Myomegalin变体8及其应用 |
|||||||
| 申请号 | CN201180055306.1 | 申请日 | 2011-11-15 | 公开(公告)号 | CN103370338B | 公开(公告)日 | 2017-12-26 |
| 申请人 | 香港科技大学; | 发明人 | 王喆; 齐众; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供了一种新的myomegalin同工型——myomegalin变体8(MMG8)。这个myomegalin变体8调节微管在高尔基体上的组织、 蛋白质 修饰、分泌和运输以及 细胞增殖 。本发明还提供了编码myomegalin同工型的核酸分子，以及包含这些核酸分子的载体与宿主细胞。此外，提供了包含本发明的myomegalin同工型的融合构建体（construct），以及与本发明的myomegalin同工型特异性结合的 抗体 。本发明进一步提供了myomegalin同工型作为诊断 生物 标记物以及作为用于筛选 疾病 治疗 手段的靶点的用途，所述疾病例如癌症、糖尿病和溶酶体贮积症。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种分离的或重组制备的myomegalin同工型在制备用于治疗与LAMP-1相关的溶酶体贮积症的药物中的应用，所述myomegalin同工型为Myomegalin变体8，其由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列构成， |
||||||
| 说明书全文 | Myomegalin变体8及其应用[0001] 与相关申请的交叉引用 [0003] 相关背景 [0005] 微管细胞骨架在高尔基体的组织、定位以及功能等方面具有重要的作用(参见文献“Rios and Bornens,Curr.Opin.Cell Biol.15:60-66(2003)”；“Sutterlin and Colanzi,J.Cell Biol.188621-628(2010)”；“Lippincott-Schwartz,Curr.Opin.Cell Biol.10:52-59(1998)”)。微管的解聚导致严重的高尔基体缺陷，比如从内质网（ER）到高尔基体运输的阻断和高尔基体的破裂(参见文献“Cole et al.,Mol.Biol.Cell.7:631-650 (1996)”；“Miller et al.,Nat.Cell Biol.11:1069-1080(2009)”)。在细胞有丝分裂过程中，高尔基体经历解体和重新组装。在此重新组装的过程中，来自高尔基体和中心体的微管促进高尔基体由高尔基体微囊堆（ministack）形成连续的带状结构，并定位于细胞中心(参见文献“Miller et al.,Nat.Cell Biol.11:1069-1080(2009)”)。 [0006] 高尔基体为主要的微管组织中心(参见文献“Chabin-Brion et al.,Mol.Biol.Cell.12:2047-2060(2001)”；“Efimov et al.,Dev.Cell.12:917-930(2007)”； “Miller et al.,Nat.Cell Biol.11:1069-1080(2009)”；“Rivero et al.,EMBO J.28: 1016-1028(2009)”)。在人类中，如在视网膜色素上皮细胞RPE1中所观察到的那样，几乎有一半细胞微 管源于高尔基体(参见文献“Efimov et al.,Dev.Cell.12:917-930(2007)”)。 高尔基体带状物的组装、定向运输和细胞迁移也需要与高尔基体有关的微管(参见文献 “Miller et al.,Nat.Cell Biol.11:1069-1080(2009)”；“Rivero et al.,EMBO J.28: 1016-1028(2009)”)。在高尔基体上的微管成核不需要中心体；而是依赖于γ-微管蛋白(参见文献“Efimov et al.,Dev.Cell.12:917-930(2007)”)，其为主要的微管成核剂，以γ-微管蛋白复合物的形式存在（γTuCs）。γTuC与两种顺面高尔基体的蛋白质GMAP-210和 AKAP450（AKAP450也被称为AKAP350、CG-NAP和hyperion）结合(参见文献“Rios et al., Cell118:323-335(2004)”；“Rivero et al.,EMBO J.28:1016-1028(2009)”；“Takahashi et al.,Mol.Biol.Cell13:3235-3245(2002)”)。据报导，使AKAP450不表达可阻断与高尔基体相关的微管成核(参见文献“Rivero et al.,EMBO J.28:1016-1028(2009)”)。 [0007] 高尔基体后分泌（post-Golgi secretion）和定向细胞迁移需要在高尔基体成核的微管。在分泌途径中，蛋白质由ER运输到高尔基体的过程为：首先在ER出口处被包装到 COPII包被的囊泡中，然后经由囊泡-管状簇(亦称为内质网-高尔基体中间区间)，沿微管运输到达高尔基体。蛋白质分泌缺陷可引起一系列疾病，诸如神经元疾病和糖尿病等。此外，由于微管参与细胞迁移，抑制微管成核可用于阻止肿瘤的转移。 [0008] EB1是EB蛋白中具有代表性的成员，此类蛋白质定位于微管并跟踪生长的微管的正端(参见文献“Akhmanova and Steinmetz,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.9:309-322(2008)”； “Vaughan,J.Cell Biol.171:197-200(2005)”)。在EB蛋白中，EB1和EB3具有相似的微管正端跟踪能力，而EB2似乎与其他两种不同，其表现出明显较弱的微管正端跟踪能力(参见文 献“Komarova et al.,J.Cell Biol.184:691-706(2009)”)。 [0009] EB1存在于所有生长微管的微管正端，并在此通过与各种正端跟踪蛋白(+TIP)的相互作用而成为正端蛋白复合物的关键成分。很多+TIP都具有SxIP基序，该基序被碱性和 富含丝氨酸的序列包围，从而与EB1的EBH结构域相互作用(参见文献“Honnappa et al., Cell138:366-376(2009)”)。该SxIP-EBH相互作用可解除EB1的自我抑制，并且是EB1 促进微管聚合所需的(参见文献“Honnappa et al.,EMBO J.24:261-269(2005)”；“Honnappa et al.,Cell138:366-376(2009)”；“Slep et al.,J.Cell Biol.168:587-598(2005)”)。在微管正端与EB结合的+TIP具有多项功能，包括调节微管动力和微管与细胞亚靶标之间的连接 (参见文献“Akhmanova and Steinmetz,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.9:309-322(2008)”)。 [0010] 在酵母双杂交筛选中，Myomegalin(MMG)同工型1(Genbank编号：NP_055459)被克隆并与环式核苷酸磷酸二酯酶4D相互作用，被鉴定为磷酸二酯酶4D相互作用蛋白(参见文 献“Verde et al.,J.Biol.Chem.276:11189-11198(2001)”)。MMG1的核苷酸序列编码大约 230kDa的蛋白质，此蛋白质在心脏和骨骼肌当中高表达。在基因数据库中，MMG1是CDK5RAP2(CDK5调节亚基-结合蛋白2)的唯一已知的人类同源蛋白质，CDK5RAP2是一种人小头畸形相 关的蛋白质，并参与微管在中心体上的组织以及微管在生长端的调控(参见文献“Fong et al.,Mol.Biol.Cell.19:115-125(2008)”；“Fong et al.,Mol.Biol.Cell.20:3660-3670 (2009)”)。跟CDK5RAP2相似，MMG同工型1显示出中心体和高尔基体定位模式。(参见文献 “Verde et al.,J.Biol.Chem.276:11189-11198(2001)”；“Wang et al., J.Biol.Chem.285:22658-22665(2010)”)。 [0011] 尽管高尔基体在诸如蛋白质修饰和运输、微管组织以及细胞迁移等各种细胞活性中的重要意义已广为人知，但高尔基体如何发挥这些功能的精确机制还未全面了解。具体 地，至今尚未阐明γTuCs如何定位于高尔基体。此外，目前也未知EB1和其他家族成员是否存在于高尔基体并发挥其功能。如将于下述内容中阐明的，本发明提供了这些和其他优点。 发明内容[0012] 本发明提供了新的myomegalin（MMG）同工型、编码所述myomegalin同工型的核酸分子、包含所述myomegalin同工型的融合构建体（construct）、以及与所述myomegalin同工型特异性结合的抗体。 myomegalin同工型调节微管在高尔基体上的组织和成核、蛋白质修饰、分泌和运输，以及细胞增殖。 [0013] 在一实施方案中，本发明提供了一种myomegalin同工型（myomegalin变体8(MMG8)），其包含SEQ ID NO:2。本发明还提供了MMG8变体。在一些实施方案中，MMG8变体包含SEQ ID NO:2的氨基酸1-389。在一些实施方案中，MMG8变体包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸1-389的多肽，其中羧基末端包含SEQ ID NO:2的氨基酸1098-1116或SEQ ID NO:2的氨基 酸1098-1116中的连续片段。 [0014] 在一实施方案中，本发明提供了编码MMG8的核酸分子，其包含SEQ ID NO:2或其片段，或者其任何互补序列。在一实施方案中，核酸分子包含SEQ ID NO:1。此外，本发明提供了含有本发明的核酸分子的载体、表达构建体和宿主细胞。 [0015] 在一实施方案中，本发明提供了融合蛋白质，其包含MMG8或MMG8变体或其片段、第二种蛋白质、和任选的连接MMG8、MMG8变体或其片段与第二种蛋白质的连接序列。 [0016] 在一实施方案中，本发明提供了特异性结合包含SEQ ID NO:2的MMG8的抗体。在一具体实施方案中，本发明的抗体特异性结合包含SEQ ID NO:2的序列926-1116的表位，或者包含SEQ ID NO:2的序列926-1116中的片段的表位。在一优选的实施方案中，抗MMG8抗体为人源化的抗体。 [0017] 本发明还提供了myomegalin同工型作为诊断生物标记物和作为用于筛选溶酶体贮积症、糖尿病和癌症的治疗药物的靶点的用途。同时，本发明还提供了通过调节本发明的myomegalin同工型的表达或活性来治疗与myomegalin相关的疾病的方法。 [0018] 附图简要说明 [0019] 图1显示，定位于顺面高尔基体网络的新的MMG同工型MMG8是维持高尔基体结构完整所需的。(A)利用以编码人MMG同工型1的474-762的区域为靶标的寡核苷酸引物进行RT- PCR。该靶标区域存在于所有目前已知较大的MMG变体序列中。总RNA提取自HeLa细 胞。在图示中显示了RT-PCR扩增区段以及抗体识别区域。突出显示的区域对应于MMG同工型1的氨基 酸474-762或MMG8的637-925。M，DNA标记。(B)利用抗MMG8抗体443M或免疫前血清探测通过SDS-PAGE解析的HeLa细胞提取物(6%和15%的胶)。(C)免疫沉淀(IPs)实验，所用抗体为443M或非特异性IgG。免疫沉淀的蛋白质经由SDS-PAGE解析之后，进行抗MMG8免疫印迹或考马斯亮蓝染色。切割约150kDa的蛋白质条带以用于质谱测序。(D)免疫印迹检测MMG在细胞培养 物中的表达，所用抗体为443M。(E)MMG变体的图示。相同的序列以相同的样式标记。P1-P13表示利用质谱测序的肽段。(F)利用对照物或以MMG8为靶标的特异性小干扰RNA(siRNA)转 染的HeLa细胞的免疫印迹。转染si-MMG8-1或si-MMG8-2后，MMG8蛋白质的表达被抑制了大 约85%。(G)利用免疫荧光显微镜分析利用siRNA转染的HeLa细胞。比例尺：5微米。 [0020] 图2显示MMG8与AKAP450相互作用。(A)HeLa细胞提取物分别用抗MMG8抗体及抗AKAP450抗体进行免疫沉淀。所沉淀之蛋白质及裂解液（input）经免疫印迹后定量分析。柱状图显示所沉淀之蛋白质相对于各自的裂解液的量。所显示的数据为三次独立实验的平均 值±S.D.。(B-C)表达不同的包含FLAG标签的MMG8构建体的HEK293T细胞经anti-FLAG免疫 沉淀。免疫沉淀物和裂解液经免疫印迹（IB）检测MMG8片段（anti-FLAG）和AKAP450（B），或蛋白质激酶A的RII亚基（C）。(D)MMG8片段瞬时表达于HeLa细胞。细胞经染色检测内源的MMG8以及高尔基体标识以进行标记。箭头表示经转染的细胞。框中的区域被放大。比例尺：5微米。 [0021] 图3显示MMG8和AKAP450在稳定性上相互依赖。(A)hTERT-RPE1细胞经siRNA转染以进行标记。细胞提取物用免疫印迹检测。定量之后，将转染有siMMG8或siAKAP450的提取物中的MMG8及AKAP450的量表示为相对于对照提取物中的量的百分比。显示了由三次独立试 验获得的数据。(B)siRNA转染的细胞在转染后72小时经MG132处理。处理之后，细胞经免疫印迹分析MMG8、AKAP450和α-微管蛋白。以由三次独立实验的定量数据对MMG8及AKAP450的量 作图。 [0022] 图4显示MMG8在高尔基体上与γ-微管蛋白复合物结合。(A-B)对HeLa细胞提取物进行抗MMG8抗体(A)及抗GCP3抗体(B)的免疫沉淀。免疫沉淀物及裂解液用免疫印迹检测。 (C)对转染了siRNA的细胞进行γ-微管蛋白和甘露糖苷酶II(Man II)的免疫染色。比例尺： 5微米。 [0023] 图5显示高尔基体上的微管成核需要MMG8。(A)hTERT-RPE1细胞经siRNA转染。在用诺考达唑使微管解聚之后，洗脱诺考达唑，微管开始重新生长。之后对细胞进行染色以检测MMG8、TGN46及微管(抗α-微管蛋白)。(B)转染了siRNA的细胞之免疫荧光照片。框中区域被放大。比例尺：5微米。 [0024] 图6显示MMG8结合至EB1和EB3，并且介导EB1募集于高尔基体。(A)EB1与MMG8之免疫共沉淀。在抗MMG8免疫沉淀之后，用免疫印迹检测免疫沉淀物和裂解液。(B-C)异位表达带有FLAG标签的全长MMG8(B)和其片段1-389(C)。在经抗FLAG抗体的免疫沉淀之后，所得之沉淀物及裂解液用免疫印迹探测。WT：MMG8野生型；311/2A：MMG8(L311A/P312A)。(D)用GFP-EB3和MMG8或其L311A/P312A突变体的FLAG标签构建体共转染HEK293细胞。经抗FLAG抗体的 免疫沉淀，分析沉淀蛋白质和裂解液的EB3（抗GFP抗体）和MMG8（抗FLAG抗体）。Vec：FLAG载体；WT：野生型MMG8；311/2A：MMG8(L311A/P312A)。(E)对转染了siRNA的HeLa细胞进行MMG8、EB1和TGN46的三重染色。比例尺：5微米。 [0025] 图7显示EB1介导MMG8与微管之间的相互作用。在表达GFP或GFP-EB1(185-268)的HEK293提取物中，微管在紫杉醇的作用下聚合。对照（ctrl）中未加入紫杉醇。在使微管沉降后，探测上清及团块中的MMG8、α-微管蛋白及GFP蛋白质。GFP-EB1C：GFP-EB1(185-268)。 [0026] 图8显示细胞增殖需要MMG8。对HeLa细胞转染对照siRNA或以MMG8为靶标的siRNA。在不同时间点对细胞的数量进行计数。 [0027] 图9显示抑制MMG8的表达可干扰LAMP-1及CD44的糖基化。 用免疫印迹分析转染了对照或MMG8siRNA的HeLa细胞的LAMP-1和CD44。 [0028] 序列的简要描述 [0029] SEQ ID NO:1为编码本发明的人myomegalin同工型的核酸序列。 [0030] SEQ ID NO:2为本发明的人类myomegalin同工型的氨基酸序列 [0031] SEQ ID NO:3为人myomegalin同工型的氨基酸序列(GenBank编号NP_055459.4). [0032] SEQ ID NO:4为人myomegalin同工型的氨基酸序列(GenBank编号NP_001002812.1)。 [0033] SEQ ID NO:5为人myomegalin同工型的氨基酸序列(GenBank编号NP_071754.3)。 [0034] SEQ ID NO:6为人myomegalin同工型的氨基酸序列(GenBank编号NP_001002810.1)。 [0035] SEQ ID NO:7为人myomegalin同工型的氨基酸序列(GenBank编号NP_001002811.1)。 [0036] SEQ ID NO:8为人myomegalin同工型的氨基酸序列(GenBank编号NP_001182189.1)。 [0037] SEQ ID NO:9为人myomegalin同工型的氨基酸序列(GenBank编号NP_001182190.1)。 [0038] SEQ ID NO:10为人myomegalin同工型的氨基酸序列(GenBank编号NP_001185761.1)。 [0039] SEQ ID NO:11为人myomegalin同工型的氨基酸序列(GenBank编号NP_001185763.1)。 [0040] SEQ ID NO:12为苏门答腊猩猩（Pongo abelii）myomegalin同工型的氨基酸序列(GenBank编号NP_001126198)。 [0041] SEQ ID NO:13为鼠myomegalin同工型的氨基酸序列(GenBank编号AAI41173)。 [0042] SEQ ID NO:14为原鸡（Gallus gallus）myomegalin同工型的氨基酸序列(GenBank编号XP_423459)。 [0043] SEQ ID NO:15为非洲爪蟾（Xenopus tropicalis）myomegalin同工型的氨基酸序列(GenBank编号NP_001072886)。 [0044] SEQ ID NO:16为斑马鱼（Danio rerio）myomegalin同工型的氨基酸序列(GenBank编号CAI11891)。 [0045] SEQ ID NO:17为斑马鱼（Danio rerio）myomegalin同工型的氨基酸序列(GenBank编号NP_956195)。 [0046] SEQ ID NO:18为KIAA0477蛋白的氨基酸序列(GenBank编号KIAA0477)。 [0047] SEQ ID NO:19为对本发明用的连接序列。 [0048] SEQ ID NO:20为对本发明用的连接序列。 [0049] SEQ ID NO:21为对本发明用的连接序列。 [0050] SEQ ID NO:22为对本发明用的连接序列。 [0051] SEQ ID NO:23为对本发明用的连接序列。 [0052] SEQ ID NO:24为对本发明用的连接序列。 [0053] SEQ ID NO:25为对本发明用的siRNA。 [0054] SEQ ID NO:26为对本发明用的siRNA。 [0055] SEQ ID NO:27为本发明的人myomegalin同工型的片段的氨基酸序列。 [0056] SEQ ID NO:28为本发明的人myomegalin同工型的片段的氨基酸序列。 [0057] SEQ ID NO:29为本发明的人myomegalin同工型的片段的氨基酸序列。 [0058] SEQ ID NO:30为本发明的人myomegalin同工型的片段的氨基酸序列。 [0059] SEQ ID NO:31为本发明的人myomegalin同工型的片段的氨基酸序列。 [0060] SEQ ID NO:32为本发明的人myomegalin同工型的片段的氨基酸序列。 [0061] SEQ ID NO:33为本发明的人myomegalin同工型的片段的氨基酸序列。 [0062] SEQ ID NO:34为本发明的人myomegalin同工型的片段的氨基酸序列。 [0063] SEQ ID NO:35为本发明的人myomegalin同工型的片段的氨基酸序列。 [0064] SEQ ID NO:36为本发明的人myomegalin同工型的片段的氨基酸序列。 [0065] SEQ ID NO:37为本发明的人myomegalin同工型的片段的氨基酸序列。 [0066] SEQ ID NO:38为本发明的人myomegalin同工型的片段的氨基酸序列。 [0067] SEQ ID NO:39为本发明的人myomegalin同工型的片段的氨基酸序列。 [0068] 详细描述 [0069] 本发明提供了新的myomegalin同工型（MMG），编码myomegalin同工型的核酸分子，包含myomegalin同工型的融合构建体，及特异性结合myomegalin同工型的抗体。在一个具体的实施方案中，本发明提供了一种新的包含SEQ ID NO：2的MMG同工型，即myomegalin8 （MMG8）。本发明的myomegalin同工型调节微管在高尔基体上的组织和成核；蛋白质修饰、分泌和运输；和细胞增殖。 [0070] 本发明提供了myomegalin同工型作为诊断生物标志物和作为筛选用于治疗溶酶体贮积症、糖尿病和癌症的治疗剂的用途。还提供了通过调节本发明的myomegalin同工型 的表达或活性来治疗与myomegalin相关的疾病的方法。 [0071] 特别地，本发明提供了分离含有MMG8的蛋白质复合物的方法，以及MMG8用于调节蛋白质运输和糖基化和抑制细胞增殖的用途。MMG8是一种MMG基因（1q12，人基因组）的拼接变体，并且为表达于本发明所检测的细胞中的主要的MMG同工型，并且还存在于C2C12肌管 中。MMG8主要存在于顺面高尔基体网络，并为高尔基体的组织及微管在高尔基体上的成核 所需。MMG8在顺面高尔基体上与 AKAP450形成复合物以发挥其功能。例如，MMG8与γTuCs结合并且为γTuCs定位于高尔基体以进行微管成核所需。此外，MMG8也与EB1/EB3相互作用。 此相互作用将EB1募集于高尔基体，并介导微管在高尔基体上与MMG8结合。 [0072] 在蛋白质分泌途径的内质网-高尔基体运输中，MMG8也起着重要的作用。抑制MMG8的表达将导致诱导LAMP-1这一溶酶体贮积病的诊断标志物的积累，并降低糖基化的成熟 CD44，而糖基化的成熟CD44是转移性肿瘤的治疗靶点。此外，抑制MMG8表达，亦可抑制肿瘤细胞系的增殖。微管已被用作筛选抗癌药物的靶标。MMG8可以用作筛选治疗药物的诊断标 记物和靶标。 [0073] MMG8同工型和变体 [0074] 一方面，本发明提供了一种新的人myomegalin（MMG），以下称为myomegalin变体8（MMG8），其包含SEQ ID NO：2。本发明还提供了包含SEQ ID NO：2的MMG8“变体”或其片段。 [0075] 目前已发现天然存在的人MMG8同工型表达于各种细胞类型，包括增殖上皮细胞、成纤维细胞和神经母细胞瘤细胞。相反，另一种人myomeglin同工型，MMG1（SEQ ID NO：3），仅存在于心脏和骨骼肌中，而不表达于或相对于MMG8（SEQ ID NO：2）的表达水平仅微量表达于增殖上皮细胞、成纤维细胞和肿瘤细胞中。 [0076] 在一些实例中，本发明提供MMG8同工型。在优选的实施方案中，MMG8同工型与AKAP450、EB1、EB3和诸如GCP2和GCP3等γ-微管蛋白质复合物亚基中的一者或多者结合。本发明中所涉及的MMG8变体优选为哺乳动物来源或更优选为人来源。 [0077] 在一个实例中，MMG8变体包含SEQ ID NO：2的氨基酸1-389。在一些实例中，本发明的MMG8变体包含含有SEQ ID NO：2的氨基酸1-389的多肽，其中羧基末端包含SEQ ID NO：2的氨基酸1098-1116或这样的片段，该片段含有SEQ ID NO：2的1098-1116中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、或18个连续氨基酸。例如，在某些实例中，MMG8变体的羧基末端包含这样的连 续片段，该连续片段开始于SEQ ID NO：2的氨基酸1098-1115中的 任意一者，延伸通过，并终止于SEQ ID NO：2的氨基酸1099到1116中的任意一者。例如，在一个特定的实例中，MMG8变体的羧基末端包含SEQ ID NO：2的氨基酸1103-1116或这样的片 段，该片段含有SEQ ID NO：2的1103至1116中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或13个连续氨基酸。 [0078] 在一些实例中，MMG8变体包含这样的多肽，其具有与SEQ ID NO：2至少90％、93％、95％、96％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、或99.5％相同的序列。在一些实例中，MMG8变体包含这样的序列，该序列与SEQ ID NO：2的氨基酸1-389至少90％、93％、95％、96％、 97％、97.5％、98％、98.5％、99％或99.5％相同。在一个实例中，MMG8变体包含SxIP基序（丝氨酸-X-异亮氨酸-脯氨酸）。 [0079] 在一些实例中，本发明的MMG8变体不包含SEQ ID NO：3-18中的任何一者。在其他一些实例中，本发明的MMG8变体不包含这样的多肽，该多肽包含具有超过SEQ ID NO：3-18中任意一者的10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、 1000、1100个连续氨基酸的片段。 [0080] 除非明确地指明，否则这里所述的蛋白质或多肽片段是指包含给定的蛋白质或多肽序列的至少250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、350、389、400、500、600、 700、800、900、或1000个连续氨基酸的序列。 [0081] 除非另有说明，否则这里所使用的序列同一性百分比和/或两个序列的相似性可以使用Karlin和Altschul（1990）的算法并通过Karlin和Altschul（1993）的方法改进而确定。这样的算法被引入Altschul等人的NBLAST和XBLAST程序（1990）中。为得到具有所需序列同一性百分比的序列，BLAST搜索可以使用NBLAST程序进行，分数=100，字长=12。为得到间隙比对结果（gapped alignment）以进行比较，可使用Altschul等(1997）所描述的Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可使用各自程序（NBLAST和XBLAST）的缺省参数。参见NCBI/NIH网站。 [0082] 在一些实例中，本发明提供MMG8变体，其中SEQ ID NO：2或其片段中的一个或多个氨基酸被修饰。氨基酸序列的修饰包括但不仅限于，对给定的蛋白质或多肽序列进行氨基酸的添加、删除和保守替换。基对MMG结构的公知常识，SEQ ID NO：2中的某些氨基酸可以被替换、删除或添加，而不有损于该蛋白质的生物活性。 [0083] 在一些实施方案中，氨基酸的修饰在SEQ ID NO：2的氨基酸390-1116、SEQ ID NO：2的氨基酸390-1097或SEQ ID NO：2的氨基酸390-1102上进行。在一个实例中，不修饰SEQ ID NO：2的SxIP基序（氨基酸309，311，和312）。 [0084] 在一些实例中，SEQ ID NO：2的氨基酸有不超过50个（例如，不超过：50、45、40、35、30、25、20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1个）被修饰。在一些实例中，SEQ ID NO：2的1-389的氨基酸有不超过50个（例如，不超过：50、45、40、35、30、25、20、15、14、13、12、 11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1个）被修饰。在一些实例中，SEQ ID NO：2的1098至1116的氨基酸有不超过10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个被修饰。 [0085] 保守修饰的方法在本领域中是已知的。保守替换通常包括以下组中的替换：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸、组氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。 [0086] 保守修饰可使制备的分子具有与在其上进行修饰的那些分子相似的功能和化学特性。此外，对分子的功能和/或化学特性的实质改变可通过选择对氨基酸序列的不同替换来实现，这些替换对以下方面的作用显著不同：（a）替换区域的分子骨架结构，例如，片或螺旋构象，（b）靶位点的电荷或疏水性，或（c）分子的大小。因此，有可能通过对目标蛋白质的氨基酸序列进行修饰来获得具有相似的或甚至所需的性质的蛋白质同系物。这些修饰的蛋 白质在本发明的范围内。 [0087] 在某些实施例中，保守的氨基酸替换还包括非天然存在的氨基酸残基，它们的引入通常通过化学肽合成而非生物系统合成。非天然存 在的氨基酸的例子总体上包括，但不限于，鸟氨酸、瓜氨酸、羟脯氨酸、高丝氨酸、苯基甘氨酸、牛磺酸、碘化酪氨酸、2,4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、γ-氨基丁酸、ε-氨基己酸、6-氨基己酸、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、正亮氨酸、正缬氨酸、肌氨酸、高瓜氨酸、磺基丙氨酸、τ-丁基甘氨酸、τ-丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟化氨基酸、设计的氨基酸（如β-甲基氨基酸、C-甲基氨基酸、N-甲基氨基酸）和氨基酸类似物。非天然存在的氨基酸还包括具有衍生的侧链基团的氨基酸。此外，蛋白质中的任何氨基酸都可以是D（右旋）的形式或L（左旋）的形式。 [0088] 氨基酸残基的修饰也可以通过直接突变、噬菌体展示、或在编码蛋白质分子的核酸内部进行重排来实现。此类方法为本领域的技术人员所熟知。在随机突变中，位置可随机选择，或使用简单的规则改变氨基酸。此外，氨基酸衍生物可包含取代的或非取代的、线形的、支链的、或环状的烷基部分，并且可包含一个或多个杂原子。 [0089] 在一个实例中，本发明提供了分离的MMG8和MMG8变体。MMG8和MMG8变体可从上皮细胞、成纤维细胞、癌症或肿瘤细胞、或正在进行分裂和扩增的细胞中分离。 [0090] 分离的MMG8和MMG8变体基本不含有其他细胞成分，如其他生物分子、蛋白质或肽、核酸、脂类和碳水化合物等。这些物质通常结合MMG8和MMG8变体。这里所述之“基本上不含”包括污染因素(例如生物分子、蛋白质或肽、核酸、脂类、和碳水化合物和其他细胞成分)的比例小于约20％、10％，优选小于5％（以干重计算）。 [0091] 本发明还提供重组形式的MMG8和MMG8变体。在一个实例中，MMG8由包含SEQ ID NO：1的多核苷酸编码。可对重组产生的蛋白质或肽进行翻译后修饰如糖基化。这些修饰的性质和程度很大程度上取决于特定的宿主细胞的翻译后修饰的能力和存在于目的肽或蛋 白质的氨基酸序列中的修饰信号。例如，在不同类型的宿主细胞之间，糖基化模式可能不 同。可供选择的，非糖基化蛋白质可通过在有糖基化缺陷的系统中表达而产生。 [0092] 融合构建体 [0093] 在另一个方面，本发明提供了融合蛋白质，其包含MMG8或MMG8变体或其片段、第二种蛋白质、和任选的连接MMG8、MMG8变体或其片段与第二种蛋白质的连接序列。 [0094] 在一个实例中，MMG8蛋白或多肽的N-末端任选通过连接序列与第二种蛋白质融合。在另一实例中，MMG8蛋白或多肽的C-末端任选通过连接序列与第二种蛋白质融合。 [0095] 在一个特定的实例中，该融合蛋白质包含MMG8蛋白，其中该MMG8蛋白包含SEQ ID NO：2。在一个实例中，融合蛋白质包含MMG8片段，其中该片段包含SEQ ID NO：2的氨基酸1- 389。在一个实例中，该融合蛋白质包含MMG8变体，其中在该MMG8变体中，SEQ ID NO：2的1- 389有不超过50（例如，不超过：50、45、40、35、30、25、20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、 3、2、或1个）个氨基酸被修饰。在一个实例中，该融合蛋白质包含MMG8或MMG8变体，其中该MMG8或MMG8变体的SxIP结构域不被修饰。 [0096] 在一个实例中，该融合蛋白质包含MMG8蛋白质，该MMG8蛋白质的羧基末端包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸1098-1116的序列，或包含含有SEQ ID NO:2的1098-1116中的1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、或18个连续氨基酸的片段。在另一个实例中，该融合蛋白质包含MMG8蛋白质，该MMG8蛋白质的羧基末端包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸 1103-1116的序列，或包含含有SEQ ID NO:2的1103-1116中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、或13个连续氨基酸的片段。 [0097] 在一些实例中，MMG8蛋白质或多肽与第二种蛋白质即Fc结构域融合。术语“Fc结构域”包括天然的人和动物的Fc和Fc变体分子和序列的全长序列或片段，包括例如IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和诸如IgG1、IgG2，IgG3、IgG4、IgA1和IgA2等亚型。至于Fc变体和天然的Fc's，术语“Fc结构域”包括单体或多聚体形式的分子，无论是通过对全抗体进行消化而获得还是通过其他方式产生。 [0098] 术语“Fc变体”是指对天然Fc进行修饰而获得的分子或序列，但 仍包含补救受体的结合位点。Fc结构域包括这样的分子，该分子具有两个或更多个通过共价、非共价、或同时具有共价和非共价的相互作用而结合的多肽链。IgG分子通常形成二聚体；IgM：五聚体； IgD：二聚体；IgA：单体、二聚体、三聚体或四聚体。多聚体可以通过开发序列并由此产生Fc的原始Ig源的活性而形成，或者通过使该原始Fc衍生（如下所定义）而形成。 [0099] 本发明的范围内的Fc结构域可以是任何同种型的抗体，包括IgG、IgA、IgE、IgD和IgM。IgG同种型抗体可以进一步细分成IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型。IgA抗体可以进一步细分成IgA1和IgA2亚型。在一个特定的实例中，Fc结构域是IgG1。 [0100] 在另一个实例中，本发明的融合蛋白质包含连接序列以连接MMG8蛋白质或多肽和第二种蛋白质如Fc结构域。连接序列一般为肽链。此肽链的长度可以为例如，6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50个或更多个氨基酸残基，但通常介于5和25个残基之间。根据长度和侧链组成，连接序列可以具有，但不必须具有大于平均挠性。可使用本领域中公知的算法来计算挠性。有用的连接序列的例子包括，但不限 于，5GlyCys2ProCys（SEQ ID NO：19）、4Gly3Ser（SEQ ID NO：20）、Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn(SEQ ID NO:21)、Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn(SEQ ID NO:22)、Gly Asp Leu Ile Tyr Arg Asn Gln Lys(SEQ ID NO:23)和9GlyProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO:24)。 [0101] 核酸分子 [0102] 另一个方面，本发明涉及编码本发明的MMG8或MMG8变体、片段、融合蛋白质、和抗体的核酸分子。本发明的核酸分子包括DNA分子（例如，基因组DNA和cDNA）和RNA分子（例如mRNA，包括pre-mRNA和成熟的mRNA）。此外，涉及的核酸分子可以是单链或双链的。 [0103] 在一个实例中，本发明的核酸分子编码具有包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的MMG8。在一个实例中，本发明的核酸分子编码MMG8的变体，其包含SEQ ID NO：2的1-389位氨基酸。在一个实例中，核酸分子编码MMG8变体，该MMG8变体的羧基末端包含SEQ ID NO：2的 1098-1116氨基酸，或这样的片段，该片段含有SEQ ID NO：2的1098-1116中的1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、或18个连续氨基酸。在一个实例中，核酸分子编码MMG8变体，该MMG8变体的羧基末端包含SEQ ID NO：2的1103-1116位氨基酸，或这样的片段，该片段含有SEQ ID NO：2的1103-1116中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或13个连续氨基酸。 [0104] 在一个实例中，本发明的核酸分子包含SEQ ID NO：1或其片段，其中所述的核酸分子编码MMG8或MMG8的变体。在一个实例中，本发明的核酸分子包含SEQ ID NO：1的核酸1-1167，或其片段，或其任何互补序列。在一些实例中，所述核酸分子包含多聚核苷酸，其中所述多核苷酸序列的3'端包含SEQ ID NO：1的3292-3348位，或SEQ ID NO：1的3292-3348位中的连续片段，或其任何互补序列。在一些实例中，所述核酸分子包含多聚核苷酸，其中所述多核苷酸序列的3'端包含SEQ ID NO：1的3309-3348位，或SEQ ID NO：1的3309-3348位中的连续片段，或其任何互补序列。 [0105] 除非明确地指明，否则此处所用的多核苷酸片段是指这样的序列，其含有给定多核苷酸序列中的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、 900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、 2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、或3400个连续的核酸。 [0106] 在一些实例中，本发明的核酸分子包含具有这样的序列的多核苷酸，该序列至少约90％、93％、95％、96％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％或99.5％与SEQ ID NO：1或它的片段或其任何互补序列相同。在一些实例中，本发明的核酸分子包含具有这样的序列的多 核苷酸，该序列至少约90％、93％、95％、96％、97％、97.5％、98％、 98.5％、99％或99.5％与SEQ ID NO：1的核酸1-1167、或其片段或其任何互补序列相同。在一个实例中，编码MMG8或MMG8变体的核酸分子包含SxIP基序（Ser-x-Ile-Pro）。 [0107] 在一个实例中，本发明的核酸序列与能够被翻译成本发明的MMG8或MMG8变体的成熟mRNA的核酸序列相同。在另一实例中，本发明的核酸分子是cDNA分子，其中一条链与能够被翻译成本发明的MMG8或MMG8变体的成熟mRNA互补。本发明主题的DNA和RNA序列可以容易 地被技术人员根据遗传密码子的简并性而确定。 [0108] 此外，本发明主题的一个或多个核苷酸可以被替换、删除或插入。DNA的天然核苷酸可以被含有以下碱基部分的核苷酸所替换，这些碱基包括但不限于，次黄嘌呤核苷、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、次黄嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、5-甲基胞嘧啶、和三苯甲基化碱基。序列中核苷酸的糖基部分也可以被改变，这样的改变包括，但不限于，阿拉伯糖、木酮糖、和己糖。 此外，核苷酸的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶碱基可以被乙酰基、甲基、和/或硫代基团所修饰。含有核苷酸替换、删除、和/或插入的序列可以使用本领域中已知的标准技术来制备和测试。 [0109] 另外，本发明提供了与编码MMG8或MMG8变体的核酸杂交的核酸、寡核苷酸、反义寡核苷酸、以及合成的寡核苷酸，它们可用作检测生物样品中的MMG8核酸分子的存在及水平的试剂。本发明预期了对应于本发明的MMG8或MMG8变体的编码序列以及对应于其互补序列 的核酸序列的用途。 [0110] 在一个实例中，这样的核酸分子可以用作寡核苷酸或多核苷酸探针。为检测生物样品中MMG8核酸分子的存在或水平，优选的寡核苷酸为与编码本发明的MMG8或MMG8变体的 cDNA序列至少部分互补的那些。这些互补序列在本领域中还称为“反义”序列。这些寡核苷酸可以是寡核糖核苷酸或寡脱氧核糖核苷酸。此外，寡核苷酸可以为由生物学上重要的核 苷酸构成的天然低聚物，所述核苷酸例如A（腺嘌呤），dA（脱氧腺嘌呤），G（鸟嘌呤），dG（脱氧鸟嘌呤），C（胞嘧啶），dC（脱氧胞嘧啶），T（胸腺嘧啶）和U（尿嘧啶）；或者为 修饰的寡核苷酸种类，例如，以甲基或硫原子替换核苷酸之间的磷酸二酯键中的磷酸氧。 [0111] 本发明的核酸分子可以从目标细胞(如有机体的组织细胞或组织衍生细胞系)中分离得到，或者人工合成(如重组DNA和化学合成的多核苷酸分子)。例如，任何商业可得的自动化核酸合成仪可制备寡核苷酸。可供选择地，寡核苷酸可以通过标准的DNA重组技术合成，例如，诱导非编码链的转录。编码MMG8或MMG8变体的DNA序列可以在重组DNA系统中被翻转，例如在合适的启动子的下游反向插入，从而使非编码链转录。 [0112] 尽管任何长度的寡核苷酸均可用来与编码MMG8或MMG8变体的核酸杂交，但优选的寡核苷酸通常在8-200、15–100或15-50的范围内。 [0113] “杂交”是指这样的反应，其中一个或多个多核苷酸反应形成通过双链核酸分子(DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA)中的特定嘌呤与特定嘧啶之间的氢键而得到稳定的复合物。 主要是鸟嘌呤与胞嘧啶特定配对以及腺嘌呤与胸腺嘧啶或尿嘧啶特定配对。可以采用不同 的杂交严格程度。条件越苛刻，越需要强的互补性以形成双链。条件的苛刻程度可通过温 度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间等控制。 [0114] 优选地，利用业内所熟知的技术在高度严格的条件下进行杂交，例如在Keller,G.H.和M.M.Manak的“DNA Probes,and the companion volume DNA Probes：Background, Applications,Procedures”(多个版本，包括第二版，Nature出版社，1993)中已有描述。分子克隆手册(冷泉港实验室出版社，包括Sambrook和Russell，分子克隆:实验室手册 (2001))中也广泛提及杂交技术。 [0115] 杂交的高严格条件的例子为，在至少约6XSSC和1%SDS的环境下于65摄氏度反应，在约42摄氏度下，利用含20%(体积/体积)甲酰胺的0.1×SSC进行第一次清洗10分钟，并且 在65摄氏度下用0.2×SSC和0.1%SDS进行随后的清洗。杂交条件的非限制性例子为这样选 择的条件，对于特定的序列，在特定的溶液中，比热熔点(Tm)低约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24或25摄氏度。Tm是这样的温度，在该温度(依赖于离子强度和pH值)下，50%的目标序列与完全匹配的探针杂交。通常Tm随[Na+]浓度 而升高，因为钠阳离子通过静电掩蔽核苷酸上的磷酸基团阴离子，并且使它们之间的排斥 最小化。使用的漂洗时间可以各约大于或等于5、10、15、20、25、30分钟，如果需要可以增加严格程度。 [0116] 通过计算和估计Tm的方法为本领域所公知。例如，熔融温度可以由以下公式表示(参见文献“Beltz,G.A.,K.A.Jacobs,T.H.Eickbush,P.T.Cherbas,and F.C.Kafatos, Methods of Enzymology,R.Wu,L.Grossman and K.Moldave[eds.]Academic Press,New York100:266-285,1983”).。 [0117] Tm=81.5℃+16.6Log[Na+]+0.41(%G+C)-0.61(%甲酰胺)-600/以碱基对为单位的双链长度 [0118] 更为准确估算的Tm可以使用最近邻模型而获得。参见文献“Breslauer,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:3746-3750(1986)”;“SantaLucia,Proc.Natl Acad.Sci.USA,95:1460-1465(1998)”;“Allawi&SantaLucia,Biochemistry36:10581-94 (1997)”;“Sugimoto et al.,Nucleic Acids Res.,24:4501-4505(1996)”。也可以在选定的溶液中，以差示扫描量热法(参见文献“Duguid et al.,Biophys J,71:3350-60,1996”)来常规地测量Tm，或通过其他本领域已知的方法，如UV-监测熔融法求得。随着杂交条件的严格程度的增加，可获得更高度的同源性。 [0119] 针对与MMG8核酸分子杂交而选择的寡核苷酸，无论化学合成还是通过重组DNA技术获得，皆可以使用标准技术进行分离和纯化，然后优选使用标准的标记方法进行标记（例如，用35S或32P）。 [0120] 本发明还考虑在聚合酶链式反应(PCR)中使用寡核苷酸对以检测生物样品中MMG8或MMG8变体的表达。寡核苷酸对包括正向的MMG8引物和反向的MMG8引物。 [0121] 病人样品中的MMG8或MMG8变体可由核酸杂交检测，例如但不限于Northern印记分析、点印记、Southern印记分析、荧光原位杂 交(FISH)和PCR。也可以使用色谱法（优选 HPLC）和其他已知分析方法来确定样品中MMG8或MMG8变体的信使RNA水平。 [0122] 在一个实例中，本发明考虑使用核酸作为检测病人生物样品中的MMG8或MMG8变体的试剂，其中所述核酸是经过标记的。核酸试剂可以标记有放射性标记、荧光标记、酶、化学发光标签、比色标签、或上文所讨论的或本领域已知的其他标记或标签。 [0123] 在一特定的实例中，检测生物样品中的MMG8核酸的方法包括Northern印记分析、点印记、Southern印记分析、FISH和PCR。 [0124] 在一个实施方案中，本发明设计使用了Northern印记分析来检测体液样品中的MMG8mRNA。分析的第一步包括以凝胶电泳分离包含MMG8核酸的样品。然后把分散的核酸转 移到硝酸纤维素膜或其他滤膜上。随后，在适当的杂交条件下（例如50%甲酰胺，5×SSPE，2×Denhardt溶液，0.1%SDS，42℃）使标记的寡核苷酸暴露于滤膜，此方法在<<分子克隆>>： 实验室手册，Maniatis等(1982年，CSH实验室)有所描述。其他业内熟知的有用方法包括溶液杂交、点和狭缝RNA杂交、以及基于探针的微阵列。测量杂交片段的放射性，使用业内熟知的标准程序对对象的生物液体中的MMG8核酸的量进行定量。 [0125] 点印迹包括将含有目的核酸的样品施加在膜上。核酸可以在施加到滤膜上之前或之后变性。将膜与标记的探针孵育。点印记的程序为本领域技术人员所公知，其方法更完整地描述在美国专利Nos.4582789和4617261中，其全部内容以引用方式并入本文。 [0126] 聚合酶链式反应(PCR)是利用杂交用引物和试剂扩增存在于核酸样品中的一种或多种特定核酸序列，之后检测扩增的序列的方法。本领域技术人员常规使用以检测目标序 列的PCR的具体例子为反转录PCR(参见文献“RT-PCR;Saiki et al.,Science,1985,230: 1350;Scharf et al.,Science,1986,233:1076”)。RT-PCR过程包括分离生物液体中总RNA，在识别目标核酸序列的引物的存在下将RNA变性，使用引物通过反转录合成RNA的cDNA拷 贝，利用特定引物通过PCR扩增cDNA，利用电泳或其他本领域技术人员已知的方法检测所扩增的cDNA。 [0127] 载体、表达构建体和宿主细胞 [0128] 在另一个方面，本发明提供了包含本发明的核酸分子的载体、表达构建体和宿主细胞。在一实施方案中，本发明的载体、表达构建体、或宿主细胞包含含有SEQ ID No:1或其片段或其任意互补序列的核酸分子。 [0129] 在一个实施方案中，本发明的载体、表达构建体、或宿主细胞包含核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQ ID No:1的核酸1-1167或其互补序列。在一些实施方案中，本发明的载体、表达构建体、或宿主细胞包含核酸分子，其中所述核酸分子包含含有SEQ ID No:1的核酸1-1167的多核苷酸，其中所述多核苷酸序列的3'端包含SEQ ID No:1的3292-3348，或SEQ ID No:1的核酸3292-3348中的连续片段，或其任意互补序列。 [0130] 在一些实施方案中，本发明的载体、表达构建体、或宿主细胞包含核酸分子，其中所述核酸分子包含含有SEQ ID No:1的核酸1-1167的多核苷酸，其中所述多核苷酸序列的3'端包含SEQ ID No.:1的3292–3348，或与SEQ ID No.:1的核酸3292-3348至少75%、80%、 85%、90%、95%或99%相同的连续片段，或其任意互补序列。 [0131] 在一些实施方案中，本发明的载体、表达构建体、或宿主细胞包含多核苷酸，该多核苷酸具有与SEQ ID No:1、或其片段、或其任意互补序列至少约90%、93%、95%、96%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、或99.5%的相同的序列。 [0132] 此处所用之术语“表达构建体”是指提供以用来转录操作性连接的核酸序列的核酸序列的组合。此处所用之术语“操作性连接”是指将所描述的组件毗连，其中所述组件之间的关系使得它们以预期的方式行使功能。一般来说，操作性连接组件是连续性关系。 [0133] 本发明的表达构建体通常还包括调节元件，这些调节元件在表达该表达构建体的目的宿主细胞中发挥功能。因此，普通业内工作者可以选择用于如细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、哺乳动物宿主细胞和人宿主细胞中的调节元件。调节元件包括启动子、转录终止序 列、翻译终止序列、增强子、和多聚腺苷酸化元件。 [0134] 本发明的表达构建体可以包含启动子序列，其可操作性连接到编码本发明的肽的多核苷酸序列上。启动子可以经业内熟知的标准技术引入多核苷酸中。多拷贝启动子或多 启动子可以用于本发明的表达构建体。在一个优选的实施方案中，启动子可以位于其与转 录起点的距离与其在自然的遗传环境中与转录起点的距离大约相同的位置。该距离的一些 变化是允许的，其不会大幅度降低启动子活性。转录起点通常包含在表达构建体中。 [0135] 本发明的表达构建体可以任选包含转录终止序列、翻译终止序列、信号肽序列和/或增强子元件。转录终止区域通常可以从真核生物或病毒基因序列的3'非翻译区获得。转 录终止序列可以放置在编码序列的下游以提供有效的终止。信号肽是一组短的氨基末端序 列，它们编码负责使操作性连接的肽重定位至翻译后细胞位点的信息，所述细胞位点包括 特定细胞器分隔间、蛋白质作用位点和细胞外环境。 [0136] 化学增强子是顺式作用元件，它们可增加基因转录并且也可以包含在表达构建体中。化学增强子元件为本领域已知的，包括但不限于，CaMV35S增强子元件、巨细胞病毒 (CMV)早期启动子增强子元件、和SV40增强子元件。指导由结构基因编码的mRNA聚腺苷酸化的DNA序列也可以包含在表达构建体中。 [0137] 专一性限制酶位点可以包含在表达构建体的5’和3’端，以利表达构建体插入到多核苷酸载体中。在此，这里使用的术语“载体”指任何遗传元件，包括例如，质粒、粘粒、染色体、噬菌体、病毒等，当与合适的控制元件结合时，它们能够复制，并且它们可在细胞之间传递多核苷酸序列。载体包含允许该载体在选定的宿主细胞内复制的核苷酸序列。很多载体可用于表达和/或克隆，包括，但不限于，pBR322、pUC系列、M13系列、和pBLUESCRIPT载体(美国拉荷亚市Stratagene)。 [0138] 本发明的宿主细胞包括，例如，细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、植物宿主细胞、昆虫宿主细胞、哺乳动物宿主细胞，优选人宿主细胞。可用于本发明的宿主细胞包括但不限于，CHO细胞、HEK-293细胞、293T细胞、COS细胞、COS7细胞和NIH3T3细胞等。 [0139] MMG8抗体和适体 [0140] 另一个方面，本发明提供了特异性结合MMG8或MMG8变体的抗体和适体。在一个实施方案中，本发明的抗体和适体特异性结合包含SEQ ID No:2的MMG8同工型。在特定的实施方案中，本发明中的抗体和适体特异性结合位于SEQ ID No:2中MMG8的羧基末端的表位。 [0141] 在特定的实施方案中，本发明的抗体和适体特异性结合包含SEQ ID No:2的926-1116的表位，或特异性结合包含含有SEQ ID No:2的1098–1116中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17或18个连续氨基酸的片段的表位。 [0142] 在特定的实施方案中，本发明的抗体和适体特异性结合包含SEQ ID No:2的926-1116的表位，或者特异性结合包含SEQ ID No:2的926–1116中的片段的表位，其中所述片段与SEQ ID No:2的926–1116至少75%、80%、90%或95%相同。 [0143] 在特定的实施方案中，本发明抗体和适体特异性结合包含SEQ ID No:2的926–1116的表位，或者特异性结合包含SEQ ID No:2的1098–1116中的片段的表位，其中所述片段与SEQ ID No:2的1098–1116至少75%、80%、90%或95%相同。 [0144] 在特定的实施方案中，本发明抗体和适体特异性结合包含SEQ ID No:2的926–1116的表位，或特异性结合包含SEQ ID No:2的1103–1116中的片段的表位，其中所述片段与SEQ ID No:2的1103–1116至少75%、80%、90%或95%相同。 [0145] 在一个优选的实施方案中，本发明的抗MMG8抗体是人源化抗体。 [0146] 在一些实施方案中，本发明的抗体和适体不结合到含有SEQ ID No:2的氨基酸1–389的表位，或包含其任意片段的表位。在一些实施方案中，本发明的抗体不与SEQ ID No: 3-18中的一种或多种结合。 [0147] “特异性结合”或“特异性”是指蛋白质与目的蛋白质或多肽分子中存在的表位可检测地结合，而与其他蛋白质或结构有相对很低的可检测反应性的能力。特异性可以使用例如Biacore仪进行结合或竞争性结合试验来相对地确定。特异性可以表现为，例如，结合至特异的靶标 分子与非特异地结合至其他无关分子的亲和性/活动性为约10:1、约20:1、 约50:1、约100:1、约10,000:1或更高的比率。 [0148] “选择性”是指与一种或多种其他生物分子、结构、细胞、组织等相比，蛋白质优先结合至特定区域、靶标或肽。例如，选择性可以由竞争性ELISA或Biacore试验确定。标志着选择性的亲和性/活动性的差异可以是任何可检测到的偏好(如，如果可检测到，比率超过1:1.1，或超过1:5)。 [0149] 本发明的抗体可以是多种形式中的任何形式，包括完整的免疫球蛋白质分子；免疫球蛋白质分子的片段，例如Fv、Fab及相似片段；免疫球蛋白分子多聚体(例如业内所熟知的二抗体（diabodie）、三抗体（triabodie）、双特异性抗体和三特异性抗体，参见例如“Hudson and Kortt,J.Immunol.Methods231:177189,1999”)；包含抗体或抗体片段的融合构建体；以及人或人源化的免疫球蛋白分子或其片段。 [0150] 本发明范围内的抗体可以是任意同种型，包括IgG、IgA、IgE、IgD、和IgM。IgG同种型抗体可以进一步细分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型。IgA抗体可以进一步细分为IgA1和IgA2亚型。 [0151] 本发明所涉及的抗体包括多克隆和单克隆抗体。这里使用的术语“单克隆抗体”指的是由基本上同种的抗体或抗体片段群体获得的抗体或抗体片段(即，群体中的各个抗体均相同，除了可能的自然发生的突变导致可能存在少量抗体分子的亚型)。 [0152] 本发明的抗MMG8抗体可以使用分离的天然MMG8或重组MMG8制备。优选地，用于本7 发明方法的抗体如果其Ka大于或等于10 M，则可与MMG8发生反应。在本发明的免疫三明治 分析中，使用鼠多克隆抗体和兔多克隆抗体。 [0153] 为了用于检测生物样品中MMG8或MMG8变体，纯化的抗体可以以共价方式，直接或通过连接序列连接到化合物，此化合物作为报告基团以允许检测MMG8及MMG8变体的存在。 多种不同类型的物质可以作为报告基团，包括但不限于，酶、染料、放射性金属或非金属同位素、荧光产生化合物（fluorogenic compound）、荧光化合物（fluorescent compound）等。 制备本发明的抗体(或其片段)连接物的方 法在美国专利Nos.4,671,958、4,741,900和4, 867,973中有所描述。 [0154] 检测MMG8同工型的试验 [0155] 另一个方面，本发明提供了用于检测样品中MMG8及MMG8变体的存在或水平的试验方法。用MMG8蛋白质或MMG8转录物来确定样品中MMG8及MMG8变体的水平。在一个实施方案 中，样品是从检测对象中获得的生物样品。 [0156] 在一个实施方案中，检测MMG8或MMG8变体存在或水平的方法包括: [0157] (a)使样品与和MMG8或MMG8变体结合的试剂相接触；以及 [0158] (b)检测所述试剂与MMG8或MMG8变体的结合。 [0159] 能够与样品中的MMG8或MMG8变体结合的试剂包括与MMG8多肽或编码MMG8的核酸分子相互作用或结合的那些。这样的试剂(也称作结合试剂)包括但不限于，特异性结合 MMG8的MMG8抗体或其片段、MMG8结合配偶体、适体、以及与编码MMG8多肽的核酸分子杂交的核酸分子等。优选地，结合试剂标记有可检测之物质(即可检测基团)。该结合试剂本身也可作为标记。 [0160] 在一个特定的实施方案中，检测MMG8或MMG8变体的试剂为特异与MMG8或MMG8变体结合的抗体。在一个特定的实施方案中，抗MMG8抗体特异性结合到位于SEQ ID No:2中MMG8的羧基末端的表位。 [0161] 在特定的实施方案中，本发明的抗体或适体特异性结合包含SEQ ID No:2的氨基酸926-1116的表位，或者特异性结合包含SEQ ID NO.2的1098–1116中的1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个连续氨基酸片段的表位。 [0162] 在特定的实施方案中，本发明的抗体或适体特异性结合包含SEQ ID No:2的氨基酸926-1116的表位，或特异性结合包含与SEQ ID No:2的926–1116至少75%、80%、85%、90%或 95%相同的片段的表位。 [0163] 在一个实施方案中，结合MMG8或其变体的试剂(如抗MMG8抗体)标记有可检测的物质。在一个特定的实施方案中，所述试剂被荧光 标记。在一个实施方案中，MMG8或其变体水平通过测量结合复合物的荧光水平来确定。 [0164] 在一个优选的实施方案中，本发明提供一种用于检测MMG8或MMG8变体的存在或水平的方法，包括: [0165] (a)将样品与对MMG8或MMG8变体特异的第一抗体和对MMG8或MMG8变体特异的第二抗体孵育，其中所述第一抗体直接或间接标记有可检测物质，所述第二个抗体被固定化； [0166] (b)从第二抗体中分离第一抗体，以提供第一抗体相和第二抗体相；和 [0167] (c)检测第一或第二抗体相中的可检测物质，从而对样品中的MMG8及MMG8变体进行定量。 [0168] 在一个实施方案中，MMG8或其变体可以通过将样品与第一抗体或第一适体和第二抗体或第二适体孵育来检测。在一个实施方案中，第一抗体或第一适体特异性结合包含SEQ ID No:2的氨基酸926–1116的表位。在一个实施方案中，第一抗体或第一适体结合至包含与SEQ ID No:2的926–1116至少75%、80%、85%、90%或95%相同的片段的表位。在一个实施方案中，第二抗体或第二适体特异性结合包含含有SEQ ID No2中的50、45、40、35、30、25、20、15、 14、13、12、11、10、9、8、7、6、或5个氨基酸的片段的表位。在一个实施方案中，第二抗体或第二适体特异性结合与包含SEQ ID No2中的50、45、40、35、30、25、20、15、14、13、12、11、10、9、 8、7、6、或5个氨基酸的片段至少75%、80%、85%、90%或95%相同的表位。 [0169] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种检测编码MMG8或MMG8变体的核酸分子的存在的方法，包括: [0170] (a)使样品与选择性结合所述核酸分子的试剂接触；和 [0171] (b)检测所述试剂是否与样品中的核酸分子结合。 [0172] 在一个特定的实施方案中，结合试剂为第二核酸分子，其包含SEQ ID No:1中的至少8个核酸或其互补序列。在一个特定的实施方案中，结合试剂是第二核酸分子，其包含SEQ ID No:1的3294–3348，或SEQ ID No:1的3294-3351，或其任意互补序列。 [0173] 术语“检测”包括分析或确定MMG8或其变体(编码MMG8或其变体的核酸)、其亚基、或试剂绑定靶标的组合等的存在或缺失。这个术语包括定量、半定量和定性检测方法。 [0174] 检测本发明的MMG8和其他生物标记物(如蛋白质或肽和核酸)的方法已众所周知，其包括但不限于，Western印迹、Northern印迹、Southern印迹、ELISA、PCR、免疫沉淀、免疫荧光、放射免疫测定、流式细胞术、免疫细胞化学、核酸杂交技术、核酸反转录方法和核酸扩增方法。 [0175] 优选地，在本发明的各种实施方案中，检测方法提供了具有有关检测对象的样品中的MMG8的存在、缺失、或量的信息的输出(即，读数或信号)。例如，输出可以是定性的(如”阳性”或“阴性”)，或定量的(如浓度，例如每毫升的纳克数)。 [0176] 术语“样品”、“生物样品”等是指一种已知或怀疑表达或含有MMG8或其变体的材料。样品可以来自任何生物源，如组织或提取物，包括细胞(如肿瘤细胞)和生理性液体，例如全血、血浆、血清、腹膜液腹水等。样品可以来自动物，优选是哺乳动物，最优选是人类。样品可以通过任何方法进行预处理和/或可以在任何方便且不干扰测定的培养基中制备。样品可以在使用前被处理，如由血液制备血浆、稀释粘性流体、在样品中应用一种或多种蛋白酶抑制剂。样品处理可以包括过滤、蒸馏、萃取、浓缩、干扰成分失活，添加试剂等。 [0177] 药物筛选试验 [0178] 本发明的另一个方面涉及MMG8或MMG8变体在筛选可以用于治疗以下疾病的治疗药物中的用途，所述疾病包括但不限于，与微管组织和/或成核缺陷有关的疾病;与蛋白质 修饰、分泌、运输缺陷相关的疾病；以及与细胞增殖异常相关的疾病。在一个特定的实施方案中，本发明的MMG8或其变体可用于筛选抗癌药物。治疗试剂可以为药物、化学物质、化合物、蛋白质或肽、或核酸分子(例如DNA、如siRNA之类的RNA)。 [0179] 在一个实施方案中，本发明所提供的方法可用于筛选降低MMG8 或其变体转录物在细胞内的水平(如MMG8的初级、中间和成熟mRNA转录物)的治疗药物。此外，本发明的方法可用于筛选可抑制或降低MMG8表达水平的治疗药物。 [0180] 在一个实施方案中，本发明提供了一种筛选抑制MMG8或MMG8变体的疗法的方法，其中所述方法包括: [0181] a)提供测试样品，该样品含有表达MMG8或MMG8变体的细胞； [0182] b)将候选试剂与测试样品接触； [0183] c)确定MMG8或其变体在该测试样品中的水平；和 [0184] d)如果候选试剂降低了测试样品中的MMG8或MMG8变体的水平，则选择所述试剂。 [0185] MMG8或其变体的水平可通过测量MMG8蛋白质和/或MMG8转录物而确定。 [0186] 在一个实施方案中，所述方法可用于筛选调节本发明的MMG8或其变体的活性的治疗药物。在特定的实施方案中，本发明提供了用于筛选这样的治疗药物的方法，所述治疗药物可调节、增强或抑制MMG8或其变体与选自AKAP450、EB1、EB3和γ-微管蛋白复合物组分 （如GCP2和GCP3）中的蛋白之间的结合。在特定的实施方案中，本发明可用于筛选调节细胞活性的治疗药物，所述细胞活性包括但不限于，微管组织；微管成核；蛋白质翻译后修饰、分泌和运输；细胞分裂、增殖和迁移。 [0187] 在一个实施方案中，本发明提供了一种用于筛选调节MMG8或MMG8变体的活性的试剂的方法，包括: [0188] a)提供含有表达MMG8或MMG8变体的细胞的第一测试样品； [0189] b)使所述第一测试样品与和MMG8或MMG8变体相互作用的蛋白质接触； [0190] c)确定在所述第一测试样品中MMG8或MMG8变体与和MMG8或MMG8变体相互作用的蛋白质的第一结合水平； [0191] d)提供第二测试样品，此测试样品含有表达MMG8或MMG8变体的细胞； [0192] e)使所述第二样品和候选试剂接触； [0193] f)在步骤e)后，使所述第二测试样品与和MMG8或MMG8变体相互作用的蛋白质接触； [0194] g)确定在所述第二测试样品中MMG8或MMG8变体与和MMG8或MMG8变体相互作用的蛋白质的第二结合水平；和 [0195] h)如果所述第二水平与所述第一水平不同，则选择所述候选试剂作为MMG8或MMG8变体的调节剂。 [0196] 在一个实施方案中，与MMG8或其变体相互作用的蛋白质选自AKAP450、EB1、EB3、GCP2或GCP3。在一个实施方案中，如果第一水平和第二水平之间的差大于10%、15%、20%、 25%、30%、40%、50%、60%m、70%、80%、90%或100%，则选择候选试剂作为MMG8的调制剂。在一个实施方案中，如果所述第二水平低于所述第一水平，则所选择的试剂为MMG8的抑制剂。在一个实施方案中，如果所述第二水平高于所述第一水平，则所选择的试剂为MMG8的抑制剂。 [0197] 本发明的调节MMG8或其变体的水平和/或活性的试剂可以用于疾病的治疗，所述疾病包括但不限于，与微管组织和/或成核缺陷有关的疾病；与蛋白质修饰、分泌、运输缺陷相关的疾病；涉及细胞异常增殖的疾病。在一个特定的实施方案中，调节MMG8水平或活性的试剂可以用于治疗的疾病包括，但不限于，神经元病（neuronal disease）、糖尿病、囊性纤维化、溶酶体贮积症(如涉及LAMP-1的疾病)。 [0199] 在进一步的实施方案中，本发明提供了一种筛选抗癌试剂的方法，其中所述方法包括: [0200] a)提供包含表达MMG8或其变体的肿瘤细胞的测试样品； [0201] b)使候选试剂与所述测试样品接触； [0202] c)确定测试样品中肿瘤细胞群体的水平； [0203] d)比较测试样品中的所述水平与对照样品中的所述水平；和 [0204] e)如果测试样品中的所述水平低于对照样品，则选择所述候选试剂。 [0205] 在一个实施方案中，如果测试样品中的肿瘤细胞群体的水平低于对照样品超过10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%，则选择候选试剂作为抗癌试剂。 [0206] MMG8相关疾病的治疗 [0207] 在另一个方面，本发明提供了预防或治疗与MMG8缺陷相关的疾病的方法。在一个实施方案中，本发明可以用于治疗的疾病包括，但不限于，神经元病、糖尿病、囊性纤维化、溶酶体贮积症和癌症。 [0208] 在一个实施方案中，本发明提供了一种用于治疗与MMG8或MMG8变体的水平异常增高有关的疾病的方法，包括：抑制或降低对象中MMG8或MMG8变体的表达。 [0209] 在一个特定的实施方案中，本发明提供了一种用于治疗与MMG8的水平异常增高有关的疾病的方法，包括：对需要所述治疗的对象施用有效量的、抑制所述对象中的MMG8或 MMG8变体表达的si-RNA。在另一个特定实施方案中，MMG8或其变体的水平或活性可以通过 对需要所述治疗的对象施用有效量的、特异性结合MMG8或MMG8变体的抗MMG8抗体来降低或 抑制。与MMG8的水平异常增高相关的疾病包括，例如，癌症，如大脑癌、皮肤癌、胃癌和乳腺癌。特别的，本发明可用于抑制肿瘤转移。 [0210] 在另一实施方案中，本发明提供了一种治疗与MMG8的水平异常降低相关的疾病的方法，包括：增加MMG8或MMG8变体的表达。 [0211] 在一个特定的实施方案中，本发明提供了一种治疗与MMG8的水平异常降低相关的疾病的方法，包括对需要所述治疗的对象施用有效量的MMG8蛋白质或其片段、编码MMG8蛋 白或其片段的核酸分子，或包含所述核酸分子的载体或宿主细胞。与MMG8水平异常降低相 关的疾病包括溶酶体贮积症。 [0212] 在另一个方面，本发明提供了一种调节细胞活性的方法，其包括调节对象中的MMG8的水平或活性。根据本发明，可调节的细胞活性包括，但不限于，微管在高尔基体上的生长、组织、和/或成核；AKAP450的稳定性；γTuCs在高尔基体上的定位；和蛋白质的翻译后修饰(如糖 基化)、运输和分泌。 [0213] 在一个实施方案中，本发明提供了一种通过抑制myomegalin的表达或活性来抑制LAMP-1的ER至高尔基体运输的方法，其中所述方法包括对需要所述抑制的细胞施用有效量 的、抑制本发明的myomegalin同工型表达的siRNA，或有效量的、特异性结合本发明的 myomegalin同工型的抗体或适体。在一个特定的实施方案中，所述方法可以用于治疗LAMP- 1相关的溶酶体贮积症。 [0214] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种降低分子量约90kDa的糖基化CD44的水平的方法，该方法包括，对需要所述降低的细胞施用有效量的、抑制本发明的myomegalin同工型表达的siRNA，或有效量的、特异性结合本发明的myomegalin同工型的抗体或适体。 [0215] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种增加分子量约90kDa的糖基化CD44的水平的方法，其包括对需要所述增加的细胞施用有效量的本发明的myomegalin同工型，或有 效量的编码本发明的myomegalin同工型的核酸分子。 [0216] 此处使用之术语“对象”是指有机体，包括哺乳动物如灵长类动物。受益于本发明方法的哺乳动物物种包括，但不限于，类人猿、黑猩猩、猩猩、人、猴子；以及驯化和/或实验室动物，如狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、鸡、小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。通常，对象为人。 [0217] 此处使用之术语“治疗”或其任何语法变形形式（例如，进行治疗、治疗用和治疗等）包括但不限于，改善或缓解疾病或病症的症状，降低、压制、抑制、减轻或影响病症的进展、严重性和/或范围。 [0218] 此处使用之术语“预防”或其任何语法变形形式（例如，进行预防、预防用和预防等）包括但不限于，延缓症状的发作、防止疾病的复发、增加症状发作的潜伏期、或它们的组合。此处所述之预防不需要完全没有症状。 [0219] 此处使用之术语“需要所述治疗的对象”包括特别有风险患有、具有症状或诊断患有MMG8或MMG8变体相关疾病的对象。在一个特定实施方案中，本发明包括诊断对象是否患有MMG8相关疾病，其中对诊断患有所述疾病的对象施用本发明的治疗试剂或组合物。 [0220] 此处使用之术语“有效量”，指的是能够预防、改善、或治疗疾病的量。在特定的实施方案中，有效量能够对MMG8的水平和/或活性进行至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%、或100%的调节。 [0221] 治疗组合物和配方 [0222] 本发明进一步提供了治疗组合物，其包含治疗有效量的治疗试剂和组合物，以及制药上可接受的载体和佐剂。 [0223] 所使用之术语“制药上可接受的”、“生理上可耐受的”和其语法变形形式，包括可交换使用的组合物、载体、稀释剂和试剂，并且是指所述物质能够对或基于诸如哺乳动物等对象施用。 [0225] 合适的载体还包括乙醇、二甲亚砜、甘油、二氧化硅、氧化铝、淀粉、山梨糖醇、肌醇、木糖醇、D-木糖、甘露糖醇、粉末状纤维素、微晶纤维素、滑石、胶体二氧化硅、碳酸钙、磷酸钙、钙铝硅酸盐、氢氧化铝、磷酸淀粉钠、卵磷脂以及等效载体和稀释剂。盐溶液以及葡萄糖和甘油的水溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。 [0226] 合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白沉粉、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。治疗组合物，如果需要，也可以包含少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。 [0227] 可以结合载体材料从而产生单一剂型的活性成分的量会有所改变，这取决于病症的类型和需要治疗的对象。一般来说，治疗组合物包含约5%至约95%的活性成分(w/w)。更具体地说，治疗组合物包含约20%(w/w)至约80%或约30%至约70%的活性成分(w/w)。 [0228] 本发明中的治疗试剂或组合物可以根据已知的制备药学上有用的组合物的方法配制。配方的详细描述可见于多个来源，这些来源对本领域技术人员来说是公知的并且容 易获得。例如，E.W.Martin的 “Remington's Pharmaceutical Science”中所述之配方可结合本发明使用。一般来说，本发明的组合物被配制为有效量的生物活性成分与适当载体混 合，以促进组合物的有效施用。 [0229] 本发明的治疗或药物组合物也可以配制成中性或盐形式。制药上可接受的盐包括与自由氨基形成的那些，例如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些，以及与自由羧基形成的那些，例如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙胺基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些。 [0230] 含有溶解或分散于其中的活性成分的药物组合物的制备方法已为业内众所周知，并且不需要受限于配方。通常这样的组合物被制成可注射的水溶液或悬浮液；然而，也可制成适于溶液或悬浮液、在使用前配成液体的固体剂型。制备物也可以被乳化，比如水包油乳液。 [0232] 给药途径 [0233] 本发明的治疗试剂及组合物可以通过标准的途径施用给接受治疗的对象，包括口服、吸入或肠胃外给药（其包括静脉内、皮下、局部、透皮、皮内、穿粘膜、腹膜内、肌内、囊内、眶内、心内、经气管、皮下、表皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外、和胸骨内注射）、输注、和电穿孔、以及作为将插入(暂时或永久)对象的任意医疗器材或物体的部件而共给药。 [0234] 本发明的治疗试剂或药物组合物的疾病治疗有效量取决于疾病、病症或紊乱的性质，并且可以用标准的临床技术确定。一般来说，剂量范围为约0.01到约2000毫克，约0.01到约1000毫克，约0.01到约500毫克，约0.01到约300毫克，约0.01到约200毫克，或约0.01到约100毫克。该单位剂量可根据医嘱及每个病人的情况每两个星期给药一次或数次（例如二次、三次、和四次）、每一个星期给药一次或数次（例如二次、三次、和四次）、一次或数次（例如二次、三次、和四次）一星期两次，每天给药一次或数次（例如二次、三次、和四次）。 [0235] 说明性的，所施用的有效成分的剂量水平可为：静脉内，0.01到大约20毫克/公斤动物(身体)重量；腹膜内，0.01到约100毫克/公斤动物(身体)重量；皮下，0.01到约100毫克/公斤动物(身体)重量；肌内，0.01到约100毫克/公斤动物(身体)重量；口服0.01到约200毫克/公斤动物(身体)重量，优选约1到100毫克/公斤动物(身体)重量；鼻内滴注，0.01到大约20毫克/公斤动物(身体)重量；气溶胶，0.01到大约20毫克/公斤动物(身体)重量。 [0236] 一旦病人的病情发生改善，如果需要可以施用维持剂量。随后，用药的剂量或频率，或两者，可以随着症状而降低至所改善的病情得以保持的水平。当症状已经减轻到所需的水平，治疗应该停止。然而，患者可能需要长期间歇性治疗以防止任何疾病症状复发。 [0237] 此外，在体外试验中，可以任选被用来帮助确定最佳剂量范围。用于药品配方的精确剂量还将取决于给药途径，和疾病、病症或紊乱的严重性，并且应该根据医嘱和每个病人的情况确定。有效剂量可以从体外或动物模型试验系统中所得的剂量-反应曲线推断。 [0238] 与MMG8相关疾病的诊断 [0239] 本发明的另一个方面涉及诊断与本发明的MMG8或MMG8变体水平异常相关疾病的方法。在一个实施方案中，该方法包括: [0240] a)从对象中获得生物样品； [0241] b)测量MMG8或其变体在生物样品中的水平；和 [0242] c)确定对象中的MMG8或其变体的水平。 [0243] 在一个特定的实施方案中，MMG8蛋白质生物标志物包含SEQ ID No:2。 [0244] 检测MMG8相关疾病的方法可基于确定样品中的MMG8或其变体的水平以及正常人群中该生物标志物的预定水平，而后将该水平与发病率、严重度、和/或人群中发生该特定疾病的频率相关联。此外，预定的值可以是单一值、多个值、单一范围或多个范围。因此，诊断可以基于确定对象的水平落入哪一个预定参考值或范围。 [0245] MMG8的水平可以通过MMG8蛋白质或MMG8转录物的水平确 定。在一个特定的实施方案中，MMG8生物标志物可用于诊断溶酶体贮积症。 [0246] 设备 [0247] 本发明的方法可在固体支撑物上进行。所用的固体支撑物可以是常规用于分析生物样品中的分析物的那些，通常由以下材料制成，例如纤维素、交联葡聚糖凝胶等多糖材 料，并且可以部分包有外壳以利固体支撑物的保护和/或处理。根据所需的应用，固体支撑物可以是刚性、半刚性、柔性、弹性(有形状记忆)等。样品中的MMG8可以在体内或体外(非体内)检测出。根据本发明的实施方案，当确定样品中的MMG8的量不涉及将样品从身体中(即 体内)取出时，支撑物应该对对象无害，且可以以任何形式方便插入到身体的适当部位。例如，支撑物可以是由聚四氟乙烯、聚苯乙烯或其他刚性无害塑料材料制成的探针，其大小和形状使得其能够被引入对象。选择合适的惰性支撑物及其用于所需目的的大小应为业内熟 练技术人员所熟知。 [0248] 本发明的试验(方法)的接触步骤可以包括，将生物样品和固体支撑物(如反应容器、微导管、管、微管、孔、多孔板或其他固体支撑物)接触、结合或混合。在本发明的一个实施方案中，与生物样品接触的固体支撑物具有使横向流动的液体介质能够被分析的吸收剂 垫或膜，例如可从Millipore公司(贝德福德，MA)购买的那些，包括但不限于Hi-Flow PlusTM膜和膜卡，和Sure WickTM垫材料。 [0249] 免疫层析试验可用于检测各种目的分析物，其也被称为横向流动测试条或简称为测试条，此试验已被人们所熟知，并且可以被用于检测MMG8。横向流测动试的好处包括用户友好型格式、快速的结果、各种气候下长期稳定、和相对较低的制造成本。这些特点使横向流动测试对于涉及各种分析物的家庭检验、快速重点照护检验、野外检验等应用是理想的。 其测试原理简单易懂。从本质上讲，任何可以结合到视觉可检测的固体支撑物(如染色微 球)的配体，都可以定性甚至很多情况下半定量地进行检验。例如，Fernandez-Sanchez等描述了用于检测血清中游离和总前列腺特异性抗原的一步法横向流动免疫条(参见文 献 “J.Immuno.Methods,2005,307(1-2):1-12”,以引用方式并入本文)，其可以用于检测生物样品中的MMG8。 [0250] 样品和/或MMG8特异性结合试剂可以以阵列方式排布于固体支撑物（或多种支撑物）上，以进行多重检测或分析。“以阵列方式排布”是指将文库(如，以相同靶标分子或不同靶标分子为靶标的一系列不同样品或一系列装置)或其他集合体的成员组织或排布成逻辑 或物理列阵。因此，“阵列”是指例如生物样品的物理或逻辑排布。物理阵列可以是任何“空间格式”或”物理网格格式”，其中相应的文库成员以有序的方式排列成物理排布，使其便于组合筛选。例如，对应于样品文库的单一或组合成员的样品可以在例如多孔板上排列为一 系列被编号的行和列。相似地，结合试剂可以铺在或沉积在微量滴定（如）96孔、384孔、或 1536孔板（或盘）上。MMG8特异性结合试剂可以固定在固体支撑物上。 [0251] 检测MMG8和其他生物标记物以及对样品进行的其他试验可以与检测其他目标分子同时或顺序进行，并且可以以高通量的形式、自动化的方式进行。 [0252] MMG8特异性结合试剂可以被沉积（但在结合区是自由的（非固定化））和固定在固体支撑物的捕获区上。MMG8特异性结合试剂可以通过例如非特异性吸附被固定到支撑物上，或通过共价键连接到支撑物上。将结合试剂固定在支撑物上的方法已为业内熟知，其在美国专利Nos.4399217、4381291、4357311、4343312和4260678中有所描述，它们以引用的方式并入本文。 [0253] 试剂盒 [0254] 在另一个方面，本发明提供的试剂盒包含检测MMG8或其变体的水平或活性、筛选治疗药物、和/或诊断或监测与MMG8或其变体相关的疾病所需的要素。优选地，试剂盒包含收集病人的生物液体的容器和和检测MMG8或其编码核酸在所述液体中存在的试剂。试剂盒 的成分可以水性介质或为冻干品的形式包装。 [0255] 在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种包含本发明的 MMG8或其变体的蛋白质芯片。在一个特定实施方案中，蛋白质芯片包含含有SEQ ID No:2的MMG8同工型。 [0256] 本发明的方法可以使用诊断试剂盒进行以定性或定量地检测样品中的MMG8。举个例子，试剂盒可以包含对MMG8特异的结合试剂(例如，抗体)，抗所述抗体的酶标记抗体、和该酶的底物。试剂盒还可以包含固体支撑物如微量多孔滴定板、标准品、测定稀释剂、清洗缓冲液、粘性板封盖和/或使用试剂盒进行本发明的方法的说明书。在一个实施方案中，试剂盒还包含一种或多种应用于待检验的生物样品的蛋白质酶抑制剂(如，蛋白质酶抑制剂 混合物)。 [0257] 试剂以被包装在收集病人生物液体的容器中。当试剂盒中使用的抗体或结合试剂以带有标记（如放射性金属离子或基团）的联合物的形式存在时，联合物的成分可以以完全结合的形式、中间产品的形式、或作为由试剂盒的使用者自行连接的分离的部分而供应。 [0258] 还可以制备这样的试剂盒，其包含一种或多种检测MMG8核酸分子，例如但不限于，全长MMG8核酸、MMG8寡核苷酸、和MMG8的引物对的试剂。试剂可以包装在收集病人生物液体的容器中。核酸可以是标记的形式或待标记的形式。 [0259] 试剂盒的其他成分可以包括，但不限于，收集生物样品的工具、标记检测试剂(结合试剂)的工具、固定生物样品中的MMG8蛋白质或MMG8核酸的膜、将生物样品加到膜上的工具、将试剂与对象的生物样品中的MMG8结合的工具、第二抗体、从对象的生物液体中分离总RNA的工具、进行凝胶电泳的工具、从分离的总RNA合成cDNA的工具、进行杂交试验的工具、和进行PCR的工具等。 [0260] 在这些示例性实施方案中，抗体可以标记有FRET染料、生物荧光共振能量转移(BRET)蛋白质，荧光染料-淬灭染料混合物，β-半乳糖互补分析蛋白质片段。这些抗体可以参与FRET、BRET、荧光猝灭或β-半乳糖互补反应以产生比如荧光、比色或增强的化学发光(ECL)信号。 [0261] 这些方法为通常用于检测特异性抗原抗体反应的方法，并且在一般免疫学教科书中有所描述，此类教科书例如Ivan Roitt,Jonathan Brostoff and David Male的 “Immunology”(London:Mosby,c1998.5th ed.和“Immunobiology:Immune System in Health and Disease/Charles A.Janeway and Paul Travers.Oxford:Blackwell Sci.Pub.,1994”)等，其内容以引用方式并入本文。 [0262] 材料和方法 [0263] MMG8的克隆: [0264] 基于质谱所显示的肽序列，MMG8的编码序列通过用RT-PCR扩增的MMG8的相应的序列置换KIAA0477的羧基端序列而构建。利用定点突变将突变引入MMG8。 [0265] MMG8抗体的产生: [0266] 两段MMG8片段（637-925和926–1116）被分别克隆并在细菌中表达为有His6-标签的蛋白。在6M尿素的存在下，使用Ni2+-氮川三乙酸树脂(Qiagen)纯化蛋白质，并在磷酸盐缓冲盐水中透析。此后，利用637–925或926–1116片段免疫兔。生成的抗637-925和抗926- 1116抗血清分别命名为443M和532C。用固定在硝酸纤维膜上的各自的抗原从血清中纯化抗 体。 [0267] 抑制MMG8表达: [0268] 合成两种针对MMG8的siRNA双链 [0269] (si-MMG8-1,AACCUCCAGUGGCUGAAAGAA(SEQ ID No:25);si-MMG8-2,AAGCAGAGAGACAGCUCUAUA)(SEQ ID No:26)。这两种siRNA用Lipofectamine2000 (Invitrogen公司)转染入细胞。转染70-80小时后，MMG8表达降低80-90%。 [0270] MMG8及其相互作用蛋白质的分离： [0271] 为免疫沉淀MMG8，用补充有蛋白酶抑制剂混合物（Roche公司）的RIPA缓冲液(25mM Tris-HCl，pH7.4，150mM NaCl，1%NP-40，1%脱氧胆酸钠,和0.1%SDS)制备细胞提取物，并澄清提取物。预先经Protein A-Agarose（Invitrogen公司）处理后，提取物与结合至蛋白质A珠子的MMG8抗体在4℃孵育4小时，并搅拌。在免疫沉淀物被洗脱以用于SDS-PAGE之前，珠子被充分清洗。 [0272] 为准备质谱分析样品，蛋白质条带经考马斯亮蓝显色后被切下， 并在胶中进行胰蛋白质酶消化。回收的肽经纳米电子喷射离子源被送入四极杆/飞行时间质谱仪。蛋白质鉴定通过搜索基于串联质谱的无冗余序列数据库进行。 [0273] 抗FLAG抗体免疫沉淀反应使用利用裂解缓冲液（20mMTris-HCl，pH7.4，150mM NaCl，1mM EDTA，1%Triton X-100，1mM二硫苏糖醇,和蛋白酶抑制剂混合物）制备的细胞提取物的抗FLAG抗体偶联珠子(M2，Sigma公司)进行。免疫沉淀物用免疫印迹检测。 [0274] 免疫荧光显微镜检测： [0275] 细胞培养于含10%胎牛血清的培养基、37℃、5%CO2条件下。HeLa、HEK293T、MCF7、IMR5(人神经母细胞瘤细胞系)和C2C12(鼠成肌细胞)生长在DMEM中；人视网膜色素上皮细胞hTERT-RPE1(RPE1)生长在DMEM:Ham's F12(1:1)(Invitrogen公司)培养基中；人胎儿肺 成纤维细胞MRC5生长在MEM(Invitrogen公司)培养基中。C2C12在补充有20%马血清的DMEM 培养基中分化为肌管。 [0276] 为进行免疫染色，细胞或用冷甲醇在-20℃下固定5分钟，或用4%多聚甲醛/磷酸盐缓冲盐水在室温下固定15分钟。在用一抗和随后的二抗染色后，在外荧光显微镜(Eclipse TE2000,Nikon公司)下获得细胞图像。 [0277] 为使在高尔基体上的γ-微管蛋白和EB1可视化，细胞在皂草苷抽提缓冲液(0.1M K-PIPES，pH6.9，2M甘油，5mM MgCl2，2mM EGTA，和0.1%皂草苷)中在冰上抽提30分钟，而后用甲醇固定。为增强γ-微管蛋白的信号，细胞随后经两种二抗染色，首先是AlexaFluor染料标记的山羊二抗(Invitrogen公司)，随后是标记相同染料的驴抗山羊二抗。 [0278] 微管再生长试验： [0279] 通过将细胞置于冰上1小时或用10μg/ml诺考达唑处理它们2小时，细胞的微管完全解聚。为启动微管再生长，低温处理的细胞被转移到37℃水浴。诺考达唑处理的细胞用冰冷的膦酸盐缓冲盐水漂洗数次后，在预热至37℃的培养基中培养。在固定之前，细胞经细胞骨架稳定缓冲液(50mM咪唑(imidazole)，pH6.8，50mM KCl，0.5mM MgCl2，0.1mM EGTA和 0.1mM EDTA，4%PEG4000，和0.1%皂草苷)简单抽 提。 [0280] 微管结合分析： [0281] 为测试微管结合，在PEM缓冲液(100mm PIPES，pH6.9，1mmEGTA，1mm MgCl2和1%Triton X-100)中在冰上制备HEK293T提取物，并在100000g下离心30分钟以使其澄清。之后微管在提取物中用20μM紫杉醇和0.5mM GTP在37℃下聚合20分钟。聚合之后，将微管覆盖在缓冲液中的20%蔗糖垫上以在25℃下离心(30000g；30分钟)沉降。上清和团块经SDS-PAGE解析后进行免疫印迹。 [0282] 细胞增殖测定： [0284] 例子 [0285] 下面是阐述如何应用本发明的例子。这些例子不应理解为限制性的。除非另有注明，所有的百分比是重量百分比，所有溶剂混合物的比例是体积比。 [0286] 实施例1-MMG8的鉴定 [0287] 为检测在增殖细胞培养物中的MMG，使用以编码人MMG同工型1的474–762的区域为靶标的寡核苷酸引物进行RT-PCR。通过搜索基因数据库，该靶标区域存在于所有目前鉴定 的大MMG变体中。从HeLa细胞中提取的总RNA中特异性扩增了预期大小的寡核苷酸条带(图 1A)。经DNA测序分析验证了RT-PCR产物的序列。这个片段对应于编码MMG同工型1的氨基酸 474–762和MMG8的637-925的区域。 [0288] RT-PCR产物还被克隆进表达载体，并在细菌中表达。表达的蛋白质被纯化以免疫兔子。所得之抗体命名为443M，其特异性检测人MMG蛋白——HeLa细胞提取物的免疫印迹上的约150kDa的单一条带(图1B)。 [0289] 用443M将此MMG蛋白从在RIPA缓冲液中制备的HeLa提取物 中免疫沉淀(图1C)，并切下以进行质谱分析。串联质谱分析总共得到13个肽序列。大多数的肽序列与MMG变体 GenBank编号NP_001002811(SEQ ID No:7)匹配，最后4个肽为cDNA序列hCG1755149所编码 (图1E和表1)。特别的是，13号肽以这两个cDNA序列的重叠区所编码的最后9个残基作为开 始，之后的7个残基仅存在于hCG1755149中。免疫沉淀的MMG8蛋白质的序列很大程度上类似于NP_001002811(SEQ ID NO:7)，例外是羧基尾巴区域。 [0290] 表1.用质谱鉴定的MMG8肽 [0291] [0292] 此新MMG变体，指定为MMG8，根据蛋白质测序和RT-PCR数据被克隆。MMG8的羧基末端区不同于所有其他MMG变体。MMG8的同源蛋白质在苏门答腊猩猩(Genbank编号：NP_ 001126198)(SEQ ID NO:12)和鼠(Genbank编号：AAI41173)(SEQ ID NO:13)中检测到，与其全序列同源性分别为98%和92%。MMG8也与原鸡XP_423459(SEQ ID NO:14)、非洲爪蟾NP_ 001072886(SEQ ID NO:15)、斑马鱼CAI11891(SEQ ID NO:16)和NP_956195(SEQ ID NO:17) 有较高的同源性。MMG8同源蛋白质在除哺乳动物外的鸡、非洲爪蟾、斑马鱼中均有发现，这说明其在脊椎动物中的保守性。在检测的细胞培养物中，MMG8是人MMG基因表达的主要同工型，此基因有多种拼接方式。迄今为止，人MMG的其他已知的拼接产物为MMG同工型1(参见文献“Verde et al.,J Biol.Chem.276:11189-11198(2001)”)。 [0293] 第二抗体，532C，被制成针对MMG8的羧基末端。532C和443M抗体产生相同的免疫沉淀和免疫印迹结果，除非另有说明，这里显示的结果皆用532C得到。 [0294] MMG8在增生的上皮细胞、成纤维细胞和神经母细胞瘤细胞的免疫印迹中呈单一蛋白质条带(图1D)。在C2C12肌管中，还发现两个较小的蛋白质带位于约150kDa的条带旁(图 1D)，这表明存在其他同工型或蛋白质水解产物。然而，约230kDa的MMG同工型1虽然在大鼠心脏组织中容易被抗体识别，但未在这些细胞培养物中检测到(图1D)。 [0295] 为探索MMG8的功能，对MMG8表达的进行了RNAi介导的抑制。设计了针对MMG8的两种siRNA寡核苷酸。转染两种siRNA中任意一种可有效使蛋白质减少约90%(图1F)。细胞表达的MMG8显示了突出的高尔基体定位；而转染了针对MMG8的siRNA的细胞在用抗MMG8抗体染 色后仅显示弱的背景，并且未显示高尔基体定位模式(图1G)，此结果印证了抗MMG8抗体染 色的特异性。此外，在转染了MMG8-siRNA的细胞中，高尔基体破碎成碎片，并与细胞核大面积重叠(图1G)。此结果表明，高尔基体结构的组织需要MMG8的存在。 [0296] 实施例2-MMG8与AKAP450的结合 [0297] 为确定MMG8的结合蛋白质，首先对MMG8进行免疫沉淀反应，免疫沉淀物用质谱分析。结果表明，MMG8与蛋白激酶A(PKA)的调节亚基以及EB1相互作用。 [0298] 为研究MMG8与PKA之间的相互作用，对MMG8和AKAP450 进行了免疫共沉淀。AKAP450是顺面高尔基体蛋白质，其与蛋白激酶A的调节亚基相结合(参见文献“Keryer et al.,Exp.Cell Res.204:230-240(1993)”；“Schmidt et al.,J.Biol.Chem.274:3055-3066(1999)”；“Takahashi et al.,J.Biol.Chem.274:17267-17274(1999)”；“Witczak et al.,EMBO J.18:1858-1868(1999)”；“Rivero et al.,EMBO J.28:1016-1028(2009)”)。正向和反向的实验显示，AKAP450与MMG8彼此特异性共沉淀(图2A)。MMG8的免疫沉淀几乎完全消耗了HeLa裂解液中的AKAP450(图2A)。在反向实验中，抗AKAP450抗体进行的免疫沉淀相应地 使MMG8也共沉淀(图2A)。对免疫沉淀物的定量分析显示，MMG8和AKAP450在裂解液中组成了化学计量的复合物。 [0299] 为确定MMG8与AKAP450相互作用的结构域，各种MMG8片段被异位表达以进行与AKAP450的免疫共沉淀反应。结果表明，由氨基酸1–389构成的头部区对结合AKAP450是必不可少的；而包含氨基酸390–1116的MMG8片段未结合AKAP450(图2B)。另外，将1–389截短会严重影响与AKAP450的结合活性(图2B)。同样，只有包含1-389的MMG8片段，结合到蛋白激酶A(图2C)。这些结果表明，MMG8通过AKAP450间接结合蛋白激酶A。 [0300] 当在低水平表达时，包含氨基酸1-389的MMG8片段显示特定的高尔基体定位(图2D)。当高度表达时，此MMG8片段将内源MMG8从高尔基体上全部置换(图2D)。相比之下，389- 1116的表达并没有显示任何特定的模式(图2D)。结果表明，氨基酸残基1–389是MMG8的 AKAP450结合和高尔基体定位的结构域。 [0301] 在RNAi介导的MMG8表达抑制的实验中，用免疫印迹检测AKAP450。MMG8表达的有效抑制显著降低了AKAP450的蛋白质水平；AKAP450的降低与MMG8的降低呈相关性(图3A)。相 似的，当AKAP450表达经siRNA干扰而被抑制约80%时，MMG8的量也显著降低（约65%）(图3A)。 结果表明，MMG8和AKAP450的蛋白质水平是相互关联的。 [0302] 为研究MMG8和AKAP450是否在稳定性上彼此依赖，蛋白酶体抑制剂MG132被应用于MMG8或AKAP450被抑制的细胞。在MMG8 被抑制的细胞中AKAP450的蛋白质水平随MG132处理 的时间逐渐增加，并最终接近其在对照细胞中的水平(图3B)。而在AKAP450被抑制的细胞 中，MG132处理也可显著提高MMG8的量(图3B)。在对照的转染细胞中，MMG8和AKAP450的水平没有随着MG132的处理而显著改变(图3B)。结果表明，在不存在MMG8或AKAP450时，另一个蛋白质变得不稳定，并且被蛋白酶体降解。 [0303] 实施例3-MMG8对微管在高尔基体上成核的作用 [0304] 本实施例考察MMG8是否与结合AKAP450的γTuC相互作用，AKAP450是微管在高尔基体上成核必不可少的顺面高尔基体蛋白(参见文献“Rivero et al.,EMBO J.28:1016- 1028(2009)”;“Takahashi et al.,Mol.Biol.Cell13:3235-3245(2002)”)。 [0305] 针对MMG8的免疫沉淀使γ-微管蛋白和GCP2(γ-微管蛋白复合物蛋白2)共沉淀。γ-微管蛋白和GCP2均为所检测的γTuC的核心组件(图4A)。在彼此反向的实验中，MMG8特 异性地与GCP3(γ-微管蛋白复合物蛋白3)共沉淀，GCP3为γTuC的另一核心组份（图4B）。这些结果表明，MMG8与γTuC结合。 [0306] 为检测γTuC在高尔基体上的定位是否需要MMG8，使MMG8的表达被抑制，然后对γ-微管蛋白进行免疫染色。RNAi介导的MMG8的减少消除了γ-微管蛋白与高尔基体的结 合，而并不显著影响其中心体染色(图4C)。结果显示MMG8为γTuC募集到高尔基体上所需，但不为γTuC募集到中心体上所需。 [0307] 这个实施例还检验了MMG8在微管经诺考达唑诱导解聚后重新成核中的作用。在试验前，对RPE1细胞转染对照或针对MMG8的siRNA。在诺考达唑处理的对照细胞中并于洗脱诺考达唑2分钟，短微管出现在破碎的高尔基体上，以及中心体呈现星状微管(图5A)。相比之下，MMG8被抑制的细胞未显示微管从高尔基体上生长；减少MMG8没有显示出对中心体的重 新生长有可见的影响(图5A)。结果表明，MMG8的降低抑制微管在高尔基体上的成核，但并不影响中心体成核。 [0308] 在RPE1细胞中，微管集中于高尔基体及其共定位的中心体从而形成放射状，而高尔基体区域具有高密度的微管(图5B)。抑制MMG8 表达显著降低高尔基体处的微管密度(图 5B)。同时，在MMG8被抑制的细胞中，微管并不集中在高尔基体区域(图5B)。此结果进一步支持，MMG8为微管在高尔基体上的生长和组织所需。 [0309] 实施例4-MMG8与EB1/EB3的结合 [0310] 质谱的结果表明，MMG8与EB1相互结合。MMG8免疫沉淀反应被用以确定是否MMG8与内源EB1共沉淀。免疫沉淀物的免疫印迹显示MMG8与EB1特异性结合(图6A)。 [0311] MMG8包含可能的SxIP基序，此结构是与EB1/EB3结合微管正端跟踪信号。在此基序中，异亮氨酸(Ile)/亮氨酸(Leu)-脯氨酸(Pro)二肽对EB1/EB3的结合至关重要(参见文献 “Honnappa et al.,EMBO J.24:261-269(2005)”)。构建了MMG8突变体，其中二肽残基 Leu311-Pro312被替换为两个丙氨酸。构建了包含了SxIP基序（Ser-x-Ile-Pro）的MMG8片段（即1–389）和其L311A/P312A突变体。 [0312] 片段1-389显示出与全长蛋白相似的EB1结合活性(图6B-C)。与野生型MMG8不同，L311A/P312A突变体完全失去了该结合活性(图6B-C)。数据证实了MMG8的SxIP基序为结合 EB1所需。 [0313] 这个例子还检测了MMG8和EB3之间的结合。EB3存在于野生型MMG8的免疫沉淀物中，但是不与MMG8的L311A/P312A突变体共存于沉淀物中(图6D)。结果表明，SxIP确实为 MMG8的EB3结合所需。 [0314] EB1定位于细胞质并与微管结合。为使EB1是否定位于高尔基体可视化，细胞在能保存高尔基体网络的条件下被抽提以除去细胞溶质和微管结合蛋白。提取后，细胞用于免 疫染色。EB1显现高尔基体模式，并与MMG8的荧光信号合并得很好(图6E)。RNAi介导的MMG8抑制消除了EB1在的高尔基体上的染色(图6E)，但对EB1与生长微管顶端的结合没有可见的 影响。结果表明，EB1以依赖与MMG8结合的方式定位于高尔基体。 [0315] 为了测试MMG8是否与微管结合，以及EB1/EB3是否参与此结合，进行了微管结合试验。简要地说，在紫杉醇诱导聚合后，细胞提 取物中的微管形成团块。为破坏MMG8和EB1/EB3之间的相互作用，过表达了EB1的羧基末端片段(185-268)，其具有与SxIP基序结合的 EBH结构域(参见文献“Askham et al.,Mol.Biol.Cell13:3627-3645(2002)”)。作为对照，表达了用作蛋白标签的GFP。 [0316] 结果表明，在没有微管的条件下，MMG8不发生沉淀(图7)。在对照细胞中，在微管团块中易于检测到MMG8(图7)。EB1片段185–268的过表达显著降低了MMG8与微管的共沉淀(图7)。结果表明，MMG8通过与EB1/EB3形成复合物而与微管结合。 [0317] 实施例5-MMG8为细胞增殖所需 [0318] 这个实施例表明，细胞增殖需要MMG8。转染了对照siRNA的HeLa细胞显示正常的细胞生长(图8)。而破坏MMG8的表达会使细胞增殖停止(图8)。此外，破坏表达并不造成严重的细胞死亡。使用乳腺癌细胞系MCF-7也获得了类似结果。结果表明抑制MMG8可抑制肿瘤细胞的增殖，故此，MMG8可以作为筛选候选的抗癌疗法的靶标。 [0319] 实施例6–敲除MMG8导致了蛋白质糖基化缺陷 [0320] 很多膜结合蛋白质或分泌蛋白质从内质网运输到高尔基体，在此过程中它们经历翻译后修饰，如糖基化。这个实施例研究MMG8对翻译后修饰，如糖基化的影响。 [0321] 为了说明，检测了LAMP-1和CD44的糖基化。LAMP-1是一种溶酶体膜蛋白质，其经历了两个阶段的糖基化：合成时在内质网中(第一阶段)以及在高尔基体中(第二阶段)(参见文献“Carlsson et al.,J.Biol.Chem.263:18911-18919(1988)”)。MMG8敲除的细胞包含 LAMP-1前体和成熟LAMP-1(图9A)，这表明MMG8敲除阻碍了蛋白质在溶酶体中的降解(参见 文献“Meikle et al.,Clin.Chem.43:1325-1335(1997)”)，这可能是由于影响或减缓了蛋白酶到溶酶体的运输(参见文献“Zhu et al.,Mol.Biol.Cell.10:537-549(1999)”)。同时，在MMG8敲除的细胞中，成熟LAMP-1与糖基化前体的比率与对照相比下降了约15％(图9A)， 这表明LAMP-1从内质网到高尔基体的运输受损。 [0322] CD44是一种质膜蛋白质，其具有多种蛋白质水解形式和糖基化形式，分子量从约42-约90kDa不等(参见文献“Lokeshwar and Bourguignon, J.Biol.Chem.266:17983- 17989(1991)”)。在MMG8被抑制的细胞中，电泳到约90kDa的充分糖基化CD44显著降低(图 9B)。 [0324] 本文中所提及和引用之所有专利、专利申请、临时申请和出版物的全部内容，包括图和表格，均以引用方式并入本文，它们与本发明的明确说明一致。应该说明的是，此处所述之实施例和实施方案仅作阐述说明之用，各种在此基础上的改进或改变均是本领域人员可想到的，同时这些改进和改变应在本申请的精神和范畴之内。此外，本文所公开的任意发明和实施方案的任意要素和限制可以与本文所公开的任意其他发明或实施方案的任意和/ 或所有其他要素或限制(单独或任何组合的形式)组合，并且所有这样的组合均被视为在本 发明的范围内而不限于此。 |
||||||
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈