中段15mm临界缺损。将实施例8制备的7MBG-10MP硅基高强度多级微纳结构复合支架材料制成长度为1.5cm，直径4mm，然后辐射灭菌。实验在无菌的手术室进行。术前用3%(w/w)戊巴比妥钠按30mg/kg静脉注射麻醉动物，在右前肢桡骨中段取约30mm的纵行切口，逐层分离软组织显露桡骨，在桡骨中段用牙科钻造成15mm缺损，立即用生理盐水冲洗后填入材料，再逐层严密缝合创口。术后2周和12周取出缺损桡骨及其连接的尺骨，X-射线检测骨缺损处新骨生成情况。结果如图8，可见所制备的硅基高强度多级微纳结构复合支架材料改善了硅基多孔支架力学强度低、易掉渣、成型难的缺点，而且在体内呈现较好的成骨效果。 |
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