吩噻嗪衍生物色素的检测方法及用于该方法的显色剂试剂 |
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| 申请号 | CN200880003539.5 | 申请日 | 2008-01-30 | 公开(公告)号 | CN101595386B | 公开(公告)日 | 2012-05-09 |
| 申请人 | 爱科来株式会社; | 发明人 | 米原聪; 稻村范郎; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供一种吩噻嗪衍 生物 色素检测方法，该方法即便在比显示最大吸收的 波长 更长波长处也能检测吩噻嗪衍生物色素。在含有吩噻嗪衍生物色素的反应体系中，添加5-羟基-1-(4-磺酸苯基)-4-(4-磺酸苯基偶氮)吡唑-3- 羧酸 盐、6-羟基-5-(4-磺酸苯基偶氮)-2- 萘 磺酸盐、3-羟基-4-(4-磺酸萘基偶氮)-2，7-萘二磺酸盐、7-羟基-8-(4-磺酸萘基偶氮)-1，3-萘二磺酸盐、3’，6’-二羟基-2’，4’，5’，7’-四碘螺[异苯并呋喃-1(3H)，9’-(9H)呫吨]-3- 酮 盐、3’，6’-二羟基-2’，4’，5’，7’-四溴-4，5，6，7-四氯螺[异苯并呋喃-1(3H)，9’-[9H]呫吨]-3-酮盐、4，5，6，7-四氯-3’，6’-二羟基-2’，4’，5’，7’-四碘螺[异苯并呋喃-1(3H)，9’-[9H]呫吨]-3-酮盐或类黄酮系色素后，通过波长610～730nm处的吸光度测定来检测吩噻嗪衍生物色素。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种吩噻嗪衍生物色素检测方法，其特征在于，其为通过吸光度测定来检测反应体系中的吩噻嗪衍生物色素的方法， |
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| 说明书全文 | 吩噻嗪衍生物色素的检测方法及用于该方法的显色剂试剂技术领域[0001] 本发明涉及吩噻嗪衍生物色素的检测方法、利用吩噻嗪衍生物色素的检测来进行的目的成分的测定方法及用于上述方法的显色剂试剂。 背景技术[0002] 作为目的成分的测定(定性、定量)方法，在实践中广泛采用利用氧化还原反应的酶法。该方法为例如由欲测定的目的成分生成氧化物质，用氧化酶催化该氧化物质与通过氧化生成显色化合物的显色剂反应，测定生成的显色的吸光度的方法。该方法中，吸光度的大小对应于生成的显色化合物的量，生成的显色化合物的量对应于生成的氧化物质的量，氧化物质的量对应于目的成分的量。即，通过生成的显色(生成的显色化合物)的检测，以如上所述的氧化还原反应为媒介，可间接地测定目的成分。 [0003] 上述酶法中使用的显色剂有例如特林德(Trinder)试剂及N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-双(二甲氨基)二苯胺钠盐(商品名DA-64；和光纯药公司生产)。此外，生成显色化合物亚甲蓝等的吩噻嗪衍生物色素的显色剂已知例如10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪盐(商品名DA-67；和光纯药公司生产，以下也称“DA-67”)、 10-(乙酰氨基羰基)-3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪、专利文献3记载的10-(苯羰基)-3， 7-双(二甲氨基)吩噻嗪、专利文献4记载的10-(3-(甲基羧基氨基)-六甲基-氨基)-吩噻嗪、10-(3-(甲基羧基氨基)-4-甲基-苯基-氨基)-吩噻嗪、10-((3-(甲基羧基氨基甲基)-苯基)-甲氨基)-吩噻嗪、10-(1-萘基氨基)-吩噻嗪、10-(甲基)-吩噻嗪、10-(苯基氨基)-吩噻嗪、10-(甲氨基)-吩噻嗪等。吩噻嗪衍生物色素在相对长波长处如590～ 670nm处有极大吸收，因此其中生成亚甲蓝等吩噻嗪衍生物色素的显色剂如DA-67等由于以下原因而受到重视。 [0004] 即，如体液那样的样品中，除含有目的成分外，还含有各种成分，其中也存在于500nm附近及其以下的波长区域有吸收的成分。因此，如上所述的酶法中，为避免目的成分以外的成分产生的影响，期望由氧化还原反应生成的显色化合物尽量可在长波长处检测。 因此，如上所述生成在590～670nm处有极大吸收的吩噻嗪衍生物色素的DA-67等显色剂，被认为特别有用。 [0005] 然而，例如全血样品及血细胞样品那样的含有血红蛋白(以下称“Hb”)的样品在约570～630nm处显示影响色素检测的程度的吸收，另外，由于Hb的氧化(met化)而有可能在约570～670nm处显示影响吩噻嗪衍生物色素检测的程度的吸收。从而，即便是生成吩噻嗪衍生物色素的如上所述的显色剂，应用于此类样品时也会担心其对测定的影响。 [0006] 另外，临床化学专用的自动分析装置检测波长被固定，例如有分析装置在610～660nm处无检测波长，在700nm处有检测波长。然而，610～670nm处有极大吸收的吩噻嗪衍生物色素因在700nm下的检测极为困难，因此无法用这种在700nm处有检测波长的现有的装置测定。 [0007] 此外，例如呈蓝色的亚甲蓝通过还原可成为无色的无色亚甲蓝。利用这种性质，将亚甲蓝等吩噻嗪衍生物色素自身作为显色剂使用，由目的成分生成还原物质还原吩噻嗪衍生物色素，通过测定还原导致的蓝色的消失(吩噻嗪衍生物色素的减少)也可测定目的成分(专利文献1及专利文献2)。然而，即便在该情况下也会产生与上述同样的问题。 [0008] 专利文献1：日本特开2000-214152号公报 [0009] 专利文献2：日本特开2000-214155号公报 [0010] 专利文献3：日本特公平4-27839号公报 [0011] 专利文献4：日本特公昭60-33479号公报 发明内容[0012] 因此，本发明的目的在于提供一种吩噻嗪衍生物色素检测方法，其即便在比显示极大吸收的波长更长波长处也可检测吩噻嗪衍生物色素。 [0013] 本发明的吩噻嗪衍生物色素的检测方法的特征在于，其为一种通过吸光度测定来检测反应体系中的吩噻嗪衍生物色素的方法，所述方法包括吩噻嗪衍生物色素的检测工序，上述检测工序中，在选自下述式(I)表示的化合物、下述式(II)表示的化合物及类黄酮系色素所组成的组中的至少一种色素物质的存在下，进行吩噻嗪衍生物色素的检测。 [0014] R1-N＝N-R2 ...(I) [0015] 上述式(I)中， [0016] R1为 [0017] [0018] R2为 [0019] [0020] R1及R2中， [0021] X为氢、卤素、钠或钾， [0022] Y为氢或SO3X， [0023] 各X相同或不同，各Y相同或不同， [0024] Z为氢、甲基或甲氧基，各Z相同或不同。 [0025] [0026] 上述式(II)中， [0027] X为氢、卤素、钠或钾，各X相同或不同， [0028] Y为氢、卤素、钠或钾，各Y相同或不同。 [0029] 本发明的目的成分的测定方法的特征在于，其为一种通过检测吩噻嗪衍生物色素来测定样品中的目的成分的方法，所述方法包括下述(A)～(E)工序： [0030] (A)由上述样品中的目的成分生成氧化物质或还原物质的工序； [0031] (B)在上述样品中，添加通过氧化还原反应而生成吩噻嗪衍生物色素的显色剂的显色剂添加工序； [0032] (C)通过上述氧化物质或还原物质与上述显色剂的氧化还原反应而生成吩噻嗪衍生物色素的工序； [0033] (D)通过本发明的吩噻嗪衍生物色素检测方法来检测吩噻嗪衍生物色素，以测定有无生成上述吩噻嗪衍生物色素或生成量的工序； [0034] (E)由上述测定结果判断上述样品中的目的成分的有无或量的工序。 [0035] 此外，本发明的目的成分的测定方法也可为包括下述(B’)～(D’)工序来替换上述(B)～(D)工序的方法： [0036] (B’)在上述样品中，添加吩噻嗪衍生物色素作为显色剂的工序； [0037] (C’)使由上述样品中的目的成分生成的还原物质与吩噻嗪衍生物色素发生氧化还原反应的工序； [0038] (D’)通过本发明的吩噻嗪衍生物色素检测方法来检测吩噻嗪衍生物色素，以测定添加的上述吩噻嗪衍生物色素有无减少或减少量的工序。 [0039] 本发明的位移试剂的特征在于，其为一种使吩噻嗪衍生物色素的吸收光谱位移的位移试剂，所述位移试剂含有选自上述式(I)表示的化合物、上述式(II)表示的化合物及类黄酮系色素所组成的组中的至少一种色素物质。 [0040] 本发明的显色剂试剂的特征在于，其为一种在上述本发明的检测方法中使用的显色剂试剂，所述显色剂试剂含有通过氧化还原反应而生成吩噻嗪衍生物色素的底物和吩噻嗪衍生物色素中的任一种的显色剂、以及上述本发明的位移试剂。 [0041] 如本发明中所述，在上述色素物质的存在下，即便在比吩噻嗪衍生物色素原本的极大吸收波长590～670nm更长波长处，也能检测吩噻嗪衍生物色素。因此，例如即便在样品中含有在570～670nm附近显示吸收的成分的情况下，也可避免其导致的影响而检测吩噻嗪衍生物色素。此外，通过本发明，例如因700nm处的吸光度增加，即便为检测波长固定于700nm的装置也可检测吩噻嗪衍生物色素。如上所述，通过本发明的方法，改进了吩噻嗪衍生物色素的检测条件，与以往相比进一步拓宽了生成吩噻嗪衍生物色素的显色剂及吩噻嗪衍生物色素的显色剂的应用范围，因此可称为例如在临床检查等中极为有用的方法。附图说明 [0042] 图1为表示在本发明的实施例1中酒石黄共存时的亚甲蓝光谱的图表。 [0043] 图2为表示在本发明的上述实施例1中可可色素共存时的亚甲蓝光谱的图表。 [0044] 图3为表示在本发明的实施例3中各种色素物质共存时的各种吩噻嗪衍生物色素光谱的图表，(A)为亚甲蓝、(B)为天青C、(C)为天青A(Fluka公司)的结果。 [0045] 图4为表示在本发明的上述实施例3中各种色素物质共存时的各种吩噻嗪衍生物色素光谱的图表，(D)为1，9-二甲基-吩噻嗪的结果、(E)为甲苯胺蓝O的结果。 [0046] 图5为表示在本发明的上述实施例3中各种色素物质共存时的各种吩噻嗪衍生物色素光谱的图表，(F)为天青B、(G)为亚甲基绿的结果。 具体实施方式[0047] <吸收光谱的位移试剂> [0048] 本发明的位移试剂的特征在于，其为一种使吩噻嗪衍生物色素的吸收光谱位移的位移试剂，所述位移试剂含有选自上述式(I)表示的化合物、上述式(II)表示的化合物及类黄酮系色素所组成的组中的至少一种色素物质。 [0049] 如上所述，通过使上述色素物质与吩噻嗪衍生物色素共存，吩噻嗪衍生物色素的吸收光谱可位移至长波长处。因此，如上所述，本发明中的色素物质可作为使吩噻嗪衍生物色素的吸收光谱发生变化的吸收光谱的位移试剂使用。此外，本发明中，“使吸收光谱位移”指例如吩噻嗪衍生物色素的原本的极大吸收波长位移至长波长处，或极大吸收波长虽不发生位移，但吸收光谱位移至长波长处等。本发明的位移试剂优选为例如有二个具有适当距离的负电基团的物质。推测该负电基团与吩噻嗪骨架的两侧的带+电的N静电结合，加长共振结构从而产生位移。予以说明，本发明不受限于该推测。 [0050] 本发明的位移试剂中可含有一种上述色素物质，也可含有两种以上。 [0051] 上述式(I)中， [0052] R1为 [0053] [0054] R2为 [0055] [0056] R1及R2中， [0057] X为氢、卤素、钠或钾， [0058] Y为氢或SO3X， [0059] 各X相同或不同，各Y相同或不同， [0060] Z为氢、甲基或甲氧基，各Z相同或不同。 [0061] 可举出例如 [0062] [0063] 可举出例如 [0064] [0065] 可举出例如 [0066] [0067] 上述式(I)表示的色素物质可举出例如5-羟基-1-(4-磺酸苯基)-4-(4-磺酸苯基偶氮)吡唑-3-羧酸或其盐(例如三钠盐)、6-羟基-5-(4-磺酸苯基偶氮)-2-萘磺酸或其盐(例如二钠盐)、3-羟基-4-(4-磺酸萘基偶氮)-2，7-萘二磺酸(也称“3-羟基-4-[(磺酰萘-1-基)偶氮]萘-2，7-二磺酸”)或其盐(例如三钠盐)、7-羟基-8-(4-磺酸萘基偶氮)-1，3-萘二磺酸或其盐(例如三钠盐)或水合物(例如11/2水合物)等。这些盐或水合物可举出例如市售品酒石黄(黄色4号)、黄色5号、红色2号、红色40号、红色102号等。此类色素物质可为食用，也可为非食用。 [0068] [0069] 上述式(II)中， [0070] X为氢、卤素、钠或钾，各X相同或不同， [0071] Y为氢、卤素、钠或钾，各Y相同或不同。 [0072] 本发明中，“卤素”指任意的卤族元素。上述卤素可举出例如氟、氯、溴及碘。 [0073] 此外，上述式(II)表示的色素物质可举出例如3’，6’-二羟基-2’，4’，5’，7’-四碘螺[异苯并呋喃-1(3H)，9’-(9H)呫吨]-3-酮或其盐(例如二钠盐)或水合物(例如一水合物)、3’，6’-二羟基-2’，4’，5’，7’-四溴-4，5，6，7-四氯螺[异苯并呋喃-1(3H)，9’-[9H]呫吨]-3-酮或其盐(例如二钠盐)、4，5，6，7-四氯-3’，6’-二羟基-2’，4’，5’， 7’-四碘螺[异苯并呋喃-1(3H)，9’-[9H]呫吨]-3-酮或其盐(例如二钠盐)、2，4，5，7-四溴-3，6-二羟基呫吨-9-螺-1’-3H-异苯并呋喃-3’-酮或其盐(例如二钠盐)、3，6-二羟基呫吨-9-螺-1’-3’H-异苯并呋喃-3’-酮或其盐(例如二钠盐)等。这些盐或水合物可使用例如红色3号、红色104号、红色105号、曙红(酸性红87)、荧光素钠(uranine)等。这些色素物质可为食用，也可为非食用。 [0074] 上述类黄酮系色素可举出例如类黄酮及类黄酮的聚合物等。上述类黄酮可举出例如市售的柿色素(Japanese persimmoncolor from Dipospyros kaki THUMB.)。上述柿色素通常以从果实抽提的类黄酮为主成分。此外，上述类黄酮的聚合物可举出例如市售的可可色素(Cacao color from Theobroma cacaoLINNE)。上述可可色素通常以花色素苷的聚合物为主成分。上述花色素苷的聚合物例如用下述式表示。下述式中，n为聚合度。n不受特别限制，但例如为5以上，优选为6以上。n的上限不受特别限制。R为配糖物半乳糖醛酸。 [0075] [0076] 本发明中吩噻嗪衍生物色素不受特别限制，可举出二氨基吩噻嗪或其衍生物。 [0077] 此外，上述吩噻嗪衍生物色素可举出例如下述式(III)表示的化合物、其互变异构体或立体异构体、或它们的盐。 [0078] [0079] 上述式(III)中，R3～R6分别为氢原子或烷基，任选相同或不同，上述烷基可举出例如碳原子数1～6的直链或支链烷基，特别优选甲基。上述式(III)中，Z分别为氢原子、烷基、硝基、氨基、卤素、磺基或羧基，任选相同或不同。上述Z中，上述烷基可举出例如碳原子数1～6的直链或支链烷基，特别优选甲基。 [0080] 予以说明，本发明中上述式(I)、(II)及(III)表示的色素也可为其互变异构体或立体异构体(例如：几何异构体、构象异构体及光学异构体)等异构体。此外，为盐的情况-下，上述式(III)中抗衡离子不受特别限制，可举出例如六氟磷酸根离子(PF6)、四氟硼酸- - 根离子(BF4)、氢氧根离子(OH)、醋酸根离子、碳酸根离子、磷酸根离子、硫酸根离子、硝酸根离子、卤离子、次卤酸根离子、亚卤酸根离子、卤酸根离子、高卤酸根离子、三氟甲基磺酸- - 根离子(OSO2CF3)、四(五氟苯基)硼酸根离子[B(C6F5)4]等阴离子(阴离子)。上述卤离- - - - 子可举出例如氟离子(F)、氯离子(Cl)、溴离子(Br)、碘离子(I)等。上述次卤酸根离子可举出例如次氟酸根离子、次氯酸根离子、次溴酸根离子、次碘酸根离子等。上述亚卤酸根离子可举出例如亚氟酸根离子、亚氯酸根离子、亚溴酸根离子、亚碘酸根离子等。上述卤酸根离子可举出例如氟酸根离子、氯酸根离子、溴酸根离子、碘酸根离子等。上述高卤酸根离子可举出例如高氟酸根离子、高氯酸根离子、高溴酸根离子、高碘酸根离子等。 [0081] 本发明中“卤素”指任意的卤族元素。上述卤素可举出例如氟、氯、溴及碘。此外，本发明中“烷基”不受特别限制，上述烷基可举出例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基等。此外，本发明中取代基等存在异构体的情况下，若无特别限制则可为任意的异构体。例如对于“丙基”的情况，可为正丙基及异丙基中的任一种。对于“丁基”的情况，可为正丁基、异丁基、仲丁基及叔丁基中的任一种。 [0082] 上述吩噻嗪衍生物色素的具体例子可举出例如下述化学式表示的亚甲蓝、天青A、天青B、天青C、甲苯胺蓝O、1，9-二甲基-3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪盐、亚甲基绿等。 [0083] 亚甲蓝 [0084] [0085] 天青A [0086] [0087] 天青B [0088] [0089] 天青C [0090] [0091] 甲苯胺蓝O [0092] [0093] 1，9-二甲基-3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪盐 [0094] [0095] 亚甲基绿 [0096] [0097] <吩噻嗪衍生物色素检测方法> [0098] 一种通过吸光度测定来检测反应体系中的吩噻嗪衍生物色素的方法， [0099] 其特征在于，其包括吩噻嗪衍生物色素的检测工序， [0100] 上述检测工序中，在选自上述式(I)表示的化合物、上述式(II)表示的化合物及类黄酮系色素所组成的组中的至少一种色素物质(本发明的位移试剂)的存在下，进行吩噻嗪衍生物色素的检测。 [0101] 如上所述，本发明中上述色素物质可使用本发明的位移试剂。上述色素物质只要在检测吩噻嗪衍生物色素时存在于上述反应体系中即可，例如可在上述检测工序之前添加。 [0102] 如上所述，本发明中的吩噻嗪衍生物色素不受特别限制。本发明中检测的吩噻嗪衍生物色素的来源不受特别限制，可举出例如来源于通过氧化还原而反应生成吩噻嗪衍生物色素的显色剂的吩噻嗪衍生物色素、以及作为显色剂添加的吩噻嗪衍生物色素自身。 [0103] 上述通过氧化还原反应而生成吩噻嗪衍生物色素的显色剂不受特别限制，可举出例如通过氧化或还原而游离(脱离)出吩噻嗪衍生物色素的底物。 [0104] 作为具体例子，通过氧化游离出吩噻嗪衍生物色素亚甲蓝的底物可举出例如10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪或其盐(例如商品名DA-67，和光纯药公司生产)、10-(乙酰氨基羰基)-3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪或其盐、专利文献3记载的10-(苯基羰基)-3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪或其盐等。此外，还可举出作为专利文献 4中记载的化合物No.II-4～9、II-10的10-(3-(甲基羧基氨基)-六甲基-氨基)-吩噻嗪、10-(3-(甲基羧基氨基)-4-甲基-苯基-氨基)-吩噻嗪、10-((3-(甲基羧基氨基甲基)-苯基)-甲氨基)-吩噻嗪、10-(1-萘基氨基)-吩噻嗪、10-(甲基)-吩噻嗪、10-(苯基氨基)-吩噻嗪、10-(甲氨基)-吩噻嗪及这些物质的盐。其中由于水溶性高的原因，优选 10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪盐。 [0105] 此外，其他生成吩噻嗪衍生物色素亚甲蓝的显色剂可举出例如无色亚甲蓝等无色化合物。无色亚甲蓝为无色的化合物(还原型)，通过氧化成为亚甲蓝(氧化型)。因此，无色亚甲蓝例如可用作检测氧化物质用的底物。本发明中，例如在上述反应体系中添加无色亚甲蓝作为显色剂，通过无色亚甲蓝与上述反应体系中的氧化物质的氧化还原反应，生成亚甲蓝，对其进行吸光度测定即可。此外，生成亚甲蓝以外的吩噻嗪衍生物色素的显色剂可举出各种吩噻嗪衍生物色素的无色体等。 [0106] 这种显色剂通常在利用氧化还原反应来检测样品中的目的成分时使用。本发明中，例如在上述反应体系中添加上述显色剂，通过上述显色剂与上述反应体系中的氧化物质或还原物质的氧化还原反应，由上述显色剂生成(游离出)吩噻嗪衍生物色素。该游离出的吩噻嗪衍生物色素的量对应于氧化物质或还原物质的量，因此通过检测游离出的吩噻嗪衍生物色素的有无及量，可判断反应体系中的氧化物质或还原物质的有无或量。上述氧化物质及还原物质例如通过氧化还原反应由样品中的目的成分生成即可。此外，样品中的目的成分为氧化物质或还原物质的情况下，其可直接与上述显色剂反应，也可进一步由目的成分生成氧化物质或还原物质，使其与上述显色剂反应。 [0107] 予以说明，如上所述，本发明中“显色剂”不仅指通过氧化还原反应生成呈现颜色的吩噻嗪衍生物色素的底物，也包含吩噻嗪衍生物色素自身。例如，如上所述，对于亚甲蓝的情况，亚甲蓝(氧化型)通过还原成为无色的无色亚甲蓝(还原型)。因此，亚甲蓝例如可作为用于检测还原物质的底物来使用。从而，本发明中例如首先在上述反应液中添加亚甲蓝作为显色剂，通过添加的亚甲蓝与上述反应体系中的还原物质的氧化还原反应，生成无色亚甲蓝。随后对亚甲蓝进行吸光度测定，测定亚甲蓝有无减少或减少的量即可。即，通过测定作为显色剂而添加的亚甲蓝的减少，能够判断反应体系中的还原物质的有无及量。对于亚甲蓝以外的吩噻嗪衍生物色素也同样，例如在上述反应液中添加吩噻嗪衍生物色素作为显色剂，添加的吩噻嗪衍生物色素与上述反应体系中的还原物质进行氧化还原反应，对吩噻嗪衍生物色素进行吸光度测定，测定吩噻嗪衍生物色素有无减少或减少的量即可。 [0108] 本发明中，上述色素物质在测定吩噻嗪衍生物色素的吸光度之前添加在反应体系中即可。因此，上述色素物质可在生成(游离出)吩噻嗪衍生物色素或使其消失的氧化还原反应的前后任一时间添加在反应体系中，也可在氧化还原反应开始的同时或途中添加。予以说明，反应体系可为试纸类的干体系、反应液类的湿体系(溶液)中的任一种。 [0109] 上述色素物质的添加比例不受特别限制，例如相对于反应体系中含有的1mol吩噻嗪衍生物色素，例如为1～1000mol，优选为2～200mol，更优选为4～100mol。此外，上述色素物质的添加比例例如可依据反应液中添加的显色剂的量来决定，相对于1mol显色剂例如为0.1～1000mol，优选为1～500mol，更优选为4～300mol。 [0110] 此外，反应体系中上述色素物质的终浓度例如为1×10-7～0.1mol/L，优选为-7 -72×10 ～0.05mol/L，更优选为5×10 ～0.03mol/L。上述反应液中上述显色剂的终-6 -6 浓度不受特别限制，例如为1×10 ～0.1mol/L，优选为5×10 ～0.01mol/L，更优选为-6 5×10 ～0.001mol/L。 [0111] 吩噻嗪衍生物色素的极大吸收波长已知通常分别为590～670nm左右。从而，由于其光谱，以往的方法仅能在波长约550～680nm的范围内进行吸光度测定。与此相对，采用本发明的方法，通过与上述色素物质共存，吩噻嗪衍生物色素的光谱与原本的光谱相比位移至长波长处，因此可在比以往方法中的上述的检测波长区更长波长区进行测定。即，采用本发明，例如可在670nm以上、680nm以上、690nm以上进行测定。本发明中的检测波长例如为560～730nm，优选为600～715nm。如上所述，采用本发明的方法，可在以往方法无法检测的700nm附近进行测定，因此，例如也可应用于检测波长固定于700nm的现有的自动分-6析装置。作为具体例子，在上述色素物质共存下测定吩噻嗪衍生物色素溶液(例如10 mol/L)的700nm处的吸光度时，与色素物质不存在时的700nm处的吸光度相比，例如可得到2～ 20倍的吸光度。 [0112] 作为具体例子，例如亚甲蓝的极大吸收波长通常为约660～670nm(例如666nm左右)，以往方法例如仅能在波长600～680nm的范围内进行吸光度测定。与此相对，采用本发明的方法例如可在670nm以上、680nm以上、690nm以上进行测定。本发明中的亚甲蓝的检测波长例如为610～730nm，优选为650～715nm，更优选为660～700nm。 [0113] (天青A) [0114] 天青A的极大吸收波长通常为约630～640nm(例如634nm左右)，以往方法例如仅能在波长550～675nm的范围内进行吸光度测定。与此相对，采用本发明的方法例如可在680nm左右以上、690nm左右以上、700nm左右以上进行测定，检测波长例如为约590～715nm，优选为约610～700nm。 [0115] (天青B) [0116] 天青B的极大吸收波长通常为约610～620nm(例如613nm左右)，以往方法例如仅能在波长550～675nm的范围内进行吸光度测定。与此相对，采用本发明的方法例如可在675nm左右以上、690nm左右以上、700nm左右以上进行测定，检测波长例如为约575～710nm，优选为约600～700nm。 [0117] (天青C) [0118] 天青C的极大吸收波长通常为约610～625nm(例如619nm左右)，以往方法例如仅能在波长540～650nm的范围内进行吸光度测定。与此相对，采用本发明的方法例如可在650nm左右以上、660nm左右以上、670nm左右以上进行测定，检测波长例如为约580～690nm，优选为约590～680nm。 [0119] (甲苯胺蓝O) [0120] 甲苯胺蓝O的极大吸收波长通常为约625～635nm(例如631nm左右)，以往方法例如仅能在波长550～670nm的范围内进行吸光度测定。与此相对，采用本发明的方法例如可在670nm左右以上、690nm左右以上、700nm左右以上进行测定，检测波长例如为约600～700nm，优选为约610～690nm。 [0121] (1，9-二甲基-3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪盐) [0122] 1，9-二甲基-3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪盐的极大吸收波长通常为约590～600nm(例如592nm左右)，以往方法例如仅能在波长520～675nm的范围内进行吸光度测定。与此相对，采用本发明的方法例如可在675nm左右以上、685nm左右以上、700nm左右以上进行测定，检测波长例如为约540～710nm，优选为约570～700nm。 [0123] (亚甲基绿) [0124] 亚甲基绿的极大吸收波长通常为约605～615nm(例如609nm左右)，以往方法例如仅能在波长540～675nm的范围内进行吸光度测定。与此相对，采用本发明的方法例如可在675nm左右以上、690nm左右以上、700nm左右以上进行测定，检测波长例如为约550～710nm，优选为约580～700nm。 [0125] 本发明的吩噻嗪衍生物色素的检测方法可应用于包括吩噻嗪衍生物色素的检测工序的所有测定(例如定性及定量)方法中。因此，优选应用于例如由氧化还原反应使吩噻嗪衍生物色素生成或消失，通过测定吩噻嗪衍生物色素的有无或其量的增减，来定性或定量目的物质的方法等。 [0126] <目的成分的测定方法> [0127] 其次，如上所述，本发明的第1种检测方法的特征在于，其为通过检测吩噻嗪衍生物色素来测定样品中的目的成分的方法，所述方法包括下述(A)～(E)工序： [0128] (A)由上述样品中的目的成分生成氧化物质或还原物质的工序； [0129] (B)在上述样品中，添加通过氧化还原反应而生成吩噻嗪衍生物色素的显色剂的显色剂添加工序； [0130] (C)通过上述氧化物质或还原物质与上述显色剂的氧化还原反应而生成吩噻嗪衍生物色素的工序； [0131] (D)通过本发明的吩噻嗪衍生物色素的检测方法来检测吩噻嗪衍生物色素，以测定有无生成上述吩噻嗪衍生物色素或生成量的工序； [0132] (E)由上述测定结果判断上述样品中的目的成分的有无或量的工序。 [0133] 此外，本发明的第2种检测方法的特征在于，其包括下述(B’)～(D’)工序替换上述(B)～(D)工序： [0134] (A)由上述样品中的目的成分生成氧化物质或还原物质的工序； [0135] (B’)在上述样品中，添加吩噻嗪衍生物色素作为显色剂的工序； [0136] (C’)使由上述样品中的目的成分生成的还原物质与吩噻嗪衍生物色素发生氧化还原反应的工序； [0137] (D’)通过本发明的吩噻嗪衍生物色素的检测方法来检测吩噻嗪衍生物色素，以测定添加的上述吩噻嗪衍生物色素有无减少或减少量的工序； [0138] (E)由上述测定结果判断上述样品中的目的成分的有无或量的工序。 [0139] 此外，本发明的特征在于，其在如上所述的本发明的位移试剂(上述色素物质)的存在下进行吩噻嗪衍生物色素的检测，关于其他的工序及条件等不受任何限制。 [0140] 本发明中的目的成分例如可利用吩噻嗪衍生物色素的检测进行测定即可，其种类不受任何限制，可举出例如能由目的成分通过氧化还原反应而生成氧化物质或还原物质的目的成分。上述目的成分自身为氧化物质或还原物质的情况下，如上所述，可由目的成分进一步生成氧化物质、还原物质，也可例如省略上述(A)工序，在上述(B)工序或上述(B’)工序中，使作为氧化物质或还原物质的目的成分自身与上述显色剂反应。上述目的成分的具体例子可举出例如糖化血红蛋白(Hb)、糖化白蛋白等糖化蛋白质、糖化肽、糖化氨基酸、葡萄糖、尿酸、胆固醇、肌酐、肌氨酸、甘油等。 [0141] 例举的目的成分中，优选应用于测定反映生物体状态的重要指标的糖化Hb。糖化Hb中例如有Hb的β链N末端氨基酸(缬氨酸)的α-氨基结合了葡萄糖的Hb(以下也称“HbA1c”)及Hb的赖氨酸的侧链氨基结合了葡萄糖的Hb(以下也称“GHbLys”)。且前者的值(HbA1c％)表示为相对于Hb量的HbA1c量的比率(比例，％)，已知其反映着生物体内血糖值的过去(约1～2个月)的履历。此外，后者的值(GHbLys％)表示为相对于Hb量的GHbLys量的比率(比例，％)，最近，由本发明人等阐明了其可反映着餐后高血糖(另外专利申请中)。如上所述，Hb的糖化率在糖尿病的诊断、预防、治疗等中为非常重要的指标，期待其改进为更优良的测定方法，因此期望在其测定中应用本发明。 [0142] 本发明的测定方法中，上述样品的种类不受任何限制。具体例子可举出例如全血、血浆、血清、血细胞等血液样品，尿、脑脊液等生物样品及饮用水、食品类等。目的成分为血细胞内成分的情况下，例如可将血细胞或含有血细胞的全血进行溶血处理来制备样品。溶血方法不受特别限制，例如可使用利用渗透压差的方法、采用超声波的方法、表面活性剂处理方法等。利用渗透压差的情况下，对于全血(或血细胞)例如添加2～100倍体积量的纯化水溶血即可。 [0143] 本发明的测定方法中，样品的种类不受任何限制，但出于以下的理由，优选应用于血液样品。如上所述，利用吩噻嗪衍生物色素检测进行的目的成分的测定方法可在相对长波长处进行测定，因此能被广泛采用。然而，血液样品(特别是含有血细胞成分的样品)中存在Hb，若Hb被氧化，其在吩噻嗪衍生物色素的原本的极大吸收波长处显示吸收，因此有可能影响吩噻嗪衍生物色素检测。与此相对，采用本发明，因可在更长波长区检测吩噻嗪衍生物色素，可减轻以往方法中氧化Hb带来的影响，可进一步提高测定精度。因此，其在测定作为血液成分的糖化Hb及糖化白蛋白等时，可称为特别有用的方法。 [0144] 下面，对本发明的目的成分的测定方法举一例进行说明，目的成分为糖化Hb，采用通过氧化游离出吩噻嗪衍生物色素的显色剂测定其HbA1c％。予以说明，本发明不受此例限制。 [0145] (蛋白酶处理) [0146] 首先，用蛋白酶处理样品中的糖化Hb。该工序虽非必需，但因后续工序中果糖氨基酸氧化酶(以下称“FAOD”)可高效地作用于Hb的糖化部分而优选该工序。 [0147] 上述蛋白酶例如可使用金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、丝氨酸羧肽酶、蛋白酶K、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、猪胰脏来源的胰蛋白酶、Bacillus subtilis来源的蛋白酶、Aspegillus oryzae来源的蛋白酶等，优选为内切蛋白酶。市售品可举出例如金属蛋白酶(爱科来公司生产)、蛋白酶A“アマノ”G(天野エンザイム公司生产)、蛋白酶M“アマノ”G(天野エンザイム公司生产)、蛋白酶S“アマノ”G(天野エンザイム公司生产)、肽酶R(天野エンザイム公司生产)、木瓜蛋白酶M-40(天野エンザイム公司生产)、商品名プロテア一ゼN(フルカ公司生产)、商品名プロテア一ゼN“アマノ”(天野制药公司生产)、Bacillus属来源的金属蛋白酶(东洋纺公司生产：商品名トヨチ一ム)等。 [0148] 特别在切出Hb的β链N末端肽的情况下，优选特异性作用于β链N末端、催化N末端肽断裂的蛋白酶(例如，日本特开2000-300294号公报、日本特开2004-344052号公报等)。此外，催化β链N末端缬氨酸的断裂的蛋白酶可举出例如国际公开第2000/50579号小册子(日本特许3668801)、国际公开第2000/61732号小册子、日本特开2002-315600号公报等公开的蛋白酶。 [0149] 该反应液中的蛋白酶的添加比例例如在0.001～300000KU/L的范围，优选为0.01～30000KU/L。上述反应液中的Hb浓度为0.005mM时，蛋白酶的添加比例例如在 0.01～300000KU/L的范围，优选为0.05～30000KU/L。蛋白酶的活性单位“U”为：35℃下 1分钟内能增加相当于1微摩尔酪氨酸在275nm处的吸光度的酶量为1U。 [0150] 上述蛋白酶处理优选例如在缓冲液中进行，可使用Tris-盐酸缓冲液、EPPS缓冲液、PIPES缓冲液、磷酸缓冲液、ADA缓冲液、MES缓冲液、MOPS缓冲液、柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液等。此外，蛋白酶反应液的pH例如在4～10的范围，优选为6～9，也可例如通过如上所述的缓冲液调整pH。 [0152] 此外，该蛋白酶处理例如也可在以下所示的促进化合物的存在下进行。在这类促进化合物的存在下对Hb进行蛋白酶处理，可实现蛋白酶处理的高效率化和缩短化。此外，由于可高效地进行蛋白酶处理，例如，也不需要增加处理中使用的蛋白酶的量。 [0153] 上述促进化合物可举出例如下述式(IV)表示的化合物。 [0154] R-X ...(IV) [0155] 上述式(IV)中，R为碳原子数为9以上的烷基、取代烷基、酰基或取代酰基。具体例子可举出碳原子数为9～16的直链烷基或直链酰基、碳原子数为10～40且主链碳原子数为9～16的支链烷基或支链酰基、或被环烷基取代的直链烷基(例如，环烷基的碳原子数为3～8，除环烷基外的直链的碳原子数为4～13)等。上述环烷基可举出例如环己基、环戊基、环丁基等。上述式(IV)中，X为糖残基，优选为例如单糖或二糖的残基。上述单糖可举出例如甘露糖苷、葡萄糖苷、硫代葡萄糖苷等，二糖可举出麦芽糖苷、吡喃果糖基-吡喃葡萄糖苷、硫代麦芽糖苷等。这些糖的构象可为α、β、D、L中的任一种。此外，结合在糖的环结构上的氢以及OH基的氢也可被例如Na、K、卤素等取代。此外，本发明中，将介于R与糖残基的环结构的键间的原子(例如，-O-、-S-等)作为糖残基的组成部分。 [0156] 上述式(IV)的促进化合物的具体例子可举出例如正十二烷基-β-D-麦芽糖苷(正十二烷基-β-D-麦芽吡喃糖苷)、6-环己基己基-β-D-麦芽糖苷、蔗糖单月桂酸酯(β-D-吡喃果糖基-α-D-吡喃葡萄糖苷单十二酸酯)、正癸基-β-D-麦芽糖苷(正癸基-β-D-麦芽吡喃糖苷)、正壬基-β-D-硫代麦芽糖苷(正壬基-β-D-硫代麦芽糖苷)、5-环己基戊基-β-D-麦芽糖苷、十一烷基-β-D-麦芽糖苷、正十二烷基-αβ-D-麦芽糖苷、十六烷基-β-D-麦芽糖苷及3-氧十三烷基-α-D-甘露糖苷等。这些化合物的化学式示意如下。其中，优选上述式(IV)中的R(烷基链)的碳原子数为12以上的正十二烷基-β-D-麦芽糖苷、蔗糖单月桂酸酯、十六烷基-β-D-麦芽糖苷等。此外，若R的碳原子数相同时(例如，碳原子数相同的烷基与酰基)，更优选为酰基，如优选正十二烷基-β-D-麦芽糖苷(正十二烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷)。 [0157] 蛋白酶处理的反应液中的上述促进化合物的添加比例例如在0.01～200mM的范围，优选为0.4～100mM。上述反应液中的Hb浓度为0.005mM时，上述促进化合物的添加比例例如在0.4～100mM的范围，优选为1～100mM。此外，上述促进化合物与蛋白酶的添加顺序不受任何限制，可同时添加，也可以不同顺序分别添加。 [0158] 如上所述，蛋白酶的处理条件不受特别限制，同时存在促进化合物的情况下，其处理时间不受限制，尤其是上限不受限制，例如，可进行0.1～60分钟左右的蛋白酶处理。处理时间优选为0.1～45分钟，更优选为0.2～20分钟，特别优选为0.2～5分钟。在上述促进化合物存在下进行蛋白酶处理时，能更迅速地切出氨基酸或多肽，因此即便采用如上所述的处理时间也可充分进行切断处理。 [0159] 此外，除上述式(IV)的化合物外，上述促进化合物还可举出例如硝基化合物。这些化合物可使用任意一种，也可两种以上同时使用。硝基化合物可举出例如亚硝酸及其盐。亚硝酸盐不受特别限制，可举出例如亚硝酸钾、亚硝酸戊酯、亚硝酸丁酯、硝化甘油、亚硝酸钠、对硝基氯苯、三硝基甲苯、硝基苯等。蛋白酶处理的反应液中的上述硝基化合物的添加比例不受特别限制，例如上述反应液中的Hb浓度为0.005mM的情况下，上述硝基化合物的添加比例优选为例如0.005mM以上，更优选为0.05～2mM。 [0160] 除上述的化合物以外，上述促进化合物还可举出例如四唑化合物。上述四唑化合物不受特别限制，可举出例如2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯基)-二氢-四唑盐、2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯基)-二氢-四唑盐、2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯基)-二氢-四唑盐、 2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-二氢-四唑盐、3，3’-(1，1’-联苯基-4，4’-二基)-双(2，5-二苯基)-二氢-四唑盐、3，3’-[3，3’-二甲氧基-(1，1’-联苯基)-4，4’-二基]-双[2-(4-硝基苯基)-5-苯基-二氢-四唑盐]、2，3-二苯基-5-(4-氯苯基)四唑盐、2，5-二苯基-3-(对二苯基)四唑盐、2，3-二苯基-5-(对二苯基)四唑盐、2，5-二苯基-3-(4-苯乙烯基苯基)四唑盐、2，5-二苯基-3-(间甲苯基)四唑盐、2，5-二苯基-3-(对甲苯基)四唑盐、2，3-二苯基-5-(2-噻吩基)四唑盐、2-苯并噻唑基-3-(4-羧基-2-甲氧基苯基)-5-[4-(2-磺乙基氨甲酰基)苯基]-二氢-四唑盐、2，2’-二苯并噻唑基-5， 5’-双[4-二(2-磺乙基)氨甲酰基苯基]-3，3’-(3，3’-二甲氧基-4，4’-亚联苯基)二四唑盐、3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-二氢-四唑盐、2，3-二苯基-5-氰基四唑盐、2，3-二苯基-5-羧基四唑盐、2，3-二苯基-5-甲基四唑盐、2，3-二苯基-5-乙基四唑盐等，特别优选为2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯基)-二氢-四唑盐。上述四唑化合物除作为促进化合物的功能外，在血液样品这样的含有抗坏血酸等还原物质的样品的情况下，例如还可避免这些物质对氧化还原反应的影响。以避免上述影响为目的的情况下，可在下一工序FAOD处理之前在样品中添加四唑化合物。予以说明，四唑化合物也具有如上所述的作为促进化合物的功能，因此优选在蛋白酶处理之前添加。 [0161] 上述四唑化合物的添加量不受特别限制，优选例如每1μL样品中添加0.001～100μmol，更优选在0.005～10μmol的范围，特别优选在0.01～1μmol的范围。 [0162] (FAOD处理工序) [0163] 随后，向由上述蛋白酶处理得到的Hb片段中添加FAOD，使FAOD作用于N末端缬氨酸的糖化部分，生成氧化物质过氧化氢。对糖化Hb的HbA1c进行测定的情况下，通过蛋白酶得到的Hb切断产物为β链N末端糖化缬氨酸或含有上述糖化缬氨酸的肽，使FAOD作用于β链N末端缬氨酸的糖化部分即可。予以说明，如上所述，Hb片段取决于使用的蛋白酶的种类的选择。 [0164] 上述FAOD不受特别限制，但优选作用于α-氨基被糖化的氨基酸或肽、催化产生过氧化氢与α-酮醛的反应的酶(以下称“FAOD-α”)。这种催化反应，例如可用下述式(1)表示。 [0165] R1-CO-CH2-NH-R2+H2O+O2 [0166] →R1-CO-CHO+NH2-R2+H2O2...(1) [0167] 上述式(1)中，R1指羟基或来源于糖化反应前的糖的残基(糖残基)。若反应前的1 1 糖为醛糖时，上述糖残基(R)为醛糖残基，若反应前的糖为酮糖时，上述糖残基(R)为酮糖残基。例如，反应前的糖为葡萄糖时，虽然可通过阿马道里重排(Amadori Rearrangement) 1 使反应后的结构转化为果糖结构，但这时糖残基(R)为葡萄糖残基(醛糖残基)。此糖残 1 基(R)例如可表示为： [0168] -[CH(OH)]n-CH2OH [0169] 其中n为0～6的整数。 [0170] 上述式(1)中，R2不受特别限制，例如为下述式(2)所示的氨基酸残基或肽残基。 [0171] -CHR3-CO-R4 ...(2) [0172] 上述式(2)中，R3表示氨基酸侧链基团，R4表示羟基、氨基酸残基或肽残基，例如3 可用下述式(3)表示。下述式(3)中，n为0以上的整数，与上述同样，R 表示氨基酸侧链基团，氨基酸侧链基团全部相同或不同。 [0173] -(NH-CHR3-CO)n-OH ...(3) [0174] 这种FAOD-α可使用例如国际公开第2004/029251号小册子记载的果糖胺氧化酶(fructosyl amine oxidase，FAOD)、日本特开2004-275013号公报及日本特开2004-275063号公报记载的果糖胺氧化酶、青霉属来源的FAOD(日本特开平8-336386号公报)等。使用这种FAOD，例如即使β链N末端缬氨酸以外被糖化，也难以作用于缬氨酸糖化部分以外的糖化部分，因此，能以更高的精度进行HbA1c的测定。 [0175] FAOD还可进一步具有上述(1)以外的底物特异性。这种FAOD可举出例如可作用于上述被糖化的α-氨基与被糖化的氨基酸侧链基团双方的FAOD(以下称“FAOD-αS”)。具体例子可举出例如商品名FPOX-CE(キツコ一マン公司生产)、商品名FPOX-EE(キツコ一マン公司生产)、市售的商品名FOD(旭化成公司生产)、赤霉(Gibberella)属来源的FAOD(日本特开平8-154672号公报)、镰刀菌(Fusarium)属来源的FAOD(日本特开平7-289253号公报)、曲霉菌(Aspergillus)属来源的FAOD(WO99/20039)等。这种FAOD例如可适当选择蛋白酶的种类，通过与能特异性切断β链N末端的氨基酸或肽的蛋白酶进行组合，可抑制作用于其他糖化部位。 [0176] FAOD处理优选与上述蛋白酶处理同样在缓冲液中进行，上述缓冲液不受特别限制，可使用与上述蛋白酶处理相同的缓冲液。FAOD处理的条件不受特别限制，反应液的pH例如可为6～9，处理温度例如在10～38℃的范围，优选为25～37℃。处理时间也不受特别限制，例如为0.1～60分钟，优选为0.1～5分钟。 [0177] FAOD处理的反应液中的FAOD的添加比例例如在0.01～50KU/L的范围，优选为0.5～10KU/L。FAOD的活性“U”定义为：以果糖基缬氨酸作为底物，1分钟内催化生成1微摩尔过氧化氢的酶量为1U。 [0178] (吩噻嗪衍生物色素生成工序) [0179] 随后，在反应液中添加如上所述的显色剂，使通过上述FAOD处理生成的过氧化氢与上述显色剂进行氧化还原反应。通过该反应，上述显色剂被氧化，生成吩噻嗪衍生物色素。 [0180] 该氧化还原反应中，优选使用氧化酶作为催化剂，可举出例如过氧化物酶(POD)。该反应优选与上述FAOD处理同样在缓冲液中进行，可使用如上所述的缓冲液。POD处理的条件不受特别限制，反应液的pH例如为5～9。处理温度例如在10～40℃的范围，优选为 25～37℃。处理时间也不受特别限制，例如为0.1～5分钟。反应液中的P OD的添加比例例如在0.01～300KU/L的范围，优选为0.5～40KU/L。POD的活性“U”定义为：1分钟内能氧化1微摩尔愈创木酚的酶量为1U。 [0181] 此外，反应液中的显色剂的添加比例例如在0.001～10mM的范围，优选为0.005～2mM。 [0182] (吸光度测定工序) [0183] 随后，在反应液中添加上述的色素物质，之后对吩噻嗪衍生物色素的吸光度进行测定。如上所述，该色素物质的添加时间在吸光度测定前即可，此外不受任何限定，例如在吩噻嗪衍生物色素的生成工序的前后均可，也可与上述显色剂及氧化酶同时添加。 [0184] 上述色素物质的添加比例不受特别限制，相对于1mol显色剂例如为0.1～1000mol，优选为1～500mol，更优选为5～300mol，此外，反应液中的终浓度例如为 0.001～100mmol/L，优选为0.005～50mmol/L，更优选为0.01～10mmol/L。 [0185] 吸光度测定例如可使用分光光度计及目前公知的检测仪器。反应液的吸光度指示着生成的吩噻嗪衍生物色素量，生成的吩噻嗪衍生物色素的量对应于过氧化氢的量，过氧化氢的量对应于Hb中的β链N末端缬氨酸的糖化量。从而通过吸光度测定，可间接地求得Hb的糖化量(HbA1c浓度)。进而，通过另外测定样品中的总Hb量(Hb浓度)，按下述式中所示，算出Hb的β链N末端缬氨酸的糖化量(HbA1c浓度)与样品中的总Hb量(Hb浓度)之比(百分比)，可求得HbA1c％。此外，Hb量可采用目前公知的方法或市售的试剂盒来测定。 [0186] HbA1c％＝(β链N末端缬氨酸的糖化量/Hb量)×100 [0187] 由吸光度算出Hb糖化量例如可采用由Hb的β链N末端的已知糖化量对吸光度作图而得到标准曲线。例如，对于β链N末端糖化量已知的Hb标准液，与上述同样进行吸光度测定，作出表示该标准液的测定值与已知的糖化量的关系的标准曲线。然后在该标准曲线中代入如上所述进行测定得到的吸光度，即可算出β链N末端的糖化量。 [0188] 此外，测定糖化Hb的GHbLys％的情况下，例如除以下几点外，可与上述的HbA1c％测定同样进行。 [0189] 蛋白酶可使用与上述同样的酶，其中切出赖氨酸或赖氨酸肽的情况下，优选使用例如国际公开第2002/006519号小册子中记载的蛋白酶等。 [0190] FAOD不受特别限制，但优选作用于氨基酸侧链的氨基(例如ε-氨基)被糖化的氨基酸或肽、催化下述式(1’)中所示的反应的酶(FAOD-S)。 [0191] R1-CO-CH2-NH-R2+H2O+O2 [0192] →R1-CO-CHO+NH2-R2+H2O2...(1’) [0193] 上述式(1’)中，R1与上述式(1)的R1相同，R2可用下述式(4’)表示。下述式(4’)中“-(CH2)4-”表示赖氨酸的侧链基团中被糖化的氨基以外的部分。 [0194] -(CH2)4-CH(NH-R6)-CO-R7...(4’) [0195] 此外，上述式(4’)中，R6为氢、氨基酸残基或肽残基，例如可用下述式(5’)表示。3 予以说明，下述式(5’)中，n为0以上的整数，R 表示氨基酸侧链基团，氨基酸侧链基团全部相同或不同。 [0196] -(CO-CR3H-NH)n-H ...(5’) [0197] 此外，上述式(4’)中，R7为羟基、氨基酸残基或肽残基，例如可用下述式(6’)表3 示。予以说明，下述式(6’)中，n为0以上的整数，R 与上述同样表示氨基酸侧链基团，氨基酸侧链基团全部相同或不同。 [0198] -(NH-CHR3-CO)n-OH ...(6’) [0199] 特异性作用于上述被糖化的氨基酸侧链的FAOD-S可举出例如镰刀菌属来源的FAOD(日本生物工学会大会平成12年度「Fusarium oxysporum由来アミノ酸オキシダ一ゼの基質特異性の変換；藤原真紀他」)(日本生物工学会大会平成12年度“Fusarium oxysporum来源的氨基酸氧化酶的底物特异性的变换；藤原真纪等”)等。予以说明，FAOD还可进一步具有上述式(1’)以外的底物特异性，也可使用如上所述的FAOD-αS。这种FAOD的情况下，例如可选择与国际公开第2002/006519号小册子中记载的蛋白酶等类似的、不生成N末端的α位氨基被糖化的糖化氨基酸的蛋白酶(例如特异地切断赖氨酸及含有赖氨酸的肽的蛋白酶)，通过与其进行组合，可抑制对其他糖化部位的作用。 [0200] GHbLys％可如下求得：通过吸光度测定间接地求得Hb的Lys的侧链氨基的糖化量(GHbLys浓度)，再如下述式中所示，算出Lys的侧链氨基酸的糖化量(GHbLys浓度)与样品中的总Hb量(Hb浓度)之比(百分比)。 [0201] GHbLys％＝(Lys的侧链氨基的糖化量/Hb量)×100 [0202] 予以说明，Hb的糖化率(％)的测定中，各处理工序可如上所述分别进行，但在不影响测定的范围内也可同时进行各处理。作为具体例子，可按如下的组合同时进行各处理。此外，蛋白酶、FAOD、POD、显色底物的添加顺序不受特别限制，其中，上述色素物质只需在吩噻嗪衍生物色素的吸光度测定前添加即可，可在任一工序中添加。 [0203] 1：溶血处理+蛋白酶处理 [0204] 2：蛋白酶处理+FAOD处理 [0205] 3：FAOD处理+POD处理 [0206] 4：蛋白酶处理+FAOD处理+POD处理 [0207] <显色剂试剂> [0208] 其次，本发明的显色剂试剂的特征在于，其为在上述本发明的吩噻嗪衍生物色素的检测方法或本发明的目的成分的测定方法中使用的显色剂试剂，所述显色剂试剂含有通过氧化还原反应而生成吩噻嗪衍生物色素的化合物或吩噻嗪衍生物色素两者中任一种显色剂、以及本发明的位移试剂(上述的色素物质)。 [0209] 上述显色剂试剂中的上述显色剂与上述色素物质的添加比例不受特别限制，例如相对于1mol显色剂，色素物质例如为0.1～1000mol，优选为1～500mol，更优选为4～300mol。此外，上述显色剂试剂中的显色剂与色素物质的浓度不受特别限制，例如可考虑添加于反应体系时的终浓度及添加在反应体系后的稀释比例等而适当决定。 [0210] 上述显色剂试剂可为固体(dry)或液体(wet)中的任一种。添加该试剂的反应体系为液体的情况下，例如可在使用时溶解于适当的溶剂中作为液体试剂，也可以液体状态保存使用。上述的色素物质，其中特别是5-羟基-1-(4-磺酸苯基)-4-(4-磺酸苯基偶氮)吡唑-3-羧酸及其盐、黄色5号及红色2号等，优选应用于液体试剂。使该色素物质以液体状态与显色剂共存的情况下，由于上述色素物质的存在，例如遮挡了对液体内的显色剂的光照，上述显色剂的自然显色被抑制。因此，采用本发明，显色剂试剂可长时间以液体状态保存，特别适合于使用DA-67这样的对光不稳定的显色剂的场合。 [0211] 上述显色剂试剂的pH不受特别限制，例如可依据显色剂的种类及目的的测定方法中的反应体系的pH条件等适当决定。具体例子例如为4～9，优选为5～9。此外，显色剂为10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪盐(商品名DA-67；和光纯药公司生产)的情况下，例如为4～10，优选为5～9。 [0212] 本发明的显色剂试剂例如可为仅含有显色剂与本发明的位移试剂(色素物质)的试剂，也可例如依据目的的测定方法进一步含有各种酶及添加物等。 [0213] 针对本发明的显色剂试剂，举出一个使用于上述糖化Hb测定方法中的例子进行说明。予以说明，本发明不受该例限制。 [0214] 如上所述，糖化Hb的测定(糖化率的测定)中，例如可使用蛋白酶、FAOD、POD、显色剂，但也可将以下的第1试剂与本发明的显色剂试剂即第2试剂组合使用。 [0215] 第1试剂例如为含有FAOD、POD的试剂，此外例如也可含有缓冲剂、血细胞溶血用的表面活性剂、促进蛋白酶处理的上述促进化合物等。这些各成分的含有比例不受特别限制，例如反应体系中的第1试剂的最终稀释倍率设定为1.3倍的情况下，例如FAOD为0.3～10KU/L，POD为1～50KU/L，缓冲剂为10～200mmol/L，表面活性剂为0.1～10g/L，促进化合物为0.1～10g/L，pH例如为5～8。 [0216] 第2试剂例如为含有色素物质、蛋白酶、显色剂的试剂，此外例如也可含有缓冲剂、氯化钙等的盐、十六烷基三甲基氯化铵等。这些各成分的含有比例不受特别限制，例如反应体系中的第2试剂的最终稀释倍率设定为5.3倍的情况下，例如色素物质为10～1000mg/L，蛋白酶为100～5000KU/L，显色剂为0.005～0.1mmol/L，缓冲剂为10～ 300mmol/L，氯化钙为0.5～20mmol/L，十六烷基三甲基氯化铵为0.1～3mmol/L，pH例如为4～7。 [0217] 本发明的显色剂试剂可作为在本发明的吩噻嗪衍生物色素的检测方法或目的成分的测定方法中使用的试剂盒的组成试剂使用。本发明中的试剂盒含有本发明的显色剂试剂，具体例子可举出含有如上所述的第1试剂及本发明的显色剂试剂即第2试剂的组成。 [0218] 此外，采用本发明的显色剂试剂，通过使本发明的位移试剂(上述色素物质)与显色剂共存，例如也可抑制吩噻嗪衍生物色素的自然产生。因此，本发明的位移试剂例如也可作为抑制由上述显色剂自然产生吩噻嗪衍生物色素的抑制剂使用。上述色素物质作为上述抑制剂使用的情况下，与上述同样，上述显色剂试剂中的显色剂与色素物质的含有比例及浓度不受特别限制。 [0219] <吸收光谱的位移方法> [0220] 本发明的位移方法的特征在于，其为一种使反应体系中的吩噻嗪衍生物色素的吸收光谱位移的方法，该方法在上述反应体系中添加上述色素物质(本发明的位移试剂)。如上所述，采用本发明的位移试剂，可使吩噻嗪衍生物色素的吸收光谱位移至长波长处。具体方法例如与本发明的吩噻嗪衍生物色素检测方法相同。 [0221] 以下，通过实施例进一步具体说明本发明，但本发明不受限于此。 [0222] 实施例1 [0223] 使各种位移试剂与亚甲蓝共存，对于亚甲蓝，确认其是否发生吸光度峰的位移或光谱向长波长处的位移。 [0224] (位移试剂) [0225] No.1酒石黄 [0226] No.2食品添加剂食用黄色5号 [0227] No.3食品添加剂食用红色2号 [0228] No.4食品添加剂食用红色3号 [0229] No.5食品添加剂食用红色102号 [0230] No.6食品添加剂食用红色104号 [0231] No.7食品添加剂食用红色105号 [0232] No.8可可色素(关东化学公司生产) [0233] No.9柿色素(关东化学公司生产) [0234] (反应液组成) [0235] 亚甲蓝 0.4mg/L [0236] MOPS 300mmol/L(pH6.5) [0237] 位移试剂 300mg/L [0238] 采用分光光度计(商品名HITACHI U-3300：日立公司生产)测定上述反应液的光谱，确认了亚甲蓝的光谱中的极大吸收波长、最大吸光度及700nm处的吸光度。此外，对不添加位移试剂的反应液同样进行了测定，将其作为比较例1。其结果如下述表1中所示。此外，含有位移试剂No.1(酒石黄)或位移试剂No.8(可可色素)的反应液(实施例)及不添加位移试剂的反应液(比较例)的光谱分别如图1及图2所示。予以说明，两图中实线为实施例的光谱，虚线为比较例的光谱。 [0239] [表1] [0240] [0241] 如上述表1中所示，使用任一位移试剂的情况下，或显示最大的吸光度的极大吸收波长位移至长波长处，或极大吸收波长虽不改变但可观察到光谱有整体向长波长处位移的倾向。前者的现象在位移试剂No.1～3及5中观察到。具体以图1中所示为例，使用位移试剂No.1的反应液中，极大吸收波长从666nm位移至长波长处，与比较例1相比，700nm处的吸光度也增加到约5倍左右，可知其为能够进行充分测定的吸光度。此外，后者的现象在位移试剂No.4及6～9中观察到。具体以图2中所示为例，使用位移试剂No.8的反应液中，极大吸收波长虽为664nm，但664nm处的吸光度减少，且光谱整体位移至长波长处。因此700nm处的吸光度与比较例1相比也有增加。予以说明，吸光度测定中，通常吸光度若显示0.05左右即可判断为可充分可靠的测定值。因此，根据实施例，可判断700nm处得到了充分的测定值。 [0242] 实施例2 [0243] 采用通过氧化生成亚甲蓝的显色剂DA-67与上述实施例1的位移试剂，进行了HbA1c％的测定。 [0244] (样品) [0245] 将下述商品用下述稀释液稀释27倍后的溶液(以下分别称“低”、“中”、“高”)作为样品。此外，使用纯化水作为对照。 [0246] <低> [0247] IFCC control Barcelona，Low HbA1c，Normal Hemoglobin(HbA1c％＝3.2％)(IFCC对照，巴塞罗那，低HbA1c，正常血红蛋白(HbA1c％＝3.2％)) [0248] <中> [0249] IFCC control Barcelona，Medium HbA1c，Medium Hemoglobin(HbA1c％＝5.1％)(IFCC对照，巴塞罗那，中HbA1c，中等血红蛋白(HbA1c％＝5.1％)) [0250] <高> [0251] IFCC control Barcelona，High HbA1c，Normal Hemoglobin(HbA1c％＝7.5％)(IFCC对照，巴塞罗那，高HbA1c，正常血红蛋白(HbA1c％＝7.5％)) [0252] [表2] [0253] (稀释液) [0254] PIPES 30mmol/L(pH7) [0255] 正十二烷基-αβ-D-麦芽糖苷 0.5g/L [0256] KNO2 35mM [0257] (方法) [0258] 将上述各样品6.5μL与纯化水6.5μL混合后，再与78μL下述第1试剂(R1)混合。将该混合液于37℃下孵育5分钟后，添加19.5μL下述第2试剂(R2)，于37℃下进行蛋白酶处理及显色反应。随后，采用生化自动分析装置(商品名JCA-BM8：日本电子公司制)测定添加第2试剂前的反应液在波长658nm处的吸光度(A0)及在波长694nm处的吸光度(A0’)、以及添加第2试剂5分钟后的反应液在波长658nm处的吸光度(A5)及在波长694nm处的吸光度(A5’)，求得其差(A5-A0)及(A5’-A0’)。予以说明，对于使用不添加位移试剂的第2试剂的样品，也进行了同样测定，将其作为比较例2。其结果如下述表4中所示。 [0259] [表3] [0260] (第1试剂：R1) [0261] FPOX-CE(キツコ一マン公司生产) 1.5KU/L [0262] POD 10KU/L [0263] PIPES 30mmol/L(pH7) [0264] Emulgen A-500(花王公司生产) 0.05g/L [0265] 正十二烷基-αβ-D-麦芽糖苷 2.5g/L [0266] (第2试剂：R2) [0267] 下述位移试剂(No.1-9)规定量 [0268] 金属蛋白酶(爱科来公司生1800KU/L [0269] 产) [0270] CaCl2 5mmol/L [0271] Tris-HCl 70mmol/L [0272] MES 30mmol/L(pH5.5) [0273] 十六烷基三甲基氯化铵 0.2g/L [0274] DA-67(和光纯药公司生产) 0.03mmol/L [0275] *R2使用制备后在遮光条件下5℃保存40天后的溶液。 [0276] (位移试剂) [0277] No.1酒石黄(キシダ化学公司生产) 100mg/L [0278] No.2酒石黄(キシダ化学公司生产) 200mg/L [0279] No.3食品添加剂食用黄色4号(东京化成公司生产)100mg/L [0280] [表4] [0281] [0282] 如上述表4中所示，不添加位移试剂的比较例2中，随着样品的HbA1c％上升(低→中→高)，658nm处的吸光度差(A5-A0)逐一增加0.01左右，但694nm处的吸光度差(A5’-A0’)基本未见变化。此外，即便对于HbA1c％高的样品“高”，694nm处的吸光度差为0.009，不满足作为具有可靠性的测定值所需的量级(0.01左右以上)。与此相对，添加了位移试剂的实施例2中，无论使用何种位移试剂，随着样品的HbA1c％的上升(低→中→高)， 694nm处的吸光度差(A5’-A0’)逐一增加0.005～0.006。此外，即便对于HbA1c％最低的样品“低”，也显示0.01以上的上述吸光度差，满足了作为具有充分可靠性的测定值所需的量级。由以上的结果可知，在亚甲蓝的检测中，使用如上所述的位移试剂可在比以往的660nm附近更长波长处进行亚甲蓝的检测，且利用长波长处的亚甲蓝的检测可进行HbA1c％的测定。 [0283] 实施例3 [0284] 使各种吩噻嗪衍生物色素与各种位移试剂共存，对于上述色素，确认其是否产生吸光度峰的位移或光谱向长波长处的位移。 [0285] (吩噻嗪衍生物溶液) [0286] 下述衍生物以1mmol/mL溶解于纯化水中。 [0287] 亚甲蓝(东京化成工业) [0288] 天青C(Fluka公司) [0289] 天青A(Fluka公司) [0290] 1，9-二甲基-吩噻嗪(1，9-二甲基-3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪盐，Sigma公司)[0291] 甲苯胺蓝O(Sigma公司) [0292] 天青B(和光纯药公司) [0293] 亚甲基绿(MP Biomedica) [0294] (色素物质溶液) [0295] 下述色素物质以10mmol/mL溶解于纯化水中。 [0296] No.1酒石黄 [0297] No.2食品添加剂食用黄色5号 [0298] No.3食品添加剂食用红色2号 [0299] (缓冲液) [0300] MES-NaOH缓冲液30mmol/mL pH5.8 [0301] MOPS-NaOH缓冲液30mmol/mL pH7.6 [0302] [表5] [0303] (反应液组成) [0304] [0305] 在制备后立即用分光光度计(商品名V-550：日本分光公司生产)对上述反应液进行光谱测定，确认极大吸收波长以及700nm处的吸光度。此外，对不添加色素物质的反应液进行了同样的测定，将其作为比较例。 [0306] 首先，上述反应液的极大吸收波长如表6所示。予以说明，下述表中括号内的数值表示对照与实施例的极大吸收波长之差。如下述表中所示，在各色素物质的存在下，与对照相比，任一吩噻嗪衍生物色素的极大吸收波长都能位移至长波长处。 [0307] [表6] [0308] 缓冲液(pH5.8) [0309] [0310] 缓冲液(pH7.6) [0311] [0312] 其次，上述反应液的700nm处的吸光度如下述表7所示。下述表中，括号内的数值表示对照与实施例在700nm处的吸光度的差。如下述表中所示，在各位移试剂的存在下，任一吩噻嗪衍生物色素在700nm处的吸光度都上升了。 [0313] [表7] [0314] 缓冲液(pH5.8) [0315] [0316] 缓冲液(pH7.6) [0317] [0318] 另外，含有各种吩噻嗪衍生物色素与各种位移试剂的反应液的光谱如图3～图5所示。予以说明，这些结果为扣除位移试剂单独的吸收光谱后的光谱。图3～图5中，(A)为亚甲蓝，(B)为天青C，(C)为天青A(Fluka公司)，(D)为1，9-二甲基-吩噻嗪，(E)为甲苯胺蓝O，(F)为天青B，(G)为亚甲基绿的结果。此外，该图中0的实线为对照(不添加位移试剂)，No.1的虚线为酒石黄，No.2的虚线为食用黄色5号，No.3的虚线表示食用红色2号的结果。如各图中所示，在位移试剂的存在下，与对照(1的实线)相比，确认了任一吩噻嗪衍生物色素的吸收光谱都位移至长波长处。 [0319] 实施例4 [0320] 生成亚甲蓝的显色剂通常显示易被光分解的性质，对此类显色剂，在色素物质(上述位移试剂)的共存下，确认了上述色素物质抑制了亚甲蓝的自然产生而导致的背景上升。 [0321] 与实施例2同样制备第2试剂(R2)后，以暴露于光中的状态在冰箱中保存30天。予以说明，第2试剂中添加的色素物质为实施例2中的No.1(酒石黄100mg/L)及No.3(食品添加剂食用黄色4号100mg/L)。 [0322] 将78μL下述第1试剂(R1-3)与13μL纯化水混合，于37℃下孵育5分钟后，添加19.5μL保存后的上述第2试剂(R2)。随后，采用生化自动分析装置(商品名JCA-BM8：日本电子公司制)测定添加第2试剂前的反应液在波长694nm处的吸光度(A0’)，以及添加第2试剂5分钟后的反应液在波长694nm处的吸光度(A5’)，求得其差(A5’-A0’)。此外，对于使用不添加色素物质的第2试剂的样品，也对其进行了同样测定，将其作为比较例3。 予以说明，为公平比较第2试剂的背景的上升，在下述第1试剂(R1-3)中添加了大量的酒石黄。 [0323] [表8] [0324] (第1试剂：R1-3) [0325] FPOX-CE(キツコ一マン公司生产) 1.3KU/L [0326] POD 5KU/L [0327] PIPES 30mmol/L(pH7) [0328] Emulgen A-500(花王公司生产) 0.05g/L [0329] 正十二烷基-αβ-D-麦芽糖苷 2.5g/L [0330] 酒石黄 1g/L [0331] [表9] [0332] [0333] 如上述表9中所示，与采用不添加色素物质的第2试剂的比较例3相比，采用添加了色素物质的第2试剂的各实施例4中，可抑制694nm处的吸光度上升(背景上升)。即，上述显色剂虽有易被光分解的性质，但通过在第2试剂中添加色素物质，光被遮挡，亚甲蓝的自然产生受到抑制。因此，使显色剂与上述色素物质共存时，如上所述，不仅可在长波长区进行测定，例如，也可以液体状态保存至使用时止，在使用不耐光的显色剂的测定方法中为非常有用的试剂。 [0334] 实施例5 [0335] 在上述色素物质的共存下，对于通过氧化生成亚甲蓝的亚甲蓝生成显色剂DA-67进行光照，确认了由上述色素物质(位移试剂)引起的生成显色剂的分解抑制效果(抑制亚甲蓝的自然产生)。 [0336] (DA-67溶液) [0337] 与实施例2同样的DA-67以0.05mmol/mL溶解于30mmol/mL的MOPS-NaOH(pH7.6)中。 [0338] (色素物质溶液) [0339] 下述色素物质以10mmol/mL溶解于纯化水中。 [0340] No.1酒石黄 [0341] No.2食品添加剂食用黄色5号 [0342] No.3食品添加剂食用红色2号 [0343] 以DA-67的终浓度为0.025mmol/mL、色素物质的终浓度按规定浓度(0.1mmol/mL、0.2mmol/mL、0.4mmol/mL)的方式，将上述DA-67溶液、色素物质及纯化水混合，制备成样品(各10mL)。在15点～16点的1小时中，将装有这些样品的透明玻璃容器置于朝南的毛玻璃附近，暴露于日光中。温度为25℃。暴露后，采用分光光度计(V-550，日本分光)测定光谱。此外，作为对照，使用纯化水代替色素物质溶液，进行了同样的测定。对于各样品，在各色素物质相应的最大吸收波长处的吸光度测定结果如下述表中所示。上述最大吸收波长分别为No.1(酒石黄)666nm、No.2(黄色5号)681nm、No.3(红色2号)646nm。予以说明，下述表中最大显色吸光度为在各样品组成中含有的DA-67全部生成亚甲蓝的情况下的吸光度，亚甲蓝的生成率为暴露后的亚甲蓝的生成率，采用以最大显色吸光度作为100％时的暴露后的吸光度的比率表示。 [0344] [表10] [0345] [0346] 如上述表中所示，在色素物质的共存下，将DA-67暴露于日光中的情况下，与不添加色素物质的对照相比，由暴露导致的吸光度的上升受到了抑制。即，通过色素物质抑制了由DA-67生成(自然产生)亚甲蓝。 [0347] 产业上的可利用性 [0348] 如上所述，采用本发明，例如通过在含有吩噻嗪衍生物色素的反应体系中添加上述色素物质，即便在比显示最大吸收的波长更长波长处，也可检测吩噻嗪衍生物色素。因此，例如即便样品中含有在660nm处显示吸收的目的成分外的成分，也可避免其导致的影响而检测吩噻嗪衍生物色素。此外，因700nm处的吸收增加，例如，即便是检测波长设定于700nm的装置也可检测吩噻嗪衍生物色素。从而，采用本发明的方法，改进了吩噻嗪衍生物色素的检测条件，因此与以往相比可进一步拓宽生成吩噻嗪衍生物色素的显色剂及吩噻嗪衍生物色素作为显色剂的应用范围。 |
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