在一个实施方案中，本发明提供了用于有效制备特定的药物-多聚物 (或寡聚物)缀合物的一步方法，所述缀合物可用于制备用于体内送递治疗 性药物的颗粒，包括微颗粒和纳米颗粒。本发明还提供了特定的药物-多 聚物和药物-寡聚物缀合物，所述缀合物可用于制备用于体内送递药物的 颗粒。本发明还提供了使用本发明的药物-多聚物或药物-寡聚物缀合物来 制备颗粒药物送递系统或运载体的方法。本发明的多聚物和寡聚物缀合物 可以用于本领域已知的任何由多聚物或寡聚物制备颗粒的方法中。本文所 述的方法特别可用于制备用于药物送递的纳米颗粒，更特别可用于制备用 于化疗应用的纳米颗粒。本发明的纳米颗粒例如可通过纳米沉淀的方法， 由本发明所述的多聚物和/或寡聚物缀合物制备。
在具体的实施方案中，本发明提供了含有选定的药物以任选地用于持 续药物释放或靶向药物释放的颗粒。在具体的实施方案中，选定的药物基 本上(药物重量的90％或更多)与颗粒中的多聚物或寡聚物共价结合。例如， 所述颗粒通过已知方法由含有药物-聚合物和/或药物-寡聚物缀合物的溶 液制备。本发明的药物缀合物在所述多聚物或寡聚物的聚合过程中形成， 其中所述药物被用作形成所述多聚物和/或寡聚物的单体发生聚合的引发 剂。更具体而言，所述药物缀合物是在存在合适的开环聚合催化剂和引发 剂(所述药物)的条件下，由环状单体的开环聚合而形成。
在具体的实施方案中，使用本发明的药物-多聚物或药物-寡聚物缀合 物来制备多种类型的含有药物的颗粒，所述颗粒可用于药物送递，并且其 大小通常在约2nm至约500微米之间。在其他的更具体的实施方案中， 使用本发明的药物-多聚物或药物-寡聚物缀合物来制备含有药物的微颗 粒，所述颗粒的大小通常在约500nm至约100微米之间。s.在其他的实 施方案中，使用本发明的药物-多聚物或药物-寡聚物缀合物来制备含有药 物的纳米颗粒，所述颗粒的大小通常在约55nm至约600纳米之间。在其 他的实施方案中，使用本发明的药物-多聚物或药物-寡聚物缀合物来制备 含有药物的颗粒，所述颗粒的大小通常在约2nm至约100纳米之间。在 其他的实施方案中，使用本发明的药物-多聚物或药物-寡聚物缀合物来制 备含有药物的颗粒，所述颗粒的大小通常在约200nm至约800纳米之间。 在其他的实施方案中，使用本发明的药物-多聚物或药物-寡聚物缀合物来 制备含有药物的颗粒，所述颗粒的大小通常在约1微米至约500微米之间。
在一个具体的实施方案中，可以使用本发明的方法来制备大小范围为 20-60nm的纳米颗粒。例如，可以使用本文所述的多聚物或寡聚物缀合物， 通过已知的微胶束化方法然后再与PEG加帽试剂(例如PEG-异氰酸酯)反 应，制备上述纳米颗粒。
在另一个具体的实施方案中，可以使用本发明的方法来制备大小范围 为1-20nm的纳米颗粒，所述颗粒可以特别用于向细胞的送递。可以使用 环状AB2型单体或这种单体与本文所述的其他环状酯和碳酸酯单体的混 合物来形成上述纳米颗粒。在本文所述的方法中，AB2型单体的聚合可形 成与选定的药物分子相缀合的高分支结构或树枝状结构的缀合物。可以使 用通过AB2型单体的聚合直接形成的颗粒来进行药物送递。或者，可对 所述颗粒进行如下文所述的表面处理。
本发明的方法可用于形成任何小分子药物的多聚物或寡聚物缀合物， 所述小分子药物即不是基于肽类、糖类和核酸类的小分子药物，前提是所 述药物中含有至少一个能够作为开环反应引发剂的官能团。所述药物可以 含有(但不是必须含有)多个这样的聚合引发基团，例如多个羟基或巯基。 在优选的实施方案中，所述药物仅含有一个这样的聚合基团。所述羟基可 为伯羟基、仲羟基或叔羟基。类似地，所述巯基可为伯巯基、仲巯基或叔 巯基。所述羟基还可以为酚羟基。在具体的实施方案中，所述药物含有一 个或多个非酚羟基。在具体的实施方案中，所述药物含有一个或多个非酚 羟基，并且它们是伯羟基或仲羟基。在具体的实施方案中，所述药物含有 单一的非酚羟基。在具体的实施方案中，所述药物含有单一的伯羟基或仲 羟基。可用于本文所述方法的示例性药物在图8和图13中有列举和说明， 另外的药物列于下文。
在具体的实施方案中，所述药物为亲水性药物，在相关的实施方案中， 所述药物为水溶性药物(例如在水中具有的溶解度在mg/mL的量级内)。在 另一些具体实施方案中，所述药物为疏水性药物，在相关的实施方案中， 所述药物不溶于水或在水中具有很低的溶解度(例如在水中具有的溶解度 在μg/mL或更低的量级内)。
在具体的实施方案中，按照本文所述的方法与多聚物或寡聚物相缀合 的所述药物为抗癌药物或用于化疗的药物。在具体的实施方案中，所述药 物为紫杉烷。在另一些具体的实施方案中，所述药物为蒽环类抗癌药物。 在其他的实施方案中，所述药物为蛋白酶抑制剂。在另一些具体实施方案 中，所述药物为逆转录酶的抑制剂。在另一些具体的实施方案中，所述药 物为抗病毒剂。在另一些具体的实施方案中，所述药物为抗真菌剂。在另 一些具体实施方案中，所述药物为酚类药物，即具有一个或多个酚羟基的 药物。在另一些具体实施方案中，所述药物为巯基药物，即具有一个或多 个巯基的药物。
本发明的方法还可用于肽类、蛋白类糖类和/或核酸类(DNA或RNA) 药物的送递。在上述每一种情况下，所述药物必须含有至少一个能够在开 环聚合反应中作为引发剂的官能团，例如至少一个羟基或巯基。
本发明的方法还可以更宽泛地适用于任何其他分子或化合物(包括合 成的或天然存在的分子以及有机或无机化合物)，前提是所述分子或化合 物含有至少一个能够在开环聚合反应中作为引发剂的官能团(例如羟基或 巯基)，并且所述分子或化合物将要通过颗粒送递系统(例如微颗粒或纳米 颗粒)被给予或送递至体内。所述方法还可用于将任何这类有用的化合物 形成多聚物或寡聚物缀合物，所述化合物包括但不限于：用于诊断方法的 试剂、营养物或维生素(它们也可被认为是药物)、或报告分子(例如放射标 记或荧光标记的分子)。可以与所述多聚物或寡聚物相缀合的所述化合物 可为亲水性的、疏水性的、水溶性的或不溶于水的。所述化合物可以含有 多个羟基或巯基，所述羟基可为伯羟基、仲羟基或叔羟基，也可为酚羟基。 在具体的实施方案中，所述羟基为伯羟基或仲羟基。在具体的实施方案中， 所述羟基为酚羟基。在具体的实施方案中，所述巯基为伯巯基或仲巯基。 在具体的实施方案中，所述化合物不是糖类化合物。在具体的实施方案中， 所述化合物不是碳水化合物。
在上述所有环状单体的具体实施方案中，Y1和Y2中的一个或两个为 卤代烷基，更特别地为氟烷基。
本发明所描述和要求保护的范围涵盖使用所述环状单体的外消旋形 式，或者使用其分别的对映异构体和非外消旋混合物。
本文所述的方法中可以使用任何合适的开环聚合催化剂，所述催化剂 可为含金属的催化剂或有机催化剂。在具体的实施方案中，所述催化剂选 自Mg(II)或Zn(II)催化剂。在另一些具体实施方案中，使用1，5，7-三氮杂 二环[4.4.0]癸-5-烯(TBD)、N-甲基-TBD(MTBD)或1，8-二氮杂二环[5.4.0] 十一-7-烯(DBU)作为有机催化剂。
所述混合的单体与引发剂的摩尔比最通常为2∶1至5000∶1，更特别地 为5∶1至200∶1，再更特别地为10∶1至100∶1。在本文所述的方法中，可以 在所述聚合反应中使用两种或多种不同环状单体的组合，以形成共聚合物 缀合物。在本文所述的方法中，可以在所述聚合反应中先后加入两种或多 种不同环状单体，以形成嵌段共聚合物缀合物。在本文所述的方法中，可 以组合使用两种或多种均含有至少一个羟基或巯基的化合物，以提供与不 同的化合物相缀合的不同的多聚物或寡聚物缀合物的混合物。例如，在本 文所述的聚合方法中，可以使用两种均含有至少一个羟基或巯基的不同药 物，从而形成多聚物或寡聚物药物缀合物的混合物。这在使用两种或多种 具有不同机理或作用的药物治疗相同或相关疾病、病症或障碍的情况下会 是有用的。
在具体的实施方案中，通过本文所述的方法形成的颗粒特别是纳米颗 粒，所具有的药物装载量(或更一般而言是选定化合物的装载量)为20％或 更高、30％或更高、40％或更高或50％或更高。
在具体的实施方案中，通过本文所述的方法形成的颗粒特别是纳米颗 粒，具有较长的循环半衰期，可用于进行有效的体内送递。当所述颗粒经 过本文所述的方法或本领域已知的方法进行了表面修饰之后更是如此。在 具体的实施方案中，通过本文所述的方法形成的颗粒特别是纳米颗粒具有 在盐溶液中的稳定性。
本发明的形成多聚物或寡聚物缀合物方法可以与本领域已知的用于 形成颗粒的方法组合使用，所述已知方法包括纳米沉淀法、微胶束化方法、 乳化法和双乳化法。
本发明还提供了通过本文所述的聚合方法制备的某些多聚物或寡聚 物缀合物。通常，所述缀合物可用于任何需要在颗粒送递系统中被送递的 化合物，特别是药物，最特别地为抗癌药物或化疗药物。在具体的实施方 案中，所述缀合物中的聚合物平均具有100个或更少的单体单元。在其他 的实施方案中，所述缀合物中的聚合物平均具75个、50个或25个单体单 元。在具体的实施方案中，所述缀合物中的聚合物的平均分子量为5000 或更低、2500或更低、1500或更低或1000或更低。在具体的实施方案中， 本发明提供了通过本文所述的聚合方法制备的某些多聚物或寡聚物缀合 物，其中所述缀合物中的化合物仅与一种多聚物或寡聚物相缀合或结合。 在具体的实施方案中，本发明提供了通过本文所述的聚合方法制备的某些 多聚物或寡聚物缀合物，其中所述缀合物中的化合物仅以所述化合物中的 某一位点与仅一种多聚物或寡聚物相缀合或结合。
在具体的实施方案中，本发明提供了与亲水性化合物特别是亲水性药 物相缀合的多聚物或寡聚物缀合物。在另一些具体的实施方案中，疏水性 化合物特别是疏水性药物与所述多聚物或寡聚物相缀合。
本发明还提供了含有本发明的多聚物缀合物或寡聚物缀合物的颗粒， 包括微颗粒和纳米颗粒，其中所述多聚物缀合物或寡聚物缀合物用于选定 化合物的体内送递，所述选定化合物特别地为一种或多种药物，最特别地 为一种或多种抗癌药物或化疗药物。在具体的实施方案中，所述颗粒(包 括微颗粒或纳米颗粒)经过表面修饰，所述表面修饰通过本领域已知的任 何方法进行，例如使用一种或多种抗体、使用一种或多种核酸分子(例如 适体)、使用一种或多种肽或蛋白(例如酶)、使用一种或多种多聚物或寡聚 物(例如两亲聚合物特别是含有PEG的两亲聚合物)。在本领域中已知，对 颗粒进行表面修饰可以促进颗粒向某一组织的靶向定位，可以促进颗粒进 入细胞，或可以增强颗粒的稳定性。例如，由聚酯、聚碳水化合物或它们 的混合物形成的纳米颗粒可以使用亲水性聚合物(例如PEG)或含有PEG 的两亲聚合物进行包被，以延长所述纳米颗粒的循环半衰期。
在另外的实施方案中，本发明提供了具有核心/外壳结构或具有多层结 构的颗粒，其中所述核心或外壳中的至少一个或所述多层中的至少一层是 由本发明的药物(或其他化合物)-多聚物/寡聚物缀合物形成的层。具体而 言，本发明涉及具有核心/外壳结构的纳米颗粒，其中所述核心或外壳由本 发明的多聚物/寡聚物缀合物形成。更具体而言，纳米颗粒可由核心和外壳 形成，所述核心由第一种多聚物/寡聚物缀合物形成，所述外壳由：(1)聚 合物例如亲水性聚合物或两亲聚合物；或(2)本发明的第二种多聚物/寡聚 物缀合物形成。在具体的实施方案中，所述第一种和第二种多聚物/寡聚物 缀合物可以选自与下列药物缀合的缀合物，所述药物为紫杉烷、蒽环类抗 生素或Shh拮抗剂，前提是它们应具有能够引发本文所述的聚合反应的官 能团例如羟基或巯基。在更具体的实施方案中，所述第一种和第二种多聚 物/寡聚物缀合物可以选自与下列药物缀合的缀合物，所述药物为Ptxl、 Dtxl、Doxo、环杷明(cyclopamine)或喜树碱(camptothecin)。本发明特别提 供了含有三层或更多个不同层的多层纳米颗粒，其中至少一层由本发明的 多聚物/寡聚物缀合物形成。纳米颗粒包括具有三层、四层或五层的纳米颗 粒。纳米颗粒包括其中所有层均由本发明的多聚物/寡聚物缀合物形成的颗 粒。纳米颗粒包括如下所述的纳米颗粒，其中至少一层由本发明的多聚物 /寡聚物缀合物形成，并且至少另一层由聚合物(非缀合的聚合物)例如亲水 性、疏水性或或两亲聚合物形成。在具体的实施方案中，纳米颗粒包括如 下所述的纳米颗粒，其中至少一层由本发明的多聚物/寡聚物缀合物形成， 并且至少另一层由含有PEG的两亲聚合物形成。
本发明还提供了使用本发明的多聚物或寡聚物缀合物制备药物的方 法，以及由所述方法制备的药物。所述药物为由本发明的缀合物形成的颗 粒，特别是纳米颗粒。
本发明还提供了试剂盒，用于使用选定的具有至少一个羟基的化合物 进行本文所述的聚合反应以形成多聚物或寡聚物缀合物。所述试剂盒包括 装有一种或多种环状单体和一种或多种开环聚合催化剂的一个或多个容 器，任选地，还包括进行所述聚合反应的说明书，制备颗粒的说明书，用 于进行颗粒的表面修饰的一种或多种试剂或说明书，用于进行制备颗粒的 聚合反应的一种或多种溶剂，一种或多种对照引发剂，用于进行所述反应 的另外的容器，以便形成颗粒或进行表面修饰。在具体的实施方案中，本 文所述的试剂盒包括用于与不同的寡聚物或多聚物形成缀合物的多种不 同的环状单体。在其他的实施方案中，本文所述的试剂盒还可包括用于形 成缀合物的具有至少一个羟基的一种或多种不同的化合物。
通过参照下文的具体描述、实施例和附图，本发明的其他实施方案应 是显而易见的。

图1A和1B分别为说明现有技术中的纳米包封和本发明的纳米缀合 物的形成的示意图。在图中说明了纳米包封和纳米缀合物之间的结构差 异。
图2A为本发明的交酯聚合的示意图，示例性说明了在存在催化剂的 条件下药物引发的聚合，以用于制备高装载量和100％装载效率的用于体 内应用的控释纳米缀合物。
图2B提供了示例性的聚乙二醇化的含pacitaxel的纳米缀合物的合成 的具体实例，其中在存在(BDI)MN(TMS)2(其中M＝Mg或Zn)的条件下， 使用Ptxl引发丙交酯的聚合，然后使用PLGA-mPEG进行纳米沉淀和非 共价的表面聚乙二醇化。相信所述聚合是通过Ptxl形成(BDI)M-氧化物而 引发的。
图3是在37℃和1×PBS中，Pxtl从Pxtl-LA纳米缀合物中释放的释 放动力学图，所述Pxtl-LA纳米缀合物为Pxtl-LA25NC和Pxtl-LA50NC(药 物装载量如图中所示)。作为比较，在图中还显示了通过Ptxl和PLA (Pxtl/PLA(wt/wt)＝1/12)的混合物进行纳米沉淀制备的Pxtl/PLA纳米包 封(NE)的释放动力学。
图4显示了使用PC-3细胞在培养24小时后，通过MTT测定测得的 PtXl-LA50NC、PtXl-LA25NC、Ptxl-LA10NC和Pxtl的毒性。“＊”号表示 在95％置信区间内的显著性水平。
图5显示了当将PLGA-mPEG5k加入至Pxt-LA200 NC中时的颗粒大 小的变化。颗粒大小作为两亲共聚物与药物-聚合物缀合物的重量比的函 数呈线性增加。
图6说明了在处理前(■)、用PLGA-mPEG5K处理后(◆)或用mPEG5k 处理后(●)，Ptxl-LA2O0NC在PBS中和37℃下的稳定性。
图7A-D显示了使用PC-3前列腺癌细胞通过MTT研究测得的 Ptxl-LA、Dtx-LAI、CPT-LA和Doxo-LA NC的细胞毒性的结果。
图8使用本发明方法引入至NC中的一些药物或其他化合物(例如Cy5 报告物染料)的化学式。
图9为制备树枝状纳米颗粒的方法的示意图，据信所述树枝状纳米颗 粒是一种单分子树枝状颗粒，在每一纳米颗粒中含有一种药物。所述聚合 方法与所描述的类似。这些树枝状颗粒具有＜20nm的颗粒直径，这样的 颗粒直径是不能通过其他方法得到的。
图10A显示了在多种药物逐层沉淀的过程中，纳米颗粒大小(nm)的变 化。在该过程中，在纳米沉淀的条件下，使用第二种药物-聚合物缀合物 处理由本发明的药物-聚合物缀合物通过纳米沉淀形成的纳米缀合物，从 而在所述纳米缀合物中形成第二种药物聚合物层或外壳。该图提供了含有 Dtxl-LA100作为核心和Doxo-LA100作为外壳或第二层的纳米颗粒在形成 过程中，纳米颗粒大小变化的大小分布图。
图10B显示了在第二种药物聚合物缀合物沉淀在第一种药物聚合物 缀合物形成的纳米颗粒(NC)上的过程中，作为所述形成外壳的(第二种药 物-聚合物)缀合物的量的函数的纳米颗粒大小(nm)的图，该图比较了作为 加入的第二种药物-聚合物缀合物的量的函数的纳米颗粒大小变化。在一 种情况下，所述第二种药物缀合物与所述第一种药物缀合物相同，此时该 图显示了相同的药物-聚合物缀合物的量逐渐增加时的效果。
图11A和11B显示了向带有编码荧光素酶的Gli-1基因的Shh-Light 2 细胞中加入含有环杷明的NC后，进行荧光素酶测定的结果。图11A显示 了加入CA-LA10和CA-LA2S的实验结果，其中的装载量在括号中显示。 该图显示，环杷明NC的EC50值显著低于游离的环杷明的EC50值，表明 使用纳米缀合物能够实现环杷明向靶细胞的送递以及在靶细胞中的浓缩 累积和释放。图11B显示了使用CA NC以及含有Shh激动剂 purmorphamine的NE培养Shh-Light 2细胞的结果。
图12提供了在缀合物的LA聚合合成过程中使用不同催化剂(如图所 示)所形成的Ptxl-LA缀合物的实际MW和PDI，通过GPC测得。
Figure 13列出了可用于本发明方法的一部分药物。图中还列出了结 构。

本发明至少部分地基于下述发现：使用能够作为开环聚合反应引发剂 的药物和其他化合物与一种或多种环状单体和开环聚合催化剂相组合，可 以通过一步法反应容易地制备所述药物和其他化合物的多聚物和寡聚物 缀合物。图2示意性说明了本发明的方法(A)，并说明了使用与PLA相缀 合的紫杉醇形成纳米缀合物的具体实例。此外，还发现由此形成的聚合物 和寡聚物缀合物可用于制备颗粒，所述颗粒包括微颗粒和纳米颗粒，它们 具有适用于体内送递化合物的颗粒大小。如图2具体示出的那样，可以使 用纳米沉淀法来形成含有本发明的缀合物的纳米颗粒(纳米缀合物)。另外， 如图2的纳米颗粒所示，可以使用PEG处理所述纳米缀合物，以实现所 述纳米颗粒表面的聚乙二醇化。
通过本文所述的方法形成的多聚物和寡聚物缀合物与通过使用化合 物(特别是药物)与预先形成的聚合物相缀合而形成的缀合物有明显的区 别。通过本发明方法形成的缀合物中的聚合物具有的平均分子量显著低于 预先形成的聚合物。。通过本发明方法形成的缀合物具有的多分散性也必 然低于预先形成的聚合物。例如，本发明的聚合物缀合物具有的多分散性 可为1.5或更低、1.3或更低和1.2或更低。通常，。通过本文所述方法形 成的缀合物与使用化合物与预先形成的聚合物相缀合形成的缀合物相比， 在聚合物长度上更为均一。
如图1所示，使用本发明的多聚物或寡聚物通过纳米沉淀形成的纳米 缀合物(NC)在药物装载量、药物包封、药物释放、颗粒分布以及制造的简 易程度等各方面都与纳米包封(NE)有着明显的区别。NE仅具有很低或中 等的药物装载量(1-5wt％)，并且该装载量还难以预先确定，而且在各批次 之间也会有变化。NC具有能够预先确定的药物装载量，并且该药物装载 量在各批次之间的稳定性比NE要高得多。NE具有不可控的包封效率(在 10-80％之间变化)，并且该包封效率在各批次和各种系统之间都有所不同， 此外，NE还不能包封亲水性药物。NC具有接近100％的包封效率，该包 封效率在各批次和各种系统之间没有差异或差异很小，此外，亲水性和疏水 性药物均可以形成NC。NE会表现出显著的初始快速释放，在最开始的 24小时内就释放40-80％的药物。NC不表现或仅表现很少的药物初始快 速释放，并能够提供药物的可调节和可控的释放。NE通常具有多模式的 颗粒分布。NC具有单模式的颗粒分布。NE的制造涉及一种多组分/多步 骤的工艺过程，这难以扩大规模，并且不利于长期储存。此外，还难以除 去未包封的药物，并且需要使用困难的过滤除菌。与之相反，NC的制造 仅涉及单组分系统，很容易扩大规模，并且在储存得当时，在储存期内药 物释放仅有最小量的增加。由于基本上没有需要被除去的游离药物聚集 物，这一方法实施起来简便而经济。
在图2A部分中所示的聚合过程中，起引发聚合作用的化合物(例如药 物)与一条或多条不断延长的寡聚物或多聚物链发生共价结合。这种聚合 反应是一种开环聚合反应，它优选地具有活性聚合(liing polymerization) 的特征。在本文中，通过能够在存在某些催化剂的条件下作为聚合引发剂 的具有一个或多个的药物和其他化合物，示例性说明了本发明。如本文所 述，开环聚合可以使用各种环状单体，包括含有环状酯、环状碳酸酯以及 环状硅氧烷和环状磷化物的单体。所述聚合的实例可以为丙交酯或乙交酯 与带有一个或多个羟基或巯基的药物化合物的聚合。
已经开发了多种金属醇盐(RO-M)，由于进行丙交酯和其他相关环状 单体的可控活性聚合，其中RO与聚丙交酯通过酯键发生定量的末端缀合。 16
可以通过调整丙交酯/ROH的比例(例如所述单体与引发剂的摩尔比) 来精确控制所得的聚丙交酯中的RO的量。在本发明中，ROH为将要与 开环聚合中形成的聚合物相缀合的含有一个或多个羟基的药物或其他化 合物。有多种有机催化剂例如TBD(1，5，7-三氮杂二环[4.4.0]癸-5-烯)都可以 与所述含羟基或巯基的引发剂(即将要缀合的药物或其他化合物)配合使 用，以形成本发明的缀合物。并且在这些反应中，也可以通过控制单体/ 引发剂的比例来控制所得的多聚物(或寡聚物)中的药物或其他化合物的 量。其他的示例性催化剂在实施例6中有所描述。
作为本发明的一部分，已经证实，使用上述方法(如图2B部分中所示 的使用Mg(II)复合物((BDI)MgN(TMS)2用Ptxl进行缀合以激活Ptxl的方 法)可以将含有羟基的化疗药物定量地掺入聚丙交酯。这样一来，就可以 通过切割药物-聚丙交酯的酯键来调控药物从所述颗粒中的释放速度，这 远比包封的非共价键合的药物从颗粒中扩散出来的机制更容易控制。可以 通过调节药物装载量和颗粒大小来控制药物的释放动力学。由于可以控制 聚合反应从而提供定量的产率，因此可以简单地通过调整单体/药物(或其 他化合物)的摩尔比(单体与引发剂的摩尔比)而精确地控制药物装载量。由 于本发明的方法能够通过控制药物-聚合物的组成而精确控制药物装载 量，因此将能够显著地增强所述纳米颗粒的临床转化率和用于临床应用的 纳米颗粒的可调节性。此外，已证实用本发明的方法生成的纳米颗粒具有 前所未有的高药物装载量(最高达约40％)。
可以使用各种已知方法将本发明的多聚物和/或寡聚物缀合物制成纳 米颗粒。在一个具体的实施方案中使用了纳米沉淀法，其中将缀合物的溶 液加入到一种不能溶解该缀合物的溶液中。使用本发明的缀合物进行的用 于形成纳米颗粒的沉淀步骤比使用其他起始材料进行的沉淀步骤要简便， 因为其中仅使用了一种类型的材料即所述缀合物。与之相比，使用游离药 物和聚合物进行的沉淀和包封步骤(即使在二元系统中)也可能十分复杂。 在相分离过程中对药物和聚合物彼此整合的过程控制通常很难做到，特别 是当上述两个要素具有不同的物理和化学性质时更是如此。在纳米包封中 总是出现两相的颗粒分布，这可能部分地归因于由于相似相溶原理而产生 的药物或聚合物自身聚集。本发明的方法提供了具有单模式颗粒分布的颗 粒。
在使用任何能够作为聚合引发剂并需要以颗粒形式进行体内送递的 化合物形成缀合物时，通常都能够实现上述的药物-多聚物或药物-寡聚物 缀合物所具有的优势。此外，当使用多聚物或寡聚物缀合物形成任意大小 的可用于体内送递的颗粒时，还能够实现上述纳米颗粒送递组合物制剂的 特殊优势。
在各种NP制备方法中，纳米沉淀法已被广泛应用于制备用作包封化 疗药物的NP。在通常的方法中，将可降解的疏水性聚合物例如聚丙交酯 与疏水性药物在可与水混溶的溶剂(例如THF或DMF)中混合，并加入过 量的水。有机溶剂在水中的扩散可以促使随机混合的药物和聚合物分子形 成大小小于约100nm的纳米聚集体。更广义而言，可以使用本领域中已 知的用多聚物或寡聚物材料制备纳米颗粒的多种方法中的任何一种来制 备本发明的缀合物。
在一方面，本发明涉及一种结合了药物-引发的环状酯(或碳酸酯)聚合 反应和纳米沉淀方法的纳米缀合物技术，所述技术用以制备含有药物的纳 米颗粒，所述纳米颗粒具有预定的药物装载量、接近100％的包封效率、 最小的颗粒不均一性和显著降低的初始快速释放效应。在癌症化疗应用 中，特别是在使用纳米颗粒进行的这类治疗中，本发明的颗粒制剂可具有 改进的效力和更低的毒性。
在一个实施方案中，本发明涉及用于癌症治疗的聚合物纳米颗粒。在 本发明的这一方面中，所述药物-多聚物或药物-寡聚物缀合物包括抗癌药 物或化疗药物。
可用于癌症治疗的纳米颗粒可包括含有两种或多种抗癌药物的缀合 物的混合物。
可以通过任何已知的方法将本发明的颗粒制剂送递至受试者，只要所 述方法与颗粒的大小以及颗粒中携带的治疗剂、诊断试剂或其他试剂相适 应即可。
本发明还涉及所述药物-多聚物和药物-寡聚物缀合物用于制备用于体 内送递所述药物的医药中的用途。所述药物例如可为抗癌药物。更具体而 言，本发明涉及所述药物用于制备治疗癌症的医药中的用途。在具体的实 施方案中，所制备的医药为可通过任何合适的剂型给药的颗粒形式，特别 地为纳米颗粒的形式。在具体的实施方案中，所述医药还包括可药用的载 体或稀释剂，特别地包括适用于所需给药方式的载体或稀释剂。
本文所使用的术语“药物”是相当广义的术语，包括能够为需要某种治 疗益处的个体提供该治疗益处的任何化合物。可以使用将要在纳米颗粒中 被送递的合适药物或其他化合物来形成缀合物。所述药物或其他化合物必 须具有至少一个能够在存在催化剂的条件下引发开环聚合反应的官能团。 据信所述官能团一定是能和催化剂相互作用从而形成具有聚合活性的物 质。例如，羟基和巯基能够引发开环聚合反应。所述羟基和巯基可为伯羟 基或伯巯基、仲羟基或仲巯基、或叔羟基或叔巯基。如本领域所知，伯-、 仲-或叔-羟基和巯基具有不同的立体结构，可能具有不同的相对反应活性。
在本说明书中所描述的化学基团意欲表示其在本领域中最宽泛的含 义。
将所述具有至少一个能够引发开环聚合的官能团的化合物与能够通 过开环聚合反应而聚合的一种或多种环状单体和合适的开环聚合催化剂 在合适的溶剂中混合，在一定条件下反应足够的时间，以生成所需的寡聚 物或多聚物。已知有多种化合物都能够在存在催化剂的条件下引发开环聚 合。在这些化合物中，在化学结构中含有一个或多个羟基或一个或多个巯 基的化合物是本发明的化合物。对于给定化合物而言，使用本文教导的或 本领域公知的材料和方法，能够很容易地通过测试性聚合反应评估该化合 物在本发明的方法中引发聚合的能力，而不必进行过多的实验。例如，可 以使用图8中所示的药物和其他化合物成功地实施本发明的方法。图13 示出了可用于制备本发明的药物缀合物和纳米缀合物颗粒的多种含羟基 的药物。
可用于本发明的方法的其他带有羟基的药物包括但不限于：地瑞那韦 (Darunavir，TMC-114)、替拉那韦(Tipranavir，TPV)、沙奎那韦(Saquinavir， SQV)、利托那韦(Ritonavir，RTV)、茚地那韦(Indinavir)、奈非那韦 (Nelfinavir，NFV)、安普那韦(Amprenavir，APV)、洛匹那韦 (Lopinavir，ABT-378)、阿扎那韦(Atazanavir，ATV)、重酒石酸长春瑞滨 (Vinorelbine bitartrate)、氟维司群(fulvestrant)、Sarcodictyins、喜树碱 (camptothecins)、长春碱(Vinblastine)、苔虫内酯1(bryostatin 1)、 (+)-Cylindhcine、(+)-Lactacystin、铜绿菌素(Aeruginosin)298-A、 (+)-Fostriecin、Garsubellin A/贯叶金丝桃素、(S)-奥昔布宁(Oxybutynin)、 埃博霉素A(Epothilone A)、齐多夫定(Zidovudine，AZT)、拉米夫定 (Lamivudine，3TC)、去羟肌苷(Didanosine，ddl)、阿巴卡韦 (Abacavir，ABC)和恩曲他滨(Emtricitabine，FTC)。
其他可用于本发明方法中的药物包括含有酚羟基的具有各种结构的 药物，它们包括但不限于：巴美生(bamethane)、香草酰二乙胺(ethamivan)、 六氯酚、水杨酰苯胺、邻苯二酚(pyrocatechin)、百里酚(thymol)、喷他佐 辛(pentazocine)、间苯三酚(phloroglucinol)、丁香酚(eugenol)、氯硝柳胺 (niclosamide)、特布他林(terbutaline)、多巴胺(dopamine)、甲基多巴 (methyldopa)、去甲肾上腺素(norepinephrine)、丁香酚(eugenol)、α-萘酚、 多元酚、肾上腺素(adrenaline)、多巴胺(dopamine)、苯肾上腺素 (phenylephrine)、间羟胺(metaraminol)、非诺特罗(fenoterol)、硫氯酚 (bithionol)、α-生育酚(alpha-tocopherol)、异丙肾上腺素(isoprenaline)、肾 上腺素(adrenaline)、去甲肾上腺素(norepiniphrine)、沙丁胺醇 (salbutamol)、非诺特罗(fenoterol)、硫氯酚(bithionol)、绿原酸/酯 (chlorogenic acid/esters)、卡托普利(captopril)、阿莫西林(amoxicillin)、倍 他洛尔(betaxolol)、马索罗酚(masoprocol)、染料木素(genistein)、大豆素 (daidzein)、大豆甙(daidzin)、乙酰黄豆黄甙(acetylglycitin)、雌马酚(equol)、 黄豆黄素(glycitein)、iodoresiniferatoxin、SB202190和tyrphostin SU1498。
对于某一种给定的将要使用本发明方法进行缀合的化合物而言，可能 需要使用不同的催化剂进行试验性的聚合反应，例如，某些化合物可能更 适合于有机金属催化剂，而另一些化合物可能更适合于有机催化剂。例如， 已经发现，有些化合物虽然含有合适的官能团，仍不能在某些基于金属的 催化剂存在的条件下引发聚合或者该功能受到限制，这是因为所述化合物 可能会使所述催化剂失活。具体而言，PLA与米托蒽醌(mitoxantrone)的 缀合就不能使用(BDI)MgN(TMS)2作为催化剂。据信这是因为米托蒽醌(式 J)具有的羟基烷基氨基可能会使Mg催化剂失活。

式J
可以使用本文所述的任何环状单体(包括AB2型环状单体)与能够引发 聚合的化合物一起形成多聚物或寡聚物缀合物。可以使用任何能够通过开 环聚合而聚合的环状单体来形成本发明的药物缀合物和颗粒，特别是纳米 颗粒。具体而言，通常可以使用能够通过活化的-OH或金属醇盐基团进行 聚合的环状单体，来形成本发明的药物缀合物和颗粒。可以使用的环状单 体包括环状酯和环状碳酸酯。环状酯包括内酯、环状二酯和环状酯-酰胺， 例如环缩酚酸肽(cyclodepsipeptide).
环状酯具有如下结构式：

式A
其中m+n的和为1-20，X为O或NH，x为0或1以表示存在或不 存在酯基或酰胺基，Y1和Y2表示在环上的一个或多个碳原子被非氢取代 基任选地取代。Y1和Y2的每一个彼此独立地为不干扰本文所述的聚合反 应的取代基，例如可以选自：氢、卤素、-COOR、-NRR’、-SR和-OR(其 中R和R’独立地为一个或多个氢、烷基或芳基)、胍盐基、咪唑基、烷基、 烯基、炔基、芳基(包括苯基或苯甲基)和-N3。Y1和Y2的每一个还可以为 氨基酸或具有1至5个氨基酸残基的短肽。Y1和Y2的每一个还可以包括 被本领域已知的保护基团保护起来的上述列出的基团。烷基、烯基、炔基 和芳基可以任选地被一个或多个卤原子(包括一个或多个氟)、-N3、 -COOR”、-NR11R”’、-SR”、-OR”取代，其中所述R”和R”’独立地为氢 或未被取代的烷基、烯基、炔基或芳基。在一个具体的实施方案中，Y1 和/或Y2可为羟基烷基。在具体的实施方案中，Y1和Y2的每一个为氢或 含有1至6个碳原子的烷基，特别是甲基。
环状碳酸酯具有如下结构式：

式B
其中p的范围为1-20，Y1和Y2表示在环上的一个或多个碳原子被非 氢取代基任选地取代，其中每一个Y1和Y2的定义如上文所述。在具体的 实施方案中，Y1和Y2的每一个为氢或含有1至6个碳原子的烷基，特别 是甲基。在一个具体的实施方案中，Y1和/或Y2可为羟基烷基。
环状酯包括但不限于内酯，例如β-丁内酯(n＝2)、δ-戊内酯(n＝4)、ε- 己内酯(n＝5)、α-甲基-β-丙内酯、β-甲基-β-丙内酯、ω-十五内酯、ω-十二 内酯和任何丙交酯或乙交酯，包括它们的所有立体异构体，例如

SS-丙交酯  RR-丙交酯  RS-丙交酯  丙交酯-乙交酯  乙交酯， 任意取代的丙交酯或乙交酯：

式C，
任何具有6元环或7元环结构的环缩酚酸肽(半酯和半酰胺)，包括但不限 于下式D1-D3分别所示的化合物：

可以通过活化的-OH或金属醇盐聚合的其他环状单体包括含磷的环 状酯，包括环状磷酸酯和膦酸酯：

式E
其中q＝1至20，Y3的定义与上述Y1和Y2相同，R3为Y3(膦酸酯) 或-OY3(磷酸酯)。
环状亚磷酸酯：

式F
其中的各变量的定义如上文所述，含硅酮的环状单体包括

式G
其中每一个R独立地选自氢或任选取代的烷基。在上述环状单体的具 体实施方案中，Y1至Y3的每一个为氢或含有1至6个碳原子的烷基。在 上述环状单体的具体实施方案中，Y1至Y3均为氢或均为含有1至6个碳 原子的烷基，或特别地它们均为甲基。在上述环状单体的具体实施方案中， 每一个R选自氢或含有1至6个碳原子的烷基。在上述环状单体的具体实 施方案中，所有的R’均为氢，或所有的R’均为含有1至6个碳原子的烷 基，特别地，所有的R’均为甲基。
在具体的实施方案中，单独使用AB2型环状可聚合单体，或将其与 其他环状酯或环状碳酸酯组合使用。AB2型环状酯单体包括下式所示的化 合物：

式H
其中z为1至6，Y1的定义如上文所述。在具体的实施方案中，Y1 可为氢或含有1至6个碳原子的烷基。
术语“烷基”指的是分枝或不分枝(直链或线性)的饱和一价烃基，或含 有一个或多个环的环状基团。除非另外指明，优选的烷基含有1至20个 碳原子，更优选的烷基含有1至10个碳原子。短链烷基为含有1至6个 碳原子的烷基，包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基，包括它们所 有的异构体。长链烷基为含有8至20个碳原子的烷基，优选地为含有12-20 个碳原子的烷基以及含有12-20个碳原子和含有16-18个碳原子的烷基。 术语“环烷基”指的是具有单环结构或多环稠环结构的环状烷基，优选地含 有3至20个碳原子。环烷基包括例如：单环结构例如环丙基、环丁基、 环戊基、环己基、环辛基等，或多环结构例如金刚烷基等。除非另外指明， 否则烷基包括环烷基以及如下定义的任选取代的烷基。
术语“烯基”含指的是有含有一个或多个双键的分枝或不分枝的一价 烃基，或含有一个或多个环的环烯基，其中至少一个环中含有双键。除非 另外指明，优选的烯基含有1至20个碳原子，更优选的烯基含有1至10 个碳原子。烯基可包括一个或多个共轭或非共轭的双键(C＝C)。优选的烯 基为含有1或2个双键的烯基，也包括ω-烯基。短链烯基为含有2至6 个碳原子的烯基，包括乙烯基(vinyl)、丙烯基、丁烯基、戊烯基和己烯基， 以及它们所有的异构体。长链烯基为含有8至20个碳原子的烯基，优选 地为含有12-20个碳原子的烯基以及含有12-20个碳原子和含有16-18个 碳原子的烯基。术语“环烯基”指的是具有单环结构或多环稠环结构的环状 烯基，优选地含有3至20个碳原子，并且其中至少一个环上含有双键 (C＝C)。环烯基包括例如：单环结构例如环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、 环己烯基、环辛烯基、环辛二烯基、环辛三烯基，以及多环结构。除非另 外指明，否则烯基包括环烯基以及如下定义的任选取代的烯基。
术语“炔基”含指的是有含有一个或多个叁键(C≡C)的分枝或不分枝的 一价烃基。除非另外指明，优选的炔基含有1至20个碳原子，更优选的 炔基含有1至10个碳原子。炔基包括乙炔基、丙炔基等。短链炔基为含 有2至6个碳原子的炔基，也包括它们所有的异构体。长链炔基为含有8 至20个碳原子的炔基，优选地为含有12-20个碳原子的炔基以及含有12-16 个碳原子和含有16-18个碳原子的炔基。术语“环炔基”指的是具有单环结 构或多环稠环结构的环状炔基，优选地含有3至20个碳原子，并且其中 至少一个环上含有叁键((C≡C)。除非另外指明，否则炔基包括环炔基以及 如下定义的任选取代的炔基。
术语“芳基”指的是含有至少一个芳香环的一价基团。所述基团在形式 上是通过将环上碳原子的氢取代后衍生而成的。芳基含有一个或多个环， 其中至少一个环为芳香性的。芳基中的环可通过单键或双键连接，或可为 稠合的。示例性的芳基包括苯基、联苯基和萘基。芳基包括含有6至30 个碳原子的芳基和含有6-12个碳原子的芳基。除非另外指明，否则芳基 可为如下所述的任选取代的芳基。术语芳基包括“芳基烷基”，指的是含有 至少一个烷基和至少一个芳基的基团，所述芳基可取代于烷基上(例如苯 甲基，即-CH2-C6H5)，或者所述烷基可取代与芳基上(例如甲苯基，即 -C6H4-CH3)。除非另外指明，否则所述芳基烷基中的烷基部分或芳基部分 均可如本文所述被取代。
如本领域所知，用于形成本发明的缀合物的聚合反应可在多种反应条 件(温度，溶剂、浓度)下进行。在选择这些条件时应部分地考虑到能保留 任何化合物特别是将要被缀合的药物的活性。所述聚合反应可在合适的溶 剂或溶剂的混合物中进行。在具体的实施方案中，所述溶剂为无水的可与 水混溶的溶剂。进行聚合反应所使用的溶剂与随后制备颗粒时所使用的溶 剂可以相同或不同。聚合反应中可用的溶剂包括但不限于：THF、丙酮、 二氯甲烷、氯仿、二甲基甲酰胺、DMSO、乙腈，或它们的混合物。
本文所使用的术语“多分散性”指的是多分散性指数(PDI)，它是给定 样本中的聚合物分子量分布的量度。用重量平均分子量除以数量平均分子 量而得到所述多分散性，这一指标与给定的聚合物样本中个体分子量的分 布相关。当给定样本中聚合物链接近于均一的链长度时，PDI就接近1。
如本领域所知，可以对本发明的颗粒进行表面修饰，以改进其作为药 物送递载体的应用。
对于颗粒特别是能够成功地携带药物分子或其他化合物到达体内部 位(例如肿瘤位置)并进入癌细胞的纳米颗粒而言，优选地，应很好地控制 其特性以使其能够克服各种生理屏障而到达肿瘤组织。通过全身途径给予 的未经过合适的修饰纳米颗粒通常会迅速地被从循环系统中清除，并主要 聚集于肝脏和脾脏。严重的肝和脾中的滞留不仅会显著减少纳米颗粒到达 靶组织(例如肿瘤组织)的量，还会对肝和脾造成损害。上述清除是由于肝 脏Kupffer细胞和脾脏巨噬细胞的清除作用。通过这种被动的和位点特异 性机制，纳米颗粒可在几分钟至几十分钟内被清除。此外，纳米颗粒的表 面特征和大小在血液调理素作用中也起了很重要的作用，所述血液调理素 作用是例如纤连蛋白(fibronectin)的调理素的沉积过程，这一过程会引发 免疫应答，并促进巨噬细胞从血液中清除所述纳米颗粒。当所述纳米颗粒 的表面特征被很好地控制时，可以显著地减少调理素与纳米颗粒表面的结 合。
例如，纳米颗粒表面的聚乙二醇化为一种公知的能够减少蛋白结合的 方法，该方法能够形成可以显著减少蛋白结合和减少肝和脾摄入的亲水 层。聚乙二醇化能够产生鞘状结构，该结构与某些病原性微生物所具有的 机制类似，可以避开免疫系统的检测。由此可以抑制调理素作用，通过这 种抑制作用可以增强纳米颗粒在循环系统中的被动滞留时间，并且在纳米 颗粒与血液接触时能够避免所述纳米颗粒被巨噬细胞捕获。这种对纳米颗 粒表面进行处理的方法虽然简单，但是却可以获得显著的效果，通过聚乙 二醇化可以使得纳米颗粒在循环系统中的半衰期从几分钟提高到几小时 或几十小时。表面聚乙二醇化成为目前广泛使用的减少巨噬细胞识别的方 法。
除了表面形态之外，纳米颗粒的大小也是另一个能够显著影响生物分 布和体内效力的重要参数。纳米颗粒的大小可以极大地影响清除速率。颗 粒大小在200nm或更大的颗粒与较小颗粒相比更容易引起巨噬细胞免疫 应答和激活Kupffer细胞的摄入。肝中内皮窦的孔的大小可达到150nm。 脾内皮细胞间的缝隙约为200-250nm，当颗粒大小超过该缝隙的大小时， 脾过滤现象就会变得很显著。因此，当纳米颗粒被用于抗癌药物的送递时， 为了延长其循环时间，颗粒的大小通常被控制在150nm或更小。然而， 所述纳米颗粒的大小也不能太小，否则颗粒就会通过肾被快速地滤掉(当 颗粒大小＜10nm时)，这是分子量为40kDa或更小的聚合物-药物缀合物 经常遇到的问题。极小的颗粒(1-20nm)从血管中渗到细胞间隙的速度也会 较慢，并且会通过淋巴管而在淋巴结中累积。颗粒大小小于20nm的纳米 颗粒很容易通过开放的孔从血管中渗漏到毛细血管。因此，纳米颗粒应该 足够大，大到能够防止从循环系统中不想要的渗漏；纳米颗粒还不能太大， 以尽量避免免疫应答。
用于抗癌药物送递的大多数纳米颗粒的大小都在20至150nm之间。 为了改进抗癌送递，人们致力于开发鞘技术，以增加长循环半衰期的NP 在易漏的肿瘤脉管中的渗透。肿瘤的脉管是高度不均一的。根据具体部位 不同，肿瘤组织的脉管可能坏死，也可能脉管高度发达以使得肿瘤能够得 到充足的养分和氧气以供其快速生长。肿瘤的血管也是高度不均一的，并 且与正常血管相比也有某些异常。通常，肿瘤血管比正常血管更易漏，并 且表现出特征性的截留孔径，该孔径在380至780nm之间。这些孔成为 NP离开循环系统而进入肿瘤间隙的途径。因此，颗粒大小为150nm或更 小的NP可以通过这些易漏的管孔自由的扩散，而颗粒大小超过400nm 的颗粒则相对很难渗入肿瘤组织。由于肿瘤组织中淋巴管系统很不发达， 因此通过上述易漏的肿瘤脉管系统的孔渗入的纳米颗粒不会被很快清除。 因此，在循环系统中的持续浓度能够导致纳米颗粒随时间不停累积增加。 这一效应就是在癌症药物送递中广为人知的增强渗透和滞留(EPR)效应被 动靶向机制。
通过反应引入所需的末端官能团，可以对本发明的多聚物和寡聚物缀 合物进行化学修饰。可用于药物送递应用的末端官能团包括但不限于：羟 基、巯基、氨基、叠氮基、炔基、烯基、酮基、酚基、卤代基、咪唑基、 胍盐基、羧酸酯基或磷酸酯基。通过公知的化学方法，可以将这些所需的 官能团引入至本发明的多聚物或寡聚物的末端。还可以使用这些官能团将 本发明的多聚物或寡聚物缀合物与其他化合物相缀合，和/或为由本发明的 缀合物制备的纳米颗粒提供表面修饰的位点，所述其他化合物例如其他多 聚物、其他寡聚物、碳水化合物、肽、蛋白、抗体、核酸、适体等等。
本发明还涉及这样一种多层颗粒，其中使用对通过本文所述方法制备 的颗粒进行处理或包被，或在所述纳米颗粒上提供第二聚合物层。所述第 二聚合物与颗粒中的聚合物缀合物中的聚合物可以相同或不同。本发明的 颗粒也可含有两种或多种缀合的化合物，例如在给定应用中相容的两种或 多种不同化合物。本发明的颗粒可含有不同的层或部分，其中所述化合物 或药物的浓度不同。例如，外层中含有的给定化合物(例如药物)的浓度可 以比内层高或者低。例如，外层可含有PEG，而内层含有另一种聚合物的 缀合物。例如，第一内层可含有第一种药物多聚物或寡聚物缀合物，第二 外层可含有第二种药物的多聚物或寡聚物缀合物。
在本发明方法和材料中使用的多聚物和寡聚物优选地为生物相容性 和可生物降解的(根据所需的应用)。优选地，它们在使用中不表现出不想 要的毒性或表现出很小的不想要的毒性。
客队本发明的颗粒进行表面修饰以使其优先靶向于某些细胞类型。颗 粒的优先靶向可以通过例如将靶向配体共价或非共价连接至所述颗粒的 表面而实现。
本文所使用的术语“颗粒”通常指具有给定形状和大小以适用于通过 某些给药方法进行体内送递的颗粒。所述颗粒可为胶束、聚集体、微球或 不规则性状。本文所使用的术语“颗粒大小”与其在本领域中通用的含义相 同，并可以通过本文的实施例中所述的方法进行测定。
本发明涉及多聚物或寡聚物的缀合物。最通常而言，聚合物为含有彼 此键合的多个重复单元的化合物。聚合物可以含有多于一种的不同的重复 单元。所述重复单元通常衍生于单体的聚合。共聚物专门指含有两种或多 种结构上不同的重复单元的聚合物。聚合物中的不同重复单元可以在聚合 物链中随机排序，或在聚合物中聚集为连续的嵌段。当聚合物中存在两种 或多种重复单元的连续嵌段时，该聚合物为嵌段共聚物。本文所使用的术 语“多聚物”指的是含有总共多于10个重复单元的化合物(其中可以有一种 或多种重复单元)。本文所使用的术语“寡聚物”指的是具有2至10个重复 单元的化合物。
本发明的缀合物由具有至少一个羟基或一个巯基的化合物与寡聚物 或聚合物通过开环聚合而形成。所述化合物必须含有至少一个能够在反应 条件下作为聚合引发剂的官能团。所述羟基最通常为与碳原子相连的伯(1’) 羟基、仲(2’)羟基或叔(3’)羟基，或为与芳香环的碳原子相连的羟基，这在 本文中通常被称为“酚羟基”。酚羟基为直接与芳香环上的碳原子相连的羟 基。术语“羟基”和“氢氧基”在本文中可以互换使用。羟基不包括-COOH 基团(羧酸基)中的-OH部分，其中的氢为酸性。酚羟基中的氢的比醇中的 氢酸性大，但是比羧酸基中的氢酸性小。本文所使用的术语“羟基”也不包 括与N、P或S原子键合的-OH部分。如本领域所知，伯羟基指的是与该 羟基相键合的碳原子还与两个氢原子键合(例如-CH2-OH)。仲羟基指的是 与该羟基相键合的碳原子还与一个氢原子键合(例如-CH(M)-OH，其中M 为一个非氢原子或其他基团，在许多情况下M为一个含碳的基团)。叔羟 基指的是与该羟基相键合的碳原子不与氢原子键合，通常该羟基相键合的 碳原子还与另外三个碳原子键合。所述巯基最通常为与碳原子相连的伯(1’) 巯基、仲(2’)巯基或叔(3’)巯基，其中伯、仲和叔的定义与上文关于羟基的 定义类似。
本发明的颗粒制剂可用于治疗多种疾病、障碍或病症。本发明的治疗 方法包括给予需要治疗的个体治疗有效量的药物，其中所述药物包含于通 过本发明方法制备的纳米颗粒中。本文所使用的术语“治疗有效量”指的是 如下所述的给定药物的量，当以颗粒形式给予所述个体时，该量能够有效 地至少部分地治疗该个体所患的障碍、疾病或病症，或能够至少部分地缓 解该障碍、疾病或病症的症状。如本领域所知，给定化合物的治疗有效量 至少部分地依赖于给药方式、所使用的载体或运载体(例如溶液、乳液等)、 具体的障碍或病症以及具体的将被给予所述化合物的个体(年龄、体重、 状况、性别等等)。要达到“治疗有效量”所需的剂量会依赖于所使用的具 体组合物、给药途径、表现症状的严重程度和被治疗具体受试者。如本领 域所知，可以根据标准药物学测试方法的结果来确定活性化合物可用的每 日剂量。
本文所述的颗粒制剂可为例如干粉的形式并可在合适时被水化。所述 颗粒制剂可为单位剂型，例如为胶囊剂、悬液、干粉等。在这些剂型中， 所述制剂可被分为含有合适量活性成分的单位剂型；所述单位剂型可为包 装的组合物，例如被包装的粉末、小管、安瓿、预装注射器或含有液体的 药袋。所述单位剂型可为例如胶囊，或可为合适数量的包装形式的任意这 类组合物。
如本领域所知，所使用的剂量可在宽范围内变动，并应在每一具体病 例中针对个体需要进行调整。在本发明方法中可以使用任何合适的给药形 式。本发明的颗粒可以通过口服、静脉内、腹膜内、皮下或肌内剂型给予， 这些剂型均是制药领域的普通技术人员所熟知的。本发明的化合物还可以 通过使用合适的鼻内给药运载体以局部应用的方式进行鼻内给药。对于鼻 内或气管内吸入而言，可将本发明的化合物配制为水性或部分水性的溶 液，然后以气溶胶的形式给药。
本发明提供了治疗哺乳动物特别是人类的障碍、疾病、病症和症状的 方法，所述方法是通过给予需要所述治疗或预防的哺乳动物个体治疗有效 量的本发明的颗粒制剂。治疗的效果可为所述障碍、病症或其一种或多种 症状的部分或未完全缓解、抑制、预防、减轻或消除。给药包括本领域已 知的对给定疾病或障碍类型有效的任何给药方式，并意图包括以任何合适 的剂型给药的方式。需要所述治疗或预防的个体包括已被确诊患有给定障 碍或病症的个体和疑似患有这类障碍或病症的个体(例如已表现出某些症 状)。
术语“药物”包括药物的“可药用盐”和前药。本文所使用的术语“前药” 意为可以在体内通过代谢方式(例如通过水解)转化为药物的化合物。
可以使用任何已知的方法对本发明的颗粒进行表面修饰，以改进其表 面性质以用于体内送递或其他应用。例如，可以使用本领域已知的聚乙二 醇化对颗粒表面进行修饰。可以使用本领域已知的聚合物进行涂覆以修饰 颗粒表面。
当本文公开一组取代基时，应当理解的是，该组中和所有其子集中的 所有个别的成员也被分别地公开，其中包括该组成员的任何亚型、对映异 构体和非对映异构体。当本文中使用马库什组或其他分组时，所述公开内 容中还意图包括该组中所有个别成员的所有可能的组合和亚组合。在本文 中公开了可变定义的多个具体的组合。而本文公开内容中意在分别包括可 变定义的具体组合的所有组合和亚组合。当本文中描述一种化合物时，虽 然为具体指明该化合物的具体亚型、对映异构体或非对映异构体(例如以 结构式或化学名进行描述)，但是本说明书意在包括曾被个别描述或组合 描述的化合物的每一种亚型和对映异构体。此外，除非特别指明，本发明 公开内容中还意在涵盖本文公开的化合物的所有同位素变体。例如，能够 理解的是在本文公开的分子中的一个或多个氢可以被氘或氚代替换。分子 的同位素变体通常作为标准物用于分子的测定和关于分子及其用途的化 学和生物学研究中。包括放射性同位素的同位素变体还可用于诊断测定和 治疗。制备这类同位素变体的方法是本领域已知的。化合物的具体名称意 为示例性的，本领域普通技术人员可能对相同的化合物具有不同的命名。
本文所公开的许多分子都含有一个或多个可离子化的基团[可以在该 基团上移去一个质子(例如-COOH)或加上一个质子(例如氨基)，或该基团 可被季铵化(例如氨基)]。本文的公开内容意在分别包括这类分子的所有可 能的离子形式和盐形式。关于本发明化合物的盐，本领域技术人员可以根 据给定的应用，从多种可用的平衡离子中选择适于制备本发明的盐的平衡 离子。在具体应用中，选择特定的阴离子或阳离子来制备盐，可能导致所 述盐的溶解性增高或降低。
除非特别指明，否则本文所述或所示例的每种制剂或组分的结合都可 用于实施本发明。
当本说明书中给出一个范围，例如温度范围、时间范围或组分或浓度 的范围时，包括在所给范围内的所有中间范围、子范围以及所有个别的数 值点都意图包括在本发明的公开内容中。应当理解的是，在本说明书中给 出的范围中的任何子范围或个别的数值点都可被本申请的权利要求所排 除。
在本说明书中提及的所有专利文献和出版物意在指示本发明所属技 术领域的普通技术人员的技术水平。本文所引用的参考文献的全部内容均 通过援引的方式纳入本文，并意在指示其出版日或公开日前的现有技术状 况，本文意图在需要时使用这些信息并排除现有技术中的具体实施方案。 例如，当本发明要求保护一种物质的组分时，应当理解的是，在本发明做 出之前的现有技术中已知的和可获得的化合物，包括本文引用文献中公开 的化合物提供的化合物，并不意图包括在本申请要求保护的物质的组分 中。通过援引的方式纳入本文的参考文献是为了提供本发明的其他的环状 单体、其他的催化剂、其他的反应条件、其他的具有至少一个羟基的药物 和其他化合物、其他的表面处理方法或修饰方法和试剂，以及本发明的方 法、组合物和试剂盒的其他应用。
本文所使用的术语“包括”与“包含”、“含有”或“特征为”是同义的，都 是表示包括的开放式表述，并不排除其他的未指明的要素或方法步骤。本 文所使用的术语“由......组成”则排除了除要求保护的要素之外未指明的 任何其他要素、步骤或成分。本文所使用的术语“基本上由......组成”则不 排除不会实质上影响权利要求的基本特征或新颖性特征的物质或步骤。在 本文的所有情况中，术语“包括”、“基本上由......组成”和“由......组成”可 能可以彼此互换使用。在本文中示例性描述的本发明可能在缺少本文未具 体公开的任何要素或限定的条件下也能够实施。
本领域普通技术人员应当理解的是，不必进行过多的试验，就能够使 用本文具体实例之外的起始原料(例如环状单体、具有至少一个羟基的药 物和其他化合物、生物材料)、试剂(例如开环聚合催化剂)、合成方法、纯 化方法、分析方法、测定方法和生物学方法来实施本发明。本发明意在包 括本发明任何物质和方法的所有本领域中已知的功能性等同物。所使用的 术语和表述都是用于描述而不是用于限制，使用这些术语和表述并不意在 排除所述或所显示的特征或其部分的任何等同物，应该认识到，在本发明 要求保护的范围内可能有多种变化方案。因此，应当理解，虽然通过优选 实施方案和任选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以基于本 发明理念而采用各种变化和修饰的方案，如后附权利要求所限定的那样， 这些变化和修饰的方案也被认为是包括在本发明的范围内。
实施例
实施例1：聚丙交酯-紫杉醇(Paclitaxel)纳米缀合物颗粒
本发明的纳米颗粒设计是基于使用药物作为开环聚合反应的引发剂， 以形成药物-多聚物(和药物-寡聚物)缀合物，其中所述药物与所述多聚物 或寡聚物共价键合。由于使用所述药物作为聚合反应的引发剂，因此所述 药物与所述多聚物(寡聚物)的缀合效率非常高，理想地为100％。此外， 如果在活性聚合(例如其中药物分子作为引发剂)中所有的药物分子均能有 效掺入，通过调节单体/引发剂的比例将能够精确控制药物装载量百分比。
为初步证实这一策略，在存在合适的催化剂的条件下，使用紫杉醇 (Ptxl)引发丙交酯的聚合。使用含有羟基基团的分子作为丙交酯的活性开 环聚合的引发剂是成熟的技术。紫杉醇(Paclitaxel)是在美国销量最大的 化疗药物，它含有三个羟基基团。
金属-氧化物(M-OR)是广泛使用的环状酯的活性开环聚合的引发剂， 所述环状酯例如本研究中使用的例如DL-丙交酯(LA)。所述金属氧化物可 以通过混合含羟基的化合物和活性金属复合物(例如金属-氨基化合物 (metal-amido compound))而在原位制备(B.M.Chamberlain，M.Cheng， D.R.Moore，T.M.Ovitt，E.B.Lobkovsky，G.W.Coates，J.Am.Chem.Soc. 2001，123，3229)。在原位形成的M-OR可以引发可控的LA的活性聚合， 从而实现OR的定量掺入到PLA的末端并实现100％的单体转化率。已经 发现，通过金属-Ptxl氧化物介导的LA的聚合，可以在聚酯中掺入Ptxl。 这样，通过调整LA与Ptxl的比值，能够精确控制药物装载量。由于金属 -OR通常是在瞬间定量地形成，因此Ptxl在所得的PLA中的掺入效率可 以达到100％。在聚合后，Ptxl分子通过可水解的酯键与PLA的末端共价 地连接，并可通过水解进行持续释放。对Ptxl-PLA缀合物进行纳米沉淀 以生成聚合的NP，其中纳米缀合物(NC)含有共价结合的Ptxl。
为了保证LA(丙交酯)在室温下快速而完全地聚合，使用了活性很高的 LA聚合催化剂——(BDI)MgN(TMS)2(Chamberlain，et al.2001，见上文) (该催化剂的结构示于图2)。将Ptxl与1当量的(BDI)MgN(TMS)2混合， 在室温下，LA的聚合在几分钟内就能完成，并且在所得的PLA中含有基 本定量掺入的Ptxl(表1)。相信原位形成的(BDI)Mg-Ptxl复合物(结构未表 征；可能为单体Mg-Ptxl氧化物)引发了聚合。
在使用0.1-1M的NaOH处理Ptxl-PLA后，在所述聚合物缀合物中 掺入的Ptxl以其初始形式和其他降解产物一起释放，这表明Ptxl通过可 水解的酯键与PLA相缀合。
Ptxl-PLA缀合物的纳米沉淀生成小于100nm的NP(表1)。为了与 NE相区分，将这些由Ptxl-PLA缀合物的纳米沉淀生成的NP称为纳米缀 合物(NC)。在本文中，具体的缀合的聚合物被命名为药物(或其他化合 物)-LAn，其中药物或其他化合物以简写形式表示(例如Ptxl、Dtxl、Doxo、 Pyr或Cy5)，PLA表示为LAn，其中n为M/I比值。在某些情况下，NC ——即由缀合的聚合物形成的纳米沉淀，被命名为药物-LAn的NC。这些 术语的含义在其上下文中是清楚的。
通过Ptxl-PLA缀合物的纳米沉淀总是能够获得具有单模式颗粒分布 和低多分散性的NC。由于NE的多模式分布部分地归因于未包封的游离 药物的聚集(J.Cheng，B.A.Teply，I.Sherifi，J.Sung，G.Luther，F.X.Gu， E.Levy-Nissenbaum，A.F.Radovic-Moreno，R.Langer，O.C.Farokhzad， Biomaterials 2007，28，869)，在NC中观察到的单模式分布可能与形成NC 的Ptxl-PLA缀合物的单分子结构有关。
所使用的溶剂和聚合物的浓度对于通过纳米沉淀制备的NP的大小有 着显著的影响。具有高水混溶性的溶剂(例如DMF)比低水混溶性的溶剂 (例如THF或丙酮)更容易在水中快速扩散(Cheng et al，2007，见上文)。因 此当溶解于高水混溶性溶剂中的疏水性聚合物被加入至水中时，预计聚合 物可以快速聚集成核。这样，当溶液中的聚合物浓度保持不变时，由于快 速成核产生的颗粒数量更多，导致颗粒大小减小。当溶剂类型和溶剂与水 的比值保持不变时，由于在该条件下颗粒的数量基本上也保持不变，因此 颗粒大小通常与聚合物的浓度呈线性相关。
表1.具有高装载量、高掺入效率、小颗粒尺寸和低颗粒分布的药物 -PLA纳米缀合物(NC)的形成

a：M/I＝单体/引发剂的比值。对所有样本，都是先溶于DMF，然后 在快速搅拌的条件下滴加至水中；
b：使用FTIR(1771cm-1)通过分析未反应的丙交酯测定；
c：掺入效率。基于游离分子的RP-HPLC分析。由于药物分子是与 聚丙交酯缀合而不是被包封于聚丙交酯中，因此使用掺入效率这一术语代 替包封效率；
d：通过动态光散射测定，SD＝标准差；
e：当通过动态光散射仪测定多分散性时，该值为显示颗粒大小的分 散性的统计学指标。
Ptxl-PLA缀合物的纳米沉淀遵循上述规律。当Ptxl-PLA缀合物的浓 度保持不变时，通过沉淀Ptxl-PLA缀合物的DMF溶液制备的NC大小通 常比使用丙酮或THF作为溶剂制备的颗粒小20-30nm。当使用DMF作 为溶剂以及DMF/水的比值为1/20(v/v)的条件下进行纳米沉淀时， Ptxl-LA200 NC的大小与Ptxl-LA2O0缀合物的浓度呈线性相关，并且可以 通过改变Ptxl-LA2O0的浓度而在60nm至100nm之间的范围内精确控制 该颗粒大小。当使用其他药物-聚合物缀合物通过纳米沉淀法形成纳米缀 合物时，也观察到类似的线性相关关系。
与常规的纳米沉淀技术相比，其中在较小颗粒中的药物装载量和包封 效率可能很低，通过本发明制备的纳米缀合物在聚合物基质中应全部含有 完全相同的药物浓度(例如Ptxl浓度)，因为在纳米沉淀过程中聚合物-缀合 物的药物装载量保持不变。
药物初始快速释放会导致不利的副作用，并降低纳米包封的治疗效 力。由于Ptxl-PLANC中的Ptxl释放动力学是由Ptxl-PLA酯键的水解和 药物扩散这两个因素决定，Ptxl从NC中释放的动力学将更容易控制，由 此能够显著降低初始快速释放效应。在NC中观察到良好受控的Ptxl释放 (图3)。在第一天时，从PtXl-LA50(10.6wt％)和PtXl-LA25(19.2wt％)中释 放的Ptxl分别为7.0％和8.7％；在第六天时，从PtXl-LA50(10.6wt％)和 PtXl-LA25(19.2wt％)中释放的Ptxl分别为43％和70.4％。与之相比，在 24小时内，从Ptxl/PLANE中释放的Ptxl为89％(图3)。Ptxl从PtXl-LA50 NC中的释放要比它从PtXl-LA25NC中的释放更慢，这可能是因为 PtXl-LA50的分子量更高，并且其颗粒聚集更紧密。事实上，在所有所研 究的药物-PLANC中，低装载量的NC表现出更慢的药物释放。
NC的体外毒性是通过Ptxl的释放量测定；因此该毒性与药物装载量 密切相关(图4)。在PC-3细胞中通过MTT测定测得的具有相似大小(约 100nm)的PtXl-LA15、PtXl-LA25和PtXl-LA50NC的IC50值分别为111nm、 370nm和855nM。PtXl-LA15NC与游离的Ptxl(87nM)具有相近的IC50； 而PtXl-LA50NC的IC50则要高一个数量级。因此，通过简单地控制NC 的药物装载量就可以在较宽的范围内调整NC的毒性。
使用聚(乙二醇)(PEG)对NP进行表面修饰是一种用于延长NP的循环 时间和减少NP在血液中聚集的常用手段(P.Caliceti，F.M.Veronese， Advanced Drug Delivery Reviews 2003，55，1261；R.Gref，Y.Minamitake，M. T.Peracchia，V.Trubetskoy，V.Torchilin，R.Langer，Science 1994，263， 1600.)。
起初，使用非共价方法对NC表面进行聚乙二醇化以减少除去未反应 试剂和副产物的工作量。例如，使用具有13kDa的PLGA和5kDa的PEG 区段的两亲共聚物——聚(乙交酯-共-丙交酯)-b-甲氧基化PEG (PLGA-mPEG)——进行NC的聚乙二醇化。据Pierri等人报道(Journal of Biomedical Materials Research Part A；2005；639-647)，当疏水性嵌段中 PEG的含量超过70％或低于50％时，可以显著降低两亲共聚物 PLA-b-PEG的微胶束化。
预计PLGA嵌段与NC通过疏水相互作用形成强的相互作用，从而形 成稳定的PEG外壳。NP表面聚乙二醇化中也使用过类似的技术(X.H. Gao，Y.Y.Cui，R.M.Levenson，L.W.K.Chung，S.M.Nie，Nat.Biotechnol. 2004，22，969)。向Ptxl-LA200中按顺序加入0.4至2当量(质量当量)的 PLGA-mPEG可以使得颗粒大小从54.5nm线性增加至100.3nm(图5)。
经过PLGA-mPEG修饰的Ptxl-LA200NC与未经处理的NC或仅使用 mPEG处理的NC相比，表现出在PBS中的显著提高的稳定性(图6)，这 表明疏水性PLGA区段对PLGA-mPEG和NC之间的非共价相互作用十 分重要。NC在静脉内给药后立刻被稀释，这可导致PLGA-mPEG与NC 解离。然而，用PBS将经过PLGA-mPEG处理的Ptxl-LA2O0NC连续地 从1mg/mL稀释至0.01mg/mL的过程中，颗粒大小并没有表现出任何增 加。这一研究表明，如上所述形成的PEG外壳在全身循环中能够保持与 NC的紧密结合。
使用PEG涂覆NC的表面可以生成循环时间较长的纳米颗粒。当将 PLA-PEG加入至Ptxl-PLA纳米颗粒中时观察到纳米颗粒的大小线性增 加，这表明由于PLA-PEG和PLA-紫杉醇的疏水相互作用而在纳米颗粒 的表面形成分层结构。PEG冠很容易形成。使用上述方法产生的纳米颗粒 在盐溶液中很稳定。这种制备在盐溶液中稳定的纳米颗粒的简便方法将使 得纳米颗粒在系统性研究中很容易被传递。
PEG也可以与NC共价缀合，这是本领域已知的(O.C.Farokhzad，J. J.Cheng，B.A.Teply，I.Sherifi，S.Jon，P.W.Kantoff，J.P.Richie，R. Langer，Pro.Nat′lAcad.Sci.USA 2006，103，6315)。
Ptxl分别在其C-2’、C-1和C-7位上有三个羟基基团。这三个羟基基 团的每一个都能够有效地引发LA聚合，这样得到的Ptxl-PLA缀合物中 与Ptxl相连接的PLA链可能有1至3条，为了减少Ptxl-PLA的不均一性， Ptxl-PLA缀合物优选地含有单一一条PLA链。已发现，可在所述药物(例 如Ptxl)的特定羟基基团上对聚合进行控制，以制备含有单一一条PLA链 的PLA缀合物。
Ptxl的三个羟基基团的空间位阻不同，其顺序为2’-OH＜7-OH＜ 1-OH。其中的1-OH为叔羟基，它是最难接近的，通常没有活性(D. Mastropaolo，A.Camerman，Y.G.Luo，G.D.Brayer，N.Camerman，Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.1995，92，6920)。其中的2’-OH是Ptxl中最容易接 近和活性最强的羟基基团，而7-OH的活性也不弱，它可以有力地与2’-OH 竞争结合金属催化剂。考虑到不同羟基基团之间的空间位阻不同，因此应 使用具有较大体积基团的催化剂，例如具有大体积的螯合配体的金属催化 剂可能能够区分2’-OH和7-OH，从而能够优先地甚至专一地通过2’-OH 形成Ptxl-金属复合物以，进行LA聚合。
由于原料过于复杂，因此使用NMR法测定PLA链与哪个(些)羟 基基团相连接的尝试并不成功。为了测定PLA到底是与2’-OH连接还是 与7-OH连接，使Ptxl-PLA中的Ptxl与四丁基硼氢化铵(Bu4NBH4)反应。 据报道，该试剂能够定量地将Ptxl中的13-酯键还原为巴卡亭III(BAC)和 (1S，2R)-N-1-(1-苯基-2，3-二羟基丙基)苯甲酰胺(PDB)(N.F.Magri，D.G.I. Kingston，C.Jitrangsri，T.Piccahello，J.Org.Chem.1986，51，3239)。BAC 带有Ptxl的7-OH，而PDB带有Ptxl的2’-OH。
使用不同的金属催化剂Mg(N(TMS)2)2和(BDI)MgN(TMS)2来制备 Ptxl-LA5并与Bu4NBH4-反应：Mg(N(TMS)2)2是一种不带有螯合配体的催 化剂而(BDI)MgN(TMS)2带有螯合配体。使用Mg(N(TMS)2)2时，会在反 应后生成PDB-PLA和BAC-PLA，这表明这种催化剂在Ptxl的2’-OH和 7-OH上均引发聚合。当使用(BDI)MgN(TMS)2时，所生成的BAC-PLA 的量显著降低，这表明使用这种催化剂的LA聚合主要发生在Ptxl的 2’-OH上。
虽然(BDI)MgN(TMS)2能够在金属/Ptxl引发的聚合反应中提供显著 改进的位点特异性控制，但是所得的Ptxl-PLA通常具有相当宽的 MWD(例如Ptxl-LA200Mw/Mn＝1.47)。这一现象是因为在Mg催化剂引发 的聚合反应中，链延长的速度要比引发反应的速度快得多(Chamberlain et al.，2001见上文)。催化剂(BDI)ZnN(TMS)2与(BDI)MgN(TMS)2具有相同 的螯合配体，虽然其反应活性要比它的Mg类似物低得多，但是它能够提 供明显改善的LA聚合。当在Ptxl引发的M/I＝200的聚合反应中使用 (BDI)ZnN(TMS)2时，所得的Ptxl-LA200具有极窄的PDI(Mw/Mn＝1.02)， 所得的MW Mn＝28，100kDa。而预计的Mn＝29.700kDa。对如上所述使 用(BDI)ZnN(TMS)2制备又与Bu4NBH4反应的PtXl-LA5进行HPLC分析， 结果表明引发和聚合都专一地发生在Ptxl的2’-OH上。
药物引发的聚合方法可以应用于制备其他含羟基药物的NC，以及含 有一个或多个巯基基团的药物的NC。例如，使用这种金属/药物复合物引 发LA聚合和随后纳米沉淀的方法，容易地制备了具有高药物装载量、大 于95％的装载效率和小于100nm的颗粒大小的多西他赛(Dtxl)-LA10和喜 树碱(CPT)-LA10NC(其高药物装载量分别为35.9wt％和19.5wt％)(表1)。 CPT与Ptxl和Dtxl的不同之处在于它没有固有的酯键。因此，需要在使 用NaOH进行处理后从CPT-PLA NC中定量回收CPT。从CPT-PLA在 PBS中的水解混合物中分离CPT，并用制备型HPLC收集，其1H NMR 谱与权威的CPT谱相同。本研究还证实，在温和的聚合反应和纳米沉淀 的反应条件下，所掺入的药物的化学结构保持不变。在NC中掺入的药物 可以以其原始形式释放出来。
与Ptxl-LANC相似，Dtxl-LANC、Doxo-LANC和CPT-PLANC在 PBS中均未显示出初始快速释放。Dtxl-PLA和CPT-PLA NC的毒性-药物 装载量的关系均与Ptxl-PLA NC相似(图7A-D)。
本发明的方法使得可以制备具有相当高的药物装载量(最高达35％)、 接近定量的装载效率、没有初始快速释放效应的可控释放特性和很窄的颗 粒分布的聚合物-药物缀合物纳米颗粒(NC)。在本发明的制剂中使用安全 的和有营养的金属；有机螯合配体可以通过溶剂萃取而被容易地除去。此 外，只需要几小时就可以制备出克量级的、高装载量的和在盐溶液中稳定 的NC。如上所述，在制备NC时，通过使用不同的环状酯单体，还可以 有效地控制药物释放特性。
Ptxl-PLA NC的制备：将(BDI)MgN(SiMe3)2(6.2mg，0.01mmol)和Ptxl (8.5mg，0.01mmol)在0.5ml的无水THF中混合。滴加溶于2ml无水THF 中的DL-丙交酯(144mg，1mmol)。当LA完全耗尽时(通过FT-IR或1H NMR监测)，将聚合反应溶液置于乙醚(25ml)中沉淀，以生成Ptxl-LA100 缀合物。使用(BDI)ZnN(SiMe3)2或Mg(N(SiMe3)2)2的聚合反应也类似地进 行。将Ptxl-LA100的丙酮或DMF溶液(100μl，10mg/mL)滴加至快速搅拌 的纳米级纯水(2ml)中，以进行沉淀。将PLGA-mPEG5k(MW＝18，300 g/mol，5mg/mL溶于DMF，100μl)或mPEG5k(5mg/mL溶于DMF，100μL) 滴加至NC。
Ptxl-PLA NC的表征和评估：使用ZetaPALS动态光散射检测仪 (Brookhaven Instruments，Holtsville，NY，USA)或通过SEM表征NC的大 小。使用超滤纯化所得的NC；使用MTT测定在PC-3细胞中评估其体外 毒性(在37℃下培养24小时)。为了测定Ptxl-PLA的释放动力学，将NC 的PBS溶液等分为几份并在37℃下培养。在预定时间时终止释放研究。 加入DMF溶液以溶解所有沉淀。然后将所有样本干燥后重溶于DCM中， 并与Bu4NBH4反应1.5小时。向溶液中加入一滴乙酸。搅拌溶液20分钟， 然后蒸干溶剂。将所得的残留固体重溶于乙腈以进行RP HPLC分析 (Curosil，250×4.6mm，5μ；Phenomenex，Torrence，CA，USA)。
发明人已经证实了通过图2所示的方法能够使用不同的小分子和肽形 成缀合物。这些分子的结构示于图8。代表性的纳米缀合物的数据示于表 1。示例性的具体PLA-药物聚合反应条件在下文中有述。纳米颗粒的形成、 表征和释放评估的方法均与上述用于PLA-紫杉醇纳米颗粒的方法相似。
实施例2：聚丙交酯-阿霉素(doxorubicin)聚合物(Doxo-PLA)
催化剂(BDI)MgN(TMS)2和D，L-丙交酯按照与Ptxl-PLA聚合反应中 相同的方法进行处理。在手套式操作箱中进行聚合反应。所有的反应容器 均使用铝箔覆盖，并关闭操作箱中的灯光。首先，将阿霉素溶于DMF并 搅拌10分钟直至其完全溶解。然后加入(BDI)MgN(SiMe3)2并使其溶于 THF中。将阿霉素和(BDI)MgN(SiMe3)2的溶液混合15-20min，溶液由橙 红色变为紫色。在HPLC分析中可以看出阿霉素的峰发生了位移，表明形 成了阿霉素和(BDI)MgN(SiMe3)2的复合物。将UV检测仪设为450nm。 将D，L-丙交酯溶于THF并滴加至阿霉素和(BDI)MgN(SiMe3)2的快速搅拌 的混合物中。通过HPLC监测反应进程直至观察不到未反应的阿霉素为 止。Doxo-LA的UV谱显示在325-400nm处具有吸收，这与阿霉素的 400-500nm的吸收不同。通过纳米沉淀形成纳米颗粒的方法与上述 Ptxl-PLA纳米颗粒的方法相似。
实施例3：使用1，5，7-三氮杂二环[4.4.0]癸-5-烯(TBD)或 BDI-Mg-N(TMS)2制备的Dtxl-PLA
将TBD或BDI-Mg-N(TMS)2催化剂与多西他赛混合，并在上述催化 剂和引发剂的混合物中加入丙交酯。例如，将多西他赛和TBD溶于THF 中并搅拌5至10min(在HPLC分析中可以看出，多西他赛的峰发生了位 移，表明TBD与多西他赛形成了复合物)。将D，L-丙交酯溶于THF中并 滴加至多西他赛和TBD的混合物中。反应过程与紫杉醇-PLA的类似，并 通过FTIR和HPLC监测。由多西他赛-Mg(II)复合物引发的聚合反应的 进行与上述使用紫杉醇的反应相似。形成纳米颗粒的方法也与上述 Ptxl-PLA纳米颗粒的方法相似。
实施例4：PLA-芘甲氧基聚合反应
将芘甲醇(Pyrenemethanol)(TCI America)溶于THF和CaH2并搅拌过 夜，过滤后真空干燥，以进行纯化，然后储存于手套式冰箱中。将芘甲醇 与LA和BDI-Mg-N(TMS)2混合。选择单体与引发剂(Pyr)的比例。在24 小时后终止反应并用甲醇和乙醚洗涤三次以进行纯化。通过NMR检测证 实缀合的芘甲醇与PLA形成了共聚物。形成纳米颗粒的方法与上述 Ptxl-PLA纳米颗粒的方法相似。
实施例5：PLA-LHRH聚合
戈舍瑞林(Goserelin)获自Bachem，并储存于冰箱中。催化剂 (BDI)MgN(SiMe3)2和D，L-丙交酯按照与Ptxl-PLA聚合反应中相同的方法 进行处理。在手套式操作箱中进行聚合反应。将戈舍瑞林溶于DMF中并 搅拌10小时。将(BDI)MgN(SiMe3)2溶于THF中。混合戈舍瑞林和 (BDI)MgN(SiMe3)2的溶液并搅拌30min。将D，L-丙交酯溶于THF的溶液 加入至上述混合物中。选择丙交酯与戈舍瑞林的比例。在聚合反应中，溶 液可能会变得混浊，表明生成了某些沉淀。如果发生上述现象，则加入 DMSO以保证组分和产物处于溶解状态。通过HPLC监测戈舍瑞林的转 化。但是观察到的转化率低于95％。使用戈舍瑞林缀合物形成纳米颗粒的 方法与上述Ptxl-PLA纳米颗粒的方法相似。
实施例6：Zn、Ca和Fe催化剂和有机催化剂
Mg(II)复合物能够使得发生快速的聚合反应。但是在某些情况下， Mg(II)可能会使得链延长的速度比引发反应的速度快得多，这对于活性聚 合的进行是不利的。Coates证实某些Zn催化剂能够促进快速的引发和相 对较慢的链延长，并且Zn介导的丙交酯聚合反应可生成具有很窄的多分 散性的聚合物。19因此，在本发明的方法中可以使用(BDI)Zn-(多西他赛) 和(BDI)Zn-(阿霉素)作为引发剂。可用于上述方法的其他催化剂包括类似 的含Ca和Fe的催化剂。16Mg、Zn、Ca和Fe都是人体中存在的元素， 因此上述催化剂比例如含有Al或Sn的其他活性催化剂要更安全。示例性 的催化剂包括但不限于：


M＝Mg，Ca，Zn
X＝OEt，OPh，O[2，6-(i-Pr)2C6H3]，OSiMe3
N(SiMe3)2
R＝t-Bu，i-Pr



L1ZnN(SiMe3)2(29a)
L1ZnN(i-Pr)2(29b)
(L1ZnOi-Pr)2(29c)
L1Zn(OSiPh2)(THF)(29d)
L1ZnOt-Bu(29e)
L1ZnOCHMeCO2Me(29f)
(L1ZnOAc)2(29g)
L1ZnEt(29h)
L1SnOi-Pr(30)
L1Mg[N(i-Pr)2](THF)(31a)
(L1MgOi-Pr)2(31b)
L1Mg(Ot-Bu)(THF)(31c)
L1Ca[N(SiMe2)2](THF)(32)
L2FeOt-Bu(33)，其中

Ar＝2，6-(i-Pr)2C6H3或Ar＝2，6-(乙基)2C6H3
实施例7.释放研究：
芘甲醇-PLA释放研究
使用游离的芘甲醇校准浓度-HPLC峰面积(或强度)曲线。在乙腈 (10mg/ml)-水(1/10)体系中形成纳米颗粒，并使用DI水洗涤三次以除去未 共价结合的小分子。在第0天，在几个小管中制备PBS 1X-NP溶液并在 37℃下培养。在一次试验中使用两个小管。将一个管中的内容物在4000 rpm离心30min，以沉淀所有的NP，并测定上清液中的芘甲醇浓度。向 另一管中加入1N的NaOH溶液并在37℃放置30-90min，以降解所有的 NP，并测量芘甲醇的总浓度(100％)。(在注入至HPLC之前，用乙酸将溶 液的pH值调节至7)。在选定的时间点，将管从37℃培养箱中取出，离心 除去NP并得到上清液，制备为1/1PBS-乙腈溶液并注入HPLC。记录积 分的峰和强度并与纳米颗粒中的总芘甲醇浓度为100％的测量值相比较， 以测定释放特性。HPLC检测仪测量227nm和265nm处的吸收。所使用 的流动相为含有0.05％TFA的50/50的乙腈/DI水。
多西他赛-PLA释放研究
使用游离的多西他赛校准HPLC分析中的标准曲线。将PLA-多西他 赛纳米颗粒完全分散于1×PBS溶液中并用1-辛醇萃取。将1-辛醇萃取物 直接注入HPLC。所用的分析条件与上述PLA-芘甲醇研究中的一样，检 测仪测量227nm和265nm处的吸收。通过将测量结果与聚合物中掺入 100％的多西他赛以及相同的HPLC注入浓度时的测量值相比，测定释放 百分率。
实施例8.2-20nm范围内的树枝状纳米缀合物
由于药物释放动力学与纳米颗粒的表面积直接相关，因此进一步减小 纳米颗粒会导致更快速的药物释放。此外，小纳米颗粒与大纳米颗粒相比， 在药物送递和其他应用方面可能具有截然不同的特性。例如，小纳米颗粒 可能具有不同的细胞吸收特性。对于相对较大(约100nm)的颗粒而言，颗粒 可能通过胞吞作用进入细胞。而当NP的大小在约10nm的范围时，颗粒 可能能够直接通过渗透作用或通过溶液的吞饮作用(胞饮作用)而进入细 胞。嵌段共聚物的微胶束化通常会使得颗粒的大小大于10nm的范围。
为制备小尺寸纳米颗粒，可以使用树枝状多聚物或寡聚物缀合物。这 类缀合物通过AB2型环状单体(例如羟基丙交酯，见下式)的聚合而形成：

式H
其中z为1-6，和Y1的定义如前所述。在具体的实施方案中，Y1为H。
例如，可以使用式H中所示且z为1和Y1为H的AB2单体。这种单 体可以通过下述反应路线1的方法合成。在存在具有至少一个羟基或巯基 的药物的条件下，羟基丙交酯分子的聚合可形成如图9所示的具有树枝状 结构或高分枝结构的缀合物。
在其他具体的实施方案中，所述药物或其他化合物具有一个羟基，单 向连接的聚合物可以在药物分子周围形成高分枝结构。在具体的实施方案 中，所述药物或其他化合物具有两个或多个羟基，多向连接的聚合物可以 在药物分子周围形成高分枝结构。这种实施方案示例性地示于图9。应当 理解的是，在所述药物或其他化合物中，不是所有的羟基都具有相同的引 发聚合和与所述多聚物或寡聚物连接的活性。因此，对于给定的药物或其 他化合物而言，可能在其中的几个羟基位置上形成多聚物或寡聚物。对于 给定的一群多聚物/寡聚物缀合物而言，它们与每一种药物或其他化合物连 接的多聚物/寡聚物的数量也可能不完全相同，也就是说，不是所有的缀合 物都具有相同数量的连接的多聚物/寡聚物。形成足够多的高分枝结构就能 形成单分子的树枝状纳米颗粒。使用环状AB2型单体的上述方法能够形 成含有选定药物的小颗粒尺寸(20nm或更小)的纳米颗粒。由于高分枝聚 酯结构的外围具有很多羟基，因此所得的纳米颗粒是水溶性的。

在反应路线1所示的合成中，将H-Ser(Z)-OH(30.0mg，154mmol)溶 于400ml的1M硫酸和400ml的乙腈中。将NaNO2(21.7g，313mmol)溶于 150ml水中并用30min将其滴加至反应烧瓶中。在氮气保护下搅拌反应物 18-24小时。将溶液用500ml二氯甲烷和乙酸乙酯萃取3次。合并有机相 并用硫酸镁干燥，过滤并在真空条件下浓缩。将所得的产物(25.4g， 129mmol)溶于二氯甲烷(300ml)和17.9ml三乙胺中，在冰浴条件下用30 分钟滴加2-溴丙酰溴(13.5ml 129mmol)和溶于150ml二氯甲烷的 DMAP(1.58g，129mmol)溶液。然后在氮气保护下搅拌反应物18-24小时。 使用乙醚沉淀所得的混合物，然后过滤剩余的溶液。合并有机溶液并蒸发， 得到浅黄色的油状物(第二步反应的产物)。
将上述第二步反应产物(4.11g，12.4mmol)溶于500ml丙酮，加入碘 化钠(18.59g，1.24mol，10当量)，将反应混合物回流过夜。温度控制为 55-60℃并用氮气保护。第二天，终止反应并使其冷却。使用硅藻土过滤 溶剂(丙酮)并蒸发丙酮。将所得的棕色油状物重新溶于丙酮中并用2M的 Na2S2O3(300ml)萃取三次，得到黄色溶液，用MgSO4干燥。最后蒸发溶剂 得到粗产物(第三步反应产物)，不经过纯化而直接用于下一步骤。
将上述产物(4.53g 12.1mmol)溶于100ml DCM中，滴加至回流的含 DIEA(4.6ml，27.7mmol)的1000ml的丙酮溶液中，回流8小时。温度控制 在70℃。通过HPLC确认反应完全。使用硅胶柱，通过氯仿和甲基叔丁 基醚(1/1)洗脱以分离非对映异构体。蒸发溶剂，并将所得的固体重新溶于 甲基叔丁基醚，然后向溶液中加入过量己烷以沉淀出白色固体。
将上述白色固体(1.5mmol，375.0mg)溶于甲醇(1.5ml)，用H2和10％ Pd/C催化剂(40mg)使Cbz基团脱保护。两天后，蒸发溶剂得到白色固体。 使用NMR和EI-MS确认其结构。
在手套式操作箱中进行羟基取代的环状单体(1.Ommol，160mg)的聚 合。将所述单体溶于50Oul DMF溶液中。将(BDI)MgN(SiMe3)2(0.03mmol， 18.0mg)溶于1ml THF中并与含多西他赛(0.01mmol，8.1mg)的THF溶液 混合10-30min。用10分钟将上述单体溶液非常缓慢地加入混合物中。通 过HPLC在227nm和265nm处监测反应。当反应完成后，使用SEC柱 和反相半制备性HPLC纯化聚合物。通过AFM和动态光散射测量，发现 所述聚合物在水溶液中形成胶束，所形成的颗粒大小为5-30nm。
实施例9.20-60nm范围的纳米缀合物的设计
制备小于60nm的纳米颗粒是一个难题，特别是通过疏水性PLA或 Dtxl-PLA的沉淀制备则更难。然而，可以使用微胶束化将制备的纳米颗 粒的大小精确控制在20-60nm的范围内。PEG与Dtxl-LA的末端羟基相 缀合。可以在聚合缀合之后进行PEG的缀合。或者，可以使用一步反应。 在每一次聚合反应后，末端羟基对于加帽基团例如异氰酸酯都有反应活 性。例如可以使用PEG-异氰酸酯作为加帽试剂，保护药物-PLA缀合物的 末端羟基。通过将PEG-NH2与三光气反应，可以容易地制备PEG-异氰酸 酯。PEG-异氰酸酯与Dtxl-LA-OH的反应速度很快，并定量地生成 Dtxl-LA-尿烷连接物-PEG。在使用SEC柱纯化缀合的聚合物之后，将纯 化的缀合的聚合物用于制备胶束。当使用较高的平均分子量的PEG时， 可以容易地生成具有小颗粒尺寸(20nm-60nm)的胶束。Kataoka20、 Kwon21，22和本发明人23，24深入研究了使用PEG-聚(天冬氨酸)-药物缀合物 形成共聚物胶束。
在具体实例中，将500mg(0.1mmol)的mPEG5k-NH2溶于不停搅拌的 二氯甲烷(10ml)中。向溶液中加入269.8mg(1mmol)的三光气，将反应混 合物在50-60℃回流至少2小时。通过FTIR监测反应，其中异氰酸酯峰 出现在2250cm-1处。通过使用定量的芘甲醇滴定mPEG5k-NCO，以确定 溶液中的mPEG5k-NCO浓度，从而计算产率。在反应进行完全后，蒸发 溶剂并用己烷和冷乙醚洗涤聚合物3次。使用尺寸排阻柱，以THF或乙 腈/己烷作为洗脱液，从产物中分离未反应的mPEG5k-NH2。真空干燥产 物并在氮气气氛的冰箱中储存。
实施例10.以Dtxl-LA缀合物为例，说明纳米颗粒(100-600nm)的双乳 化法设计
使用油-水-油(W/O/W)溶剂蒸发法，制备药物包封的微颗粒。简而言 之，使用探头超声仪(Sonic&Materials Inc，Danbury，CT，USA)，以10W 的功率将50ml水与50mg聚合物缀合物(Dtxl-LA)溶于1ml二氯甲烷的 溶液乳化15-3O秒。然后将所得的乳液倒入50ml的PVA水溶液(1％)或 胆酸钠溶液(1％w/v)中，混匀该混合物1分钟(8000rpm)。在温和搅拌的 条件下，将所得的乳液倒入150ml的PVA水溶液或胆酸钠溶液(0.3％w/v) 中，然后在室温下搅拌2小时以蒸发有机溶剂，或使用旋转蒸发器快速除 去有机溶剂。最后以在6000rpm离心30min以分离纳米颗粒，用蒸馏水 洗涤，并以蒸馏水(6ml)中的乳液形式保存于-15℃。或者，所述纳米颗粒 可被冻干获得粉末。
实施例11.双乳化法制备微颗粒(600nm-100μm)
也可以使用油-水-油(W/O/W)溶剂蒸发法(双乳化法)，制备药物包封 的微颗粒。简而言之，使用探头超声仪(Sonic&Materials Inc，Danbury，CT， USA)，以10W的功率将50ml水与50mg聚合物缀合物(Doxo-LA)溶于1 ml二氯甲烷的溶液乳化15-3O秒。然后将所得的乳液倒入50ml的PVA 水溶液(1％)或胆酸钠溶液(1％w/v)中，混匀该混合物1分钟(速度为 500-8000rpm)。在温和搅拌的条件下，将所得的乳液倒入150ml的PVA 水溶液或胆酸钠溶液(0.3％w/v)中，然后在室温下搅拌2小时以蒸发有机 溶剂，或使用旋转蒸发器快速除去有机溶剂。最后以在6000rpm离心30 min以分离纳米颗粒，用蒸馏水洗涤，并以蒸馏水(6ml)中的乳液形式保 存于-15℃，或者，所述纳米颗粒可被冻干获得粉末。
实施例12.使用赫赛汀(Herceptin)进行表面功能化
将曲妥珠单抗(Trastuzumab，Herceptin)以1mg/ml的浓度溶于磷酸缓 冲液(pH＝8.0)中。将2-硫醇亚胺(5.7mg)溶于5ml磷酸缓冲液(pH 8.0)中。 将2-硫醇亚胺溶液(8.04ml)与1ml曲妥珠单抗溶液在20℃混合6小时。 可以使用Dextran Desalting SEC柱，以磷酸缓冲液作为洗脱液纯化所得 的硫醇化抗体，并在280nm处进行检测。使用Microcon 30000微浓缩器 进一步浓缩抗体。可以使用Ellman试剂测定抗体溶液中的巯基浓度。在 室温下，将250μl抗体溶液与6.25μl的4mg/ml的Ellman试剂溶液(溶于 pH＝8.0的磷酸缓冲液)混合15min，通过UV分光光度计在412nm处进行 检测。相对于L-半胱氨酸标准溶液计算巯基的数量。
在室温下，将MAL-PEG5k-异氰酸酯(其中MAL为马来酰亚胺基团) 与Doxo-PLA缀合8小时，然后使用SEC柱纯化聚合物。将聚合物以 10mg/ml的浓度溶于丙酮，然后在强烈搅拌的条件下将其滴加入水中，使 得丙酮∶水的比例为1/20。然后在室温下，在纳米级纯水中进行抗体的巯 基和聚合物的马来酰亚胺基的偶联反应。反应至少进行12小时。使用SEC 柱检测水相中的未结合的硫醇化抗体。在缀合之后，通过比较相同浓度下 SEC柱测得的反应前后的硫醇化抗体的峰面积来测定反应效率。
还可以使用另一种方法引入硫醇化抗体。PLGA-PEG-MAL(末端带有 马来酰亚胺基团的聚(乳酸-乙醇酸)-聚(乙二醇)共聚物)或PLA-PEG-MAL (末端带有马来酰亚胺基团的聚(乳酸)-聚(乙二醇)共聚物)可以通过商购获 得或通过已知方法制备。首先，将Doxo-LA is溶于丙酮，将所述原料进 行纳米沉淀形成纳米颗粒。然后向所述纳米颗粒中滴加含 PLGA-PEG-MAL或PLA-PEG-MAL的丙酮溶液。使用这种方法可以使 得颗粒分布保持不变。马来酰亚胺和抗体的巯基的进一步缀合按照上文所 述的方法进行。
在缀合后，使用赫赛汀对纳米颗粒进行表面修饰。可以测试抗体的功 能。将所述纳米颗粒与MCF-7和SK-BR-3细胞一起培养3天，然后进行 蛋白质印迹分析。使用表达HER2的SK-BR-3细胞和MCF 7细胞作为阴 性对照。
实施例13：环杷明(CA)NC的制备
CA-LA100纳米缀合物的制备包括两个步骤。第一步是将CA与PLA 聚合物相缀合。简而言之，在手套式操作箱中，将环杷明(4.11mg，0.01 mmol)溶于1.0ml的THF中。将CA与(BDI)MgN(SiMe3)2(6.0mg，0.01 mmol)混合5-15min。然后在强烈搅拌的条件下，向CA和 (BDI)MgN(SiMe3)2的混合物中滴加含DL-丙交酯(144mg，1.0mmol)的1 mL THF溶液。使用FTIR计算丙交酯的转化率。反应进行过夜，获得 CA-LA100聚合物缀合物。第二步为使用该聚合物溶液通过纳米沉淀法直 接制备NP。将含有CA-LA100聚合物的DMF溶液滴加至20倍体积的纳 米级纯水(非溶剂)中。所得的NP悬液可以通过超滤进行纯化(15min，3000 g，Amicon Ultra，10，000NMWL的Ultracel膜，Millipore，Billerica，MA)。
实施例14：环孢菌素(CP)NC的制备
CA-LA100纳米缀合物的制备包括两个步骤。第一步是将CP与PLA 聚合物相缀合。简而言之，在手套式操作箱中，将环孢菌素(12.02mg，0.01 mmol)溶于1.0ml的THF中。将CP与(BDI)MgN(SiMe3)2(6.0mg，0.01 mmol)混合5-15min。然后在强烈搅拌的条件下，向CA和 (BDI)MgN(SiMe3)2的混合物中滴加含DL-丙交酯(144mg，1.0mmol)的1 mL THF溶液。使用FTIR计算丙交酯的转化率。最后，反应进行过夜， 获得CA-LA100聚合物缀合物。第二步为使用该聚合物溶液通过纳米沉淀 法直接制备NP。通常，将含有CA-100聚合物的DMF溶液滴加至20倍 体积的纳米级纯水(非溶剂)中。所得的NP悬液可以通过超滤进行纯化(15 min，3000g，Amicon Ultra，10,000NMWL的Ultracel膜，Millipore， Billerica，MA)。
实施例15：含有两种或多种药物的核心-外壳纳米缀合物(50-200nm 范围)的制备
将D0X0-LA25聚合物(5mg/mL溶于DMF，100μL)滴加至2mL纳米 级纯水中，生成Doxo-LA25NC。然后向Doxo-25NP中滴加 PLGA-mPEG5k(MW＝18,300g/mol，5mg/mL溶于DMF，100μl)或 mPEG5k(5mg/mL溶于DMF，100μl)。所得的NC为具有核心-外壳结构的 NC，其中核心为Doxo-LA25，外壳为PLGA-mPEG5k或mPEG5k。
将PtXl-LA200缀合物(2mg/mL溶于DMF，100μL)滴加至2mL纳米 级纯水中，生成Ptxl-LA2O0 NC。然后在强烈搅拌的条件下，向Ptxl-LA200 NC溶液中顺序加入PLA-PEG3k(MW＝17,500g/mol，2mg/mL溶于 DMF)。所得的NC为具有核心-外壳结构的NC。
使用本文所述的方法制备的药物-聚合物缀合物都可以通过与上述类 似的方法形成类似的具有核心-外壳结构的纳米缀合物。
Dtxl-LA100(核心)/Doxo-LA100(外壳)NC：将溶于DMF的Dtxl-LA100(l0 mg/mL，100μL)滴加至2mL纳米级纯水中，生成纳米颗粒(NC)，然后在 强烈搅拌(3000rpm)的条件下，向所述纳米颗粒溶液中以50μL/min的速 度加入溶于DMF的Doxo-LA100(10mg/mL，100μL)。所得的NC为如图 10A所示的双重药物的核心-外壳结构的NC。在该图中，显示了颗粒的大 小由约80nm变化为约100nm。
Ptxl-LA100/CPT-LA100：将溶于DMF的Ptxl-100(10mg/mL，100μL)滴 加至2mL纳米级纯水中，然后在强烈搅拌(3000rpm)的条件下，向所述 纳米颗粒溶液中以50μL/min的速度加入溶于DMF的CPT-100(10mg/mL， 10OμL)。
使用由本文所述的方法制备的任何药物-聚合物缀合物，都可以通过 上述方法制备含有多种药物的NC。上述方法还可以用于制备核心和外壳 由含有相同药物的不同聚合物缀合物制成的NC，例如Ptxl-LA2O0/Ptxl- LA100，或Ptxl-LA100/Ptxl-LA2O0。在上述方法中，可以根据需要调整聚 合物缀合物的相对量，以获得所需的大小和特性。
图10B显示了在向NC中加入不同聚合物缀合物以形成具有核心-外 壳结构的NC时，NC的颗粒大小的变化。
图10A和10B中的颗粒大小是通过动态光散射法测定的。更具体而 言，使用ZetaPALS动态光散射(DLS)仪(15mW激光器，入射光＝676nm； Brookhaven Instruments，Holtsville，NY)。
实施例16：NC的细胞毒性测试
将PC-3细胞铺于96孔培养板中放置24h(每孔10,000细胞)。在实验 当天，用预热的PBS洗涤细胞，然后加入新鲜制备的NC(在1×PBS中制 备)。对照细胞也在培养基中培养。在5％的CO2气氛下总共培养细胞24 小时。然后，移去培养基并加入MTT溶液和OptiMEM培养基，继续培 养3小时。将所得的晶体溶解，并使用微量滴定板读数仪在655nm处比 色读数，以评估细胞存活率。图7A-D显示了一些细胞毒性研究的结果， 其中的NC是使用Ptxl、Dtxl、CPT和Doxo通过不同的M/I比值制得的， 图中还显示了游离药物的对照。
使用含有多种药物的NC，对人类前列腺癌细胞PC-3细胞培养72小 时并进行了类似的MTT细胞毒性测试。表3列出了通过IC50测量的一系 列NC的相对细胞毒性。
表3：装载有多种药物的NC的MTT细胞毒性

如表3的结果所示，含有两种药物的NC(紫杉醇和环杷明的组合，或 蒽环类抗生素(阿霉素)和环杷明的组合)对前列腺癌细胞表现出协同作用。 不拘囿于任何具体的活性理论，相信紫杉烷和蒽环类抗生素对于癌细胞的 效力能够显著提高环杷明对于Shh的抑制作用。
实施例17：使用荧光素酶测定，评估含有环杷明的NC对于刺猬途径 的抑制
Shh-LIGHT2细胞中稳定整合了Gli-依赖性萤火虫荧光素酶和组成型 海肾荧光素酶报告物，在96孔板中将该细胞培养至汇合，然后用下述药 物处理：(1)各种浓度的含有环杷明的PLA-环杷明NC(例如CA-LA10 NC 或CA-LA25NC)，悬于含0.5％小牛血清的DMEM，并添加或不添加(2) PLA-purmorphamine NE。图11A显示了作为环杷明浓度(mM)的函数的 相对海肾荧光素酶活性。将经过处理的细胞在标准条件下培养36小时， 然后根据生产厂商的说明，使用双荧光素酶试剂盒(Promega)测定萤火虫 荧光素酶和海肾荧光素酶的活性。
实施例18：催化剂对缀合物结构的影响
如实施例1所述，当所述药物或其他化合物带有一个以上的能够在存 在催化剂的条件下引发聚合的官能团时，催化剂的结构或性质可能影响是 哪个官能团参与聚合，以及生长的聚合物连接到所述药物(或其他化合物) 的哪个或哪些位点上。图12显示了使用不同催化剂时，通过本文所述的 方法制备的药物-聚合物缀合物的分子量和多分散性(PDI)。具体而言，该 图显示了使用不同催化剂对于缀合物形成的影响，制备所述缀合物时使用 的LA/Ptxl/催化剂的摩尔比为200/1/1，制备出的Pxtl-LA2O0的预期MW 为29,653。Ptxl本身含有三个能够引发聚合的羟基(2’-OH、1-OH和7-OH)。 然而如前所述，因为在该反应中羟基需要形成金属氧化物，所以由于空间 位阻的关系，认为1-OH不容易参与引发反应。相信在所形成的Pxtl-LA 缀合物中，多分散性的主要原因是由于一部分缀合物中的聚合物与药物分 子上的两个位点相连接。如图所示，通过标准凝胶渗透色谱法测量的 Pxtl-LA200缀合物的实际MW和PDI与所使用的催化剂密切相关。使用具 有大体积配体的Zn催化剂(图12中所示的催化剂4和5)会使得缀合物具 有较低的多分散性。据信这种较低的多分散性是因为聚合物对连接至某一 位点(例如Ptxl的2’-OH位点)具有更高的选择性。
实施例19：使用凝胶渗透色谱法测定药物-聚合物缀合物的MW和 PDI
使用药物作为LA聚合的引发剂，(在存在催化剂的条件下)如前述实 施例所述制备药物-聚合物缀合物。使用公知的凝胶渗透色谱法测量实际 的MW和PDI。
表4：含有Ptxl、CPT、Dtxl、Doxo、CA或CP的纳米缀合物的GPC数 据

上述实施例仅为说明性的，并不意图以任何方式限制本发明的范围。
相关申请的交互引用
本专利申请要求以2007年3月2日提交的美国临时专利申请No. 60/892,834作为优先权基础，该申请的全部内容通过援引的方式纳入本文。
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