[0001] 本发明涉及瞬时转染植物或植物上的叶的方法。本发明还涉及在植物中或在植物上的叶中瞬时表达目的DNA序列的方法。另外，本发明涉及农杆菌(Agrobacterium)菌株。

[0002] 发明背景

[0003] 用于农业的当前基因工程方法均基于1983年首次阐明(Fraley等人1983；Barton等人1983)并自1996年商业化的作物物种的稳定基因修饰。尽管基于植物稳定遗传转化的农业方法如今是现实并且是成功新实践的基础，但它具有多种限制，主要限制是开发转基因作物所需的时间很长和成本高昂。参与植物生物技术的公司之间的一般共识是取决于作物物种，研发过程需要8–16年，并且平均开发总成本估计在一亿和一亿五千万美元之间。因为这些限制，自从发现植物遗传转化方法以来超过25年后，仅少量性状和少数GM作物物种迄今已商业化。

[0004] 已知也可以使植物细胞和全株植物短暂再编程(即，没有新遗传物质稳定整合在植物染色体上)，并且瞬时方法例如病毒感染快捷。此类瞬时方法原则上可以允许非常快速地调节植物代谢，有利于用户感兴趣的某些产物。此类方法要求已经被工程化以有效和安全地转染植物的DNA或RNA载体(病毒或细菌)。早期尝试使用基于植物病毒的载体已经部分获得成功，在于它们允许转染植物以制造高价值的重组蛋白质，例如某些生物药(Gleba等人2007，2008；Lico等人2008)。文献中已经描述利用病毒操纵其他性状例如输入性状(例如除草剂抗性，Shiboleth等人2001；Zhang和Ghabiral 2006)，但病毒转染在感染的宿主中引入如此多不想要的变化，从而不再继续寻求这类瞬时方法用于输入性状。瞬时方法还可以围绕农杆菌(Agrobacterium)物种将其Ti质粒的部分转移给真核细胞(特别是植物细胞)的能力进行构建。使用基于农杆菌的转染是用于遗传操纵例如遗传转化方案和实验室瞬时转染试验的基础。基于农杆菌的转染的工业应用也局限于重组蛋白质制造，原因是最佳应用条件(例如用细菌悬液对植物的真空渗入)不能在田间大规模使用，而用细菌溶液喷洒地上部分或浇灌植物导致转染据推测非常小部分的植物细胞，并且先前研究根本未解决这个具体问题。

[0005] 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌(A.rhizogenes)在世界上广泛用于研究实验室中，用于植物的瞬时转染和稳定遗传转化。这些应用基于农杆菌将遗传信息转移给真核细胞的能力。目前培养的许多转基因植物例如大豆、卡诺拉油菜和棉，通过农杆菌介导的遗传转化产生。在瞬时转化和稳定转化之间的本质差异是：在稳定转化的方法中，农杆菌递送的DNA最终整合到植物染色体中，并且随后由植物子代继承。此类整合事件甚至在专门设计以提供植物细胞和细菌之间大量接触的实验室实验中是稀有的；因此为了选择稳定转化体，不得不利用专用选择性筛选方法并且使用为最佳转化和再生成完整植物而选择的特定植物外植体(富含分生组织)。因此，在这个科学领域积累的知识对于对瞬时方法有兴趣的那些人而言价值有限，在瞬时方法中应影响植物体的许多细胞，但不选择被转染的细胞。

[0006] 另一方面，瞬时转染仅考虑农杆菌驱动的向植物细胞核递送DNA的早期步骤以及下述事实：此类递送的DNA分子可以在胞核中转录，甚至在DNA不整合到植物染色体的情况下，这种表达导致植物细胞的瞬时代谢性再编程。已经将这种再编程开发成用于快速评价不同遗传实验的实验工具。尽管存在关于农杆菌介导向植物细胞转移DNA的大量知识，但是这种信息总是限于实验室规模的实验，并且因而迄今为止，极少尝试开发涉及农杆菌作为DNA载体的工业规模应用。

[0007] 实验室应用的局限之一是：基于农杆菌的DNA递送要求难以或不可能在大田或大规模应用的某些处理。在常见的瞬时实验中，将培养的植物细胞或植物部分(外植体)用过量细菌处理，以提供最大程度的递送。在常见的研究实验中，人们还对如果按工业规模进行则经济上不可行的表达水平感兴趣。一般而言，这个领域内进行的研究已使研究者引出这样的结论：严重影响瞬时表达的参数是允许农杆菌与植物体内的植物细胞实现最佳相互作用的那些参数。此类研究大多数利用真空渗入、注射入植物叶内或表面活性剂处理，弄创植物表面(例如用刀片)、或其组合。事实上，正在开发不涉及(基于病毒)进一步扩增原始DNA的用于商业生产重组蛋白质的基于农杆菌的转染方法的唯一团队是Medicago的团队(D’
Aoust等人2008，2009；Vezina等人，2009)。他们的方法完全依赖于真空渗入作为递送方法。
然而，因为基于大大过量的细菌与植物细胞比，用于植物瞬时转染的当前实验室方案不具有真正的转化价值，即，它们不能直接按工业水平重复。除了少数情况之外(例如Vaquero等人，1999，D’Aoust等人，2008，2009)，他们仍未定量地解决瞬时转染方法的效率问题。(此类研究的例子是大量的，我们仅引用少数代表性例子：Li等人，1992；Liu等人，1992；Clough和Bent，1998；De Buck等人，1998，2000；Chung等人，2000；Yang等人，2000；Zambre等人，2003；
Wroblewski等人，2005；Lee和Yang，2006；Zhao等人，2006；Shang等人，2007；Jones等人，
2009；Li等人，2009；De Felippes和Weigel，2010)。

[0008] 目前尚在开发中的工业方法之一是magnifection，一种基于农杆菌真空渗入植物叶的方法。magnifection法(由Icon Genetics GmbH注册为 商标且由几项专利/专利申请覆盖)是一种用于植物中异源蛋白质表达的简单和可无限放大规模的方案，该方案避免植物的稳定遗传转化，而依赖于由农杆菌以DNA前体形式递送到植物体的多个区域(全身性递送)的病毒载体瞬时扩增。这种方法实质上是用携带编码病毒RNA复制子的T-DNA的农杆菌的稀释悬液渗入完整成熟植物。在这个方法中，细菌承担初始感染和全身移动的(以前是病毒)功能，而病毒载体提供细胞至细胞的(短距离)传播、扩增和高水平蛋白质表达。放大(工业)形式围绕完全装配的病毒载体(而不是要求在植物中装配的前载体)建立并且要求通过真空渗入将农杆菌高通量递送至完整植物的装置。该方法可以放大，但它要求植物的地上部分在真空下浸入细菌悬液内(该过程涉及颠倒盆中或盘中培育的植物)，这是一个在以下方面造成限制的流程：可以按这种方式处理的生物量的体积、该方法的通量、在处理前可以培养植物的方式，并且它还带来一些成本，这些成本将该方法的用途限于高成本产品，例如仅仅用于重组生物药。magnifection法是有效的，因为它允许转染所处理植物中的几乎全部叶细胞、或约50％的总地上植物生物量(剩余部分是茎和叶柄)。该方法已经以许多方式优化，参见例如Marillonnet等人，2005。然而，当前方法完全围绕细菌递送方法构建，例如注射到植物叶中或真空渗入(例如Simmons等人，2009)、弄伤叶(Andrews和Curtis，2005)，或将农杆菌倾入土壤中(‘agrodrenching’，Ryu等人，2004；Yang等人，
2008)，但是这些方法不能用于大量处理田间植物(在Gleba等人，2004、2007、2008中综述；
Gleba和Giritch，2010、2011；Lico等人，2008；我们研究组的原著包括Giritch等人2006；
Marillonnet等人，2004，2005；Santi等人，2006；和来自其他研究团队的思路上相似的论文–Voinnet等人，2003；Sudarshana等人，2006；Gao等人，2006；Mett等人，2007；Lindbo，
2007a,b；Plesha等人，2007，2009；Huang等人，2006；Regnard等人2009；Green等人，2009；
Shoji等人，2009)。

[0009] 在无真空渗入下对完整植物(在植物中)使用农杆菌处理的尝试已经产生极低数目的初始转染的细胞，从而大大限制该方法的实际应用。另外，由于在瞬时转染系统中未选择转染的植物细胞，如果避免真空渗入，则对于大规模应用而言，整个瞬时转染方法的效率太低。另外，几个植物物种如大豆或油籽油菜难以由农杆菌转染，除非使用特定植物组织，因而在植物中瞬时转染尚未明显程度地实现。

[0010] 发明简述

[0011] 从现有技术出发，本发明的一个目的是提供在植物中瞬时转染的有效方法。本发明的另一个目的是提供在植物中瞬时表达目的DNA序列的有效方法。另外，本发明的一个目的是提供一种在不需要应用压力差以将农杆菌引入植物的细胞间隙内情况下允许大(工业)规模(即，平行针对许多植物)使用农杆菌瞬时转染植物的有效方法。再一目的是提供适用于这个目的的农杆菌细胞和菌株。

[0012] 这些问题由一种瞬时转染植物或植物上的叶的方法解决，所述方法包括使所述植物或所述叶与包含以登录号DSM25686保藏的农杆菌菌株CryX或菌株CryX的衍生菌株的细胞的悬液接触，其中所述衍生菌株具有菌株CryX的染色体背景或所述衍生菌株含有菌株
CryX的vir质粒或所述vir质粒的衍生物。

[0013] 还提供一种在植物中瞬时表达目的DNA序列的方法，所述方法包括使所述植物或所述植物上的所述叶与包含以登录号DSM25686保藏的农杆菌菌株CryX或菌株CryX的衍生
菌株的细胞的悬液接触，其中所述衍生菌株具有菌株CryX的染色体背景或所述衍生菌株含有菌株CryX的vir质粒或所述vir质粒的衍生物。

[0014] 本发明也提供具有DSM登录号DSM25686的农杆菌菌株CryX或菌株CryX的衍生菌株，其中所述衍生菌株具有菌株CryX的染色体背景或所述衍生菌株含有菌株CryX的vir质粒或所述vir质粒的衍生物；或菌株CryX或所述衍生菌株的农杆菌细胞。

[0015] 本发明也提供具有DSM登录号DSM25686的农杆菌菌株CryX细胞或其衍生物，所述细胞含有双元载体，所述双元载体含有在T-DNA中待转染至植物细胞的目的DNA序列，其中所述双元载体可以编码来自菌株CryX的VirG蛋白或如下文定义的密切相关的VirG蛋白。

[0016] 本发明还提供一种试剂盒，其包含：

[0017] -如上文定义的所述菌株或所述衍生菌株的农杆菌细胞和

[0018] -含有在T-DNA中待转染至植物细胞中的目的DNA序列的双元载体。

[0019] 该双元载体可以编码来自菌株CryX的VirG蛋白或如下文定义的密切相关的VirG蛋白。

[0020] 本发明也提供菌株CryX的vir质粒和具有菌株CryX的染色体的农杆菌细胞。

[0021] 本发明还提供具有DSM登录号DSM25686的农杆菌菌株CryX或菌株CryX的衍生菌株(如本文定义)的含水细胞悬液，所述悬液具有最多1.1x106cfu/ml悬液、优选地最多
4.4x105cfu/ml悬液和更优选地最多1.1x105cfu/ml悬液的细胞浓度。

[0022] 本发明的发明人已经发现一种强烈增加农杆菌瞬时转染植物的效率的方式。发明人已经鉴定了用广泛类型的植物在植物中瞬时转染时实现特别高的效率的农杆菌菌株(农杆菌菌株CryX)。尤其地，与作为植物转化或转染的标准使用的其他农杆菌菌株如菌株LBA4404或EHA105相比，菌株CryX实现高得多的植物中瞬时转染效率(参见Slater等人的第
64页，引自：Plant Biotechnology，第2版，Oxford University Press，2008)。发明人还已经发现菌株CryX比相关的农杆菌菌株如Chry5/KYRT1实现更高的瞬时转染效率。另外，发明人已经发现，在chrysopine型或琥珀碱(succinamopine)型根癌农杆菌菌株中表达virG基因、尤其来自农杆菌菌株LBA4404的virG基因或与来自LBA4404的virG基因密切相关的virG基因时，可以获得特别高的转染效率。

[0023] 附图简述

[0024] 图1A和图1B显示在实施例中使用的载体的带有目的DNA序列的T-DNA区域。Pact2：拟南芥(Arabidopsis)肌动蛋白2基因启动子；o：来自TVCV(芜菁脉明病毒(turnip vein clearing virus))的5'末端；RdRp：来自cr-TMV(感染十字花科植物的烟草花叶病毒)的RNA依赖性RNA聚合酶可读框(ORF)；MP：来自cr-TMV的移动蛋白ORF；N：来自cr-TMV的3’-非翻译区；Tnos或nos：胭脂碱合酶终止子；间断RdRp和MP ORFs中灰色区段的白色区段表示插入这些ORF中以增加植物细胞胞质中RNA复制子形成可能性的内含子，这在WO 2005049839中详述；GUS：GUS蛋白的编码序列；GFP：绿色荧光蛋白编码序列；fs：消除细胞至细胞移动能力的移码；P35S：35S启动子；P19：番茄丛矮病毒的基因沉默阻抑蛋白(参见Plant J.33,949-
56)；Tocs：ocs终止子；LB：T-DNA左边界；RB：T-DNA右边界。

[0025] 图2显示不同根癌农杆菌菌株的瞬时转染效率的比较。照片显示UV光下感染后4日(4dpi)的GFP荧光，所述GFP荧光归因于如实施例2中所述用稀释的农杆菌培养物注射器渗入本塞姆氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶后基于TMV的GFP表达。数字10-2、10-3和10-4表示对600nm处OD＝1.3的过夜农杆菌培养物的浓缩倍数，其分别对应于102倍、103倍和104倍稀释。用于渗入的缓冲液的组成是5mM MES、pH 5.5和10mM MgSO4。使用同一植物的三片独立叶一式三份进行每次渗入。

[0026] (A)能够进行细胞至细胞移动的基于TMV的载体：TMV(MP)-GFP(pNMD560)。

[0027] (B)缺乏细胞至细胞移动能力的基于TMV的载体：TMV(fsMP)-GFP(pNMD570)。

[0028] 1-根癌农杆菌菌株AGL1；

[0029] 2-根癌农杆菌菌株EHA105；

[0030] 3-根癌农杆菌菌株GV3101；

[0031] 4-根癌农杆菌菌株ICF320；

[0032] 5-根癌农杆菌菌株CryX；

[0033] 6-根癌农杆菌菌株LBA4404；

[0034] 7-根癌农杆菌菌株LBA9402。

[0035] 图3展示virG基因过量表达对AGL1、EHA105、ICF320和GV3101菌株瞬时转染效率的影响。来自GV3101和LBA4404菌株的携带N54D突变的virG序列以及来自LBA4404菌株的天然序列用于比较。照片显示UV光下感染后4日(图3A)和感染后6日(图3B)的GFP荧光，所述GFP荧光归因于如实施例3中所述用稀释的农杆菌培养物注射器渗入来自3个独立植株的年龄相同的本塞姆氏烟草叶后基于TMV的GFP表达。数字10-2、10-3和10-4显示降低600nm处OD＝
1.3的过夜农杆菌培养物的细胞浓度的倍数。因此，倍数10-2、10-3和10-4分别对应于102、103和104倍稀释。用于渗入的缓冲液的组成：5mM MES、pH 5.3和10mM MgCl2。在全部情况下使用能够进行细胞至细胞移动的基于TMV的载体。

[0036] 1–GV3101中的pNMD560(无virG)；

[0037] 2-GV3101中的pNMD064(virGN54D/GV3101)；

[0038] 3-GV3101中的pNMD063(virGN54D/LBA4404)；

[0039] 4-GV3101中的pNMD062(virG/LBA4404)；

[0040] 5-ICF320中的pNMD560(无virG)；

[0041] 6-ICF320中的pNMD064(virGN54D/GV3101)；

[0042] 7-ICF320中的pNMD063(virGN54D/LBA4404)；

[0043] 8-ICF320中的pNMD062(virG/LBA4404)；

[0044] 9-EHA105中的pNMD560(无virG)；

[0045] 10-EHA105中的pNMD064(virGN54D/GV3101)；

[0046] 11-EHA105中的pNMD063(virGN54D/LBA4404)；

[0047] 12-EHA105中的pNMD062(virG/LBA4404)；

[0048] 13-AGL1中的pNMD560(无virG)；

[0049] 14-AGL1中的pNMD064(virGN54D/GV3101)；

[0050] 15-AGL1中的pNMD063(virGN54D/LBA4404)；

[0051] 16-AGL1中的pNMD062(virG/LBA4404)。

[0052] 图4A和图4B显示virG基因过量表达对GV3101和CryX菌株瞬时转染效率的影响。来自GV3101和LBA4404菌株的携带N54D突变的virG序列以及来自LBA4404菌株的天然序列用于比较。照片显示UV光下感染后3、4、5日的GFP荧光，所述GFP荧光归因于如实施例3中所述用稀释的农杆菌培养物注射器渗入来自3个独立植株的年龄相同的本塞姆氏烟草叶后基于TMV的GFP表达。数字10-4和10-5表示对600nm处OD＝1.3的过夜农杆菌培养物的浓缩倍数。用于渗入的缓冲液的组成：5mM MES、pH 5.3和10mM MgCl2。使用能够进行细胞至细胞移动的基于TMV的载体。

[0053] 1-GV3101菌株中的pNMD560(无virG)；

[0054] 2-GV3101菌株中的pNMD064(virGN54D/GV3101)；

[0055] 3-GV3101菌株中的pNMD063(virGN54D/LBA4404)；

[0056] 4–CryX菌株中的pNMD560(无virG)；

[0057] 5-CryX菌株中的pNMD064(virGN54D/GV3101)；

[0058] 6-CryX菌株中的pNMD063(virGN54D/LBA4404)。

[0059] 图5显示使用注射器渗入本塞姆氏烟草叶时在过夜农杆菌培养物的从10-3至10-7一系列稀释范围内CryX菌株和GV3101菌株瞬时转染效率的比较。数字10-3、10-4、10-5、10-6和
10-7表示对600nm处OD＝1.3的过夜农杆菌培养物的浓缩倍数。这些浓缩倍数分别对应于
103、104、105、106和107倍稀释。用于渗入的缓冲液的组成：在水中5mM MES、pH 5.3和10mM MgCl2。在感染后4日拍摄照片。

[0060] 1-GV3101菌株中的pNMD560(无virG)；

[0061] 2-GV3101菌株中的pNMD064(virGN54D/GV3101)；

[0062] 3-GV3101菌株中的pNMD063(virGN54D/LBA4404)；

[0063] 4–CryX菌株中的pNMD560(无virG)；

[0064] 5-CryX菌株中的pNMD064(virGN54D/GV3101)；

[0065] 6-CryX菌株中的pNMD063(virGN54D/LBA4404)。

[0066] 图6显示使用农杆菌细胞悬液喷洒法测试不同农杆菌菌株瞬时转染大豆的结果。将pNMD2190构建体(质粒骨架中的35S:GUS；35S:p19和virGN54D/LBA4404)用于AGL1、
EHA105，CryX和LBA4404菌株；将pNMD2180构建体(质粒骨架中的35S:GUS；35S:p19和
virGN54D/GV3101)用于GV3101和ICF320菌株。在感染后11日针对GUS活性进行叶的染色。

[0067] (A)对于喷洒，将OD600＝1.3的液体农杆菌培养物用含有5mM MES，pH 5.3；10mM MgCl2和0.05％(v/v) 20的缓冲液以1:10的比例稀释。

[0068] (B)对于喷洒，将OD600＝1.3的液体农杆菌培养物以1:10、1:100和1:1000的比例用按0.3％(w/v)浓度补充以Size 800的碳化硅粒子的(含有5mM MES，pH 5.3；10mM MgCl2和0.05％(v/v) 20的)缓冲液稀释。

[0069] 图7显示使用农杆菌细胞悬液喷洒法测试CryX菌株和EHA105菌株瞬时转染陆地棉(Gossipium hirsutum L.)的结果。对于喷洒，将OD600＝1.3的液体农杆菌培养物用含有5mM MES，pH 5.3；10mM MgCl2和0.25％(v/v)Silwet L-77的缓冲液以1:10比例稀释。为了测试，使用构建体pNMD1971(35S:GUS；35S:p19)，pNMD2180(质粒骨架中的35S:GUS；35S:p19和virGN54D/GV3101)和pNMD2190(质粒骨架中的35S:GUS；35S:p19和virGN54D/LBA4404)。在感染后6日进行GUS活性测试。

[0070] 图8显示使用能够进行细胞至细胞移动的基于TMV的载体(TMV-GFP，pNMD560载体)，对从不同实验室收到的两个根癌农杆菌Chry5/KYRT1菌株获得物的比较。照片显示UV光下感染后4日(4dpi)的GFP荧光，所述GFP荧光归因于如实施例8中所述用600nm处OD＝1.3的经稀释过夜农杆菌培养物注射器渗入本塞姆氏烟草叶后基于TMV的GFP表达。从肯塔基大学G.Collins博士实验室(列克星敦，美国)获得的菌株在每片叶的右侧上渗入。来自细胞生物学和遗传工程研究所(ICBGE，基辅，乌克兰)的菌株在每片叶的左侧上渗入。用于渗入的缓冲液的组成是5mM MES、pH 5.5和10mM MgSO4。使用同一植物的三片独立叶一式三份进行每次渗入。

[0071] 1-ICBGE获得物(accession)，浓缩倍数10-1(10倍稀释)；

[0072] 2-ICBGE获得物，浓缩倍数10-2；

[0073] 3-ICBGE获得物，浓缩倍数10-3；

[0074] 4-肯塔基大学获得物，浓缩倍数10-1；

[0075] 5-肯塔基大学获得物，浓缩倍数10-2；

[0076] 6-肯塔基大学获得物，浓缩倍数10-3。

[0077] 本发明的详细描述

[0078] 在本发明中，将特定类别的根癌农杆菌菌株用于瞬时转染植物，如植物上的叶。这种类别的农杆菌包含根癌农杆菌菌株CryX及其如下文定义的衍生菌株。根据布达佩斯条约，将菌株CryX在2012年2月23保藏于DSMZ-德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)，位于德国茵霍芬街7B(Inhoffenstraβe 
7B)，38124布劳恩斯切魏格。已经赋予它登录号DSM25686。菌株CryX具有染色体整合的利福平抗性。

[0079] 菌株CryX与已经在1991年由Busch和Puepke鉴定的源自菊花(Chrysanthemum morifolium)的农杆菌菌株Chry5相关。在他们的论文中，已经显示按常规的生物型试验，该菌株是生物型I并且它在至少10个植物物种上产生肿瘤。已经将它表征为不寻常的，原因在于它能够在大豆(Glycine max)上高效地形成大肿瘤并且出于这个原因，它随后由众多研究小组在许多论文中进一步表征。Chry5不能利用章鱼碱或甘露碱作为碳源；相反，它能够异化每种胭脂碱和琥珀碱的单种异构体，同时它对土壤杆菌素84不敏感(Busch和Puepke，
1991)。此外，Chry5菌株诱导的肿瘤产生一个阿马多里型冠瘿碱(Amadori-type opine)家族，其包括脱氧果糖基谷氨酰胺(Dfg)及其内酯chrysopine(Chy)(Palanichelvam等人，
2000)。已经显示Chry5的分离株含有至少两种质粒，一种与pTiB6具有同源性。Torisky等人(1997)已经通过同源重组从Chry5的285-kb Ti质粒移除包含约4kb致癌性T-DNA的大约
16.5kb区段，部分地使该菌株卸甲。已经显示这个缺失突变体(命名为KYRT1)是有效的载体生物，并且从那时起，这种部分卸甲的Chry5衍生物已经由一些研究者使用。另外最近，Palanichelvamet等人(2000)已经开发出充分卸甲的衍生物。

[0080] 在导致本发明的研究中，发明人已经首次测试了来自不同实验室的两个登录号的Chry5/KYRT1。从G.Collins博士实验室(Torisky等人，1997)获得的菌株在我们的瞬时研究中不显示胜过标准比较菌株EHA105和GV3101的任何优越性并从进一步研究排除。在另一方面，已经发现来自细胞生物学和遗传工程研究所(乌克兰的基辅)的登录号在其瞬时转染和表达效率方面异常有效并且已经在本发明中使用。将后一个登录号根据布达佩斯条约在官方保藏机构DSMZ-德意志微生物保藏中心，位于德国布劳恩斯切魏格，以名称CryX保藏，以反映如下事实：不存在关于它的清晰出处信息。

[0081] 首发论文和后续论文已经以更多细节表征了Chry5菌株。这些研究的目的是标准表征该菌株的分子生物学和遗传学，以及其诱导肿瘤以造成不同植物物种遗传转化的对比性能力，以及其在农杆菌处理的外植体中造成瞬时表达的能力。下文简要总结这些研究的结果。

[0082] 用来表征根癌农杆菌Chry5的比较方法

[0083] 1.关于致瘤性的数据

[0084] 在Bush和Puepke(1991)的首发论文中，已经确立Chry5菌株能够在代表7个植物科的10个植物物种上造成肿瘤。试验涉及相对于常见实验室菌株B6，半定量评价具有这个菌株引起的肿瘤的植物的数目。各菌株之间在9个物种中的6个物种(甜菜、伽蓝菜(kalanchoe)、金盏花(marigold)、向日葵、烟草和番茄)中不存在致瘤性的显著差异。与B6相比，在羽衣甘蓝上，Chry5大约两倍更高效，并且在大豆上大约3倍更高效，而在豌豆上，它或多或少地效率较低。Torisky等人(1997)提供关于肿瘤在烟草和番茄的茎上形成的额外数据；在这项研究中，Chry5菌株和其部分卸甲的衍生物KYRT1已经与转化研究中经常使用的两个其他农杆菌菌株比较，包括A281(在C58染色体背景中含有Bo542Ti质粒的琥珀碱型菌株)及其卸甲的衍生物EHA105菌株。已经在那项研究中显示，所用的原始Chry5菌株和另一个琥珀碱菌株A281均是高度致肿瘤的，但部分失能的衍生物KYRT1和EHA105无活性。

[0085] 2.关于使用部分失能和完全失能的菌株时转化效率的数据

[0086] Torisky等人(1997)展示了KYRT1成功地转移β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因至烟草叶外植体中，产生可以再生成有活力植物的表达GUS的愈伤组织。在这些实验中，KYRT1菌株的转化效率与对EHA105所显示的转化效率大致相同。Grant等人(2003)发现用于评价具有三个不同植物基因型的子叶外植体，就产生豌豆转基因植物而言，KYRT1菌株平均三倍更有效于AGL1。

[0087] 在Palanichelvam等人(2000)的工作中，已经显示KYRT1衍生物仅部分地卸甲并且含有全部致瘤性T右区域和T左区域的片段。然而，就稳定转化大豆而言，具有完全卸甲的Ti质粒pKPSF2的Chry5衍生物(Palanichelvam等人，2000)较不高效，因为KYRT1菌株保留了对植物外植体的某种激素效应，增强大豆中的体细胞胚发生(Ko等人，2004)。

[0088] 3.表征瞬时活性的数据

[0089] Torisky等人(1997)再次通过利用大豆子叶节外植体中GUS表达的定量分析，首次研究了Chry5衍生物KYRT1引起的β-葡糖醛酸糖苷酶转基因的瞬时表达。这些数据表明与EHA105或GV3850相比时，KYRT1衍生物在造成瞬时表达方面大约2.5倍更高效。对于在顽抗性豆科植物兵豆(Lens culinaris M.)的子叶柄上产生瞬时β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因(gus)表达而言，KYRT1比EHA105和C58C1平均2.8倍更高效(Akcay等人，2009)。在用KYRT1和两个其他常见的载体C58C1和EHA105处理后，Akbulut等人(2008)已经测量源自受伤籽苗的外植体中的GUS活性。对GUS表达点的定量评价已经显示在16小时吸液后，KYRT1和C58C1之间不存在统计显著差异，并且40小时后，KYRT1大约50％更好，但是仅在两个测量点之一中如此。

[0090] 完整解释上文提及数据是困难的，因为不同作者使用不同的植物物种、不同的植物外植体、不同的农杆菌菌株用于比较，并且基于三种不同的活性方法：致肿瘤性活性、遗传转化效率和瞬时表达效率，得出他们的结论。植物细胞和农杆菌相互作用的过程非常复杂，并且它涉及T-DNA-蛋白质复合物的转移、蛋白质如VirE2(通过独立分泌系统)的转移、在植物细胞中瞬时表达T-DNA基因、所表达基因的激素效应、一些T-DNA分子整合入植物染色体DNA等。这些中间过程的任一个可能影响最终结果；因此，关于致瘤性和关于转化效率的数据未给出有关T-DNA转移及瞬时表达效率的信息。在另一方面，展示的关于瞬时活性的数据有限并且观察到的轻微差异不是结论性的或实际上不相关。

[0091] 本文所述的方法及菌株和在上文描述的现有技术中使用的方法的主要差异是用于瞬时表达研究的植物材料的不同生物学。尽管全部先前作者均使用体外培养或切下的富含分生组织的植物外植体(最终目的是转化植物细胞并从所述转基因细胞再生出完整植物的能力)如切下的胚、嫩籽苗的部分等，本发明涉及瞬时转染与农杆菌差异性相互作用的完整、发育的植物。在完整植物上，农杆菌通过气孔(其在其他器官中和分生组织中不存在)并且不通过植物外植体上的伤口进入叶。如之前提到，当处理植物外植体时，全部作者无一例外地使用高细菌密度。

[0092] 本发明的菌株CryX含有至少部分卸甲的vir质粒。“卸甲的”意指vir质粒和其宿主农杆菌不具有致瘤性，即，它不向植物细胞插入癌基因或用来生产冠瘿碱类的基因，因为它不含有这类基因或它不能转移这类基因。vir质粒包含T-DNA转移至植物细胞中所需的vir基因(毒力基因)。Vir基因和它们在T-DNA转移中的功能是本领域已知的并且例如在Slater等人的书Plant Biotechnology,第2版；Oxford University Press,2008中总结；还见Hellens等人,Trends in Plant Science 5(2000)446-451。

[0093] 本发明的菌株CryX是双元菌株，即，T-DNA转移至植物细胞中所需的vir基因和T-DNA位于分立的质粒上(参见例如关于双元农杆菌菌株和载体系统的Slater等人书籍和Hellens等人文章)。在双元农杆菌菌株的情况下，含有vir基因的质粒在本文中称作“vir质粒”或“vir辅助质粒”。含有待转染的T-DNA的质粒称作“载体”或“双元载体”。术语“菌株”或“农杆菌菌株”涉及除双元载体之外的农杆菌组分。因此，本文中，不含有双元载体并且在引入双元载体后的双元农杆菌菌株由相同的菌株名称提及。保藏的菌株CryX含有vir质粒，但是不含有双元载体。

[0094] 本发明还涉及菌株CryX的衍生菌株。在一个实施方案(i)中，菌株CryX的衍生菌株具有菌株CryX的染色体背景。它可以具有与CryX相同的染色体。在另一个实施方案(ii)中，菌株CryX的衍生菌株含有菌株CryX的vir质粒。在又一个实施方案(iii)中，菌株CryX的衍生菌株含有菌株CryX的vir质粒的衍生物，并且可以具有菌株CryX的染色体。在实施方案(ii)中，菌株是双元菌株并且在引入含有目的T-DNA的双元载体后用于本发明的方法中。在实施方案(i)和(iii)中，菌株可以是双元菌株。如果它们是双元菌株，则这些双元菌株在引入含有目的T-DNA的双元载体后用于本发明的方法中。备选地，在实施方案(i)和(iii)中，可以将在本发明的方法中待转移至植物细胞的T-DNA插入vir质粒中，从而vir基因和T-DNA存在于一个相同的质粒分子上。然而，通常更便利并且因此优选使用双元菌株。

[0095] 术语“染色体背景”是农杆菌转化或转染领域的标准术语(参见Hellens等人，Trends in Plant Science 5(2000)446-451)。它涉及所述农杆菌菌株除Ti质粒、vir辅助质粒和双元载体之外的遗传物质。在一个实施方案中，菌株CryX的衍生菌株具有与菌株
CryX相同的染色体。与CryX的vir质粒相比，具有菌株CryX的染色体背景的衍生菌株可以与CryX不同，例如，在vir质粒中不同。因此，菌株CryX的衍生菌株可以含有vir质粒，所述vir质粒是菌株CryX的vir质粒的衍生物。

[0096] 可以通过比较来自菌株CryX的含有T-DNA的双元载体的T-DNA转移效率(或转染效率)与含有CryX的vir质粒和相同双元载体的待测试菌株，实验地测试具有与菌株CryX不相同的染色体的给定农杆菌菌株是否具有菌株CryX的染色体背景。如果待测试菌株实现菌株CryX的至少70％、优选地至少80％的T-DNA转移效率，则认为它具有CryX的染色体背景。转染效率可以如实施例2中所述那样确定。备选地，转染效率可以如实施例2中所述那样，但使用编码不能够细胞至细胞移动的TMV-病毒复制子的双元载体如pNMD570确定。T-DNA转移效率也可以通过如WO 2005049839中所述的原生质体计数法确定。在一个实施方案中，具有菌株CryX的染色体背景的农杆菌菌株的染色体具有在碱基序列方面与菌株CryX相同的染色
体。

[0097] 当在具有与菌株CryX相同的染色体的农杆菌细胞中存在时，菌株CryX的vir质粒的衍生物从这些细胞中存在的含有T-DNA的双元载体实现相似的T-DNA向植物细胞转中的
转移效率。出于这个目的，衍生性vir质粒具有与菌株CryX的vir质粒充分相似的vir区。衍生性vir质粒可以编码菌株CryX的virG蛋白或密切相关的virG蛋白。优选地，衍生性vir质粒含有菌株CryX的virG基因。在一个实施方案中，衍生性vir质粒含有编码CryX的以下毒力蛋白中至少两种毒力蛋白的基因：VirA、virG、VirB1-BirB11、VirC1、VirD1、VirD2、VirD4、VirE1、VirE2、VirF和VirJ。在又一个实施方案中，衍生性vir质粒至少含有编码CryX的以下毒力蛋白的基因：VirA、virG、VirD2和VirE2。在又一个实施方案中，衍生性vir质粒含有完整的vir区，即，菌株CryX的vir质粒的全部vir基因。衍生性vir质粒可以在质粒骨架方面不同CryX的vir质粒。例如，衍生性vir质粒可以具有不同或额外的选择性标记基因或可以从vir区外部进一步缺失其他核酸部分。在一个实施方案中，衍生性vir质粒是pKYRT1(US5,
929,306)，尤其如果该衍生菌株具有与CryX相同的染色体。

[0098] 可以通过以下方式实验地测试给定的vir质粒是否为本发明意义下的衍生性vir质粒：在其他方面相同的条件下比较农杆菌菌株CryX和除了待测试的vir质粒之外具有菌株CryX的染色体的农杆菌之间来自含有T-DNA的双元载体的T-DNA转移效率。在一个实施方案中，含有本发明衍生性质粒的农杆菌实现菌株CryX的至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％T-DNA转移效率。转染效率可以如实施例2中所述和如上文提到那样确定。

[0099] 相对于CryX的virG蛋白而言“密切相关的virG蛋白”意指与CryX的virG蛋白差异最多3个非保守性氨基酸置换或最多6个、优选地最多3个保守性氨基酸置换的virG蛋白。非保守性氨基酸置换可以在与SEQ ID NO:1的第6、7或106位置相对应的位置处，所述SEQ ID NO:1是来自农杆菌菌株LBA4404的VirG蛋白，全部其他氨基酸残基如SEQ ID NO:1那样。此外，密切相关的virG蛋白可以在与SEQ ID NO:1的第54位置相对应的位置处具有天冬酰胺至天冬氨酸置换。保守性氨基酸置换可以在SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第6、7和/或106位置处。

[0100] 本文中，保守性置换是置换以下四组中每个组内部的氨基酸残基：

[0101] -Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Asn、Ser、Thr

[0102] -Val、Ile；Leu、Met

[0103] -Lys Arg、His

[0104] -Phe、Tyr、Trp

[0105] 将全部其他氨基酸残基置换视为非保守的。

[0106] 本文中，“目的T-DNA”是在T-DNA左边界序列和右边界序列之间含有目的DNA序列的DNA。目的T-DNA可以存在或可以已经通过亚克隆并入vir质粒如菌株CryX的vir质粒中。在本发明的方法中，优选使用双元载体系统。因此，目的T-DNA优选地存在或将被并入双元载体中。

[0107] 待用于本发明中的双元载体是包含待转染至植物细胞中的目的DNA序列的DNA分子。目的DNA序列一般编码在转染植物的细胞中待表达的蛋白质或RNA。一般通过将含有目的DNA序列的核酸构建体插入或克隆至前体双元载体的T-DNA内部的克隆位点中产生双元
载体，如农杆菌介导的植物转染中通常所做那样。在所述插入后，使核酸构建体旁侧分布有T-DNA左边界序列和右边界序列以允许用所述T-DNA转染所述植物。在双元载体的T-DNA中，目的DNA序列如此存在，从而在植物细胞中可表达。为此目的，目的DNA序列例如在所述核酸构建体中一般处于植物细胞中有活性的启动子控制下。目的DNA序列的例子是编码DNA病毒复制子或RNA病毒复制子或待表达基因的DNA序列。该基因可以编码在植物细胞中待表达的目的RNA或目的蛋白质。病毒复制子一般也编码在植物中待表达的目的RNA或蛋白质。除了目的DNA序列外，DNA构建体还可以包含其他序列，例如用于表达目的DNA序列的调节序列。
在本发明中可用的双元载体是技术人员已知的，例如从引言中引用的参考文献、或从植物生物技术方面的教科书例如Slater，Scott和Fowler，Plant Biotechnology，第2版，Oxford University Press，2008中获知。双元载体一般具有允许在细菌如大肠杆菌中选择的抗生素抗性基因。

[0108] 为了增加转染效率，双元载体可以在T-DNA外部包含在所述农杆菌菌株中可表达的virG基因。备选地，可以将额外质粒插入所述农杆菌菌株中，因而所述额外的质粒含有在所述农杆菌菌株中可表达的virG基因(Pazour等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991)
6941-6945)。virG基因优选地编码来自根癌农杆菌菌株LBA4404的VirG蛋白或密切相关的VirG蛋白。另外，VirG蛋白可以在与SEQ ID NO:1(即，来自根癌农杆菌菌株LBA4404的VirG蛋白)的第54相对应的位置处具有N54D突变。来自另一个农杆菌菌株的VirG蛋白中的N54D突变由Jung等人,Current Microbiology 49(2004)334-340描述。

[0109] 密切相关的VirG蛋白可以是

[0110] (i)包含SEQ ID NO:1氨基酸序列或SEQ ID NO:1氨基酸序列的N54D突变体的氨基酸序列的至少235个、优选地至少239个连续氨基酸的蛋白质；或

[0111] (ii)包含下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列具有SEQ ID NO:1或其N54D突变体的氨基酸序列的不多于3个非保守性氨基酸置换和不多于10个保守性氨基酸置换；
或

[0112] (iii)包含下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列具有SEQ ID NO:1或其N54D突变体的氨基酸序列的不多于20个、优选地不多于10个保守性氨基酸置换。

[0113] 在项(ii)和(iii)中，所述蛋白质优选地在与SEQ ID NO:1的第54位置相对应的位置处具有天冬酰胺或天冬氨酸残基。

[0114] 在上文提到的实施方案中保守性氨基酸置换的可能位置是SEQ ID NO:1的第6、7、18、35、38、42、44、66、69、73、81、86、89、97、106、107、122、124、133、135、143、147、150、165、
188、208、212、213、232、235和238位置，而在其他位置的氨基酸残基是如SEQ ID NO:1中的那些残基。非保守性置换的可能位置是SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第6、7和106位置。

[0115] 在需要蛋白质或RNA强烈表达或其中不关注病毒核酸在所述植物的细胞中高量累积和可能不利影响植物健康的实施方案中，核酸构建体或目的DNA序列可以编码能在植物细胞中复制的复制型病毒载体。为了复制，病毒载体含有可以由植物细胞中存在的核酸聚合酶(例如从复制子表达的病毒聚合酶)识别的复制起点。在RNA病毒载体的情况下，病毒复制子可以在DNA构建体已经引入植物细胞核后，在植物启动子的控制下通过转录从该DNA构建体形成。在DNA病毒复制子的情况下，病毒复制子可以通过DNA构建体分布于编码病毒复制子的序列侧翼的两个重组位点之间的重组而形成，例如，如WO00/17365和WO 99/22003中所述。如果病毒复制子由DNA构建体编码，则优选RNA病毒复制子。在过去至少15年已经在文献中广泛地描述DNA和RNA病毒复制子的用途。一些例子是Icon Genetics的以下专利公开：
WO 2008028661、WO 2007137788、WO 2006003018、WO 2005071090、WO 2005049839、WO 
02097080、WO 02088369和WO 02068664。DNA病毒载体的例子是基于双生病毒的那些。对于本发明，优选基于植物RNA病毒、尤其基于正义单链RNA病毒的病毒载体或复制子。这类病毒载体的例子是在实施例中使用的烟草花叶病毒(TMV)和马铃薯X病毒(PVX)。基于马铃薯X病毒的病毒载体和表达系统在EP2061890中描述。许多其他植物病毒复制子在上文提及的专利公开中描述。

[0116] 当实施本发明的方法时，可以通过常规方法如电穿孔，将在T-DNA中含有目的DNA序列的双元载体引入含有vir质粒或其衍生物的农杆菌菌株中。将含有双元载体的菌株的培养物随后在合适的培养基中培育，一般在用于选择含有双元载体的农杆菌细胞的选择剂存在下培育，并且，任选地，传代培养以产生所需量的包含农杆菌细胞的水悬液。获得的悬液可以用水、合适的缓冲液或培养基稀释至所需的浓度并且用于转染植物或植物上的叶。备选地，如果T-DNA是vir质粒的部分，则将含有T-DNA的vir质粒通过常规方法如电穿孔法引入农杆菌中并如对双元系统所述那样进一步处理。

[0117] 在本发明的方法中，使用在植物中转染。在植物中(in planta)意指对苗期后的整株活植株、优选地对充分发育的植株实施所述方法，而非切下或体外培养的植物组织或器官。优选地，所述方法平行适用于许多植株，如生长在田间的植株。

[0118] 所述植株可以在施加或不施加真空的情况下通过渗入与农杆菌细胞悬液接触。在一个实施方案中，尤其当平行应用于多个植株时，植株可以通过喷洒与悬液接触。在本发明9
方法中使用的含水悬液可以具有至多1.1x10cfu/ml农杆菌细胞的浓度，其大致对应于LB
培养基中600nm处光密度1的农杆菌培养物。然而，由于本发明中实现的高转染效率，可以使用低得多的浓度，这允许处理许多植物例如整幅农田，且无需巨大的发酵罐用于农杆菌生产。因此，浓度优选地是至多2.2x107cfu/ml、更优选地至多1.1x107cfu/ml、更优选地至多
6 6
4.4x10cfu/ml。在一个实施方案中，浓度是每毫升悬液至多1.1x10cfu。在又一个实施方案中，浓度是至多4.4x105cfu/ml悬液，并且在又一个实施方案中，浓度是至多1.1x105cfu/ml悬液

[0119] 为了避免根据cfu/ml确定细胞浓度，经常通过使用分光光度计测量600nm处的表观光密度评估农杆菌悬液的浓度。此处，1.1x107cfu/ml的浓度对应于600nm处0.01的计算光密度，其中计算的光密度定义为：用水或缓冲液稀释600nm处具有光密度1.0的悬液100倍。类似地，4.4x106cfu/ml、1.1x106cfu/ml、4.4x105cfu/ml和1.1x105cfu/ml悬液的浓度分别对应于600nm处0.004、0.001、0.0004和0.0001的计算光密度，其中计算的光密度定义为：
用水或缓冲液分别稀释600nm处具有光密度1.0的悬液250倍、1000倍、2500倍或10000倍。

[0120] 因此，在一个特别优选的实施方案中，本发明提供一种在植物中瞬时表达目的DNA序列的方法和用于此方法的农杆菌细胞悬液，所述方法包括使所述植物或所述植物上的所述叶与包含农杆菌菌株CryX或菌株CryX的衍生菌株的细胞的悬液接触，其中所述衍生菌株具有菌株CryX的染色体背景或所述衍生菌株含有菌株CryX的vir质粒或所述vir质粒的衍生物，其中所述悬液具有在前述两个段落的任一段落中提到的任一个最大农杆菌细胞浓
度。在这个实施方案中，农杆菌菌株优选地是含有双元载体的双元菌株，所述双元载体包含在所述菌株CryX或所述衍生菌株中可表达的virG基因。所述virG基因可以编码来自根癌农杆菌菌株LBA4404的具有SEQ ID NO:1的VirG蛋白，或是来自根癌农杆菌菌株LBA4404的
virG基因编码的VirG蛋白的N54D突变体。

[0121] 可以将磨料纳入悬液中以增加转染效率。磨料是在农杆菌细胞的水悬液中基本上不可溶的颗粒状材料。认为磨料，尤其如果与湿润剂一起使用时，可以削弱植物组织(例如叶)的表面，从而促进农杆菌细胞渗入植物组织的细胞间隙中。关于可用于本发明中的可能磨料、其粒度、浓度和可能的商业产品，参考以WO 2012/019669公开的国际专利申请并且在此引用此公开关于磨料的公开内容。

[0122] 本发明的水悬液以含有农用喷雾辅助剂。喷雾辅助剂可以是表面活性剂或润湿剂。表面活性剂和润湿剂在本发明中具有多重优点。它减少水悬液中水的表面张力且致使植物叶的蜡质表面对于农杆菌更具可透性。它还可以改善悬液的稳定性和减少悬液中磨料的沉降。不具体地限制可用于本发明方法中的表面活性剂，并且它们在WO 2012/019669的国际专利申请中公开。优选的表面活性剂是HLB值为12或更大、优选地至少13的非离子型表面活性剂。作为非离子型表面活性剂，在本发明中最优选有机硅氧烷表面活性剂，例如聚环氧烷改性的七甲基三硅氧烷。商业产品是来自GE Advanced Materials的Silwet L77TM喷雾辅助剂。

[0123] 表面活性剂如在WO 2012/019669中公开的那些可以单独或与两种或更多种表面活性剂组合使用。尤其，优选的有机硅氧烷表面活性剂可以与其他表面活性剂组合。表面活性剂在本发明水悬液中的总浓度可以通过实施比较性喷雾实验容易地测试，类似于如实施例中所做那样。然而，通常，表面活性剂的总浓度可以是所述悬液的0.005-2体积％、优选地
0.01-0.5体积％、更优选地0.025-0.2体积％。因为表面活性剂的密度一般接近于1.0g/ml，所以表面活性剂的总浓度可以定义为0.05-20g/升所述悬液，优选地0.1-5.0g、更优选地
0.25-2.0g/升所述悬液(包含磨料)。如果使用上文的有机硅氧烷表面活性剂例如聚环氧烷改性的七甲基三硅氧烷，则用于喷雾的农杆菌悬液中的有机硅氧烷表面活性剂的浓度可以是0.01-0.5体积％、优选地0.05-0.2体积％。备选地，用于喷雾的农杆菌悬液中的有机硅氧烷表面活性剂的浓度可以定义为0.1-5.0g、优选地0.5-2.0g/升所述悬液。

[0124] 为了改善水悬液的物理特性，可以添加高度分散的亚微米规格的硅酸(二氧化硅)或多孔聚合物例如脲/甲醛缩合物(PergopakTM)。尤其，在磨料的中位值粒度为0.1-30μm之间或处于上文给出的那个范围的优选子范围之一内的情况下，可以将高度分散的亚微米规格的二氧化硅添加至悬液。此处，亚微米规格的二氧化硅是具有0.01-0.5μm、优选地0.02-0.5μm、更优选地0.02-0.1μm的中位值粒度的二氧化硅。高度分散的硅酸例如Hi-SilTM233(PPG Industries)可以有助于水悬液的摩擦特性(见Jensen等人，Bull.Org.mond.Sante,Bull.Wld Hlth Org.41(1969)937-940)。这些试剂可以按1–10g/升本发明悬液的量掺入。

[0125] 农杆菌悬液的其它可能添加剂是维持用于喷雾的悬液的pH处在所需pH(一般在4.5和6.5之间、优选地在5.0和5.5之间)的缓冲物质。另外，可以添加无机可溶性盐，例如氯化钠，以调节悬液的离子强度。营养肉汤例如LB培养基也可以包含于悬液中。

[0126] 可以如下产生用于与植物接触的水悬液。在一种方法中，将含有在本发明的方法中待使用的目的双元载体的农杆菌菌株或细胞接种到培养基中并生长至高细胞浓度。更大的培养物可以用小体积的高浓度培养物接种以获得大量培养物。一般将农杆菌培育到与600nm处至少1、一般约1.5的OD值对应的细胞浓度。随后将这种高度浓缩的农杆菌悬液稀释以实现所需的细胞浓度。为了稀释高度浓缩的农杆菌悬液，使用水。水可以含有缓冲剂。水还可以含有本发明的表面活性剂。备选地，可以用水稀释这种浓缩的农杆菌悬液，并且在稀释步骤之后或期间添加任何添加剂例如表面活性剂和任选的缓冲物质。可以在稀释之前、期间或之后添加磨料。然而，优选在添加磨料期间搅拌悬液以在农杆菌悬液中均匀地分散磨料。稀释浓缩的农杆菌悬液的步骤可以在用于喷洒稀释悬液的喷雾器的喷雾罐中实施。

[0127] 所述植物、尤其所述植物上的叶随后与农杆菌细胞悬液接触以实现植物细胞的瞬时转染。如上解释，可以通过喷洒实施接触。在本发明方法中待使用的喷雾器主要取决于待喷洒的植物的数量或面积。对于待喷雾一个或少数植物，可以使用如家居和园艺中广泛使用的泵式喷雾器。这些喷雾器可以具有0.5-2升的喷雾罐体积。对于中等规模的施加，可以使用手动操作的液压喷雾器，例如手柄操作的背负式喷雾器或手动操做的压力喷雾器。然而，在本发明中实现的高转染效率使本发明完全可能转染许多植物，例如在农田上或在温室中生长的植物。为此目的，可以使用动力操作的液压喷雾器，例如配备喷杆的拖拉机载式液压喷雾器。使用直升飞机或飞机的空中施加技术也可能用于大的田块。全部这些类型的喷雾器是本领域已知的，并且例如在G.A.Matthews的书籍“Pesticide Application Methods”，第3版，Blackwell Science，2000中描述。为了确保喷雾器的喷雾罐中的均质悬液，可以在喷雾期间以规律间隔或连续振摇小尺寸或中等尺寸的喷雾器。大喷雾器例如拖拉机载式喷雾器应在喷雾箱中配备搅拌器。

[0128] 考虑待喷洒的悬液中存在农杆菌细胞和磨料，在本发明中使用的喷雾器应当产生至少具有细雾滴液滴大小的喷雾。另外，可以使用处在G.A.Matthews的“Pesticide Application Methods”，第3版，Blackwell Science，2000，第74页中所用的喷雾分类内的中等雾滴或粗雾滴。本发明中喷雾的主要目的是用悬液润湿植物组织。因此，确切的液滴大小并非关键。然而，转染效率可以通过以增加的压力向植物表面提供喷雾而进一步改善。

[0129] 在本发明的方法中，喷洒植物的至少部分。在一个重要的实施方案中，喷洒在田间土壤中生长的植物，即不在可移动盆或容器中生长的植物。不能将此类植物颠倒并浸入用于真空渗入的农杆菌悬液。喷洒植物的至少部分，例如叶。优选地，喷洒大多数的叶或整个植物。

[0130] 本发明用于瞬时转染植物或用于以目的DNA序列瞬时转染，所述目的DNA序列随后可以瞬时表达。术语“瞬时”意指不使用选择方法，所述选择方法使用例如选择剂和能够脱毒所述选择剂的选择标记基因，在未转染的细胞或植物的背景下选择出用目的DNA序列转染的细胞或植物。由此，一般不将转染的目的DNA序列稳定引入植物染色体DNA内。取而代之的是，瞬时方法在恰好转染的植物中利用转染效应。

[0131] 本发明一般用于转染多细胞植物，尤其高等植物。单子叶植物和双子叶植物均可以被转染，其中优选双子叶植物。用于本发明中的植物包括任何植物物种，优选农业和园艺上重要的作物物种。用于本发明中的常见作物植物包括苜蓿、大麦、豆、卡诺拉油菜、豇豆、棉、谷物、三叶草、莲、小扁豆、羽扇豆、粟、燕麦、豌豆、花生、稻、黑麦、草木樨、向日葵、香碗豆、大豆、高粱、黑小麦、豆薯、藜豆、野豌豆(vetch)、小麦、紫藤和坚果植物。优选用于实施本发明的植物物种包括但不限于禾本科(Gramineae)、菊科(Compositeae)、茄科(Solanaceae)和蔷薇科(Rosaceae)的代表。

[0132] 在本发明中使用的其它优选物种是来自下述属的植物：拟南芥属(Arabidopsis)、剪股颖属(Agrostis)、葱属(Allium)、金鱼草属(Antirrhinum)、芹属(Apium)、落花生属(Arachis)、天门冬属(Asparagus)、颠茄属(Atropa)、燕麦属(Avena)、簕竹属(Bambusa)、芸苔属(Brassica)、雀麦属(Bromus)、Browaalia、山茶属(Camellia)、大麻属(Cannabis)、辣椒属(Capsicum)、鹰嘴豆属(Cicer)、藜属(Chenopodium)、菊苣属(Chichorium)、柑橘属(Citrus)、咖啡属(Coffea)、薏苡属(Coix)、黄瓜属(Cucumis)、南瓜属(Curcubita)、狗牙根属(Cynodon)、鸭茅属(Dactylis)、曼陀罗属(Datura)、胡萝卜属(Daucus)、毛地黄属(Digitalis)、薯蓣属(Dioscorea)、油棕属(Elaeis)、穇属(Eleusine)、羊茅属(Festuca)、草莓属(Fragaria)、老鹳草属(Geranium)、大豆属(Glycine)、向日葵属(Helianthus)、萱草属(Heterocallis)、橡胶树属(Hevea)、大麦属(Hordeum)、天仙子属(Hyoscyamus)、番薯属(Ipomoea)、莴苣属(Lactuca)、兵豆属(Lens)、百合属(Lilium)、亚麻属(Linum)、黑麦草属(Lolium)、百脉根属(Lotus)、番茄属(Lycopersicon)、Majorana、苹果属(Malus)、芒果属(Mangifera)、木薯属(Manihot)、苜蓿属(Medicago)、龙面花属(Nemesia)、烟草属
(Nicotiana)、驴食草属(Onobrychis)、稻属(Oryza)、黍属(Panicum)、天竺葵属
(Pelargonium)、狼尾草属(Pennisetum)、碧冬茄属(Petunia)、豌豆属(Pisum)、菜豆属(Phaseolus)、梯牧草属(Phleum)、早熟禾属(Poa)、李属(Prunus)、毛茛属(Ranunculus)、萝卜属(Raphanus)、茶藨子属(Ribes)、蓖麻属(Ricinus)、悬钩子属(Rubus)、甘蔗属
(Saccharum)、Salpiglossis、黑麦属(Secale)、千里光属(Senecio)、狗尾草属(Setaria)、白芥属(Sinapis)、茄属(Solanum)、高粱属(Sorghum)、钝叶草属(Stenotaphrum)、可可属(Theobroma)、车轴草属(Trifolium)、胡卢巴属(Trigonella)、小麦属(Triticum)、野豌豆属(Vicia)、豇豆属(Vigna)、葡萄属(Vitis)、玉蜀黍属(Zea)和莪利竹族(Olyreae)、早熟禾亚科(Pharoideae)及其他。

[0133] 优选地，本发明的方法适用于双子叶植物如本塞姆氏烟草、烟草、棉、大豆、油籽油菜、椒、马铃薯或番茄。

[0134] 在一个实施方案中，本发明的方法可以用于在一株植物中或在田间生长的许多植物中产生目的蛋白。为此目的，可以在植物的所需生长状态，用包含农杆菌细胞的悬液喷洒植物，所述农杆菌细胞含有所需的双元载体。如果主要目的是实现最高的可能表达水平并随后收获植物用于获得含有高量蛋白质的植物材料，则可以使用病毒载体，因为它们通常产生最高的表达水平。

[0135] 在另一个实施方案中，本发明的方法用于在植物中产生或改变性状例如输入性状。在这个实施方案中，可能不希望目的蛋白质或RNA的过量表达以避免对植物健康的有害影响。对于此类实施方案，优选非复制型载体(在本文中也称为“转录载体”)，即缺乏被植物细胞中存在的核酸聚合酶识别的功能性复制起点的载体。本发明的另一个应用是RNA表达，例如用于RNA干扰，其中干扰信号可以在植物中从已表达信号的细胞传播到其他细胞。一个例子是，如Pooggin在Nat.Biotech.21(2003)131中所描述，在植物中对不想要的病毒DNA打靶。可以适 应于瞬时系统的 癌基因沉默的 一个例子由Es cobar等 人
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98(2001)13437-13442描述。又一个例子是通过类似于Baum等
人，Nat.Biotech.25(2007)1322-1326所描述的RNA干扰来控制鞘翅类病害昆虫，这可以通过以下方式适用于本发明的瞬时方法：用编码dsRNA从而可以表达该dsRNA的目的DNA序列瞬时转染害虫侵染的植物。适用于本发明瞬时方法的其它方法是Huang等人，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103(2006)14302-14306；Chuang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 
97(2000)4985-4990描述的那些。

[0136] 另外，本发明的方法允许在目的时间点及时改变性状，所述性状涉及调节开花时间或果实形成，例如马铃薯中的块茎形成(tuborisation)(Martinez-Garcia等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(2002)15211-15216)或利用转录因子调节类黄酮途径(Deluc等人，Plant Physiol.147(2008)2041-2053)。可以通过瞬时表达可移动性成花素蛋白FT来诱导开花(Zeevaart，Current Opinion in Plant Biology 11(2008)541-547；Corbesier等人，Science  316(2007)1030-1033)。可以使用本发明和Pandolfini等人，BMC 
Biotechnology 2(2002)描述的方法在番茄中大规模产生单性果实。本发明还应用于通过MYB转录因子改变棉纤维发育(如Lee等人，Annals of Botany 100(2007)1391-1401描述
的)或活化植物防御基因(Bergey等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(1996)12053-12058)的情况。

[0137] 本发明还提供保护田间作物植物免遭害虫影响的方法。在这种方法中，可以从一块田地或农田上生长的多株植物确定对至少一种植物的侵染。鉴于本发明方法的快速性，只有确定害虫侵染时，才需要引起对害虫有害的蛋白质或RNA的表达。因此，在不存在侵染风险的情况下，无需强烈和组成型表达害虫毒素或用于RNAi的dsRNA。在用携带相应的基于PVX的表达载体的稀释农杆菌培养物喷雾后苏云金芽孢杆菌内毒素的瞬时表达保护了本塞姆氏烟草植物不受烟草天蛾幼虫的采食损害(参见WO2012/019660的图30)。实施例

[0138] 参考实施例1：根据菌落形成单位(cfu)确定液体培养物中的农杆菌细胞浓度

[0139] 可以使用下述方案，根据菌落形成单位/ml液体悬液(cfu/ml)确定液体悬液中农杆菌细胞的浓度。在含有25mg/L卡那霉素(AppliChem，A1493)和50mg/L利福平(Carl Roth，
4163.2)的7.5ml液体LBS培养基中生长用构建体pNMD620转化的根癌农杆菌菌株ICF 320的细胞。细菌培养物在28℃培育，伴随连续振摇。在600nm波长处使用分光光度计，监测1ml培养物等分试样中以吸光度单位(AU)表示的细菌培养物的吸光度或光密度(OD600)。可以在OD600值1；1.3；1.5；1.7和1.8时，分析被估计为菌落形成单位数/毫升液体培养物(cfu/ml)的细胞浓度。为此目的，将250μl液体培养物等分试样用LBS培养基稀释，以实现25ml最终体积(稀释度1:100)。将2.5ml这种1:100稀释物与22.5ml LBS混合，以实现稀释度1:1000。类似地制备液体培养物稀释物1:100；1:1,000；1:10,000；1:100,000；1:1,000,000；1:10,
000,000和1:100,000,000。最后三个稀释物的等分试样涂布在补充有25mg/L卡那霉素和
50mg/L利福平的琼脂固化LBS培养基上(250μl细菌培养物/90mm直径平板)。对于每个稀释度，一式三份进行等分试样的铺板。在28℃温育2日后，对于每块平板计数细菌菌落。1:1,
000,000和1:10,000,000稀释物的铺板分别产生每平板数百个菌落和数打个菌落。由于稀释度1:100,000,000仅提供数个菌落/平板，所以该稀释度不用于计算细胞浓度。根据下式估计细胞浓度：cfu/ml＝4x每平板菌落数x稀释倍数。

[0140] 为了换算由600nm处吸光度量值(LB培养基中)所度量的细胞浓度和根据细胞形成单位所度量的细胞浓度，本文中使用以下关系：1.0的OD600对应于1.1x109cfu/ml。

[0141] LBS培养基(液体)

[0142] 1％大豆蛋白胨(大豆粕的木瓜蛋白酶水解物；Duchefa，S1330)

[0143] 0.5％酵母提取物(Duchefa，Y1333)

[0144] 1％氯化钠(Carl Roth，9265.2)

[0145] 溶解于水中，并且用1M NaOH(Carl Roth，6771.2)调节至pH 7.5

[0146] 为制备固体LBS培养基，向液体LBS培养基补充1.5％琼脂(Carl Roth，2266.2)。将培养基在121℃高压灭菌20分钟。

[0147] 实施例1：在下述实施例中使用的载体

[0148] 在这项研究中，我们使用基于TMV的和基于PVX的病毒载体以及基于35S CaMV启动子的标准转录载体。

[0149] 基于Marillonnet等人(2006)中描述的载体产生了具有细胞至细胞移动能力的基于TMV的载体pNMD560、pNMD062、pNMD063和pNMD064(图1A)。全部这些载体均设计用于表达作为报道基因的GFP；它们含有sGFP的编码序列的插入物，所述sGFP是来自维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)的修饰绿色荧光蛋白(GFP)(GeneBank登录号EF030489)。
pNMD560构建体按顺序含有来自拟南芥肌动蛋白2(ACT2)启动子的片段(GenBank登记号
AB026654)；TVCV的5'末端(GenBank登记号BRU03387，碱基对1–5455)和cr-TMV的片段
[GenBank登记号Z29370，碱基对5457–5677，两者一起含有16个内含子插入物]；sGFP编码序列；cr-TMV 3′非翻译区(3′NTR；GenBank登记号Z29370)和胭脂碱合酶(Nos)终止子。将整个片段克隆在双元载体的T-DNA左边界和右边界之间。

[0150] 基于pNMD560构建体产生pNMD062质粒。为此目的，通过PCR扩增以下DNA片段并利用AfeI限制性位点插入质粒骨架中，所述DNA片段包含从5’末端侧翼存在序列ctgtcgatc并且从3’末端侧翼存在序列aagatcgacag(SEQ ID NO:8)的来自根癌农杆菌LBA4404菌株章鱼碱型Ti-质粒的virG基因的编码序列和5’上游基因组区(GenBank登录号AF242881.1，碱基对160603–161600)。

[0151] pNMD063构建体与pNMD062除了N54D突变不同外，其它均是相同的。

[0152] 为了产生pNMD064构建体，通过PCR扩增以下DNA片段并利用AfeI限制性位点插入pNMD560构建体的质粒骨架中，所述DNA片段包含来自根癌农杆菌GV3101菌株胭脂碱型Ti-质粒的virG基因的含有N54D突变的编码序列和5’上游基因组区(GenBank登录号
AE007871.2，碱基对194307–193333)。

[0153] PNMD570构建体(缺乏细胞至细胞运动能力的基于TMV的载体)与pNMD560除了MP-编码序列中导致MP翻译失真的可读框移码的点突变不同之外，其它均是相同的(图1A)。

[0154] pNMD620构建体(用于GFP表达的无细胞至细胞和全身性移动能力的基于PVX的载体)按顺序含有35S CaMV启动子、RNA依赖性RNA聚合酶的编码序列、包含25kDa、12kDa和
8kDa蛋白质的三重基因区段模块、sGFP编码序列和3’非翻译区。将整个片段克隆到双元载体的T-DNA左边界和右边界之间(图1B)。

[0155] 全部转录载体均基于pICBV10(pBIN19衍生的双元载体)(Marillonnet等人，2004，2006)产生。它们含有在相同T-DNA区的右边界和左边界内部插入的两个表达盒(图1B)。在pNMD1971构建体的情况下，与右边界毗邻的表达盒按顺序包含花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、来自烟草花叶病毒的ω翻译增强子、来自大肠杆菌的β-葡糖醛酸糖苷酶的编码序列(GenBank登录号S69414)，其含有来自矮牵牛(Petunia hybrids)PSK7基因的内含子
(GenBank登录号AJ224165.1，碱基对4411-4484)，和来自根癌农杆菌胭脂碱合酶基因的终止子。第二表达盒在第一表达盒和T-DNA左边界之间插入。它按顺序含有花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，来自烟草花叶病毒的ω翻译增强子、来自番茄丛矮病毒(TBSV)的P19沉默阻抑蛋白的编码序列(GenBank登录号CAB56483.1)和来自根癌农杆菌章鱼碱合酶基因的终止子。

[0156] 基于pNMD1971载体产生pNMD2180构建体。为此目的，将pNMD1971构建体的NotI/NdeI片段替换为pNMD064构建体的相同片段，所述相同片段含有旁侧分布有5’上游基因组区域的来自根癌农杆菌GV3101菌株的胭脂碱型Ti-质粒的virGN54D基因。

[0157] 以相似的方式产生pNMD2190。将pNMD1971构建体的NotI/NdeI片段替换为pNMD063载体的相同片段，所述相同片段含有旁侧分布有5’上游基因组区域的来自根癌农杆菌LBA4404菌株的章鱼碱型Ti-质粒的virGN54D基因。

[0158] 实施例2：如果与常规使用的根癌农杆菌菌株相比，菌株CryX显示更强的本塞姆氏烟草瞬时转染

[0159] 我们测试用于瞬时转染本塞姆氏烟草植物的根癌农杆菌菌株的数目，所述根癌农杆菌菌株包括AGL1、EHA105、GV3101、ICF320、CryX、LBA4404和LBA9402。为此目的，使用无针-3 -4头注射器，将植物叶用上述7个菌株的10 和10 稀释度的OD600＝1.3农杆菌培养物渗入，所述菌株携带如图2A中所示的表达GFP的能够进行细胞至细胞运动的基于TMV的载体(TMV-
GFP，pNMD560构建体)。平行地，将叶用相同菌株的10-2和10-3稀释度的过夜农杆菌培养物渗入，所述菌株携带如图2B中所示的缺乏细胞至细胞运动能力的基于TMV的载体(TMV(fsMP)-GFP，pNMD570构建体)。

[0160] 基于荧光点的密度和GFP荧光的强度，我们证明几个菌株(例如，AGL1、EHA105和LBA9402)的高效瞬时转染，然而如果与任何其他测试的菌株相比，对于两种构建体的全部所测试稀释度的农杆菌培养物而言，CryX菌株的瞬时转染效率显著地更高。

[0161] 为了定量评价CryX菌株的瞬时转染效率，我们估计细菌悬液中在叶中渗入的细胞数目和被视为单个转染事件的、产生的GFP荧光点数目之间的比例。为此目的，使用无针头的注射器以200μl OD600＝1.3的农杆菌培养物渗入6周龄本塞姆氏烟草植物的叶，其中所述农杆菌培养物用5mM MES、pH 5.3和10mM MgCl2组成的缓冲液按稀释倍数10-5、10-6和10-7稀释。CryX、EHA105、GV3101和ICF320农杆菌细胞携带构建体pNMD560(TMV-GFP载体)。为评价细菌细胞，将用于叶渗入的细菌悬液的100μl等分试样一式三份涂布在含有50μl/l利福平和50μl/l卡那霉素的LB琼脂平板上。将平板在28℃温育2日并且此后计数cfu(菌落形成单位)数。根据我们的估计，100μl CryX、EHA105、GV3101和ICF320细菌培养物含有7.38+/-1.72、5.00+/-1.50、2.53+/-0.87和6.17+/-1.37cfu(表1)。平行地在感染后4日，对本塞姆氏烟草叶评定GFP荧光点。平均而言，对于CryX，EHA105，GV3101和ICF320菌株，每100μl 10-7稀释度的渗入农杆菌培养物分别产生7.38+/-1.72、5.00+/-1.50、2.53+/-0.87和6.17+/-
1.37个荧光点。对于CryX菌株，每个农杆菌细胞产生0.46个转染位点，并且对于全部其他测试的菌株，产生0.01个转染位点，CryX菌株比EHA105、GV3101和ICF320菌株效率高46倍。

[0162] 表1在浓缩倍数10-7的农杆菌培养物时与其他菌株相比CryX的转染效率(pNMD560构建体，感染后4日)。

[0163]

[0164] 实施例3.过量表达来自LBA4404菌株的virG基因增加CryX菌株的瞬时转染效率

[0165] 我们测试了virG基因过量表达对几个农杆菌菌株的瞬时转染效率的影响。为此目的，我们产生在其质粒骨架中携带来自GV3101或LBA4404菌株的virG基因插入的基于TMV的载体(图1A)。首先，使用携带来自GV3101和LBA404菌株的virGN54D基因的载体(分别是pNMD063和pNMD064)以及具有来自LBA4404菌株的天然virG基因序列的载体(pNMD062)，我们测试了AGL1、EHA105，ICF320和GV3101菌株。使用无针头的注射器以102、103和104倍稀释OD600＝1.3的农杆菌培养物渗入本塞姆氏烟草叶。在感染后第4日(图3A)和第6日(图3B)拍摄显示紫外线下GFP荧光的照片。基于目视评价，我们展示瞬时转染效率的菌株特异性增加。如表2中总结，来自GV3101菌株的virGN54D的过量表达增加GV3101菌株和ICF320菌株的瞬时转染效率；来自LBA4404菌株的virGN54D改进AGL1、EHA105和LBA4404菌株的瞬时转染效率。

[0166] 类似地测试CryX菌株，如图4中所显示。使用无针头的注射器用缓冲液以10-4和10-5稀释度稀释OD600＝1.3的CryX和GV3101农杆菌液体培养物渗入本塞姆氏烟草叶。在质粒骨架中含有来自GV3101和LBA404菌株的virGN54D基因的表达GFP的基于TMV的载体(分别是pNMD063和pNMD064)与不含有virG基因插入的pNMD560载体比较。图4A描述在感染后3日和4-4 -5
日时稀释度10 的GFP荧光；图4B显示在感染后4日和5日时稀释度10 的GFP荧光。我们展示CryX菌株与来自LBA4404的virGN54D基因组合时瞬时转染效率显著增加；相反，来自GV3101菌株的virGN54D基因的过量表达对CryX介导的瞬时转染具有不利影响。

[0167] 表2.virG过量表达对T-DNA转移效率的影响

[0168]农杆菌菌株 virGN54D/GV3101 virGN54D/LBA4404
AGL1 无影响 增加
GV3101 增加 无影响
ICF320 增加 无影响
EHA105 无影响 增加
LBA4404 无影响 增加

[0169] 实施例4.使用叶渗入法，CryX与virGN54D/LBA4404组合在高达107倍稀释时提供对本塞姆氏烟草的高效瞬时转染

[0170] 为了找到用于瞬时转染本塞姆氏烟草植物的CryX液体培养物的最大有效稀释度，我们用OD600＝1.3的CryX和GV3101农杆菌液体培养物进行叶的注射器渗入，所述液体培养-3 -4 -5 -6 -7物以缓冲液稀释至10 、10 、10 、10 和10 倍用于渗入。

[0171] 在我们的实验中，根癌农杆菌菌株CryX与来自LBA4404菌株的virGN54D组合提供我们迄今观察到的最有效的本塞姆氏烟草植物转染，甚至在过夜培养物的10-7浓缩倍数时产生合理数目的荧光点(图5)。与 系统中一般使用的103倍稀释相比，这允许
增加用于植物渗入的农杆菌培养物的稀释度大约100至1000倍。

[0172] 为了定量评价CryX菌株的瞬时转染效率，我们估计细菌悬液中在叶中渗入的细胞数目和被视为单个转染事件的、产生的GFP荧光点数目之间的比例。为此目的，使用无针头的注射器以200μl OD600＝1.3的农杆菌培养物渗入6周龄本塞姆氏烟草植物的叶，其中所述-7农杆菌培养物用含5mM MES、pH 5.3和10mM MgCl2的含水质缓冲液稀释至10 倍。CryX农杆菌细胞携带构建体pNMD560(TMV-GFP载体)和pNMD062(在质粒骨架中含有来自LBA4404菌株的virGN54D的TMV-GFP载体)。为评价细菌细胞，将用于叶渗入的细菌悬液的100μl等分试样一式三份涂布在含有50μl/l利福平和50μl/l卡那霉素的LB琼脂平板上。将平板在28℃温育
2日并且此后计数cfu(菌落形成单位)数。根据我们的估计，对于pNMD560和pNMD062构建体，
100μl细菌培养物分别含有14.7+/-4.4和13.9+/-3.4cfu(表3)。平行地在感染后5日，对本塞姆氏烟草叶评定GFP荧光点。平均而言，对于pNMD560和pNMD062构建体，每100μl渗入农杆菌培养物分别产生16.3+/-1.5和24.0+/-0.0个荧光点。也就是说，携带pNMD560构建体的每个农杆菌细胞产生约1.1个转染位点；对于pNMD062构建体，这个值更高，为1.7，显示转染效率的增加归因于virG基因过量表达。

[0173] 实施例5.与virGN54D/LBA4404组合的根癌农杆菌菌株CryX对大豆显示高喷洒转染效率

[0174] 使用农杆菌细胞悬液喷洒植株，我们测试了用于瞬时转染大豆植物的根癌农杆菌菌株的数目，所述根癌农杆菌菌株包括AGL1、EHA105、GV3101、ICF320、CryX和LBA4404。为此目的，将携带GUS表达载体的液体培养物生长至OD600＝1.3并用含有5mM MES，pH 5.3；10mM MgCl2和0.05％(v/v) 20的缓冲液以1:10比例稀释，用于喷洒。为测试AGL1、EHA105、CryX和LBA4404菌株，我们使用pNMD2190构建体(质粒骨架中的35S:GUS；35S:p19和virGN54D/LBA4404)。用pNMD2180载体(质粒骨架中的35S:GUS；35S:p19和virGN54D/
GV3101)测试GV3101和ICF320菌株。在喷洒后11日针对GUS活性进行叶染色。与不显示转染或显示低转染的其他测试菌株相比，CryX提供显著更高的瞬时转染率，如GUS染色所揭示(图6A)。

[0175] 组合表面活性剂和磨料处理，对于高达10-2稀释的农杆菌培养物，当使用GUS表达转录载体pNMD2190时，我们用CryX菌株实现了大豆的高效瞬时转染(图6B)。

[0176] 实施例6.与virGN54D/LBA4404组合的根癌农杆菌菌株CryX对棉显示增强的瞬时喷洒转染作用。

[0177] 使用喷洒法，我们用EHA105、GV3101、ICF320和CryX菌株测试棉的瞬时转染。为此目的，将OD600＝1.3的液体农杆菌培养物用含有5mM MES，pH 5.3；10mM MgCl2和0.25％(v/v)Silwet L-77的缓冲液以1:10比例稀释。将pNMD2180构建体(质粒骨架中的35S:GUS；35S:p19和virGN54D/GV3101)用于GV3101和ICF320菌株；将pNMD2190构建体(质粒骨架中35S:
GUS；35S:p19和virGN54D/LBA4404)用于EHA105和CryX菌株。使用pNMD1971构建体(35S:
GUS；35S:p19)作为全部菌株的对照。在喷洒后6日进行GUS染色检验。在染色后，对GV3101和ICF320菌株，发现少数蓝色点(数据未显示)。对于使用pNMD1971构建体的EHA105和CryX菌株，也显示很低的转染效率。与全部其他测试的菌株相比，与来自LBA4404菌株的virGN54D(pNMD2190)组合的CryX展示增加的瞬时转染效率(图7)。

[0178] 表3.与virGN54D/LBA4404(pNMD062构建体)组合的CryX的转染效率

[0179]

[0180] 实施例7.根癌农杆菌Chry5/KYRT1菌株的ICBGE获得物与相同菌株的肯塔基大学获得物相比显示更强的本塞姆氏烟草瞬时转染

[0181] 我们测试了从以下不同实验室接收的两个根癌农杆菌Chry5/KYRT1菌株获得物：肯塔基大学G.Collins博士实验室(Lexington，美国)、以及细胞生物学和遗传工程研究所(ICBGE，基辅，乌克兰)。为此目的，使用无针头注射器，将植物叶用浓缩倍数10-1、10-2和10-3对OD600＝1.3进行稀释的两种菌株获得物的农杆菌培养物渗入，所述菌株获得物携带如图8中所示的表达GFP的能够进行细胞至细胞运动的基于TMV的载体(TMV-GFP，pNMD560构建
体)。基于荧光点的密度和GFP荧光的强度，当与肯塔基大学获得物相比，我们对ICBGE获得物显示了更高的瞬时转染效率。

[0182] 通过引用方式在本文中完整并入2012年4月3日提交的欧洲专利申请号12002402.1的内容，包括说明书、权利要求书、附图和序列表。

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[0239] 附录：

[0240] SEQ ID NO:1:来自农杆菌LBA4404virG蛋白的氨基酸序列。N54以粗体显示。

[0241] LKHVLLVDDDVAMRHLIIEYLTIHAFKVTAVADSTQFTRVLSSATVDVVV

[0242] VDL LGREDGLEIVRNLAAKSDIPIIIISGDRLEETDKVVALELGASDFI

[0243] AKPFSIREFLARIRVALRVRPNVVRSKDRRSFCFTDWTLNLRQRRLMSEA

[0244] GGEVKLTAGEFNLLLAFLEKPRDVLSREQLLIASRVRDEEVYDRSIDVLI

[0245] LRLRRKLEADPSSPQLIKTARGAGYFFDADVQVSHGGTMAA

[0246] SEQ ID NO:2：pNMD560、pNMD062、pNMD063、pNMD064的T-DNA区域序列

[0247]cctgtggttggcacatacaaatggacgaacggataaaccttttcacgcccttttaaatatccgattattctaataaacgctcttttctcttaggtttacccgccaatatatcctgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatctaagctagcttggaattggtaccacgcgtttcgacaaaatttagaacgaacttaattatgatctcaaatacattgatacatatctcatctagatctaggttatcattatgtaagaaagttttgacgaatatggcacgacaaaatggctagactcgatgtaattggtatctcaactcaacattatacttataccaaacattagttagacaaaatttaaacaactattttttatgtatgcaagagtcagcatatgtataattgattcagaatcgttttgacgagttcggatgtagtagtagccattatttaatgtacatactaatcgtgaatagtgaatatgatgaaacattgtatcttattgtataaatatccataaacacatcatgaaagacactttctttcacggtctgaattaattatgatacaattctaatagaaaacgaattaaattacgttgaattgtatgaaatctaattgaacaagccaaccacgacgacgactaacgttgcctggattgactcggtttaagttaaccactaaaaaaacggagctgtcatgtaacacgcggatcgagcaggtcacagtcatgaagccatcaaagcaaaagaactaatccaagggctgagatgattaattagtttaaaaattagttaacacgagggaaaaggctgtctgacagccaggtcacgttatctttacctgtggtcgaaatgattcgtgtctgtcgattttaattatttttttgaaaggccgaaaataaagttgtaagagataaacccgcctatataaattcatatattttcctctccgctttgaagttttagttttattgcaacaacaacaacaaattacaataacaacaaacaaaatacaaacaacaacaacatggcacaatttcaacaaacaattgacatgcaaactctccaagccgctgcgggacgcaacagcttggtgaatgatttggcatctcgtcgcgtttacgataatgcagtcgaggagctgaatgctcgttccagacgtcccaaggtaataggaactttctggatctactttatttgctggatctcgatcttgttttctcaatttccttgagatctggaattcgtttaatttggatctgtgaacctccactaaatcttttggttttactagaatcgatctaagttgaccgatcagttagctcgattatagctaccagaatttggcttgaccttgatggagagatccatgttcatgttacctgggaaatgatttgtatatgtgaattgaaatctgaactgttgaagttagattgaatctgaacactgtcaatgttagattgaatctgaacactgtttaaggttagatgaagtttgtgtatagattcttcgaaactttaggatttgtagtgtcgtacgttgaacagaaagctatttctgattcaatcagggtttatttgactgtattgaactctttttgtgtgtttgcaggtccacttctccaaggcagtgtctacggaacagaccctgattgcaacaaacgcatatccggagttcgagatttcctttactcatacgcaatccgctgtgcactccttggccggaggccttcggtcacttgagttggagtatctcatgatgcaagttccgttcggttctctgacgtacgacatcggcggtaacttttccgcgcaccttttcaaagggcgcgattacgttcactgctgcatgcctaatctggatgtacgtgacattgctcgccatgaaggacacaaggaagctatttacagttatgtgaatcgtttgaaaaggcagcagcgtcctgtgcctgaataccagagggcagctttcaacaactacgctgagaacccgcacttcgtccattgcgacaaacctttccaacagtgtgaattgacgacagcgtatggcactgacacctacgctgtagctctccatagcatttatgatatccctgttgaggagttcggttctgcgctactcaggaagaatgtgaaaacttgtttcgcggcctttcatttccatgagaatatgcttctagattgtgatacagtcacactcgatgagattggagctacgttccagaaatcaggtaacattccttagttacctttcttttctttttccatcataagtttatagattgtacatgctttgagatttttctttgcaaacaatctcaggtgataacctgagcttcttcttccataatgagagcactctcaattacacccacagcttcagcaacatcatcaagtacgtgtgcaagacgttcttccctgctagtcaacgcttcgtgtaccacaaggagttcctggtcactagagtcaacacttggtactgcaagttcacgagagtggatacgttcactctgttccgtggtgtgtaccacaacaatgtggattgcgaagagttttacaaggctatggacgatgcgtggcactacaaaaagacgttagcaatgcttaatgccgagaggaccatcttcaaggataacgctgcgttaaacttctggttcccgaaggtgctcttgaaattggaagtcttcttttgttgtctaaacctatcaatttctttgcggaaatttatttgaagctgtagagttaaaattgagtcttttaaacttttgtaggtgagagacatggttatcgtccctctctttgacgcttctatcacaactggtaggatgtctaggagagaggttatggtgaacaaggacttcgtctacacggtcctaaatcacatcaagacctatcaagctaaggcactgacgtacgcaaacgtgctgagcttcgtggagtctattaggtctagagtgataattaacggtgtcactgccaggtaagttgttacttatgattgttttcctctctgctacatgtattttgttgttcatttctgtaagatataagaattgagttttcctctgatgatattattaggtctgaatgggacacagacaaggcaattctaggtccattagcaatgacattcttcctgatcacgaagctgggtcatgtgcaagatgaaataatcctgaaaaagttccagaagttcgacagaaccaccaatgagctgatttggacaagtctctgcgatgccctgatgggggttattccctcggtcaaggagacgcttgtgcgcggtggttttgtgaaagtagcagaacaagccttagagatcaaggttagtatcatatgaagaaatacctagtttcagttgatgaatgctattttctgacctcagttgttctcttttgagaattatttcttttctaatttgcctgatttttctattaattcattaggttcccgagctatactgtaccttcgccgaccgattggtactacagtacaagaaggcggaggagttccaatcgtgtgatctttccaaacctctagaagagtcagagaagtactacaacgcattatccgagctatcagtgcttgagaatctcgactcttttgacttagaggcgtttaagactttatgtcagcagaagaatgtggacccggatatggcagcaaaggtaaatcctggtccacacttttacgataaaaacacaagattttaaactatgaactgatcaataatcattcctaaaagaccacacttttgttttgtttctaaagtaatttttactgttataacaggtggtcgtagcaatcatgaagtcagaattgacgttgcctttcaagaaacctacagaagaggaaatctcggagtcgctaaaaccaggagaggggtcgtgtgcagagcataaggaagtgttgagcttacaaaatgatgctccgttcccgtgtgtgaaaaatctagttgaaggttccgtgccggcgtatggaatgtgtcctaagggtggtggtttcgacaaattggatgtggacattgctgatttccatctcaagagtgtagatgcagttaaaaagggaactatgatgtctgcggtgtacacagggtctatcaaagttcaacaaatgaagaactacatagattacttaagtgcgtcgctggcagctacagtctcaaacctctgcaaggtaagaggtcaaaaggtttccgcaatgatccctctttttttgtttctctagtttcaagaatttgggtatatgactaacttctgagtgttccttgatgcatatttgtgatgagacaaatgtttgttctatgttttaggtgcttagagatgttcacggcgttgacccagagtcacaggagaaatctggagtgtgggatgttaggagaggacgttggttacttaaacctaatgcgaaaagtcacgcgtggggtgtggcagaagacgccaaccacaagttggttattgtgttactcaactgggatgacggaaagccggtttgtgatgagacatggttcagggtggcggtgtcaagcgattccttgatatattcggatatgggaaaacttaagacgctcacgtcttgcagtccaaatggtgagccaccggagcctaacgccaaagtaattttggtcgatggtgttcccggttgtggaaaaacgaaggagattatcgaaaaggtaagttctgcatttggttatgctccttgcattttaggtgttcgtcgctcttccatttccatgaatagctaagattttttttctctgcattcattcttcttgcctcagttctaactgtttgtggtatttttgttttaattattgctacaggtaaacttctctgaagacttgattttagtccctgggaaggaagcttctaagatgatcatccggagggccaaccaagctggtgtgataagagcggataaggacaatgttagaacggtggattccttcttgatgcatccttctagaagggtgttt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[0248] SEQ ID NO:3：pNMD570的T-DNA区域的序列

[0249]cctgtggttggcacatacaaatggacgaacggataaaccttttcacgcccttttaaatatccgattattctaataaacgctcttttctcttaggtttacccgccaatatatcctgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatctaagctagcttggaattggtaccacgcgtttcgacaaaatttagaacgaacttaattatgatctcaaatacattgatacatatctcatctagatctaggttatcattatgtaagaaagttttgacgaatatggcacgacaaaatggctagactcgatgtaattggtatctcaactcaacattatacttataccaaacattagttagacaaaatttaaacaactattttttatgtatgcaagagtcagcatatgtataattgattcagaatcgttttgacgagttcggatgtagtagtagccattatttaatgtacatactaatcgtgaatagtgaatatgatgaaacattgtatcttattgtataaatatccataaacacatcatgaaagacactttctttcacggtctgaattaattatgatacaattctaatagaaaacgaattaaattacgttgaattgtatgaaatctaattgaacaagccaaccacgacgacgactaacgttgcctggattgactcggtttaagttaaccactaaaaaaacggagctgtcatgtaacacgcggatcgagcaggtcacagtcatgaagccatcaaagcaaaagaactaatccaagggctgagatgattaattagtttaaaaattagttaacacgagggaaaaggctgtctgacagccaggtcacgttatctttacctgtggtcgaaatgattcgtgtctgtcgattttaattatttttttgaaaggccgaaaataaagttgtaagagataaacccgcctatataaattcatatattttcctctccgctttgaagttttagttttattgcaacaacaacaacaaattacaataacaacaaacaaaatacaaacaacaacaacatggcacaatttcaacaaacaattgacatgcaaactctccaagccgctgcgggacgcaacagcttggtgaatgatttggcatctcgtcgcgtttacgataatgcagtcgaggagctgaatgctcgttccagacgtcccaaggtaataggaactttctggatctactttatttgctggatctcgatcttgttttctcaatttccttgagatctggaattcgtttaatttggatctgtgaacctccactaaatcttttggttttactagaatcgatctaagttgaccgatcagttagctcgattatagctaccagaatttggcttgaccttgatggagagatccatgttcatgttacctgggaaatgatttgtatatgtgaattgaaatctgaactgttgaagttagattgaatctgaacactgtcaatgttagattgaatctgaacactgtttaaggttagatgaagtttgtgtatagattcttcgaaactttaggatttgtagtgtcgtacgttgaacagaaagctatttctgattcaatcagggtttatttgactgtattgaactctttttgtgtgtttgcaggtccacttctccaaggcagtgtctacggaacagaccctgattgcaacaaacgcatatccggagttcgagatttcctttactcatacgcaatccgctgtgcactccttggccggaggccttcggtcacttgagttggagtatctcatgatgcaagttccgttcggttctctgacgtacgacatcggcggtaacttttccgcgcaccttttcaaagggcgcgattacgttcactgctgcatgcctaatctggatgtacgtgacattgctcgccatgaaggacacaaggaagctatttacagttatgtgaatcgtttgaaaaggcagcagcgtcctgtgcctgaataccagagggcagctttcaacaactacgctgagaacccgcacttcgtccattgcgacaaacctttccaacagtgtgaattgacgacagcgtatggcactgacacctacgctgtagctctccatagcatttatgatatccctgttgaggagttcggttctgcgctactcaggaagaatgtgaaaacttgtttcgcggcctttcatttccatgagaatatgcttctagattgtgatacagtcacactcgatgagattggagctacgttccagaaatcaggtaacattccttagttacctttcttttctttttccatcataagtttatagattgtacatgctttgagatttttctttgcaaacaatctcaggtgataacctgagcttcttcttccataatgagagcactctcaattacacccacagcttcagcaacatcatcaagtacgtgtgcaagacgttcttccctgctagtcaacgcttcgtgtaccacaaggagttcctggtcactagagtcaacacttggtactgcaagttcacgagagtggatacgttcactctgttccgtggtgtgtaccacaacaatgtggattgcgaagagttttacaaggctatggacgatgcgtggcactacaaaaagacgttagcaatgcttaatgccgagaggaccatcttcaaggataacgctgcgttaaacttctggttcccgaaggtgctcttgaaattggaagtcttcttttgttgtctaaacctatcaatttctttgcggaaatttatttgaagctgtagagttaaaattgagtcttttaaacttttgtaggtgagagacatggttatcgtccctctctttgacgcttctatcacaactggtaggatgtctaggagagaggttatggtgaacaaggacttcgtctacacggtcctaaatcacatcaagacctatcaagctaaggcactgacgtacgcaaacgtgctgagcttcgtggagtctattaggtctagagtgataattaacggtgtcactgccaggtaagttgttacttatgattgttttcctctctgctacatgtattttgttgttcatttctgtaagatataagaattgagttttcctctgatgatattattaggtctgaatgggacacagacaaggcaattctaggtccattagcaatgacattcttcctgatcacgaagctgggtcatgtgcaagatgaaataatcctgaaaaagttccagaagttcgacagaaccaccaatgagctgatttggacaagtctctgcgatgccctgatgggggttattccctcggtcaaggagacgcttgtgcgcggtggttttgtgaaagtagcagaacaagccttagagatcaaggttagtatcatatgaagaaatacctagtttcagttgatgaatgctattttctgacctcagttgttctcttttgagaattatttcttttctaatttgcctgatttttctattaattcattaggttcccgagctatactgtaccttcgccgaccgattggtactacagtacaagaaggcggaggagttccaatcgtgtgatctttccaaacctctagaagagtcagagaagtactacaacgcattatccgagctatcagtgcttgagaatctcgactcttttgacttagaggcgtttaagactttatgtcagcagaagaatgtggacccggatatggcagcaaaggtaaatcctggtccacacttttacgataaaaacacaagattttaaactatgaactgatcaataatcattcctaaaagaccacacttttgttttgtttctaaagtaatttttactgttataacaggtggtcgtagcaatcatgaagtcagaattgacgttgcctttcaagaaacctacagaagaggaaatctcggagtcgctaaaaccaggagaggggtcgtgtgcagagcataaggaagtgttgagcttacaaaatgatgctccgttcccgtgtgtgaaaaatctagttgaaggttccgtgccggcgtatggaatgtgtcctaagggtggtggtttcgacaaattggatgtggacattgctgatttccatctcaagagtgtagatgcagttaaaaagggaactatgatgtctgcggtgtacacagggtctatcaaagttcaacaaatgaagaactacatagattacttaagtgcgtcgctggcagctacagtctcaaacctctgcaaggtaagaggtcaaaaggtttccgcaatgatccctctttttttgtttctctagtttcaagaatttgggtatatgactaacttctgagtgttccttgatgcatatttgtgatgagacaaatgtttgttctatgttttaggtgcttagagatgttcacggcgttgacccagagtcacaggagaaatctggagtgtgggatgttaggagaggacgttggttacttaaacctaatgcgaaaagtcacgcgtggggtgtggcagaagacgccaaccacaagttggttattgtgttactcaactgggatgacggaaagccggtttgtgatgagacatggttcagggtggcggtgtcaagcgattccttgatatattcggatatgggaaaacttaagacgctcacgtcttgcagtccaaatggtgagccaccggagcctaacgccaaagtaattttggtcgatggtgttcccggttgtggaaaaacgaaggagattatcgaaaaggtaagttctgcatttggttatgctccttgcattttaggtgttcgtcgctcttccatttccatgaatagctaagattttttttctctgcattcattcttcttgcctcagttctaactgtttgtggtatttttgttttaattattgctacaggtaaacttctctgaagacttgattttagtccctgggaaggaagcttctaagatgatcatccggagggccaaccaagctggtgtgataagagcggataaggacaatgttagaacggtggattccttcttgatgcatccttctagaagggtgttt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[0250] SEQ ID NO:4：pNMD620的T-DNA区域的序列

[0251]cctgtggttggcacatacaaatggacgaacggataaaccttttcacgcccttttaaatatccgattattctaataaacgctcttttctcttaggtttacccgccaatatatcctgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatctaagctaggcatgcctgcaggtcaacatggtggagcacgacacgcttgtctactccaaaaatatcaaagatacagtctcagaagaccaaagggcaattgagacttttcaacaaagggtaatatccggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcactttattgtgaagatagtggaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggccatcgttgaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggagaaaactaaaccatacaccaccaacacaaccaaacccaccacgcccaattgttacacacccgcttgaaaaagaaagtttaacaaatggccaaggtgcgcgaggtttaccaatcttttacagactccaccacaaaaactctcatccaagatgaggcttatagaaacattcgccccatcatggaaaaacacaaactagctaacccttacgctcaaacggttgaagcggctaatgatctagaggggttcggcatagccaccaatccctatagcattgaattgcatacacatgcagccgctaagaccatagagaataaacttctagaggtgcttggttccatcctaccacaagaacctgttacatttatgtttcttaaacccagaaagctaaactacatgagaagaaacccgcggatcaaggacattttccaaaatgttgccattgaaccaagagacgtagccaggtaccccaaggaaacaataattgacaaactcacagagatcacaacggaaacagcatacattagtgacactctgcacttcttggatccgagctacatagtggagacattccaaaactgcccaaaattgcaaacattgtatgcgaccttagttctccccgttgaggcagcctttaaaatggaaagcactcacccgaacatatacagcctcaaatacttcggagatggtttccagtatataccaggcaaccatggtggcggggcataccatcatgaattcgctcatctacaatggctcaaagtgggaaagatcaagtggagggaccccaaggatagctttctcggacatctcaattacacgactgagcaggttgagatgcacacagtgacagtacagttgcaggaatcgttcgcggcaaaccacttgtactgcatcaggagaggagacttgctcacaccggaggtgcgcactttcggccaacctgacaggtacgtgattccaccacagatcttcctcccaaaagttcacaactgcaagaagccgattctcaagaaaactatgatgcagctcttcttgtatgttaggacagtcaaggtcgcaaaaaattgtgacatttttgccaaagtcagacaattaattaaatcatctgacttggacaaatactctgctgtggaactggtttacttagtaagctacatggagttccttgccgatttacaagctaccacctgcttctcagacacactttctggtggcttgctaacaaagacccttgcaccggtgagggcttggatacaagagaaaaagatgcagctgtttggtcttgaggactacgcgaagttagtcaaagcagttgatttccacccggtggatttttctttcaaagtggaaacttgggacttcagattccaccccttgcaagcgtggaaagccttccgaccaagggaagtgtcggatgtagaggaaatggaaagtttgttctcagatggggacctgcttgattgcttcacaagaatgccagcttatgcggtaaacgcagaggaagatttagctgcaatcaggaaaacgcccgagatggatgtcggtcaagaagttaaagagcctgcaggagacagaaatcaatactcaaaccctgcagaaactttcctcaacaagctccacaggaaacacagtagggaggtgaaacaccaggccgcaaagaaagctaaacgcctagctgaaatccaggagtcaatgagagctgaaggtgatgccgaaccaaatgaaataagcgggacgatgggggcaatacccagcaacgccgaacttcctggcacgaatgatgccagacaagaactcacactcccaaccactaaacctgtccctgcaaggtgggaagatgcttcattcacagattctagtgtggaagaggagcaggttaaactccttggaaaagaaaccgttgaaacagcgacgcaacaagtcatcgaaggacttccttggaaacactggattcctcaattaaatgctgttggattcaaggcgctggaaattcagagggataggagtggaacaatgatcatgcccatcacagaaatggtctccgggctggaaaaagaggacttccctgaaggaactccaaaagagttggcacgagaattgttcgctatgaacagaagccctgccaccatccctttggacctgcttagagccagagactacggcagtgatgtaaagaacaagagaattggtgccatcacaaagacacaggcaacgagttggggcgaatacttgacaggaaagatagaaagcttaactgagaggaaagttgcgacttgtgtcattcatggagctggaggttctggaaaaagtcatgccatccagaaggcattgagagaaattggcaagggctcggacatcactgtagtcctgccgaccaatgaactgcggctagattggagtaagaaagtgcctaacactgagccctatatgttcaagacctctgaaaaggcgttaattgggggaacaggcagcatagtcatctttgacgattactcaaaacttcctcccggttacatagaagccttagtctgtttctactctaaaatcaagctaatcattctaacaggagatagcagacaaagcgtctaccatgaaactgctgaggacgcctccatcaggcatttgggaccagcaacagagtacttctcaaaatactgccgatactatctcaatgccacacaccgcaacaagaaagatcttgcgaacatgcttggtgtctacagtgagagaacgggagtcaccgaaatcagcatgagcgccgagttcttagaaggaatcccaactttggtaccctcggatgagaagagaaagctgtacatgggcaccgggaggaatgacacgttcacatacgctggatgccaggggctaactaagccgaaggtacaaatagtgttggaccacaacacccaagtgtgtagcgcgaatgtgatgtacacggcactttctagagccaccgataggattcacttcgtgaacacaagtgcaaattcctctgccttctgggaaaagttggacagcaccccttacctcaagactttcctatcagtggtgagagaacaagcactcagggagtacgagccggcagaggcagagccaattcaagagcctgagccccagacacacatgtgtgtcgagaatgaggagtccgtgctagaagagtacaaagaggaactcttggaaaagtttgacagagagatccactctgaatcccatggtcattcaaactgtgtccaaactgaagacacaaccattcagttgttttcgcatcaacaagcaaaagatgagaccctcctctgggcgactatagatgcgcggctcaagaccagcaatcaagaaacaaacttccgagaattcctgagcaagaaggacattggggacgttctgtttttaaactaccaaaaagctatgggtttacccaaagagcgtattcctttttcccaagaggtctgggaagcttgtgcccacgaagtacaaagcaagtacctcagcaagtcaaagtgcaacttgatcaatgggactgtgagacagagcccagacttcgatgaaaataagattatggtattcctcaagtcgcagtgggtcacaaaggtggaaaaactaggtctacccaagattaagccaggtcaaaccatagcagccttttaccagcagactgtgatgctttttggaactatggctaggtacatgcgatggttcagacaggctttccagccaaaagaagtcttcataaactgtgagaccacgccagatgacatgtctgcatgggccttgaacaactggaatttcagcagacctagcttggctaatgactacacagctttcgaccagtctcaggatggagccatgttgcaatttgaggtgctcaaagccaaacaccactgcataccagaggaaatcattcaggcatacatagatattaagactaatgcacagattttcctaggcacgttatcaattatgcgcctgactggtgaaggtcccacttttgatgcaaacactgagtgcaacatagcttacacccatacaaagtttgacatcccagccggaactgctcaagtttatgcaggagacgactccgcactggactgtgttccagaagtgaagcatagtttccacaggcttgaggacaaattactcctaaagtcaaagcctgtaatcacgcagcaaaagaagggcagttggcctgagttttgtggttggctgatcacaccaaaaggggtgatgaaagacccaattaagctccatgttagcttaaaattggctgaagctaagggtgaactcaagaaatgtcaagattcctatgaaattgatctgagttatgcctatgaccacaaggactctctgcatgacttgttcgatgagaaacagtgtcaggcacacacactcacttg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[0252] SEQ ID NO:5：含有pNMD062的virG基因的质粒骨架插入

[0253]ctgtcgatcagatctggctcgcggcggacgcacgacgccggggcgagaccataggcgatctcctaaatcaatagtagctgtaacctcgaagcgtttcacttgtaacaacgattgagaatttttgtcataaaattgaaatacttggttcgcatttttgtcatccgcggtcagccgcaattctgacgaactgcccatttagctggagatgattgtacatccttcacgtgaaaatttctcaagcgctgtgaacaagggttcagattttagattgaaaggtgagccgttgaaacacgttcttcttgtcgatgacgacgtcgctatgcggcatcttattattgaataccttacgatccacgccttcaaagtgaccgcggtagccgacagcacccagttcacaagagtactctcttccgcgacggtcgatgtcgtggttgttgatctaaatttaggtcgtgaagatgggctcgagatcgttcgtaatctggcggcaaagtctgatattccaatcataattatcagtggcgaccgccttgaggagacggataaagttgttgcactcgagctaggagcaagtgattttatcgctaagccgttcagtatcagagagtttctagcacgcattcgggttgccttgcgcgtgcgccccaacgttgtccgctccaaagaccgacggtctttttgttttactgactggacacttaatctcaggcaacgtcgcttgatgtccgaagctggcggtgaggtgaaacttacggcaggtgagttcaatcttctcctcgcgtttttagagaaaccccgcgacgttctatcgcgcgagcaacttctcattgccagtcgagtacgcgacgaggaggtttatgacaggagtatagatgttctcattttgaggctgcgccgcaaacttgaggcggatccgtcaagccctcaactgataaaaacagcaagaggtgccggttatttctttgacgcggacgtgcaggtttcgcacggggggacgatggcagcctaagatcgacag

[0254] SEQ ID NO:6：含有pNMD063、pNMD2190的virG基因的质粒骨架插入

[0255]ctgtcgatcagatctggctcgcggcggacgcacgacgccggggcgagaccataggcgatctcctaaatcaatagtagctgtaacctcgaagcgtttcacttgtaacaacgattgagaatttttgtcataaaattgaaatacttggttcgcatttttgtcatccgcggtcagccgcaattctgacgaactgcccatttagctggagatgattgtacatccttcacgtgaaaatttctcaagtgctgtgaacaagggttcagattttagattgaaaggtgagccgttgaaacacgttcttcttgtcgatgacgacgtcgctatgcggcatcttattattgaataccttacgatccacgccttcaaagtgaccgcggtagccgacagcacccagttcacaagagtactctcttccgcgacggtcgatgtcgtggttgttgatctagatttaggtcgtgaagatgggctcgagatcgttcgtaatctggcggcaaagtctgatattccaatcataattatcagtggcgaccgccttgaggagacggataaagttgttgcactcgagctaggagcaagtgattttatcgctaagccgttcagtatcagagagtttctagcacgcattcgggttgccttgcgcgtgcgccccaacgttgtccgctccaaagaccgacggtctttttgttttactgactggacacttaatctcaggcaacgtcgcttgatgtccgaagctggcggtgaggtgaaacttacggcaggtgagttcaatcttctcctcgcgtttttagagaaaccccgcgacgttctatcgcgcgagcaacttctcattgccagtcgagtacgcgacgaggaggtttatgacaggagtatagatgttctcattttgaggctgcgccgcaaacttgaggcggatccgtcaagccctcaactgataaaaacagcaagaggtgccggttatttctttgacgcggacgtgcaggtttcgcacggggggacgatggcagcctaagatcgacag

[0256] SEQ ID NO:7：pNMD1971的全长核苷酸序列

[0257]ttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgacctgcaggcatgccaattccaatcccacaaaaatctgagcttaacagcacagttgctcctctcagagcagaatcgggtattcaacaccctcatatcaactactacgttgtgtataacggtccacatgccggtatatacgatgactggggttgtacaaaggcggcaacaaacggcgttcccggagttgcacacaagaaatttgccactattacagaggcaagagcagcagctgacgcgtacacaacaagtcagcaaacagacaggttgaacttcatccccaaaggagaagctcaactcaagcccaagagctttgctaaggccctaacaagcccaccaaagcaaaaagcccactggctcacgctaggaaccaaaaggcccagcagtgatccagccccaaaagagatctcctttgccccggagattacaatggacgatttcctctatctttacgatctaggaaggaagttcgaaggtgaaggtgacgacactatgttcaccactgataatgagaaggttagcctcttcaatttcagaaagaatgctgacccacagatggttagagaggcctacgcagcaggtctcatcaagacgatctacccgagtaacaatctccaggagatcaaataccttcccaagaaggttaaagatgcagtcaaaagattcaggactaattgcatcaagaacacagagaaagacatatttctcaagatcagaagtactattccagtatggacgattcaaggcttgcttcataaaccaaggcaagtaatagagattggagtctctaaaaaggtagttcctactgaatctaaggccatgcatggagtctaagattcaaatcgaggatctaacagaactcgccgtgaagactggcgaacagttcatacagagtcttttacgactcaatgacaagaagaaaatcttcgtcaacatggtggagcacgacactctggtctactccaaaaatgtcaaagatacagtctcagaagaccaaagggctattgagacttttcaacaaaggataatttcgggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttcatcgaaaggacagtagaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggctatcattcaagatctctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgacatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggacacgctcgagtataagagctctatttttacaacaattaccaacaacaacaaacaacaaacaacattacaattacatttacaattaccatggaacgagctatacaaggaaacgatgctagggaacaagcttatggtgaacgttggaatggaggatcaggaagttccacttctcccttcaaacttcctgacgaaagtccgagttggactgagtggcggctacataacgatgagacgatttcgaatcaagataatccccttggtttcaaggaaagctggggtttcgggaaagttgtatttaagagatatctcagatacgacgggacggaaacttcactgcacagagtccttggatcttggacgggagattcggttaactatgcagcatctcgatttctcggtttcgaccagatcggatgtacctatagtattcggtttcgaggagttagtgtcaccatttctggagggtcgcgaactcttcagcatctcagtgaaatggcaattcggtctaagcaagaactgctacagcttaccccagtcaaagtggaaagtgatgtatcaagaggatgccctgaaggtgttgaaaccttcgaagaagaaagcgagtaaggatcctctagagtcctgctttaatgagatatgcgagacgcctatgatcgcatgatatttgctttcaattctgttgtgcacgttgtaaaaaacctgagcatgtgtagctcagatccttaccgccggtttcggttcattctaatgaatatatcacccgttactatcgtatttttatgaataatattctccgttcaatttactgattgtaccctactacttatatgtacaatattaaaatgaaaacaatatattgtgctgaataggtttatagcgacatctatgatagagcgccacaataacaaacaattgcgttttattattacaaatccaattttaaaaaaagcggcagaaccggtcaaacctaaaagactgattacataaatcttattcaaatttcaaaagtgccccaggggctagtatctacgacacaccgagcggcgaactaataacgctcactgaagggaactccggttccccgccggcgcgcatgggtgagattccttgaagttgagtattggccgtccgctctaccgaaagttacgggcaccattcaacccggtccagcacggcggccgggtaaccgacttgctgccccgagaattatgcagcatttttttggtgtatgtgggccccaaatgaagtgcaggtcaaaccttgacagtgacgacaaatcgttgggcgggtccagggcgaattttgcgacaacatgtcgaggctcagcaggacctgcataagctcttctgtcagcgggcccactgcatccaccccagtacattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagcgtcaatttgtttacaccacaatatatcctgccaccagccagccaacagctccccgaccggcagctcggcacaaaatcaccactcgatacaggcagcccatcagtcagatcaggatctcctttgcgacgctcaccgggctggttgccctcgccgctgggctggcggccgtctatggccctgcaaacgcgccagaaacgccgtcgaagccgtgtgcgagacaccgcggccgccggcgttgtggatacctcgcggaaaacttggccctcactgacagatgaggggcggacgttgacacttgaggggccgactcacccggcgcggcgttgacagatgaggggcaggctcgatttcggccggcgacgtggagctggccagcctcgcaaatcggcgaaaacgcctgattttacgcgagtttcccacagatgatgtggacaagcctggggataagtgccctgcggtattgacacttgaggggcgcgactactgacagatgaggggcgcgatccttgacacttgaggggcagagtgctgacagatgaggggcgcacctattgacatttgaggggctgtccacaggcagaaaatccagcatttgcaagggtttccgcccgtttttcggccaccgctaacctgtcttttaacctgcttttaaaccaatatttataaaccttgtttttaaccagggctgcgccctgtgcgcgtgaccgcgcacgccgaaggggggtgcccccccttctcgaaccctcccggcccgctaacgcgggcctcccatccccccaggggctgcgcccctcggccgcgaacggcctcaccccaaaaatggcagcgctggccaattcgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatggctaaaatgagaatatcaccggaattgaaaaaactgatcgaaaaataccgctgcgtaaaagatacggaaggaatgtctcctgctaaggtatataagctggtgggagaaaatgaaaacctatatttaaaaatgacggacagccggtataaagggaccacctatgatgtggaacgggaaaaggacatgatgctatggctggaaggaaagctgcctgttccaaaggtcctgcactttgaacggcatgatggctggagcaatctgctcatgagtgaggccgatggcgtcctttgctcggaagagtatgaagatgaacaaagccctgaaaagattatcgagctgtatgcggagtgcatcaggctctttcactccatcgacatatcggattgtccctatacgaatagcttagacagccgcttagccgaattggattacttactgaataacgatctggccgatgtggattgcgaaaactgggaagaagacactccatttaaagatccgcgcgagctgtatgattttttaaagacggaaaagcccgaagaggaacttgtcttttcccacggcgacctgggagacagcaacatctttgtgaaagatggcaaagtaagtggctttattgatcttgggagaagcggcagggcggacaagtggtatgacattgccttctgcgtccggtcgatcagggaggatatcggggaagaacagtatgtcgagctattttttgacttactggggatcaagcctgattgggagaaaataaaatattatattttactggatgaattgttttagctgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctacc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