콜라겐 파티클을 함유한 콜라겐 현탁액 제조방법

콜라겐 파티클을 함유한 콜라겐 현탁액 제조방법{Collagen suspension manufacture method containing collagen particle}

본 발명은 콜라겐 파티클을 함유한 콜라겐 현탁액 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 콜라겐 용액의 물성을 개선하여 콜라겐 분해효소의 공격에 오래 견디도록 하고 생체 내 주입시 부피 감속속도가 늦도록 하여 조직수복 효과가 장기간 유지될 수 있도록 한 콜라겐 파티클을 함유한 콜라겐 현탁액 제조방법에 관한 것이다.

콜라겐이란 단백질의 일종으로서, 길고 가는 섬유형태를 띠며 인간을 비롯한동물의 체내에서 세포와 세포 사이를 연결하는 세포접착 및 고리 사슬 같은 역할을하는 것이다.

콜라겐은 아주 중요한 섬유상태의 경단백질로 콜라겐 혹은 교원질이라고 불리우며, 다세포가 다수 집합되어 있는 부위에는 반드시 콜라겐이 존재한다.

이에 따라, 콜라겐은 단세포의 동물에는 존재하지 않으며, 다세포 동물 중, 특히 동물의 피부, 뼈, 연골, 혈관벽, 치아, 근육 외에 물고기의 비늘 등에는 콜라겐이 다량으로 존재한다.

상기 콜라겐은 우리 몸을 구성하는 단백질 중, 무려 1/3을 차지하는 중요한 성분이다.

콜라겐은 세포와 세포를 연결시켜 주며, 소장에서 흡수된 영양소는 상기 콜라겐을 매개체로 각 세포에 전해진다.

또한, 노폐물도 콜라겐을 통해 혈관으로 운반되어 몸 밖으로 배출된다.

신체장기 중 눈의 투명한 수정체 역시 모두 콜라겐이며, 이 상아질의 18%, 잇몸이나 치근막도 주로 콜라겐을 포함하고 있다.

또한, 각종 내장은 반투명막에 의해 싸여 있는데, 그 막이 콜라겐이며 뼈와 뼈를 이어주고 있는 연골의 50%가 콜라겐이다.

뼈의 경우 칼슘과 뼈세포를 연결하고 있는 것이 콜라겐이며, 뼈중량의 20%가 콜라겐이다.

혈관의 대부분 역시 콜라겐으로 구성되어 있으며, 피부의 경우 표피 아래 진피의 70%가 콜라겐이다.

콜라겐은 세포 중에서 아미노산으로 만들어지며 그것도, 모든 세포에서가 아니라 섬유아세포, 연골세포, 골아세포, 근세포 등 특수한 세포에서만 만들어진다.

세포 내에서 만들어진 콜라겐은 세포 외로 분비되어 필요한 장소에 머물면서세포의 증식 및 세포 기능의 활성화를 촉진하는 작용도 한다.

콜라겐은 현재 20여 가지의 종류가 알려져 있는데, 콜라겐1형이 대부분을 차지하고 있으며 글리신, 프롤린, 하이드록시프롤린, 알라닌, 글루탐산 등의 아미노산으로 이루어져 있다.

특히, 다른 단백질에는 존재하지 않는 하이드록시 프롤린의 함량이 높은데, 섬유상 콜라겐의 대부분은 약 100kD의 콜라겐 폴리펩타이드 사슬분자 세 가닥이 서로 결합하여 만드는 약 300kD의 콜라겐 단분자를 구성하며 이를 트로포콜라겐 이라고 부르기도 한다.

이 단분자 단백질이 특정부위에서 공유결합으로 가교되어 있기 때문에, 동물조직에 존재하는 콜라겐은 불용성이며 높은 인장강도를 갖는다.

구성아미노산은 Gly-XY이며 X는 주로 프롤린이고, Y는 주로 하이드록시프롤린이며 그 중에서도 다른 단백질에 존재하지 않는 하이드록시프롤린의 함량이 높다는 것이 특징이다.

콜라겐은 아미노산의 구성 및 3중 나선 구조를 이루고, 적은 다당류 수식으로 인하여 다른 단백질에 비하여 항원성이 떨어진다고 알려져 있으며 콜라겐의 발단부위에 있는 텔로펩타이드가 제거된 콜라겐을 아텔로콜라겐 이라고 부르기도 한다.

아텔로콜라겐의 경우 항원성이 최소화되어 이종동물에 사용되었을 때 면역학적 문제점이 거의 없어 연부조직수복용으로 활용되어 왔다.

또한, 농축된 콜라겐 용액이나 다공성의 콜라겐 스폰지는 그대로 사용되어 지혈 및 상처치유 촉진용으로 사용되거나 약물을 전달하는 매개체의 역할을 하기도 하고 세포와 같이 혼합되어 조직 공학의 담체로 사용되기도 한다.

세포와 결합되어 상처를 치유하거나 조직결손을 재건하는 in vitro 연구 및 임상연구에 있어서 고체 상의 제품을 이용하는 것보다 주사가능한 형태의 콜라겐 용액을 사용하는 것이 최소 침습을 보장할 수 있고 결손 부위의 형태에 상관없이 적용할 수 있다.

그리고, 세포의 차원적 균등 분포를 보장할 수 있어 가장 바람직한 제품의 형태라고 볼 수 있다.

하지만 상기한 특징을 갖는 콜라겐은 다음과 같은 문제가 있었다.

첫째, 순수 분리된 콜라겐은 300kD의 단분자 형태로 되어 있고일반적으로 농도가 낮아 겔(gel)화 조건에서의 반응시 강도가 약해지는 문제가 있었다.

둘째, 저농도의 상태로 생체 내에 주입되거나, 혹은 이와 유사한 조건을 가하면 수분이 빠져나가 생체의 일부가 함몰되거나 그 부피가 급격히 감소하여 기대하는 조직 수복의 효과를 기대하기 어려운 단점이 있다.

셋째, 저농도의 콜라겐 단분자만으로 이루어진 생체 폴리머의 경우, 생체 내부로 주입되었을 때 생체 폴리머 내부로 분해 효소를 분비하는 각종 세포들이 쉽게 침투되어 콜라겐이 너무 빨리 분해되므로 소기의 목적을 달성할 수 없는 문제가 있었다.

즉, 연부 조직의 결손 부위를 회복할 목적으로 사용되는 콜라겐을 주성분으로 하는 대부분의 필러 제품들은 상기한 문제점이 있기 때문에, 이러한 문제점을 해소하고자 연부 조직에 콜라겐을 과량으로 주입하거나 여러 번에 걸쳐 콜라겐을 주입하게 되는바, 이러한 시술은 시술자 및 피시술자 모두에게 불편함을 초래하게 되는 것이다.

본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 중성의 콜라겐 용액을 이용해 만든 콜라겐 파티클을 중성의 콜라겐 용액에 현탁하여, 생체 내에서의 겔 성질이 그대로 유지되어 연부 조직 내에서 콜라겐이 지속적으로 머무를 수 있을 뿐만 아니라 콜라겐 파티클이 포함됨으로써 단위 부피당 콜라겐의 농도가 높아 부피유지 효과 및 효소분해 저항성이 높은 콜라겐 파티클을 함유한 콜라겐 현탁액 제조방법을 제공하고자 한 것이다.

본 발명은 상기한 목적을 달성하기 위하여, 동물의 조직으로부터 콜라겐을 추출하는 콜라겐 추출단계;추출된 콜라겐을 산성용액에 용해시키는 콜라겐 용해단계;용해된 콜라겐을 중화시켜 콜라겐 중성용액을 생성시키는 콜라겐 중화단계;콜라겐 중성용액을 겔(gel)화 시키는 콜라겐 겔화단계;겔화된 콜라겐을 건조시키는 건조단계;건조된 콜라겐을 분쇄시켜 콜라겐 파티클을 형성시키는 분쇄단계;콜라겐 파티클과 콜라겐 중성용액을 혼합한 후, 희석시키는 현탁액 제조단계:를 포함하여 구성된 지속성 콜라겐 파티클을 함유한 콜라겐 현탁액 제조방법을 제공한다.

이때, 상기 건조단계는, 콜라겐 겔 덩어리를 무균작업대에 놓고 3~5일간 상온에서 무균공기로 건조시키는 상온건조단계와, 상온건조단계후, 건조된 콜라겐 덩어리를 100℃~150℃의 온도로 24~48시간 동안 가열하여 건조시키는 고온건조단계를 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 분쇄단계는, 무균용기에 건조된 콜라겐을 투입시키는 콜라겐 투입단계와, 무균용기에 멸균된 100%에탄올을 투입하는 에탄올 투입단계와, 호모게나이저(homogenizer)로 콜라겐을 분쇄하여 콜라겐 파티클을 형성하는 파티클화 단계로 구성된 것이 바람직하다.

또한, 상기 콜라겐 중성용액은 콜라겐 함유율이 0.1%~8%이며, 콜라겐 파티클과 콜라겐 중성용액의 무게비는 1:1~1:40인 것이 바람직하다.

이때, 상기 콜라겐 파티클과 콜라겐 중성용액은 저온에서 혼합되며, 혼합된 현탁액의 콜라겐 농도는 1~10%인 것이 바람직하다.

또한, 상기 동물조직은 돈피(豚皮) 또는 우피(牛皮)인 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 콜라겐 파티클을 함유한 콜라겐 현탁액 제조방법은 다음과 같은 효과가 있다.

첫째, 중성의 콜라겐 용액 침전물을 상온 및 고온에서 두 번 건조하여 만든 덩어리를 분쇄하여 콜라겐 파티클로 만든 후, 상기 콜라겐 파티클을 중성의 콜라겐 용액에 현탁시킴으로써, 콜라겐 용액 내에 함유된 콜라겐의 농도가 고농도를 유지하게 된다.

이에 따라, 콜라겐 용액은 겔 성질을 그대로 보유하여 주사가 용이함과 더불어, 생체 내에서 고형화되는 정도가 높기 때문에 콜라겐 용액이 주입된 연부 조직내에 지속적으로 머무를 수 있는 효과가 있다.

둘째, 단위 부피당, 콜라겐의 농도가 높기 때문에 부피유지 효과 및 효소분해 저항성이 높은 효과가 있다.

이에 따라, 조직수복에 대한 효과가 향상되며, 조직수복에 대한 효과를 장기간 유지할 수 있게 된다.

도 1은 본 발명의 바람직한 실시에 따른 콜라겐 파티클을 함유한 콜라겐 현탁액 제조방법을 나타낸 순서도
도 2는 본 발명의 바람직한 실시에 따른 콜라겐 파티클을 함유한 콜라겐 현탁액 제조방법 중, 분쇄단계를 나타낸 순서도
도 3은 본 발명의 바람직한 실시에 따른 콜라겐 파티클을 함유한 콜라겐 현탁액 제조방법 중, 혼합단계를 나타낸 순서도
도 4는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 콜라겐 파티클을 함유한 콜라겐 현탁액 제조방법을 이용해 만든 콜라겐 현탁액을 확대하여 나타낸 사진
도 5는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 콜라겐 파티클을 함유한 콜라겐 현탁액이 주입된 주사용기를 나타낸 사진.

이하, 첨부된 도 1 내지 도 5를 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 콜라겐 파티클을 함유한 콜라겐 현탁액 제조방법에 대하여 설명하도록 한다.

먼저, 동물조직으로부터 콜라겐을 추출한다.(S10)

이때, 동물조직이라 함은, 소의 피부조직 또는 돼지의 피부조직임이 바람직하며, 우피 또는 돈피로부터 콜라겐을 추출하기 위해서는 다음 과정을 수행한다.

우피 또는 돈피로부터 콜라겐을 추출하기 위해서는, 절편기를 이용하여 우피 또는 돈피를 절편(切片)으로 만든다.

이때, 절편의 크기는 대략 5mm X 50mm임이 바람직하다.

이후, 우피 또는 돈피 절편을 0.1N 염산에 넣어 저온에서 2일 동안 수화 및 연화시킨다.

이후, 쇄절기를 이용하여 연화된 절편을 미세절편으로 만든다.

이때, 미세절편의 크기는 5mm X 5mm임이 바람직하다.

이후, 상기 미세절편을 20mM 인산용액에 현탁시킨 후(S11), 0.1N 염산에 용해된 3% 펩신 용액을 추가시킨다.(S12)

이때, 펩신용액의 비율은 미세절편 무게 대비 100:1임이 바람직하다.

이와 같이 혼합된 미세절편은 원심분리기를 통해 10rpm으로 원심분리되면서 약 5일간 효소반응됨에 따라, 상기 미세절편으로부터 산성 콜라겐이 추출된다.

이후, 필터를 이용해 효소반응이 이루어지지 않은 절편 찌꺼기를 제거하여 콜라겐 용액을 분리한다.

이후, 상기 콜라겐 용액에 5M의 염화나트륨을 추가하여 최종적으로 0.7M의 염화나트륨 용액으로 만든다.(S20)

이에 따라, 분리된 콜라겐은 다른 단백질 불순물로부터 분별되어 염침전이 된다.

다음으로, 염침전된 콜라겐을 증류수에 넣은 후, 최종농도 20mM의 인산용액을 희석하여 재용해시킨다.(S30)

이때, 콜라겐의 농도는 0.25%~0.35%가 되도록 하는 것이 바람직하다.

이에 따라, 콜라겐은 산성화된다.

이후, 용해된 콜라겐 용액을 0.5㎛ 노미널 여과필터, 0.2㎛ 노미널 여과필터, 0.1㎛ 노미널 여과필터의 순으로 여과하여 불순물을 제거한다.(S40)

이후, 불순물이 제거된 산성 콜라겐 용액에 20mM 인산용액을 희석시킨다.

이때, 산성 콜라겐 용액은 1g/L가 되는 것이 바람직하다.

이후, 상기 산성 콜라겐 용액을 제균 여과하여 저농도 산성 무균 콜라겐 용액으로 만든다.

다음으로, 저농도 산성 무균 콜라겐 용액을 중화시키는 단계를 수행한다.(S50)

이를 위해, 상기 저농도 무균 콜라겐 용액에 멸균된 2N 수산화나트륨 용액을 혼합시킨다.

이때, 상기 용액의 산성도는 pH 6.8~7.2가 되도록 하는 것이 바람직하다.

다음으로, 상기 용액을 항온기에 1일간 보관하여 콜라겐의 중성 침전이 이루어지도록 한다.(S60)

이때, 항온기의 온도는 대략 37℃임이 바람직하다.

이와 같은 과정에 의해, 콜라겐은 뿌연 부유성 침전물 덩어리 형태로 이루어지게 된다.

이후, 중성 침전된 부유성 침전물 덩어리 형태의 콜라겐을 100㎛ 크기의 멸균된 메쉬에 넣고, 4℃의 온도환경에서 1~3일간 상분리를 실시한다.(S70)

이와 같은 과정에 의해, 콜라겐은 겔(gel) 형태의 슬러리(slurry)로 이루어지게 된다.

다음으로, 상분리 과정에서 메쉬에 잔류된 겔 형태의 콜라겐 슬러리를 무균 작업대에 놓고 상온에서 3~5일간 무균공기로 건조시킨다.(S81)

이후, 건조된 콜라겐 덩어리를 멸균된 가위로 잘라 멸균된 스테인레스 용기에 넣는다.

이때, 가위로 잘린 콜라겐 덩어리의 너비는 5mm임이 바람직하다.

다음으로, 상기 스테인레스 용기를 고온 건조기로 옮겨 재차 건조시킨다.(S82)

이때, 고온 건조기의 온도는 대략 120℃를 유지하게 되며, 건조는 1~2일 동안 이루어지게 된다.

다음으로, 고온건조된 콜라겐을 파티클화 하기 위한 분쇄단계를 수행한다.(S90)

상기 분쇄단계를 수행하기 위해서는 도 2에 도시된 바와 같이, 먼저 무균용기에 고온건조된 콜라겐을 투입한다.(S91)

이후, 상기 무균용기에 100% 에탄올을 투입한 후(S92), 호모게나이저를 이용하여 상기 콜라겐을 분쇄시켜 파티클화 한다.(S93)

다음으로, 콜라겐 파티클을 콜라겐 용액에 혼합시키는 단계를 수행한다.(S100)

이를 위해, 도 3에 도시된 바와 같이, 콜라겐 파티클을 콜라겐 함유량이 6%~8%인 무균의 중성 콜라겐 용액에 혼합한 후 희석시킨다.(S101)

이때, 혼합이 이루어지는 외부 환경은 저온임이 바람직하다.

한편, 콜라겐 파티클과 무균의 중성 콜라겐 용액의 무게 비는 1:1~1:40의 범위에 해당되는 것이 바람직하며, 그의 범위는 1:20인 것이 더욱 바람직하다.

이와 같은 과정을 거쳐 콜라겐 용액에 콜라겐 파티클이 혼합되면, 현탁액에 대한 제조가 완료된다.(S102)

이때, 콜라겐의 농도는 1%~10%가 되며, 3%~6%의 범위에 해당되는 농도를 유지하는 것이 바람직하다.

이때, 도 4에 도시된 바와 같이 고농축의 콜라겐을 제공하게 된다.

도 4는 콜라겐 파티클을 함유한 콜라겐 현탁액을 유리슬라이드에 펴바른 후 건조시키고 0.1% sirius red 염색액으로 염색한 것을 확대하여 나타낸 현미경 사진으로서, 왼쪽 사진의 그림 막대는 500㎛를 표시한다.

그리고, 오른쪽 사진은 왼쪽사진의 중앙부를 20배 확대한 사진으로서, 배경에서 진하게 염색된 것은 콜라겐 섬유이며, 약하게 염색된 무정형 파티클은 고농축 콜라겐 입자이다.

이를 통해 알 수 있듯이, 콜라겐용액 내부에 콜라겐 파티클이 고루 분포되어있는 것을 확인할 수 있었다.

한편, 상기와 같이 제조가 완료된 콜라겐 현탁액을 도 5에 도시된 바와 같이 주사용기에 주입한 후 시술을 하게 된다.(S103)

지금까지 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 콜라겐 파티클을 함유한 콜라겐 현탁액 제조방법은 중성의 콜라겐 용액으로부터 콜라겐 파티클을 제조하여, 상기 콜라겐 파티클을 중성의 콜라겐 용액에 혼합한 것을 기술적 특징으로 한다.

이에 따라, 콜라겐의 농도를 고농도로 유지할 수 있으므로, 콜라겐이 시술된 생체의 연부 조직에는 콜라겐이 지속적으로 머무를 수 있기 때문에 조직 수복에 대한 효과를 장기간 유지할 수 있게 된다.