含有突变的lpdA基因的大肠杆菌及其应用 |
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| 申请号 | CN201310198769.4 | 申请日 | 2013-05-24 | 公开(公告)号 | CN104178442B | 公开(公告)日 | 2017-10-31 |
| 申请人 | 中国科学院天津工业生物技术研究所; | 发明人 | 张学礼; 朱欣娜; 陈晶; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及通过遗传工程改造大肠杆菌的领域。具体而言，本发明提供了一种含有突变的lpdA基因的大肠杆菌。本发明还涉及使用所述大肠杆菌用于生产如 乙醇 和丁二酸等化工原料的用途。本发明还提供了使用所述大肠杆菌生产乙醇和丁二酸等化工原料的方法，以及通过引入突变的lpdA基因而提高大肠杆菌中丙 酮 酸 脱氢酶活性的方法。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种重组大肠杆菌，其中所述大肠杆菌含有突变的lpdA基因，其所编码的多肽由其中在A358的位置上含有用V置换A的修饰的SEQ ID No:1所示氨基酸序列组成 |
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| 说明书全文 | 含有突变的lpdA基因的大肠杆菌及其应用发明领域 [0001] 本发明涉及通过遗传工程改造大肠杆菌的领域。具体而言，本发明提供了一种含有突变的lpdA基因的重组大肠杆菌。本发明还涉及使用所述大肠杆菌用于生产如乙醇、丁二酸、丁醇和1,3-丙二醇等化工原料的用途。本发明还提供了使用所述大肠杆菌生产乙醇和丁二酸等化工原料的方法，以及通过引入突变的lpdA基因而提高大肠杆菌中丙酮酸脱氢酶活性的方法。 [0002] 发明背景 [0004] 在微生物发酵生产中，大肠杆菌(E.coli)由于其遗传背景清楚、易操作、易调控、易培养、生长迅速等优点，被广泛用于研究以获得高产菌株。大肠杆菌在缺氧条件下，通常消耗糖或其衍生物，并发酵产生甲酸、乙酸、乳酸、丁二酸、乙醇等产物。野生型大肠杆菌生产乙醇和丁二酸等的产率通常较低。近年来的研究表明，对大肠杆菌的代谢途径中所涉及的酶进行遗传改造，可以获得相应的高产菌株。 [0005] 丙酮酸脱氢酶复合物(PDH)在大肠杆菌代谢途径中发挥重要的作用。丙酮酸脱氢酶是三个酶的复合物，催化丙酮酸不可逆氧化脱羧转化成乙酰辅酶A(acetyl-CoA)，同时将NAD+还原为NADH。乙酰辅酶A可继而被用于柠檬酸循环以进行细胞呼吸作用(cellular respiration)。丙酮酸脱氢酶复合物将糖酵解代谢途径与柠檬酸循环联系起来。丙酮酸脱羧也称作“丙酮酸脱氢反应”，因为其中也涉及了丙酮酸的氧化(Hansen et al.,1996Biochim Biophys Acta122:355–358;Bisswanger1981J Biol Chem256:815–822; Quail et al.,1994J Mol Microbiol12:95-104)。 [0006] 在微生物厌氧发酵过程中，NAD和NADH是维持氧化还原反应的重要辅因子，其中NAD是重要的电子受体，而NADH则是电子传递过程中重要的辅因子，它决定着反应过程中还原力的供给(Garrigues et al.,1997J Bacteriol179:5282–5287;Cassey et al.,1998FEMS Microbiol Lett159:325-329)。在糖酵解过程中一分子葡萄糖产生两分子的NADH，而丙酮酸脱羧过程中，一分子葡萄糖可以产生两分子的乙酰辅酶A，并且伴随四分子的NADH产生(glucose→2acetyl-CoA→4NADH)，这相对于丙酮酸转化为甲酸的过程多产生了两分子的NADH，增加了还原力的供给，所以提高丙酮酸脱羧反应中丙酮酸脱氢酶(PDH)的活力，对提高代谢过程中的还原力供给有很重要的意义。 [0007] PDH作为连接糖酵解和三羧酸循环(TCA)的重要酶，其在好氧条件下酶活较高， 但在厌氧条件下酶活很低。PDH复合物所催化生成的产物乙酰辅酶A与NADH，能够抑制丙酮酸脱氢酶复合物的作用能力。NADH是用于微生物生物合成的重要的还原力来源，但是高浓度的NADH却会抑制丙酮酸脱氢酶复合物的活性，成为代谢路径中关键的限速酶。Kim(Kim et al.,2008J Bacteriol190:3851–3858)筛选得到了PDH复合体中的二氢硫辛酰胺脱氢酶(LPD)突变株E354K(lpd101)使PDH在无氧条件下对NADH抑制的敏感性显著下降,提高了利用该途径生产乙醇的能力。Zhou(Zhou et al.,2008Biotechnol Lett30:335-342)等的研究也表明，lpd突变的引入和对aceEF基因调控提高了丙酮酸脱氢酶(PDH)的活性，提高发酵过程中菌株的生长及产量。 [0008] 为了提高大肠杆菌生产化工原料的产量和/或转化率，需要进一步对大肠杆菌的代谢途径进行改造。 [0009] 发明概述 [0010] 一方面，本发明提供了一种经工程化的重组大肠杆菌。 [0011] 在一个实施方案中，本发明提供了一种重组大肠杆菌，其中所述大肠杆菌含有突变的lpdA基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:1所示氨基酸序列如下位置的一个或多个位置上含有修饰：T81、P275和A358，对应的位置是通过与SEQ ID No.:1进行序列比对而确定的，其中在对应于T81的位置上的修饰是用I置换T，在对应于P275的位置上的修饰是用S置换P，以及在对应于A358的位置上的修饰是用V置换A。在一个优选的实施方案中，所述大肠杆菌中所述突变的lpdA基因的表达增强、和/或所述突变的lpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。 [0012] 在一个实施方案中，本发明提供了一种大肠杆菌，其中含有突变的lpdA基因，其中所述突变的lpdA基因在对应于SEQ ID No.:2所示核苷酸序列如下位置的一个或多个位置上含有突变：C242、C823和C1073，对应的位置是通过与SEQ ID No.:2进行序列比对而确定的，并且其中所述突变均是用T置换C。在一个优选的实施方案中，所述大肠杆菌中所述突变的lpdA基因的表达增强、和/或所述突变的lpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。 [0013] 在一个实施方案中，本发明提供了一种大肠杆菌，其中含有突变的lpdA基因，其中所述突变的lpdA基因所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:1所示氨基酸序列的A358的位置上含有修饰，并且在对应于A358的位置上的修饰是用V置换A。 [0014] 在一个实施方案中，本发明提供了一种大肠杆菌，其中含有突变的lpdA基因，其中所述突变的lpdA基因在对应于SEQ ID No.:2所示核苷酸序列的C1073的位置上含有突变，并且其中所述突变是用T置换C。 [0015] 在一个实施方案中，本发明提供了一种大肠杆菌，其中含有突变的lpdA基因，其中所述突变的lpdA基因所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:1所示氨基酸序列的T81、P275和A358的位置上都含有修饰，其中在对应于T81的位置上的修饰是用I置换T，在对应于P275的位置上的修饰是用S置换P，以及在对应于A358的位置上的修饰是 用V置换A。 [0016] 在一个实施方案中，本发明提供了一种大肠杆菌，其中含有突变的lpdA基因，其中所述突变的lpdA基因在对应于SEQ ID No.:2所示核苷酸序列的C242、C823和C1073的位置上都含有突变，并且其中所述突变均是用T置换C。 [0017] 在优选的实施方案中，本发明的大肠杆菌中所含有的突变的lpdA基因的活性增强。 [0018] 在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中含有突变的lpdA基因，并且所述突变的lpdA基因位于质粒中或者整合至染色体中。 [0019] 在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有如下的修饰：磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)中所涉及的基因表达的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)中所涉及的基因所编码的蛋白质活性的抑制；pflB和/或adhE基因表达的抑制、和/或pflB和/或adhE基因所编码的蛋白质活性的抑制；ldhA基因表达的抑制、和/或ldhA基因所编码的蛋白质活性的抑制；galP基因和/或外源glf基因表达的增强、和/或galP基因和/或外源glf基因所编码的蛋白质活性的增强；和pck基因表达的增强、和/或pck基因所编码的蛋白质活性的增强。 [0020] 在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)所涉及的基因表达的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)中所涉及的基因所编码的蛋白质活性的抑制，其中所述基因是选自如下的一或多种基因：编码PTSGlc系统酶I的基因ptsI、编码PTS系统酶Hpr的基因ptsH、编码PTS系统酶IIA 的基因crr和编码PTS系统酶IICBGlc的基因ptsG。 [0021] 在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有如下的修饰：pflB基因表达的抑制、和/或pflB基因所编码的蛋白质活性的抑制；ldhA基因表达的抑制、和/或ldhA基因所编码的蛋白质活性的抑制；和frdABCD基因簇表达的抑制、和/或frdABCD基因簇所编码的蛋白质活性的抑制。 [0022] 在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有如下的修饰aceEF基因簇表达的增强、和/或aceEF基因簇所编码的蛋白质活性的增强。 [0023] 在第二方面，本发明提供了一种生产化工原料的方法，其中包括培养本发明的大肠杆菌的步骤。 [0024] 在一个实施方案中，本发明提供了用于生产乙醇、丁二酸、丁醇和/或1,3-丙二醇的方法，其中包括培养本发明的大肠杆菌的步骤。 [0025] 在第三方面，本发明涉及本发明的大肠杆菌在生产化工原料中的用途。 [0026] 在一个实施方案中，本发明涉及本发明的大肠杆菌在生产乙醇、丁二酸、丁醇和/或1,3-丙二醇中的用途。 [0028] 图1:(A)lpdA基因及lpdA突变基因的PDH酶活性分析；(B)lpdA基因及lpdA突变基因受NADH/NAD抑制的分析。 [0029] 图2：使用RBS文库调控JC-007的lpdA*基因获得的突变库中随机挑选的10个克隆厌氧发酵。（A）乙醇的产量和转化率；（B）丙酮酸脱氢酶活性。 [0030] 图3：使用RBS文库调控JC-015的aceEF基因获得的突变库中随机挑选的10个克隆厌氧发酵。（A）乙醇的产量和转化率；（B）丙酮酸脱氢酶活性。 [0031] 图4：(A)野生型lpdA基因以及突变的lpdA基因(lpdA*)的核苷酸序列比对；(B)野生型以及突变的lpdA基因(lpdA*)所编码的多肽的氨基酸序列比对 [0032] 发明详述 [0034] 一方面，本发明提供了一种重组大肠杆菌，其中含有突变的lpdA基因 [0035] 如本文所用，术语“经工程化的重组大肠杆菌”、“工程化的大肠杆菌”和“重组大肠杆菌”可互换使用，均是指经过遗传改造的大肠杆菌，其中所述的遗传改造可以是，例如，基因表达的增强、基因表达的抑制、引入新的基因、引入突变的基因或者对基因进行突变等，其中可以通过本领域常规的技术手段实现基因表达的增强或基因表达的抑制，例如基因的敲除、改变基因的拷贝数、引入质粒、改变基因的启动子(例如使用强启动子或弱启动子)等。 [0036] 在一个实施方案中，本发明提供了一种重组的大肠杆菌，其中含有突变的lpdA基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:1所示氨基酸序列如下位置的一个或多个位置上含有修饰：T81、P275和A358，对应的位置是通过与SEQ ID No.:1进行序列比对而确定的。在一个优选的实施方案中，所述大肠杆菌中所述突变的lpdA基因的表达增强、和/或所述突变的lpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。 [0037] 在一个实施方案中，本发明提供了一种重组的大肠杆菌，其中含有突变的lpdA基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:1所示氨基酸序列如下位置的一个或多个位置上含有修饰：T81、P275和A358，对应的位置是通过与SEQ ID No.:1进行序列比对而确定的，并且其中在对应于T81的位置上的修饰是用I置换T，在对应于P275的位置上的修饰是用S置换P，以及在对应于A358的位置上的修饰是用V置换A。在一个优选的实施方案中，所述大肠杆菌中所述突变的lpdA基因的表达增强、和/或所述突变的lpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。 [0038] 术语“突变”具有本领域内常用的含义，是指在核苷酸序列中插入、添加、缺失、或者取代一或多个核苷酸，或者是指在多肽序列中插入、添加、缺失、或者取代一或多个氨基酸。 [0039] 在一个实施方案中，本发明提供了一种大肠杆菌，其中含有突变的lpdA基因，其中所述突变的lpdA基因在对应于SEQ ID No.:2所示核苷酸序列如下位置的一个或多个位置上含有突变：C242、C823和C1073，对应的位置是通过与SEQ ID No.:2进行序列 比对而确定的。在一个优选的实施方案中，所述大肠杆菌中所述突变的lpdA基因的表达增强、和/或所述突变的lpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。 [0040] 在一个实施方案中，本发明提供了一种大肠杆菌，其中含有突变的lpdA基因，其中所述突变的lpdA基因在对应于SEQ ID No.:2所示核苷酸序列如下位置的一个或多个位置上含有突变：C242、C823和C1073，对应的位置是通过与SEQ ID No.:2进行序列比对而确定的，并且其中所述突变均是用T置换C。在一个优选的实施方案中，所述大肠杆菌中所述突变的lpdA基因的表达增强、和/或所述突变的lpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。 [0041] lpdA基因(Genbank ACA79157.1)是编码硫辛酰胺脱氢酶(EC No:1.8.1.4)的基因。在本发明的一个实施方案中，所使用的初始大肠杆菌菌株中的野生型lpdA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.:2所示，其所编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.:1所示。在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中所包含的突变的lpdA基因含有对应于如下突变的一或多种突变：C242T、C823T、和C1073T(参见图4A)；而所述突变的lpdA基因所编码的多肽具有对应于如下突变的一或多种氨基酸置换：T81I、P275S、和A358V(参见图4B)。 [0042] 本领域技术人员会意识到不同大肠杆菌菌株的lpdA基因序列可能与SEQ ID No.:2所示lpdA基因序列不完全等同，以及不同大肠杆菌菌株的lpdA基因所编码的多肽序列可能与SEQ ID No.:1所示的多肽序列不完全等同。在本发明的某些实施方案中，所述突变的lpdA基因中的突变位于对应于SEQ ID No.:2的第C242位、第823位、和/或第1073位的位置上。在本发明的某些实施方案中，所述突变的lpdA基因所编码的多肽中的置换位于对应于SEQ ID No.:1的第81位、第275位、和/或第358位的位置上。 [0043] 在本发明中，“对应于”SEQ ID No.:1或SEQ ID No.:2中某一特定位置的位置可以通过序列比对而确定，包括如使用人工排列对比及通过使用众多可利用的排列对比程序(例如BLASTP)以及本领域技术人员已知的其它方法。通过对比多肽或核苷酸序列，本领域技术人员可以在适当的位置引入相应的突变，从而实现本发明的技术效果。另外，本领域技术人员也可以使用保守和类似的氨基酸残基来置换相应位置上的氨基酸残基，或者在lpdA基因序列中引入同义突变，而实现本发明的技术效果。 [0044] 在一个实施方案中，本发明提供了一种大肠杆菌，其中含有突变的lpdA基因，其中所述突变的lpdA基因所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:1所示氨基酸序列的A358的位置上含有修饰。在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种大肠杆菌，其中含有突变的lpdA基因，其中所述突变的lpdA基因所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:1所示氨基酸序列的A358的位置上含有修饰，并且在对应于A358的位置上的修饰是用V置换A。 [0045] 在一个实施方案中，本发明提供了一种大肠杆菌，其中含有突变的lpdA基因，其中所述突变的lpdA基因在对应于SEQ ID No.:2所示核苷酸序列的C1073的位置上含有突变。在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种大肠杆菌，其中含有突变的lpdA 基因，其中所述突变的lpdA基因在对应于SEQ ID No.:2所示核苷酸序列的C1073的位置上含有突变，并且其中所述突变是用T置换C。 [0046] 在一个实施方案中，本发明提供了一种大肠杆菌，其中含有突变的lpdA基因，其中所述突变的lpdA基因所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:1所示氨基酸序列的T81、P275和A358的位置上都含有修饰。在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种大肠杆菌，其中含有突变的lpdA基因，其中所述突变的lpdA基因所编码的多肽在对应于SEQID No.:1所示氨基酸序列的T81、P275和A358的位置上都含有修饰，并且其中在对应于T81的位置上的修饰是用I置换T，在对应于P275的位置上的修饰是用S置换P，以及在对应于A358的位置上的修饰是用V置换A。 [0047] 在一个实施方案中，本发明提供了一种大肠杆菌，其中含有突变的lpdA基因，其中所述突变的lpdA基因在对应于SEQ ID No.:2所示核苷酸序列的C242、C823和C1073的位置上都含有突变。在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种大肠杆菌，其中含有突变的lpdA基因，其中所述突变的lpdA基因在对应于SEQ ID No.:2所示核苷酸序列的C242、C823和C1073的位置上都含有突变，并且其中所述突变均是用T置换C。 [0048] 在一个优选的实施方案中，所述大肠杆菌中所述突变的lpdA基因的表达增强、和/或所述突变的lpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。 [0049] 如本文所用，术语“基因表达增强”，其具有本领域内熟知的含义，是指基因表达强度的增强，并导致基因转录后产生的mRNA数量的增加。基因表达增强可以通过如下方式实现，例如但不限于：在基因前引入强启动子、增加基因的拷贝数、或者增强mRNA的稳定性等。如本文所用，术语“基因所编码的蛋白活性增强”具有本领域内熟知的含义，是指基因转录翻译后产生的蛋白活性的增加。其可以例如通过基因表达强度的增强、增加酶在细胞中的含量、氨基酸位点的突变来实现。实现“基因的表达增强”以及“基因所编码的蛋白质的活性增强”的各种技术手段是本领域技术人员熟知的。 [0050] 在本发明中，基因表达增强可以例如通过引入强启动子来实现。在本发明的一些实施方案中，使用的强启动子例如是：Ppck*(SEQ ID No.:5)(Zhang et al.,2009b,Appl Environ Microbiol75:7807-7813)或M1-93(SEQ ID No.:6)(Lu et al.,2012,Appl Microbiol Biotechnol93:2455-2426)。 [0051] 在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中含有突变的lpdA基因，并且所述突变的lpdA基因位于质粒中或者染色体中。 [0052] 在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中含有突变的lpdA基因，并且所述突变的lpdA基因位于染色体中。 [0053] 在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中含有突变的lpdA基因，并且所述突变的lpdA基因位于质粒中。 [0054] 如本文所用，术语“质粒”具有本领域熟知的定义，其是以附加体形式存在于细胞中的非染色体DNA并且能够自主复制的DNA分子。本发明中可以使用的质粒例如有：pEASY-Blunt、pACYC184、pTrc99A、pTrc99A-M、pTrc99A-M-Kan、pKD4和pKD46 等。 [0055] 如本文所用，术语“染色体”具有本领域熟知的定义。在一些实施方案中，本发明所涉及的经修饰的基因位于染色体中。将经修饰的基因整合至染色体的技术是本领域技术人员熟知的，例如可以参见Michael R.Green和Joseph Sambrook的"Molecular Cloning:A Laboratory Manual"(Fourth Edition)。 [0056] 在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有选自如下的一或多种修饰：磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)所涉及的基因表达的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)所涉及的基因所编码的蛋白质活性的抑制；pflB和/或adhE基因表达的抑制、和/或pflB或adhE基因所编码的蛋白质活性的抑制；ldhA基因表达的抑制、和/或ldhA基因所编码的蛋白质活性的抑制；galP基因和/或外源glf基因表达的增强、和/或galP基因或外源glf基因所编码的蛋白质活性的增强；和pck基因表达的增强、和/或pck基因所编码的蛋白质活性的增强。 [0057] 在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)所涉及的基因表达的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)中所涉及的基因所编码的蛋白质活性的抑制，其中所述基因是选自如下的一或多种基因：编码PTS系统酶I的基因ptsI、编码PTS系统酶Hpr的基因ptsH、编码PTS系统酶IIAGlc的基因crr和编码PTS系统酶IICBGlc的基因ptsG。 [0058] 在本发明中，ptsI基因(GenBank No:ACA76928.1、NC_010468.1)编码一种磷酸转移酶，其被称为磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶I(EC No:2.7.3.9)。ptsH基因(GenBank No:ACA76929.1)编码磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶Hpr(EC No:2.7.1.69)。crr基因(GenBank No:ACA76927.1)编码磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶IIAGlc(EC No:2.7.1.69)。ptsG基因(GenBank No:ACA78131.1)编码磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶IICBGlc(EC No:2.7.1.69)。 [0059] 在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有选自如下的一或多种修饰：ptsI基因表达的抑制、和/或ptsI基因所编码的蛋白质的活性抑制；pflB和/或adhE基因表达的抑制、和/或pflB和/或adhE基因所编码的蛋白质活性的抑制；ldhA基因表达的抑制、和/或ldhA基因所编码的蛋白质活性的抑制；galP基因和/或外源glf基因表达的增强、和/或galP基因和/或外源glf基因所编码的蛋白质活性的增强；和pck基因表达的增强、和/或pck基因所编码的蛋白质活性的增强。 [0060] 在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有选自如下的一或多种修饰：ptsI基因表达的抑制、和/或ptsI基因所编码的蛋白质的活性抑制；pflB和/或adhE基因表达的抑制、和/或pflB和/或adhE基因所编码的蛋白质活性的抑制；ldhA基因表达的抑制、和/或ldhA基因所编码的蛋白质活性的抑制；galP基因表达的增强、和/或galP基因所编码的蛋白质活性的增强；和pck基因表达的增强、和/或pck基因所编码的蛋白质活性的增强。 [0061] 在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有选自如下的一或多种修饰：ptsI基因 表达的抑制、和/或ptsI基因所编码的蛋白质的活性抑制；pflB基因表达的抑制、和/或pflB所编码的蛋白质活性的抑制；ldhA基因表达的抑制、和/或ldhA基因所编码的蛋白质活性的抑制；galP基因表达的增强、和/或galP基因所编码的蛋白质活性的增强；和pck基因表达的增强、和/或pck基因所编码的蛋白质活性的增强。 [0062] 在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有选自如下修饰：ptsI基因表达的抑制、和/或ptsI基因所编码的蛋白质的活性抑制；pflB基因表达的抑制、和/或pflB所编码的蛋白质活性的抑制；ldhA基因表达的抑制、和/或ldhA基因所编码的蛋白质活性的抑制；galP基因表达的增强、和/或galP基因所编码的蛋白质活性的增强；和pck基因表达的增强、和/或pck基因所编码的蛋白质活性的增强。 [0063] 在本发明中，pflB基因(GenBank No:ACA78322.1)编码丙酮酸甲酸裂解酶(Pyruvate formate lyase)(EC No:2.3.1.54)。adhE基因(Genbank No:ACA78022.1)编码乙醇/乙醛脱氢酶(Alcohol/acetaldehyde dehydrogenase)(EC No:1.1.1.1,EC No: 1.2.1.10)。ldhA基因(GenBank No:ACA77176.1)编码乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A)(EC No:1.1.1.28)。galP基因(GenBank No:ACA76443.1)编码半乳糖MFS转运蛋白。glf基因(GenBank No:AAA27691.1)编码葡萄糖转运蛋白Glf(glucose facilitator protein)。pck基因(GenBank No:ACA75988.1)编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶,又称作PCK酶(EC No:4.1.1.49)。 [0064] 如本文所用，术语“基因表达的抑制”具有本领域内熟知的含义，是指基因表达强度的降低，从而导致基因转录后产生的mRNA数量的减少。基因表达的抑制可以通过如下方式实现，例如但不限于：基因的敲除、减少基因的拷贝数、改变基因的启动子(例如使用弱启动子)等。如本文所用，术语“基因所编码的蛋白质的活性抑制”具有本领域内熟知的含义，是指基因转录翻译后产生的蛋白活性的降低。其可以例如通过基因表达强度的降低、基因中核苷酸的插入或缺失、氨基酸位点的突变来实现。实现“基因表达的抑制”以及“基因所编码的蛋白质的活性抑制”的各种技术手段是本领域技术人员熟知的。 [0065] 在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有如下的修饰：frdABCD基因簇表达的抑制、和/或frdABCD基因簇所编码的蛋白质活性的抑制。 [0066] frdABCD基因簇编码富马酸还原酶(EC No:1.3.5.4),包括frdA基因(GenBank No:ACA79460.1)编码富马酸还原酶黄素蛋白亚基、frdB基因(GenBank No:ACA79461.1)编码富马酸还原酶黄素蛋白亚基、frdC基因(GenBank No:ACA79462.1)编码富马酸还原酶C亚基、和frdD基因(GenBank No:ACA79463.1)编码富马酸还原酶D亚基。 [0067] 在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有如下的一或多种修饰：pflB基因表达的抑制、和/或pflB基因所编码的蛋白质活性的抑制；ldhA基因表达的抑制、和/或ldhA基因所编码的蛋白质活性的抑制；和frdABCD基因簇表达的抑制、和/或frdABCD基因簇所编码的蛋白质活性的抑制。 [0068] 在另一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有如下修饰：pflB基因表达的抑制、 和/或pflB基因所编码的蛋白质活性的抑制；ldhA基因表达的抑制、和/或ldhA基因所编码的蛋白质活性的抑制；和frdABCD基因簇表达的抑制、和/或frdABCD基因簇所编码的蛋白质活性的抑制。 [0069] 在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有如下的修饰：aceEF基因簇表达的增强、和/或aceEF基因簇所编码的蛋白质活性的增强。 [0070] aceEF基因簇编码丙酮酸复合体E1/E2，包括aceE基因(GenBank No:ACA79159.1)编码丙酮酸脱氢酶复合体E1(EC No:1.2.4.1)和aceF基因(GenBank No:ACA79158.1)编码丙酮酸脱氢酶复合体E2。 [0072] 在第二方面，本发明提供了一种生产化工原料的方法，其中包括培养本发明的大肠杆菌的步骤。 [0073] 在一个实施方案中，本发明的方法包括培养本发明的大肠杆菌的，以及任选的分离或纯化所得的化工原料。 [0074] 本发明的方法可以用于生产各种可通过微生物发酵产生的化工原料，包括但不限于：丁二酸、乙醇、丁醇和1,3-丙二醇等。 [0076] 如本文所用，术语“种子培养”是指将用于发酵的菌种在固体培养基上活化后，再经过摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种的过程。 [0077] 如本文所用，术语“发酵培养”是指利用微生物菌种，在适宜的条件下，将培养基组分经过特定的代谢途径转化为某些特定产物的过程。 [0078] 在一个实施方案中，本发明的方法中包括将本发明的大肠杆菌厌氧发酵。 [0079] 如本文所用，术语“厌氧发酵”是指利用厌氧发酵菌株，在隔绝空气的条件下，经特定代谢途径将培养基组分转化为某些特定产物的过程。 [0080] 在一个实施方案中，本发明的方法中的培养过程不进行任何通气步骤。 [0081] 在一个实施方案中，本发明中对大肠杆菌进行培养的方法包括以下步骤： [0082] (1)将本发明的重组大肠杆菌接种于种子培养基，在适宜大肠杆菌生长的条件下培养一段时间得到种子液； [0083] (2)将种子液接种于发酵培养基，在厌氧条件下培养。 [0084] 本发明的方法中可以使用本领域中常规用于培养大肠杆菌的各种培养条件，例如培养基、培养温度、培养时间和是否摇动以及摇动速度等。本领域技术人员根据需要可以选择适当的培养条件。本发明的方法中所使用的培养条件以及发酵条件是本领域技术人员熟知的(诸葛健等，1994，工业微生物实验技术手册，中国轻工业出版社)。 [0085] 在一个实施方案中，本发明的培养条件包括但不限于：温度为30-45℃，例如30-31℃、31-32℃、32-33℃、33-34℃、34-35℃、35-36℃、36-37℃、37-38℃、38-39℃、39-40℃、40-41℃、41-42℃、42-43℃、43-44℃、或44-45℃。 [0086] 在一个实施方案中，本发明的培养条件包括但不限于：种子培养的时间为6-16小时，例如6-7小时、7-8小时、8-9小时、9-10小时、10-11小时、11-12小时、12-13小时、13-14小时、14-15小时、或15-16小时。 [0087] 在一个实施方案中，本发明的培养条件包括但不限于：发酵培养的时间为2-5天，例如2天、3天、4天、或5天。 [0088] 在一个实施方案中，本发明的培养条件包括但不限于：将本发明的重组大肠杆菌按照0.1-10%(V/V)的接种量接种于种子培养基，例如0.1%、0.5%、1%、2.5%、5%、或10%。。 [0089] 在一实施方案中，本发明的培养条件包括但不限于：将种子液按照终浓度OD550=0.05-0.5的接种量接种于发酵培养基，例如OD550为0.05-0.1、0.1-0.2、0.2-0.3、0.3-0.4或 0.4-0.5。 [0090] 在一实施方案中，可以使用常用于大肠杆菌的培养基。用于本发明的大肠杆菌的培养基可以包括合适的氮源，例如有机含氮化合物或无机含氮化合物或其混合物。在一实施方案中，所述有机含氮化合物例如选自豆饼粉、花生饼粉、牛肉膏、鱼粉、酵母膏、蛋白胨、玉米浆中的一种或任意几种的混合物，所述无机含氮化合物选自硝酸盐(如硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙)，铵盐(如磷酸铵、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵)中的一种或任意几种的混合物。在一实施方案中，用于本发明的大肠杆菌的培养基可以包括合适的碳源，例如选自葡萄糖、淀粉、淀粉水解糖、果糖、糊精、乳糖、半乳糖、木糖、蔗糖、甘油、麦芽糖、脂肪酸、乙酸、丙酮酸、和富马酸中的一种或任意几种的混合物。 [0091] 在一个实施方案中，本发明的方法中所使用的种子培养基和发酵培养基由以下成分组成(溶剂为水)： [0092] 大量元素：葡萄糖、KH2PO4、K2HPO4、(NH4)2HPO4、MgSO4·7H2O、和甜菜碱-KCl； [0093] 微量元素：FeCl3·6H2O、CoCl2·6H2O、CuCl2·2H2O、ZnCl2、Na2MoO4·2H2O、MnCl2·4H2O2、和H3BO3。 [0094] 在一个实施方案中，本发明的培养基由以下成分组成(溶剂为水)： [0095] 大量元素：葡萄糖20-120g/L，KH2PO42-5g/L、K2HPO44-8g/L、(NH4)2HPO43-5g/L、MgSO4·7H2O0.1-0.3g/L、以及甜菜碱-KCl0.1-1g/L； [0096] 微量元素：FeCl3·6H2O1-5μg/L、CoCl2·6H2O0.05-1μg/L、CuCl2·2H2O0.05-1μg/L、ZnCl20.05-1μg/L、Na2MoO4·2H2O0.05-1μg/L、MnCl2·4H2O20.1-1μg/L,H3BO30.01-0.5μg/L。 [0097] 在一个实施方案中，本发明中对大肠杆菌进行培养的具体方法如下： [0098] 将菌株厌氧发酵，包括以下步骤： [0099] (1)种子培养：将1/3-1/2体积的种子培养基置于三角瓶中，高温高压灭菌。冷却后将本发明的重组大肠杆菌按照0.1-10%(V/V)的接种量接种于种子培养基，在37℃以及摇动的条件下培养6-16小时得到种子液，用于发酵培养基接种； [0100] (2)发酵培养：将1/3-1/2体积的发酵培养基体积置于厌氧发酵罐中，将种子液按照终浓度OD550=0.05-0.5的接种量接种于发酵培养基，37℃培养2-5天，得到发酵液。 [0101] 在一个实施方案中，本发明生产化工原料的方法中还包括从发酵液中收集、提取、分离和/或纯化所得的化工原料的步骤。 [0102] 在第三方面，本发明涉及本发明的大肠杆菌在生产丁二酸中的用途。 [0103] 实施例 [0104] 本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。 [0105] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 [0106] 实施例1：菌株HX-024的构建 [0107] 以野生型大肠杆菌ATCC 8739为起始菌株，敲除乳酸脱氢酶基因ldhA，敲除丙酮酸甲酸裂解酶编码基因pflB，敲除磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶I基因ptsI，激活半乳糖MFS转运蛋白GalP，激活磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK，敲除磷酸乙酰转移酶基因pta和乙酸激酶基因ackA，激活苹果酸合成酶AceA和异柠檬酸裂解酶AceB，激活二羧酸Dcu转运蛋白DcuC，得到菌株NZ-037。 [0108] 再将NZ-037经过1080代进化后获得菌株HX021。 [0109] 从重组大肠杆菌菌株HX021出发，敲除mgsA基因(GenBank No.ACA78263.1)，获得重组大肠杆菌HX023。 [0110] HX023经过360代进化后获得菌株HX024。HX024以保藏号CGMCC 7259(2013年2月25日，分类命名：大肠埃希氏菌E.coli)保藏于CGMCC(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中科院微生物所)。具体构建过程可以参见发明人于同日提交的题目为“生产丁二酸的重组大肠杆菌及其应用”的专利申请说明书。 [0111] 实施例2：lpdA及lpdA突变基因克隆于pTrc99A-M [0112] (1)质粒pXZ163和pXZ174的构建(其中所含有的lpdA基因分别来自于E.coli ATCC 8739(Gunsalus et al.,1941,J Biol Chem 141:853-858)和菌株HX-024(CGMCC 7259)： [0113] 以E.coli ATCC 8739和HX-024的基因组DNA为模板，用引物对8739-lpdA-up-SacI/8739-lpdA-down-PstI(SEQ ID No.:7/SEQ ID No.:8)分别进行PCR扩增；用限制性内切酶SacI和PstI I(NEB,UK)在37℃酶切30分钟，用相同的限制性内切酶处理pTrc99A-M质粒(Shi et al.,2013,Metab Eng16:1-10)，用PCR纯化试剂盒清洗(Gel/PCR Extration Kit，购自BioMIGA生物技术有限公司)；克隆体系：取50ng目标片段，20ng载体pTrc99A-M片段，加入2μl 10XT4连接缓冲液(NEB公司)、1μl T4多 核苷酸激酶(NEB公司)，补充蒸馏水至20μl，37℃反应30分钟；加入1μl T4连接酶(NEB公司，400,000粘附末端单位/ml)，室温反应 2小时得到连接产物；氯化钙热转化法：取5μl连接产物加入50μl Trans1-T1感受态细胞(购自北京全式金生物技术有限公司)中，冰浴30分钟。42℃热激30秒，立即置于冰上2分钟。加入250μl LB培养基，200rpm，37℃孵育1小时。取200μl菌液涂在含有卡那霉素(终浓度为50μg/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，进行菌落PCR验证，引物为pTrc99A-F/pTrc99A-R(SEQ ID No.:17/SEQ ID No.:18)。送样测序分析，结果正确的为阳性克隆，得到质粒pXZ163和pXZ174(表3)。 [0114] (2)质粒pXZ165(含有lpdA所编码的多肽中的单突变E354K)、pXZ173(含有lpdA所编码的多肽中的单突变T81I)、pXZ178(含有lpdA所编码的多肽中的单突变P275S)和pXZ179(含有lpdA所编码的多肽中的单突变A358V)的构建： [0115] 以质粒pXZ163的DNA为模板，用引物对8739-lpdA-E354K-F/8739-lpdA-E354K-R(SEQ ID No.:9/SEQ ID No.:10)，或引物对8739-lpdA-T81I-F/8739-lpdA-T81I-R(SEQ ID No.:11/SEQ ID No.:12),或引物对8739-lpdA-P275S-F/8739-lpdA-P275S-R(SEQ ID No.:13/SEQ ID No.:14)，或引物对8739-lpdA-A358V-F/8739-lpdA-A358V-R(SEQ ID No.:15/SEQ ID No.:16)进行反向PCR扩增；分别得到大小约4kb的片段用限制性内切酶DpnI(NEB公司)在37℃处理模板30分钟，用PCR纯化试剂盒清洗(Gel/PCR Extration Kit，购自BioMIGA生物技术有限公司)；克隆体系：取30ng纯化后的PCR扩增产物，加入2μl10XT4连接缓冲液(NEB公司)、1μl T4多核苷酸激酶(NEB公司)，补充蒸馏水至20μl，37℃反应30分钟；加入1μl T4连接酶(NEB公司，400,000粘附末端单位/ml)，室温反应2小时得到连接产物；氯化钙热转化法同实施例2(1)。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为50μg/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选2-3个克隆，送样进行测序分析，正确的质粒命名为pXZ165,pXZ173，pXZ178和pXZ179(表3)。 [0116] (3)质粒pXZ180(含有lpdA所编码的多肽中的双突变P275S A358V)的构建：以质粒pXZ178(含有lpdA所编码的多肽中的单突变P275S)的DNA为模板，用引物对8739-lpdA-A358V-F/8739-lpdA-A358V-R(SEQ ID No.:15/SEQ ID No.:16)进行反向PCR扩增，分别得到大小约4kb的片段用限制性内切酶DpnI(NEB公司)在37℃处理模板30分钟，用PCR纯化试剂盒清洗(Gel/PCR Extration Kit，购自BioMIGA生物技术有限公司)；克隆体系同实施例2(2)；氯化钙热转化法同实施例2(1)。加入250μl LB培养基，200rpm，37℃孵育1小时。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为50μg/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选2-3个克隆，送样进行测序分析，正确的质粒命名为pXZ180(表3)。 [0117] 表1.本发明构建的菌株 [0118] [0119] [0120] Ppck*(SEQ ID No.:5)代表大肠杆菌pck启动子突变体(在相对于ATG起始处的-64位处G变为A)(Zhang et al.,2009a)。M1-93(SEQ ID No.:6)是先前构建的人工调控元件(Lu et al.,2012)，以大肠杆菌lacZ基因启动子诱导后的强度为1，M1-93人工调控元件的强度为它的5倍。lpdA*代表大肠杆菌LpdA三突变T81I P275S A358V。 [0121] 表2.本发明所用的引物 [0122] [0123] [0124] [0125] [0126] 表3.本发明构建的质粒 [0127] [0128] [0129] [0130] 实施例3：突变的lpdA对PDH酶活性的影响和对NADH抑制的影响 [0131] 细胞培养及诱导：将选择含有上述7个质粒(pXZ163、pXZ165、pXZ173、pXZ178、pXZ179、pXZ180和pXZ174)和对照质粒pTrc99A-M(空质粒)的单克隆，接种到3ml LB培养基中过夜培养；按1%的接种量接种到装有30ml LB的250ml三角瓶，置摇床250rpm于37℃条件下培养。OD=0.3时，加入终浓度为1mM IPTG，继续培养诱导4h。 [0132] 细胞粗酶液的准备：4℃离心收集诱导后的菌液30ml；用预冷的Tris-HCl(pH7.5)洗2次；并将菌体重悬于1.5ml的Tris-HCl(pH7.5)中。用超声细胞粉碎机(SCIENTZ-II0，宁波新芝生物科技股份有限公司)破碎细胞，超声强度为25%，时间为3min，超声过程为超声1sec，停1sec。最后，将破碎的细胞于4℃，13000rpm离心15min，去除细胞碎片。 [0133] 粗酶液总蛋白浓度的测定：粗酶液总蛋白浓度用Bio-Rad Protein Assay(伯乐生物技术有限公司)试剂盒进行测定，操作按试剂盒提供的说明书进行。 [0134] 丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase，PDH)酶活测定方法：1ml反应液中含有100mM Tris(pH7.5)，10mM MgCl2，1mM DTT，2.5mM NAD+，0.2mM TPP，0.1mM CoA，5mM丙酮酸钠盐，10μl粗酶液。测定体系在340nm下NADH吸光值的增加；消光系数为6.3mM-1cm-1。酶活单位定义为：反应1min，生成1μmol NADH所需的酶量，为一个酶活单位。 [0135] 丙酮酸脱氢酶受NADH抑制的影响：在丙酮酸脱氢酶酶活测定的反应母液中加入终浓度为0mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM、025mM、0.3mM、0.35mMNADH(相应的NADH/NAD+比值为0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.12、0.14)测定在不同NADH/NAD+比值条件下丙酮酸脱氢酶的酶活。 [0136] 酶活测定结果表明，大肠杆菌的lpdA四个单突变：E354K(pXZ165)、T81I(pXZ173)、P275S(pXZ178)、A358V(pXZ179)的丙酮酸脱氢酶酶活分别为0.17μmol/mg·min、0.085μmol/mg·min、0.20μmol/mg·min、0.27μmol/mg·min。单突变中A358V(pXZ179)酶活最高，是对照质粒pTrc99A-M酶活(0.046μmol/mg·min)的5.9倍，是野生型lpdA(pXZ163)酶活(0.13μmol/mg·min)的2.1倍。双突变P275SA358V(pXZ180)和三突变(T81I P275SA358V)(pXZ174)的酶活分别为0.22μmol/mg·min和0.24μmol/mg·min，其中，三突变的酶活是野生型lpdA(pXZ163)酶活的1.85倍。 [0137] 受高浓度NADH/NAD+的抑制分析：野生型lpdA(pXZ163)和单突变P275S(pXZ178)的+ +酶活在NADH/NAD比值为0.12时，酶活降低到0。单突变T81I(pXZ173)酶活在NADH/NAD比值为0.04时，酶活降低到0(图1)。 [0138] 当NADH/NAD+比值为0.14时，三突变T81IP275SA358V(pXZ174)的酶活最高为0.16μmol/mg·min，是NADH/NAD+比值为0时酶活的67%。当NADH/NAD+比值为0.14时，单突变A358V+ +(pXZ179)酶活为0.13μmol/mg·min，是NADH/NAD比值为0时酶活 的48%。当NADH/NAD比值为0.14时，双突变P275SA358V(pXZ180)酶活为0.08μmol/mg·min，是NADH/NAD+比值为0时酶活的36%。当NADH/NAD+比值为0.14时，其它突变的酶活均为0。 [0139] 将lpdA三突变(T81I P275SA358V)基因命名为lpdA*。 [0140] 实施例4：提高厌氧条件下丙酮酸脱氢酶活性用于发酵生产乙醇 [0141] (1)重组大肠杆菌ET-T006的构建 [0142] (1-1)构建质粒pXZ-CS，用于基因敲除、基因表达调控和外源基因整合。 [0143] 质粒构建操作步骤共四步： [0144] 第一步，以pACYC184质粒(Mok et al.,1991,Nucleic Acids Res19:2321-2323)DNA为模板，使用引物184-cat-up/184-cat-down(SEQ ID No.:19/SEQ ID No.:20)，扩增得到氯霉素抗性基因，基因片段大小为994bp，包含有氯霉素基因启动子序列，称为片段I。 [0145] 扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion5X缓冲液10μl、dNTP(每种dNTP各10mM)1μl、DNA模板20ng、引物(10μM)各2μl、Phusion High-Fidelity DNA聚合酶(2.5U/μl) 0.5μl、蒸馏水33.5μl，总体积为50μl。 [0147] 第二步，以芽孢杆菌Bacillus subtilis sp subtilis168DNA(该菌购自中国普通微生物菌种保藏中心，CGMCC No.1.1390)为模板，使用引物Bs-sacB-up/Bs-sacB-down(SEQ ID No.:21/SEQ ID No.:22)进行PCR扩增果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)，基因片段大小为1618bp，含有sacB基因启动子序列，称为片段II。扩增体系和扩增条件参考实施例4(1-1)第一步。 [0148] 第三步，将第一步得到的片段I和第二步得到的片段II分别用限制性内切酶SacI(NEB公司)在37℃酶切30分钟；PCR纯化试剂盒清洗(Gel/PCR Extration Kit，购自BioMIGA生物技术有限公司)；各取20ng片段I和片段II，加入1μl10XT4连接缓冲液(NEB公司)、1μl T4-DNA快连酶(NEB公司)，补充蒸馏水至10μl，25℃反应5分钟；以酶连片段为底物，取1μl，用引物184-cat-up/Bs-sacB-down(SEQ ID No.:19/SEQ ID No.:22)PCR扩增，扩增体系和扩增条件参考实施例4(1-1)第一步，得到含有cat-sacB连接片段III。 [0149] 第四步，将PCR获得的片段III取1μl，加入1μl pEASY-blunt simple载体(试剂盒，北京全式金生物技术有限公司)，25℃反应15分钟；氯化钙热转化法同实施例2(1)。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素(终浓度为34μg/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，进行菌落PCR验证，引物为M13-F/M13-R(SEQ ID No.:23/SEQ ID No.:24)。送样测序分析，结果正确的为阳性克隆，得到质粒pXZ-CS(表3)。 [0150] (1-2)从大肠杆菌ATCC8739出发，敲除ldhA基因(GenBank No:ACA77176.1)，获得重组大肠杆菌Suc-T102。 [0151] 从大肠杆菌ATCC8739出发，采用两步同源重组的方法敲除ldhA基因，获得重组大肠杆菌Suc-T102，共分为以下六步： [0152] 第一步，以大肠杆菌ATCC8739基因组DNA为模板，使用引物XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down(SEQ ID No.:25/SEQ ID No.:26)，扩增1753bp PCR产物，该PCR产物包含大肠杆菌ATCC8739的乳酸脱氢酶编码基因ldhA(GenBank No:ACA77176.1)及其上下游各400个左右碱基。扩增体系和扩增条件参考实施例4(1-1)第一步。 [0153] 将扩增得到的1753bp PCR产物克隆到pEASY-Blunt克隆载体(购自北京全式金生物技术有限公司)上。克隆体系同实施例4(1-1)，氯化钙热转化法同实施例2(1)。取200μl菌液涂在含有卡那霉素(终浓度为15μg/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，进行菌落PCR验证，引物为M13-F/M13-R(SEQ ID No.:23/SEQ ID No.:24)。送样测序分析，结果正确的为阳性克隆，将得到的重组质粒命名为pXZ001。 [0154] 第二步，以pXZ001质粒DNA为模板，使用引物XZ-ldhA-1/XZ-ldhA-2(SEQ ID No.:27/SEQ ID No.:28)扩增，得到4758bp的PCR产物，该PCR产物包含pEASY-Blunt载体和乳酸脱氢酶编码基因上下游各400个左右碱基。扩增体系和扩增条件参考实施例4(1-1)第一步。 [0155] 第三步，将含有氯霉素基因(cat)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)DNA片段cat-sacB连接至第二步的PCR扩增产物，具体如下： [0156] 以pXZ-CS为模板，使用引物cat-sacB-up/cat-sacB-down(SEQ ID No.:29/SEQ ID No.30)扩增，得到2618bp的PCR产物，即为含有氯霉素基因(cat)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)的DNA片段。 [0157] 连接体系为：10ng的第二步4758bp的PCR产物、30ng的cat-sacB DNA片段，2μl10XT4连接缓冲液(NEB公司)，1μl T4连接酶(NEB公司，400,000cohesive end units/ml)，补充蒸馏水至20μl。室温连接2小时。氯化钙热转化法同实施例2(1)。取200μl菌液涂在含有氯霉素(终浓度为17ug/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒(将cat-sacB DNA片段克隆到pXZ001中的质粒)进行测序验证，测序结果在上述第二步的PCR扩增产物上连接了cat-sacB DNA片段，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为pXZ002C。 [0158] 第四步，以pXZ002C质粒DNA为模板，使用引物XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down(SEQ ID No.:25/SEQ ID No.:26)扩增出3447bp DNA片段I。扩增体系和扩增条件参考实施例4(1-1)第一步。DNA片段I包含乳酸脱氢酶编码基因ldhA上游400个左右碱基、cat-sacB DNA片段、乳酸脱氢酶编码基因ldhA下游400个左右碱基。 [0159] 将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒(Datsenko and Wanner2000,Proc Natl Acad Sci USA97:6640-6645)通过氯化钙转化法转化至大肠杆菌ATCC8739，然 后将DNA片段I电转至带有pKD46的大肠杆菌ATCC8739。 [0160] 电转条件为：首先准备带有pKD46质粒的大肠杆菌ATCC8739的电转化感受态细胞(Dower et al.,1988,Nucleic Acids Res16:6127-6145)；将50μl感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片段I，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1ml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75rpm，30℃孵育2小时。取200μl菌液涂在含有氯霉素(终浓度为17ug/ml)的LB平板上，37℃过夜培养后，挑选5个单菌落进行PCR验证，使用引物XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down(SEQ ID No.:25/SEQ ID No.:26)进行验证，挑选一个正确的单菌落，命名为Suc-T101。 [0161] 第五步，将第二步得到的4758bp的PCR产物进行磷酸化处理，自连得到的质粒用于第二次同源重组；具体步骤如下：将第二步的4758bp的PCR产物首先用PCR纯化试剂盒清洗(Gel/PCR Extration Kit，购自BioMIGA生物技术有限公司)；取30ng纯化后的PCR扩增产物，加入2μl10XT4连接缓冲液(NEB公司)、1μl T4多核苷酸激酶(NEB公司)，补充蒸馏水至20μl，37℃反应30分钟；加入1μl T4连接酶(NEB公司，400,000cohesive end units/ml)，室温反应2小时得到连接产物。氯化钙热转化法同实施例2(1)。取200μl菌液涂在含有卡那霉素(终浓度为15ug/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果上述第二步的PCR扩增产物进行了自连，证明质粒构建正确，得到质粒pXZ003。 [0162] 第六步，以pXZ003质粒DNA为模板，用引物XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down(SEQ ID No.:25/SEQ ID No.:26)扩增出829bp DNA片段II。DNA片段II用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至菌株Suc-T101。 [0163] 电转条件：首先准备带有pKD46质粒的Suc-T101的电转化感受态细胞；将50μl感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片段II，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1ml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75转，30℃孵育4小时，去除pKD46质粒。将菌液转移至含有10%蔗糖的没有氯化钠的LB液体培养基(250ml烧瓶中装50ml培养基)，培养24小时后在含有6%蔗糖的没有氯化钠的LB固体培养基上划线培养。经过PCR验证，所用引物为XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down(SEQ ID No.:25/SEQ ID No.:26)，正确的菌落扩增产物为763bp的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为Suc-T102(表1)。 [0164] 敲除ldhA基因所构建的质粒见表3，使用的引物序列见表2。 [0165] (1-3)从重组大肠杆菌Suc-T102出发，使用和实施例4(1-2)相同的方法敲除pflB基因(GenBank No:ACA78322.1)，获得重组大肠杆菌Suc-T104。构建的质粒见表3，使用的引物序列见表2。其中引物的命名对应于敲除ldhA基因过程中所使用的引物的名称，仅分别将ldhA替换为pflB。 [0166] (1-4)从重组大肠杆菌Suc-T104出发，使用和实施例4(1-2)相同的方法敲除富马酸还原酶编码基因frdABCD(frdA GenBank No:ACA79460.1,frdB GenBank No:ACA79461.1,frdC GenBank No:ACA79462.1,frdD GenBank No:ACA79463.1)，得到重组大肠杆菌ET-T006。构建的质粒见表3，使用的引物序列见表2。其中引物的命名对应于敲除ldhA基因过程中所使用的引物的名称，其中XZ-frdB-up对应于XZ-ldhA-up、XZ-frdC-down对应于XZ-ldhA-down、XZ-frdC-1对应于XZ-ldhA-1，以及XZ-frdB-2对应于XZ-ldhA-2。 [0167] (2)重组大肠杆菌JC-009的构建 [0168] 从重组大肠杆菌ET-T006出发，将lpdA*整合于ackA-pta位点，获得重组菌株JC007。用人工调控元件M1-93(SEQ ID No.:6)对lpdA*进行调控，获得重组菌株JC-009。具体步骤如下： [0169] 第一步：构建整合载体pTrc99A-M-Kan。 [0170] 具体步骤如下：以pKD4质粒(Datsenko and Wanner2000,Proc Natl Acad Sci USA97:6640-6645;质粒购买于美国耶鲁大学CGSC大肠杆菌保藏中心)DNA为模板，用引物Kan-up-PacI/Kan-down-EcoRI(SEQ ID No.:39/SEQ ID No.:40)进行PCR扩增，扩增体系和扩增条件参考实施例4(1-1)第一步。得到FRT-Km的DNA片段，用限制性内切酶PacI/EcoRI(NEB公司)在37℃处理30分钟；用相同的酶和条件酶切质粒pTrc99A-M(Zhao et al2013,Met Eng doi:10.1016/j.ymben.2013.02.002;本实验室构建，其序列为SEQ ID No.:82)。用PCR纯化试剂盒清洗(Gel/PCR Extration Kit，购自BioMIGA生物技术有限公司)；纯化后的FRT-Km DNA片段和pTrc99A-M载体片段连接，克隆体系和氯化钙热转化法同实施例2(1)。 取200μl菌液涂在含有卡那霉素(终浓度50μg/ml)和氨苄霉素(终浓度为50μg/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选2-3个克隆，用引物Kan-F(SEQ ID No.:41)/pTrc99A-R(SEQ ID No.: 18)进行PCR验证，正确的质粒命名为pTrc99A-M-Kan。 [0171] 第二步，将lpdA*连接到整合型载体pTrc99AM-Kan上，获得质粒pXZ177。 [0172] 具体步骤如下：取质粒pXZ174，用限制性内切酶SacI和HindIII(NEB公司)在37℃酶切30分钟，胶回收得到大小1455bp的lpdA*片段；用相同的限制性内切酶处理pTrc99AM-Kan，用PCR纯化试剂盒清洗(Gel/PCR Extration Kit，购自BioMIGA生物技术有限公司)；lpdA*片段和pTrc99AM-Kan片段连接，克隆体系和氯化钙热转化法同实施例2(1)。取200μl菌液涂在含有卡那霉素(终浓度为50μg/ml)和氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，进行菌落PCR验证，引物为Kan-F(SEQ ID No.:41)/lpdA-R-170(SEQ ID No.:44)。测序结果证明质粒构建正确，得到质粒pXZ177。 [0173] 第三步，将lpdA*片段整合于重组大肠杆菌ET-T006菌株的ackA位点，获得重组 大肠杆菌JC-007。 [0174] 一步法整合片段的准备：以pXZ177为模板，用引物ackA-FRT-up/pta-rrnB-down(SEQ ID No.:42/SEQ ID No.:43)进行PCR扩增，获得一步法整合片段。一步法整合片段包括：ackA左同源臂50bp；FRT-km-lpdA*序列；pta右同源臂50bp。 [0175] 然后将一步法整合片段电转至带有pKD46质粒的ET-T006。电转化条件同实施例4(1-2)方法。取200μl菌液涂在含有卡那霉素(终浓度为50ug/ml)的LB平板上，37℃过夜培养后，挑选5个单菌落进行PCR验证，引物XZ-ackA-up/lpdA-R-170(SEQ ID No.:76/SEQ ID No.:44)进行PCR验证，挑选一个正确的单菌落，将其命名为JC007。 [0176] 第四步，用两步法同源重组，将人工调控元件M1-93(SEQ ID No.:6)整合于重组大肠杆菌JC-007的lpdA*前，获得重组大肠杆菌JC009。 [0177] 以pXZ-CS质粒为模板，使用引物ackA-cat-sacB-up/lpdA-cat-sacB-down(SEQ ID No.:45/SEQ ID No.:46)PCR扩增,扩增体系和扩增条件参考实施例4(1-1)第一步。得到同源重组的DNA片段I，包括ackA左同源臂50bp，cat-sacB片段和lpdA右同源臂50bp，大小约3kb。 [0178] 第一次同源重组使用和实施例4(1-2)相同的方法，用同源重组的DNA片段I将JC-007的ackA-pta基因替换为cat-sacB片段，得到菌株JC-009a。 [0179] 以重组大肠杆菌M1-93(Lu et al.,2012,Appl Microbiol Biotechnol.93:2455-2462)的基因组DNA为模板，用引物ackA-P-up/lpdA-RBS-down(SEQ ID No.:47/SEQ ID No.:48)进行PCR扩增，扩增体系和扩增条件参考实施例4(1-1)第一步。得到同源重组的DNA片段II，包括：ackA左同源臂50bp，M1-93启动子片段和lpdA右同源臂50bp，共大小约200bp。 [0180] 第二次同源重组使用和实施例4(1-2)相同的方法，用DNA片段II替换JC009a中cat-sacB；得到重组菌株，用引物AP1-up/lpdA-R-170(SEQ ID No.:56/SEQ ID No.:44)进行PCR验证。验证正确的重组菌株命名为JC009(表1)。 [0181] (3)重组大肠杆菌ET-T006和JC-009的发酵 [0182] 种子培养基和发酵培养基由以下成分组成(溶剂为水)： [0183] 大量元素：葡萄糖50g/L，KH2PO43.9g/L，K2HPO45.85g/L，(NH4)2HPO43.5g/L，MgSO4·7H2O0.37g/L，和Betaine-KCl0.15g/L； [0184] 微量元素：FeCl3·6H2O1.5μg/L，CoCl2·6H2O0.1μg/L，CuCl2·2H2O0.1μg/L，ZnCl20.1μg/L，Na2MoO4·2H2O0.1μg/L，MnCl2·4H2O0.1μg/L,H3BO30.05μg/L。 [0185] ET-T006和JC-009的厌氧发酵产乙醇实验，包括以下步骤： [0186] (a)种子培养：250ml三角瓶中种子培养基为100ml，115℃灭菌15min。冷却后将重组大肠杆菌JC009按照1%(V/V)的接种量接种于种子培养基，在37℃和100rpm的条件下培养12小时得到种子液，用于发酵培养基接种。 [0187] (b)发酵培养：500ml厌氧罐中发酵培养基体积为250ml，将种子液按照终浓度 OD550=0.1的接种量接种于发酵培养基，37℃静置培养3天，得到发酵液。发酵液为发酵罐内所有物质。培养过程没有通任何气体。 [0188] 发酵产物分析方法：使用安捷伦(Agilent-1200)高效液相色谱仪对第四天发酵液中的组分进行测定。发酵液中的葡萄糖、乙醇和有机酸浓度测定采用伯乐(Biorad)公司的Aminex HPX–87H有机酸分析柱。 [0189] 丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase，PDH)酶活测定方法：(a)细胞粗酶液的准备：4℃离心收集对数生长期的发酵液15ml；用预冷的Tris-HCl(pH7.5)洗2次；并将菌体重悬于1.5ml的Tris-HCl(pH7.5)中。用超声细胞粉碎机(SCIENTZ-II0，宁波新芝生物科技股份有限公司)破碎细胞，超声强度为25%，时间为3min，超声过程为超声1sec，停1sec。最后，将破碎的细胞于4℃，13000rpm离心15min，去除细胞碎片。(b)粗酶液总蛋白浓度的测定：粗酶液总蛋白浓度用Bio-Rad Protein Assay(伯乐生物技术有限公司)试剂盒进行测定，操作按试剂盒提供的说明书进行。(c)1ml反应液中含有100mM Tris(pH7.5)，10mM +MgCl2，1mM DTT，2.5mM NAD ，0.2mM TPP，0.1mM CoA，5mM pyruvate，10μl粗酶液。测定体系在340nm下NADH吸光值的增加；消光系数为6.3mM-1cm-1。酶活单位定义为：反应1min，生成1μmol NADH所需的酶量，为一个酶活单位。 [0190] 发酵结果如表4所示。ET-T006发酵96小时乙醇产量为5.8mM，乙醇的转化率为0.28mol/mol。丙酮酸脱氢酶的活性为0.15μmol/mg/min。 [0191] JC-009发酵96小时乙醇产量为12.8mM，乙醇的转化率为0.34mol/mol。丙酮酸脱氢酶的活性为0.33μmol/mg/min。 [0192] (4)重组大肠杆菌JC-015的构建与发酵 [0193] 从重组大肠杆菌JC-007出发，用两步法同源重组对lpdA*进行RBS文库调控。分为以下三步： [0194] 第一步同源重组使用和实施例4(1-2)相同的方法将JC-007的ackA-pta基因替换为cat-sacB片段，得到菌株JC-009a。 [0195] 第二步，以菌株JC-009的基因组DNA为模板，使用引物ackA-up-500/lpdA-RBSL-down(SEQ ID No.:49/SEQ ID No.:50)扩增，得到RBS文库片段用于第二步同源重组。电转化条件同实施例4(1-2)。得到的克隆经过用引物AP1-up/lpdA-R-170(SEQ ID No.:56/SEQ ID No.:44)进行PCR验证，挑选十个正确的单菌落。 [0196] 第三步，对这十株菌进行发酵。实验操作与实施例4(3)相同。 [0197] 结果见表4，图2。其中，第10株菌的PDH酶活最高，为0.48μmol/mg/min，将其命名为菌株JC-015。发酵96小时乙醇产量为11.5mM，乙醇的转化率为0.35mol/mol。 [0198] 通过引入lpdA*基因，并提高其表达强度，获得重组大肠杆菌JC-015。和出发菌株ET-T006相比，丙酮酸脱氢酶在厌氧条件下的活性提高了3.2倍，厌氧发酵乙醇的产量提高了2倍，乙醇转化率提高了25%。 [0199] 测序分析JC-015的lpdA*基因的RBS调控元件，并命名为RBSL10(SEQ ID No.:80)[0200] (5)重组大肠杆菌JC-018的构建与发酵 [0201] 从大肠杆菌重组菌株JC-015出发，用一步法同源重组对aceEF进行RBS文库调控。 [0202] 第一步，以重组大肠杆菌M1-93的基因组DNA为模板，使用引物aceEF-FRT-up/aceEF-RBSL-down(SEQ ID No.:57/SEQ ID No.:58)扩增用于同源重组的RBS文库调控片段。扩增体系和扩增条件参考实施例4(1-1)第一步。 [0203] 第二步，将所得DNA扩增片段电转至带有pKD46质粒的菌株JC-015。电转化条件同实施例4(1-2)，得到的克隆用引物aceEF-1/Ap1-up(SEQ ID No.:55/SEQ ID No.:56)进行PCR验证。挑选十个正确的单菌落。 [0204] 对这十株菌进行发酵。步骤和实施例4(3)相同。 [0205] 结果见表4，图3。其中，第一株菌的PDH酶活最高，为9.9μmol/mg/min，将其命名为菌株JC-018。该菌发酵96小时乙醇产量达181.1mM，乙醇转化率达1.8mol/mol(表4)。 [0206] 通过引入lpdA*基因，并提高lpdA*和aceEF基因的表达强度，获得重组大肠杆菌JC-018。和重组大肠杆菌ET-T006相比，丙酮酸脱氢酶在厌氧条件下的活性提高了66倍，厌氧发酵乙醇的产量提高了31倍，乙醇转化率提高了6.4倍。 [0207] 测序分析JC-018的aceEF基因的RBS调控元件，并命名为RBSL1(SEQ ID No.:81)。 [0208] (6)重组大肠杆菌JC-019的构建与发酵 [0209] 从重组大肠杆菌ET-T006出发，用JC-015的aceEF基因RBS文库调控中的最优调控元件RBSL1(SEQ ID No.:81)对aceEF进行调控。 [0210] 第一步，以重组大肠杆菌JC-018的基因组DNA为模板，使用引物aceEF-up-500/aceEF-1(SEQ ID No.:59/SEQ ID No.:55)扩增用于一步法同源重组的RBSL::aceEF调控片段I。扩增体系和扩增条件参考实施例4(1-1)第一步。 [0211] 第二步，将所得DNA扩增片段电转至带有pKD46质粒的菌株ET-T006。电转化条件同实施例4(1-2)。取300μl菌液涂在含有卡那霉素的LB平板上，37℃过夜培养后，用引物kan-F/aceEF-1(SEQ ID No.:41/SEQ ID No.:55)进行PCR验证。挑选正确的单菌落,命名为JC-019。 [0212] 对JC-019菌进行发酵。步骤和实施例4(3)相同。 [0213] 结果见表4。JC-019PDH酶活为7.5μmol/mg/min，该菌发酵96小时乙醇产量达121mM，乙醇转化率达1.33mol/mol(表4)。 [0214] 通过提高aceEF基因的表达强度，获得重组大肠杆菌JC-019。和重组大肠杆菌ET-T006相比，丙酮酸脱氢酶在厌氧条件下的活性提高了50倍，厌氧发酵乙醇的产量提高了21倍，乙醇转化率提高了4.8倍。 [0215] 和重组大肠杆菌JC-019相比，重组大肠杆菌JC-018引入了lpdA*基因并提高了lpdA*基因的表达强度，结果丙酮酸脱氢酶在厌氧条件下的活性提高了32%，厌氧发酵乙醇的产量提高了50%，乙醇转化率提高了35%。 [0216] 表4：重组大肠杆菌ET-T006,JC-009,JC-015,JC-018和JC-019的厌氧发酵 [0217] [0218] 实施例5：提高厌氧条件下丙酮酸脱氢酶活性用于发酵生产丁二酸 [0219] (1)重组大肠杆菌Suc-T110的构建 [0220] (1-1)从重组大肠杆菌Suc-T104出发，使用和实施例4(1)1.2相同的方法敲除ptsI基因(GenBank No:ACA76928.1)，获得重组大肠杆菌Suc-T106。构建的质粒见表3，使用的引物序列见表2，其中引物的命名对应于敲除ldhA基因过程中所使用的引物的名称，仅将ldhA替换为ptsI。 [0221] (1-2)从重组大肠杆菌Suc-T106出发，将galP基因(GenBank No:ACA76443.1)的原始调控元件替换为调控元件Ppck*，获得重组大肠杆菌Suc-T108。在本发明中，Ppck*代表大肠杆菌pck启动子突变体，也即在相对于ATG起始处的-64位处G变为A(Zhang et al.,2009b,Appl Environ Microbiol75:7807-7813)。 [0222] 共分为以下六步： [0223] 第一步，以大肠杆菌ATCC8739基因组DNA为模板，使用引物XZ-galP-P-up/XZ-galP-P-down(SEQ ID No.:64/SEQ ID No.:65)，扩增841bp扩增产物，为大肠杆菌ATCC8739的半乳糖转运蛋白编码基因galP调控元件其上下游各400个左右碱基。将扩增产物克隆到pEASY-Blunt克隆载体上。提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体pEASY-Blunt上插入了敲除半乳糖转运蛋白编码基因galP调控元件及其上下游各400个左右碱基，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为pXZ011。 [0224] 第二步，以pXZ011质粒DNA为模板，使用引物XZ-galP-P-1/XZ-galP-P-2(SEQ ID No.:66/SEQ ID No.:67)进行PCR扩增，得到4614bp扩增产物，其扩增产物包含pEASY-Blunt载体和半乳糖转运蛋白编码基因galP调控元件以及上下游各400个左右碱基。 [0225] 第三步，以pXZ-CS质粒为模板，使用引物cat-sacB-up/cat-sacB-down(SEQ ID No.:29/SEQ ID No.:30)扩增，得到2618bp的PCR产物，即为含有氯霉素基因(cat)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)的DNA片段。 [0226] 将含有氯霉素基因(cat)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)DNA片段连接至第二步的4614bp PCR扩增产物。克隆连接体系和氯化钙热转化法同实施例2(1)。取200μl菌液涂在含有氯霉素(终浓度为17μg/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒(将cat-sacB DNA片段克隆到pXZ010中的质粒)进行测序验证，测序结果在上述第二步的PCR扩增产物上连接了cat-sacB DNA片段，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为pXZ012C。 [0227] 第四步，以pXZ012C质粒DNA为模板，使用引物XZ-galP-P-up/XZ-galP-P-down(SEQ ID No.:64/SEQ ID No.:65)扩增出3303bp DNA片段I；该DNA片段I包含半乳糖转运蛋白编码基因galP调控元件上游400个左右碱基、cat-sacB DNA片段、半乳糖转运蛋白编码基因galP调控元件下游400个左右碱基。 [0228] 将DNA片段I用于第一次同源重组。首先将pKD46质粒通过氯化钙转化法转化至菌株Suc-T106，然后将DNA片段I电转至带有pKD46的菌株Suc-T106。 [0229] 电转条件同实施例4步骤(1-2)。取200μl菌液涂在含有氯霉素(终浓度为17ug/ml)的LB平板上，37℃过夜培养后，挑选5个单菌落进行PCR验证，使用引物为XZ-galP-P-up/XZ-galP-P-down(SEQ ID No.:64/SEQ ID No.:65)，得到验证正确的单菌落，将其命名为Suc-T107。 [0230] 第五步，以大肠杆菌ATCC8739基因组DNA为模板，使用引物P-pck*-up-SpeI/P-*pck-down-KpnI(SEQ ID No.:68/SEQ ID No.:69)扩增大肠杆菌ATCC8739的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK的调控元件pck，引物序列见表2。PCR产物进行SpeI(购自NEB公司)和KpnI(购自NEB公司)酶切。将其克隆到经过相同酶酶切的质粒pTrc99A(Amann et al.,1998,Gene69:301-15)表达载体上，命名为质粒pXZ602。以质粒pXZ602为模板，设计引物pck*-F/pck*-R(SEQ ID No.:70/SEQ ID No.:71)进行扩增，引物序列为见表2。扩增产物经过T4多核苷酸激酶(购自NEB公司)加磷，自连得到阳性质粒，测序验证无误后，命名为pXZ603。 [0231] 以pXZ603为模板，使用引物P-pck*-up-SpeI和P-pck*-down-KpnI(SEQ ID No.:68/SEQ ID No.:69)扩增，得到378bp磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK的突变调控元件Ppck*，与第二步得到的4614bp扩增产物连接，得到质粒pXZ013。 [0232] 用XZ-galP-P-up/XZ-galP-P-down(SEQ ID No.:64/SEQ ID No.:65)引物对以质粒pXZ013为模板进行扩增出DNA片段II。 [0233] 第六步，DNA片段II用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至Suc-T107。电转化条件同实施例4步骤(1-2)相同的方法。用引物XZ-galP-P-up/XZ-galP-P-down(SEQ ID No.:64/SEQ ID No.:65)进行PCR以及测序验证，得到1051bp为正确的单菌落，将其命名为Suc-T108(表1)。 [0234] 将半乳糖转运蛋白编码基因galP调控元件置换成Ppck*所构建的质粒见表3，使用的引物序列见表2。 [0235] (1-3)从重组大肠杆菌Suc-T108出发，将pck基因(GenBank No:ACA75988.1)的原始调控元件替换为调控元件Ppck*，获得重组大肠杆菌Suc-T110 [0236] 具体如下： [0237] 第一步同源重组：以pXZ-CS为模板，使用引物pck-cat-sacB-up和pck-cat-sacB-down(SEQ ID No.:72/SEQ ID No.:73)扩增DNA片段I，用于第一次同源重组。引物序列见表2；得到2717bp DNA片段I，将所得DNA扩增片段I电转至带有pKD46质粒的重组菌Suc-T108，筛选氨苄青霉素与氯霉素抗性的菌落，得到中间重组菌； [0238] 第二步同源重组：以pXZ603质粒为模板，使用引物P-pck*-up-SpeI/P-pck*-down-KpnI(SEQ ID No.:68/SEQ ID No.:69)扩增(引物序列见表2)，得到378bp人工调控元件Ppck*；将378bp人工调控元件Ppck*电转入整合了片段I的中间重组菌，得到重组菌1。重组菌1PCR验证的引物pck-YZ-up/pck-YZ-down(SEQ ID No.:74/SEQ ID No.:75)，得到676bp且测序正确的单菌落，将其命名为菌株Suc-T110。 [0239] (2)重组大肠杆菌NZ-038的构建 [0240] 从Suc-T110出发，将lpdA*整合于ackA位点，得到重组大肠杆菌NZ-038b。再用人工调控元件M1-93(SEQ ID No.:6)对lpdA*的表达进行调控，得到重组大肠杆菌NZ-038；操作步骤与实施例4(2)相同。引物序列见表2。 [0241] (3)重组大肠杆菌NZ-035的构建 [0242] 从重组大肠杆菌Suc-T110出发，使用和实施例4(1-2)相同的方法敲除乙酰转移酶编码基因pta GenBank No:ACA77021.1)和乙酸激酶编码基因ackA(GenBank No:ACA77022.1)，获得重组大肠杆菌NZ-035。构建的质粒见表3，使用的引物序列见表2，其中扩增ackA-pta基因片段引物的命名对应于扩增ldhA基因过程中所使用的引物的名称，仅分别将ldhA替换为ackA或者pta。以质粒pXZ-023为DNA模板，反向PCR扩增引物为XZ-ackA-2/XZ-pta-2(SEQ ID No.:78/(SEQ ID No.:79)。 [0243] (4)重组大肠杆菌NZ-041的构建 [0244] 以NZ-038出发，用两步法同源重组，将aecEF的原始调控元件替换为人工调控元件M1-93(SEQ ID No.:6)，获得重组大肠杆菌NZ-041。操作步骤与实施例4(2)第四步lpdA*固定强度调控。所用引物见表2，其中引物的命名对应lpdA*基因固定强度调控过程中所使用的引物名称，仅分别将ack或lpdA替换为aceEF。 [0245] (5)重组大肠杆菌NZ-099的构建 [0246] 从重组大肠杆菌Suc-T110出发，使用和实施例4(2)相同的方法将lpdA*基因整合 ackA位点后，用lpdA*基因文库中的最优调控元件RBSL10(SEQ ID No.:x)对lpdA*进行调控。其中用于第二步同源重组的调控元件片段RBSL10-lpdA*按以下方式获得：以JC-015的基因组DNA为模板，用引物ackA-up-500/lpdA-R-170(SEQ ID No.:49/SEQ ID No.:44)PCR扩增得到，最终得到重组大肠杆菌NZ-099。引物序列见表2。 [0247] (6)重组大肠杆菌NZ-098的构建 [0248] 从重组大肠杆菌Suc-T110出发，使用和实施例4(6)相同的方法用aceEF基因RBS文库中的最优调控元件RBSL1对aceEF进行调控，获得重组大肠杆菌NZ-098。引物序列见表2。 [0249] (7)重组大肠杆菌NZ-100的构建 [0250] 从重组大肠杆菌NZ-099出发，使用和实施例4(6)相同的方法用aceEF基因RBS文库中的最优调控元件RBSL1对aceEF进行调控，获得重组大肠杆菌NZ-100。引物序列见表2。 [0251] (8)重组大肠杆菌Suc-T110,NZ-035,NZ-038,NZ-041，NZ-098，NZ-099，NZ-100的发酵 [0252] 种子培养基由以下成分组成(溶剂为水)： [0253] 大量元素：葡萄糖20g/L，KH2PO43.5g/L，K2HPO46.55g/L，(NH4)2HPO43.5g/L，MgSO4·7H2O0.12g/L和Betaine-KCl0.15g/L； [0254] 微量元素：FeCl3·6H2O1.5μg/L，CoCl2·6H2O0.1μg/L，CuCl2·2H2O0.1μg/L，ZnCl20.1μg/L，Na2MoO4·2H2O0.1μg/L，MnCl2·4H2O20.2μg/L,H3BO30.05μg/L。 [0255] 发酵培养基大部分和种子培养基相同，区别是葡萄糖浓度为50g/L、另外还加入了100mM KHCO3。以Suc-T110,NZ-035,NZ-038,NZ-041和NZ-098，NZ-099，NZ-100厌氧发酵，包括以下步骤： [0256] (a)种子培养：250ml三角瓶中种子培养基为100ml，115℃灭菌15min。冷却后将重组大肠杆菌Suc-T110,NZ-035,NZ-038,NZ-041，NZ-098，NZ-099，NZ-100按照1%(V/V)的接种量接种于种子培养基，在37℃和100rpm的条件下培养12小时得到种子液，用于发酵培养基接种。 [0257] (b)发酵培养：500ml厌氧罐中发酵培养基体积为250ml，将种子液按照终浓度OD550=0.1的接种量接种于发酵培养基，37℃，150rpm，发酵4天，得到发酵液。中和剂为2.4M K2CO3和1.2M KOH。发酵液为发酵罐内所有物质。培养过程没有通任何气体。 [0258] 分析方法：使用安捷伦(Agilent-1200)高效液相色谱仪对第4天发酵液中的组分进行测定。发酵液中的葡萄糖和有机酸浓度测定采用伯乐(Biorad)公司的Aminex HPX–87H有机酸分析柱。 [0259] 结果见表5。Suc-T110发酵96小时后，丁二酸产量达280mM，产率达1.12mol/mol；NZ-035发酵96小时后，丁二酸产量达286mM，产率达1.16mol/mol。 [0260] 以Suc-T110为出发菌株，通过引入lpdA*基因，并提高lpdA*基因的表达强度，获得重组大肠杆菌NZ-099。发酵96小时后，丁二酸产量达345mM，产率达1.42mol/mol；和NZ-035相比，丙酮酸脱氢酶在厌氧条件下的活性提高了20倍，丁二酸产量提高了21%，丁二酸转化率提高了22%。 [0261] 以Suc-T110为出发菌株，通过提高aceEF基因的表达强度，获得重组大肠杆菌NZ-098。发酵96小时后，丁二酸产量达302mM，产率达1.23mol/mol；和Suc-T110相比，丙酮酸脱氢酶在厌氧条件下的活性提高了600倍，丁二酸产量提高了8%，丁二酸转化率提高了10%。 [0262] 以Suc-T110为出发菌株，通过引入lpdA*基因，并提高lpdA*和aceEF基因的表达强度，获得重组大肠杆菌NZ-100。发酵96小时后，丁二酸产量达353mM，产率达1.45mol/mol；和NZ-035相比，丙酮酸脱氢酶在厌氧条件下的活性提高了580倍，丁二酸产量提高了23%，丁二酸转化率提高了25%。 [0263] 表5：重组大肠杆菌Suc-T110,NZ-035,NZ-038,NZ-041,NZ-098,NZ-099和NZ-100发酵生产丁二酸 [0264] [0265] 参考文献： [0266] Cassey B,Guest JR,Attwood MM(1998)Environmental control of pyruvate dehydrogenase comlex expression in Escherichia coli.FEMS Microbiol Lett159:325-329. 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