光动力学疗法(PDT)是用于癌症和各种疾病的诊断和治疗的一种 新兴形式，其涉及光和光敏剂的综合作用。可以参考Lane，N.Scientific American 2003，38-45；Bonnett，R.Chem.Soc.Rev.1995，24，19； Dougherty，T.J.Photochem.Photobiol.1987，45，879；Kessel，D.； Dougherty，T.J.Phorphyrin Photosensitization；Plenum Publishing Corp. New York，1983。该方法需要能够被目标组织吸收且在被特定波长的 光激发时产生对这些组织有毒性的物质的光敏化剂的存在。光动力学 疗法由于光动力学方法的选择性而具有超过许多常规疗法的优势。在 肿瘤组织中具有比正常组织更多的光敏剂，这降低了破坏正常组织的 可能性。此外，通过利用光纤技术能够将光特别引导到目标细胞和组 织上，这进一步增加了该方法的选择性。同样，在光激发前不产生反 应的光敏化剂的采用也显著降低了副作用的可能。
在PDT中，肿瘤组织的检测(诊断)与杀死肿瘤细胞(治疗)相比同 等重要。近红外(NIR)染料作为癌症检测的荧光探针目前吸引了相当 多的关注。可以参考Lin，Y.；Weissleder，R.；and Tung，C.H. Bioconjugate Chem.200213，605-610；Achilefu，S.；Jimenez，H.N.； Dorshow，R.B.；Bugal，J.E.；Webb，E.G.；Wilhelm，R.R.；Rajagopalan， R.；Johler，J.；Erion，J.L.J.Med.Chem.2002 45，2003-2015；Mujumdar， S.R.；Mujumdar，R.B.；Grant，C.M.；Waggoner，A.S.Bioconjugate Chem.1996，7，356-362。由于组织对于NIR光是相对透明的，NIR荧 光成像(NIRF)和PDT能够分别检测和治疗甚至表面下肿瘤 (subsurface tumor)。与此相关，本发明旨在开发用于生物学应用的 基于方酸菁染料的高效近红外吸收荧光探针。我们已合成了基于方酸 菁结构的染料，其呈现近红外区域中的吸收和发射且具有赋予它们两 亲性的如羧基和乙二醇基的取代基，从而提高了其溶解度、荧光强度 并加速了细胞吸收。
在诊断技术中，如在治疗技术中一样，染料被施用并使其分布在 体内。但是，除了肿瘤选择性以外，光敏剂应当在生理条件下表现出 显著的荧光量。因此在长波长区域具有强吸收、对正常组织无毒性、 可溶解在生理pH的缓冲液中且表现出较高的疗效的光敏化剂的开发 仍是迫切需要的。而且由于生物化学和生物医学应用的需要，能够以 特定癌细胞作为靶子的功能性分子的设计也是极其重要的。
我们在这一领域中的兴趣源于在光动力学应用中利用方酸菁染 料的思想。方酸菁构成了一类在红到近红外区域中具有清晰的强吸收 带的染料。它们的光物理和光化学性质已被深入地研究过，因为它们 的吸收和光化学特性使它们非常适用于许多的工业应用。可以参考美 国专利6,001,523；5,552,253；5,444,463；Law，K.-Y.Chem.Rev.1993， 93，449；Piechowski，A P；Bird，G.R.；Morel，D L.；Stogryn，E.L.J.Phy. Chem.1984，88，934。我们的初期研究显示，方酸菁染料以重原子(如 溴和碘)取代导致其与母体方酸菁染料相比在水性介质中溶解度增加 和系统间跨越效率增强。这些染料根据卤素原子的性质的不同表现出 600-620nm范围内的吸收并显示出三重线受激态(ΦT＝0.22-0.5)和 单线态氧(Φ(1O2)＝0.22-0.5)的量子产额。使用哺乳动物细胞和细 菌株的细胞毒性和致突变性研究显示，这些染料表现出在用可见光线 激发时的显著细胞毒性，且其生物活性的机理可能是由于体外单线态 氧的产生。可以参考Ramaiah，D.；Arun，K.T.；Das，S.and Epe，B.美 国专利6,770,787B2(2004)，Ramaiah，D.；Arun，K.T.；Das，S.and Epe， B.印度专利193540(2004)，Ramaiah，D.；Joy，A.；Chandrasekhar，N； Eldho，N.V.；Das，S.；George，M.V.Photochem.Photobiol.1997，65， 783；Arun，K.T.；Ramaiah，D.；Epe，B.J.Phys.Chem.B 2002，107， 11622，Ramaiah，D.；Eckert，I；Arun，K.T.；Weidenfeller，L.；Epe，B. Photochem.Photobiol.2002，76，672；Ramaiah，D.；Eckert，I；Arun，K.T.； Weidenfeller，L.；Epe，B.Photochem.Photobiol.2004，79，99。但是， 这些重原子取代的染料在水性介质中具有非常低的荧光量子产额(Φ F≤0.0003)，因而限制了其在通过选择性地定位于肿瘤组织的染料 的荧光发射检测肿瘤(诊断)中的应用。
在本发明中，新型的基于方酸菁的染料已经被合成，且证明了它 们作为生物学、生物化学和工业应用中近红外荧光探针的潜力。
发明目的
本发明的主要目的是提供高效的基于方酸菁的染料和/或其药物 上可接受的衍生物，用作光动力学诊断、生物化学和工业应用中的近 红外光敏剂。
本发明的另一目的是提供高效的基于方酸菁的染料和/或其药物 上可接受的衍生物，用作检测肿瘤的光动力学诊断中的近红外荧光探 针。
本发明的另一目的是提供高效的基于方酸菁的染料和/或其药物 上可接受的衍生物，用作生物学、生物化学和工业应用的近红外荧光 传感器。
本研究的再另一目的是提供能够用作蛋白质标记的近红外荧光 探针的基于方酸菁的染料。
本研究的再另一目的是提供能够用作免疫分析中的近红外荧光 标记的通式1的方酸菁染料。
附图简要说明
在说明书附图中
图1通式1(其中R1＝-(CH2-CH2-O)n-CH3，n＝4和R2＝-CH3)、 通式2(其中R1、R2＝-(CH2-CH2-O)n-CH3，n＝4)和通式3(其中R1＝ -(CH2)n-CO2X，n＝3，X＝H和R2＝-CH3)的方酸菁染料在10％v/v乙醇 水混合物中的吸收波谱。
图2通式1(其中R1＝-(CH2-CH2-O)n-CH3，n＝4和R2＝-CH3)、 通式2(其中R1、R2＝-(CH2-CH2-O)n-CH3，n＝4)和通式3(其中R1＝ -(CH2)n-CO2X，n＝3，X＝H和R2＝-CH3)的方酸菁染料在10％v/v乙醇 水混合物中的荧光发射光谱。
图3通式1(其中R1＝-(CH2-CH2-O)n-CH3，n＝4和R2＝-CH3)的 方酸菁染料在可变浓度的[CTAB]a)0和g)129mM存在下的发射光 谱。激发波长600nm。
图4通式1(其中R1＝-(CH2-CH2-O)n-CH3，n＝4和R2＝-CH3)的 方酸菁染料在可变浓度的[SDS]a)0和e)21mM存在下的发射光谱。 激发波长600nm。
图5通式1(其中R1＝-(CH2-CH2-O)n-CH3，n＝4和R2＝-CH3)的 方酸菁染料在可变浓度的[Triton X-100]a)0和g)118mM存在下的 发射光谱。激发波长600nm。
图6通式1(其中R1＝-(CH2-CH2-O)n-CH3，n＝4和R2＝-CH3)的 方酸菁染料在10％(vol/vol)乙醇-水混合物中的荧光衰减曲线图。(a) 10％(vol/vol)乙醇-水，(b)Triton X-100，(c)CTAB，(d)SDS和(L)灯曲 线。激发波长635nm。发射波长670nm。
图7通式1(其中R1＝-(CH2-CH2-O)n-CH3，n＝4和R2＝-CH3)的 方酸菁染料在可变浓度的[β-CD]a)0和g)25mM存在下的发射光谱。 激发波长600nm。
图8通式1(其中R1＝-(CH2-CH2-O)n-CH3，n＝4和R2＝-CH3)的 方酸菁染料10％(vol/vol)乙醇-水混合物中的荧光衰减曲线图。[β -CD]a)0(b)12mM和(L)灯曲线。

因此，本发明涉及通式1的方酸菁染料及其药物上可接受的衍生 物。

式1
其中，R1＝-(CH2-CH2-O)n-CH3，n＝4-8，或-(CH2)n-CO2X，n＝3-6， X＝H、琥珀酰胺基；和R2＝-CH3或-(CH2-CH2-O)n-CH3，n＝4-8。
在本发明的一种实施方式中，N-甲基-N-取代的或N，N-双取代的 苯胺与方形酸在苯和正丁醇(1∶1)的混合物中以2∶1的比例在90-100 ℃回流18-24h的时间。除去溶剂得到残留物，该残留物然后进行硅 胶柱层析以得到通式1的化合物。
本发明的另一实施方式是提供高效的基于方酸菁的染料和/或其 药物上可接受的衍生物，用作生物学、生物化学和工业应用的近红外 荧光传感器。
在本发明的再另一实施方式中，式1的化合物作为诊断癌症的近 红外荧光传感器用在光动力治疗中。
本研究的再另一实施方式是提供能够用作蛋白质标记的近红外 荧光探针的基于方酸菁的染料。
本研究的另一实施方式是提供能够用作免疫分析中的近红外荧 光标记的通式1的方酸菁染料。
再另一实施方式涉及式1的化合物作为流体、水的灭菌及相关的 其它工业应用中的光敏剂的用途。

在本研究中，通式1的方酸菁染料已经被合成，并研究了其在膜 模拟物(如胶束)(micelles)和药物载体系统(如β-环糊精)存在 和不存在的情况下的光物理性质。在通式1的化合物的制备中，苯胺 部分的氨基质子被甲基、乙二醇和脂族羧酸基团取代。用乙二醇和羧 酸基团修饰预期赋予这些染料两亲性，因而提高了细胞透过性并产生 了靶特异性。
下面的实施例以举例说明的方式给出，因此不应构成对本发明范 围的限制。
实施例1-3描述了通式1的化合物的典型合成方法，而实施例4 和5描述了通式1的化合物在膜模拟物如中性、阴离子和阳离子胶束 和药物载体(如β-环糊精)存在和不存在的情况下的光物理性质。
实施例1
通式1(其中R1＝-(CH2-CH2-O)n-CH3，n＝4和R2＝-CH3)的方酸菁 染料的制备。在正丁醇和苯(1∶3)的混合物中的N-甲基-N-(3，6，9，12- 四氧杂十三烷基)苯胺(400mg，1.35mmol)和方形酸(77mg，0.67mmol) 的溶液通过水的共沸蒸馏回流18h。溶剂被减压蒸馏掉，且所获得的 残留物在硅胶上进行层析。用甲醇和氯仿的混合物(1∶49)进行柱 洗脱得到100mg(15％)的通式1(其中R1＝-(CH2-CH2-O)n-CH3，n＝4 和R2＝-CH3)的方酸菁染料，mp 100-102℃；1H NMR(300MHz，CDCl3， 30℃，TMS)：δ＝3.21(s，6H，-NCH3)，3.37(s，6H，-OCH3)，3.72-3.52(m， 32H，-OCH2)，6.81(d，4H，J＝8.96，Ar-H)，8.39(d，4H，J＝8.95Hz， Ar-H)；13C NMR(75MHz，CDCl3，30℃，TMS)：δ＝39.68，52.29，58.97， 68.53，70.42，70.52，70.56，70.81，71.83，112.43，119.90，133.17，154.41， 183.32，188.58；IR(Neat)：vmax 2877，1610，1584，1140，1098cm-1；元素 分析(％)，C36H52N2O10的计算值：C，64.27；H，7.79；N，4.16；实测值：C， 64.51；H，7，69；N，3.88。
实施例2
通式2(其中R1、R2＝-(CH2-CH2-O)n-CH3，n＝4)的方酸菁染料的 制备。在正丁醇和苯(1∶3)的混合物中的双-(N，N-(3，6，9，12-四氧杂 十三烷基))苯胺(350mg，0.74mmol)和方形酸(42mg，0.37mmol) 的溶液通过水的共沸蒸馏回流18h。溶剂被减压蒸馏掉，且所获得的 残留物在硅胶上进行层析。用甲醇和氯仿的混合物(1∶99)进行柱 洗脱得到40mg(5％)的通式2(其中R1、R2＝-(CH2-CH2-O)n-CH3，n＝4) 的方酸菁染料，mp 78-80℃；1H NMR(300MHz，CDCl3，30℃，TMS)： δ＝3.37(s，12H，-OCH3)，3.37-3.55(m，64H，-OCH2)，6.84(d，4H，J＝ 8.96，Ar-H)，8.37(d，4H，J＝8.95Hz，Ar-H)；13C NMR(75MHz，CDCl3， 30℃，TMS)：δ＝50.73，58.91，68.31，70.38，70.49，70.53，71.80，111.54， 115.85，129.15，147.60，183.32，188.58；IR(Neat)：vmax 2918，2867，1610， 1584，1114cm-1；元素分析(％)，C52H84N2O18的计算值：C，60.92；H，8.26； N，2.73；实测值：C，61.20；H，7，98；N，2.49。
实施例3
通式3(其中R1＝-(CH2)n-CO2X，n＝3，X＝H和R2＝-CH3)的方酸菁 染料的制备。在正丁醇和苯(1∶3)的混合物中的N-甲基-N-(羧丙基) 苯胺(319mg，1.74mmol)和方形酸(100mg，0.87mmol)通过水的共 沸蒸馏回流24h。溶剂被减压蒸馏掉，且所获得的残留物在硅胶上进 行层析。用甲醇和氯仿的混合物(1∶9)进行柱洗脱得到100mg(13％) 的通式3(其中R1＝-(CH2)n-CO2X，n＝3，X＝H和R2＝-CH3)的方酸菁染 料，mp 238-240℃(d)；1H NMR(300MHz，[D6]DMSO，30℃，TMS)：δ ＝1.91(p，4H，-CH2)，2.40(t，4H，J＝7.2Hz，-CH2)，2.91(s，6H，-NH3)， 3.35(t，4H，J＝7.3Hz，-CH2)，6.99(d，4H，J＝9.07Hz，Ar-H)，8.05(d，4H， J＝8.97Hz，Ar-H)；13C NMR(75MHz，[D6]DMSO，30℃，TMS)：δ＝ 21.82，31.41，38.46，52.03，112.64，116.73，129.17，149.13，179.23；IR (KBr)：vmax 3420，2924，1729，1590，1439，1130cm-1；元素分析(％)， C26H28N2O6计算值：C，67.23；H，6.08；N，6.03；实测值：C，67.50；H， 5.81；N，5.80。
实施例4
人们对开发具有在生物生色团不吸收的较长波长区域中的吸收 的水溶性近红外探针具有很大兴趣。图1显示了通式1的染料在 10％vol/vol乙醇-水混合物中的吸收波谱。从图中可以看出，这些染料 在水溶液中显示出吸收最大值在640-645nm附近的尖的吸收峰，而它 们显示出在如乙醇的醇溶剂中最大值在640-645nm附近的红移。图2 显示了这些染料在10％vol/vol乙醇-水混合物中的发射光谱。这些染 料显示出在水溶液中荧光发射最大值在670-676nm的范围内，而在醇 溶剂中的发射最大值在660-665nm的范围内。这些染料显示出在水性 介质中荧光量子产额在0.007-0.021的范围内，而在乙醇中荧光量子 产额在0.18-0.21的范围内。这些染料在水和醇溶剂中的吸收和发射 最大值及荧光量子产额列于表1中。在水性介质中的长波区吸收和发 射最大值及良好的荧光量子产额使这些染料成为荧光探针的应用的 理想候选者。
表1
式    乙醇                      10％乙醇/水            水
      λmax，nm                 λmax，nm              λmax，nm
      吸收       发射   Φf     吸收   发射   Φf      吸收   发射   Φf
1     637        660    0.19    645    674    0.018    644    671    0.013
2     638        662    0.21    646    675    0.026    646    676    0.021
3     636        662    0.18    647    673    0.015    645    673    0.007
实施例5
光敏剂在生理条件下的稳定性和光物理性质的研究在评价其用 于各种体外或体内应用中是很重要的。特别是，膜模拟物如溴化十六 烷基三甲基铵(CTAB)和载体系统如β环糊精(β-CD)的影响， 将提供有关该光敏剂在生理条件下的行为的信息。另外，这种研究也 用于澄清一些要点，如特定染料在这种环境下是否形成聚集体和它是 否产生细胞毒性物质。这些介质在其性质方面是独特的，因为β-CD 与客分子形成包合复合物，而其它的形成胶束结构，因而同时提供疏 水和亲水环境。
图3、4和5显示了通式1(其中R1＝-(CH2-CH2-O)n-CH3，n＝4和 R2＝-CH3)的染料分别在阳离子胶束CTAB、阴离子胶束SDS和中性 胶束Triton X-100存在下的发射光谱。随着胶束浓度的增加，染料的 荧光强度增加，显示了胶束和染料之间的有效的相互作用。为更好地 理解胶束介质的效应，我们分析了通式1染料的皮秒时间分辨荧光寿 命。这些染料在没有胶束存在时显示出单指数衰减，而在有胶束存在 时显示出双指数衰减。这种在胶束存在时的双指数衰减表明存在两种 光谱学不同的物质，一种来自于包囊的染料分子，而另一种来自于未 结合的染料分子。图6显示了通式1(其中R1＝-(CH2-CH2-O)n-CH3，n＝4 和R2＝-CH3)的方酸菁染料在10％vol/vol乙醇-水混合物中和在阳离 子胶束CTAB、阴离子胶束SDS和中性胶束Triton X-100存在下的荧 光衰减曲线图。表2、3和4列出了通式1(其中R1＝-(CH2-CH2-O)n-CH3， n＝4和R2＝-CH3)、通式2(其中R1、R2＝-(CH2-CH2-O)n-CH3，n＝4) 和通式3(其中R1＝-(CH2)n-CO2X，n＝3，X＝H和R2＝-CH3)的染料在 阳离子胶束CTAB、阴离子胶束SDS和中性胶束Triton X-100存在和 不存在的情况下的吸收和发射最大值、荧光量子产额和寿命。这些结 果表明这些染料是生物学应用中近红外传感器的理想候选者，在这些 应用中它们将有效地与细胞膜结构相互作用。
表2
式   在CTAB存在时
     吸收       发射                寿命，
     λmax，nm  λmax，nm  Φf      ps
1    642        663        0.12     560(45％)
                                    920(55％)
2    644        667        0.096    410(25％)
                                    1140(75％)
3    644        667        0.14     440(4％)
                                    860(96％)
表3
式    在SDS存在时
      吸收       发射               寿命，
      λmax，nm  λmax，nm  Φf     ps
1     640        663        0.15    590
2     643        668        0.16    690(4％)
                                    1240(96％)
表4
式   在Triton X-100存在时
     吸收       发射               寿命，
     λmax，nm  λmax，nm  Φf     ps
1    645        669        0.12    130(21％)
                                   1120(90％)
2    646        671        0.14    450(7％)
                           1450
3    649    672    0.12    430(31％)
                           1140(69％)
图7显示了通式1(其中R1＝-(CH2-CH2-O)n-CH3，n＝4和R2＝-CH3) 的染料在β-CD存在下的发射光谱。与在胶束存在时观察到的情况相 似，随着β-CD浓度的增加，通式1的方酸菁染料的发射强度增加， 且发射最大值显示出蓝移，表明染料与β-CD腔之间的有效相互作 用。图8显示了通式1(其中R1＝-(CH2-CH2-O)n-CH3，n＝4和R2＝-CH3) 的染料在β-CD存在和不存在的情况下的荧光衰减曲线，其在没有β -CD存在时显示出单指数衰减。在β-CD存在时观察到双指数衰减， 表明存在两种类型，一种来自于包囊在β-CD腔内的染料分子，而另 一种来自于自由染料分子。表5概括了在β-CD存在的情况下通式1 的方酸菁染料的吸收和发射最大值、荧光量子产额和寿命。这些结果 清楚地表明这些染料可使用药物输送系统定位在特定的靶上。
表5
式   在β-CD存在时
     吸收       发射               寿命，
     λmax，nm  λmax，nm  Φf     ps
1    644        663        0.10    380(58％)
                                   1470(42％)
2    645        668        0.07    610(83％)
                                   1920(17％)
3    649        666        0.19    470(34％)
                                   1600(66％)
本发明的方酸菁染料具有令人满意的作为光动力学、诊断及生物 学、生物化学和工业应用中的近红外荧光探针的性质。
这些系统的主要优势包括：
1.式1、2和3表示的方酸菁染料是新型的、纯的单一物质。
2.它们的合成方法非常经济。
3.式1、2和3表示的方酸菁染料具有近红外区域(600-700nm) 的吸收。
4.式1、2和3表示的方酸菁染料具有近红外区域(620-720nm) 的发射。
5.式1、2和3表示的对称方酸菁染料在水性介质中具有 0.015-0.03范围的发射量子产额且在膜模拟物和药物载体存在下增加 接近10倍(ΦF＝0.09-0.2)。
6.它们可用于光动力学应用，如流体的灭菌等。
7.该方酸菁基染料可用作蛋白质标记的近红外荧光探针。
8.通式1的方酸菁染料可用作免疫分析中的近红外荧光标记。
9.它们可用于在生理条件下检测生物重要金属离子。
10.这些新型染料可以在生物学、生物化学和工业应用中用作近 红外荧光传感器。