大家都知道许多物质诸如肽、多肽如蛋白质及生物缀合物的性 能可通过在其上接枝有机链状分子来增强。这种接枝可提高作为连 接结构基元的多个拷贝的连接体的物质的有效性、提高物质免受免 疫系统影响和提高物质的半衰期。生物传感器表面也可在共价连接 生物分子之前首先在表面(通常为金或玻璃)上接枝有机链状分子来增 强，例如Biacore AB(瑞典)出售的葡聚糖涂覆的传感器。
常用于增强性能的有机链状分子是聚乙二醇基即“PEG基”的 链，即基于重复单元-CH2CH2O-的链。参见例如Tsutsumi等人，Jpn.J. CancerRes.85：9-12(1994)，其中显示单甲氧基聚乙二醇的酯提高人 肿瘤坏死因子α效能。PEG基的链为柔韧、两亲、非免疫原性的并且 不易受蛋白水解酶的剪切。经PEG或PEG基链修饰的物质的制剂已 降低了免疫原性和抗原性。参见例如Abuchowski等人，Journal of Biological Chemistry 252(11)：3578-3581(1977)，其中显示了PEG改 变了牛血清清蛋白的免疫性能。PEG也用于提高其所连接物质的分 子尺寸，由此提高其生物半衰期。这些PEG修饰物质的有益性质使 得其在各种治疗应用中非常有用。
人们已知将PEG链或基于PEG的链接枝到蛋白质上。参见例如 Zalipsky的美国专利5122614号，其描述了被转变成其N-琥珀酰亚 胺碳酸酯衍生物的PEG。已知的还有用反应性基团修饰以便于接枝 到蛋白质上的PEG链。参见例如Harris的美国专利5739208号，其 描述了用砜部分活化而选择性连接到分子和表面的硫醇部分的PEG 衍生物以及参见Harris等人的美国专利5672662号，其公开了具有 单个丙酸或丁酸部分的PEG酸的活性酯。Zalipsky在Bioconjugate Chemistry 6：150-165(1995)中对该领域进行了广泛详尽地综述。除了 使用PEG外，Wright的EP 0605963 A2描述了包含与蛋白质上的醛 基形成腙键的水溶性聚合物的连接试剂。
聚酰胺链也可用作增强性能的有机链状分子。此外，在啮齿动 物中进行的急性毒性筛选也表明聚酰胺既无毒性也无免疫原性(Hai 等人，Bioconj.Chem.9：645-654(1998))。
但是，由于该领域的现有技术现状不能提供具有可测长度的有 机链状分子的合成，也遇到了一些问题。
用于制备PEG或PEG基链[甚至是那些相当低分子量如3400的 链(参见例如Kramer等人，Nature 395：710(1998))]的技术涉及难控制 的聚合步骤，其产生具有一平均值附近的宽范围链长的制剂，即它 们涉及-(CH2CH2O)m-的聚合物制剂，其中m不是一个独立的值而是 一个平均值附近的范围值。这在PEG链本身和已接枝PEG链的化合 物的质谱上看得很明显。例如，在John等人，Chemistry & Biology 4：939 (1997)中，当标示相对分子量3400和5000的PEG链接枝到一种小 肽上时，产生均值±1000的质量范围，即2000amu的范围的产物。 这是现有技术方法的典型结果。当可获得足够的质量分辨时，光谱 图显示出许多相隔44amu的信号。例如，参见Lu等人，Int.J.Peptide  Protein Res.43：127-138(1994)。这种大的质量范围相应于相应的链长 范围。因此，含这种PEG或PEG基链的产物并不均一，其包括具有 短、中和长链的分子。这种情况在具有两个PEG链的化合物情况下 更糟，因为统计上它们必须由具有两个短链、一个短链和一个长链 和两个长链的分子混合物组成，因此在质量上的变化比只具有一个 链的产物更大。因为当这种链用于连接两个部分(如在Johnson等人， Chemistry & Biology，上述)时，链长影响质量、生物半衰期、免于来 自免疫系统的作用和亚基的间隔，具有一个或多个常规PEG链的化 合物的生物作用为所存在的各种物质(具短链、具中链和具长链的物 质)及其相对浓度(因为对于一系列类似的化合物来说生物半衰期是质 量的函数，因此其主要随时间变化)的平均作用。因为PEG非常有用， 所以这种复杂的状况被容忍。
固相肽合成产生充分定义的重复单元“-NH-Y-CO-”的聚酰胺， 但是需要保护衍生物和去保护步骤。重复单元-NH-Y-NH-CO-X-CO-如“-NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)4-CO”的聚酰胺(例如Nylon 66)通过聚 合二酸和二胺来制备。这种合成与涉及二酸和二胺的溶液聚合的更 新的技术一起产生了具有宽范围链长的产物。所得到的这些聚酰胺 的链长非均一性很大程度上归于没有保护基。
从用有机链状分子修饰的物质的许多潜在用途来看，本领域需 要有用于修饰目标大分子或物质如表面的改良链。因此，需要有一 种制备这种聚合物并使其具有可定长度的方法，它通过自动固相合 成而无需保护基。具体地说，需要有精确长度的PEG基链(即含一个 -(CH2CH2O)m-基团的链，其中m为一单值)以及构建这种链的方法。 这样，可克服在目前所用于医药和非医药用途的PEG链中固有的及 可看到的缺陷。本发明提供的精确长度的聚酰胺链和方法满足了这 类需要以及其它需要。
本发明概述
本发明涉及一种新类型的聚合物，含精确数量的重复单体单元( -NH-Y-NH-CO-X-CO-)的聚酰胺基链，其通过无需保护基的自动固相 合成来合成，其中每个步骤中X和Y可独立变化。显示为噬菌体源 结合肽的二聚物、支链结构物和多聚体分子容易与这些精确长度聚 酰胺链装配，这些精确长度聚酰胺链可用于作为分子间隔基取代多 肽和聚乙二醇。
更具体地说，本发明提供了具有精确重复单元数目的精确长度 的水溶性有机聚酰胺基链，它是基于形成精确数目的单体单元的酰 胺键构建的，同时本发明提供了制备这类链的方法。这种链具有式 (III)：
       -{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-式中n为1-100的整数；n’为0或1；X和Y为无反应性官能基的二 价有机基团或者不存在并相同或不同，并且对于每个所述重复单元 可各不相同；Y’为无反应性官能基的二价有机基团或者不存在。
更具体地说，本发明提供了基于精确数目的重复聚乙二醇基单 元的精确长度的聚乙二醇基链以及制备这种链的方法。
本质上，本发明并不增加含-(CH2CH2O)m-基团链中的m(这将随 m变大并取范围值而不是独立值导致非均一性)，而是通过酰胺键连 接一系列含-(CH2CH2O)p-基团的单体单元，其中p为足够小的单体单 元数目值从而使p为单一值而非范围值。
本发明的另一方面提供了在温和条件下用一个或多个精确长度 的聚酰胺链修饰大分子(如蛋白质、肽、核酸、脂质体)或物质如表面 的方法和化合物。
在本发明的另一方面，其中n’为1的式(III)的链通过下面步骤合 成：(a)用摩尔过量的试剂L-CO-L’(其中L和L’为离去基团并且相 同或不同)酰化式Z-Q载体化合物的氨基或羟基，其中Z为H2N-或 HO-；Q为连接基(可以为氨基酸残基)或目标分子；所述载体为一固 相、基体或表面；(b)用摩尔过量的式NH2-Y’-NH2的二胺氨解步骤(a) 的产物；(c)用摩尔过量的式HOOC-X-COOH的二酸衍生物酰化步 骤(b)的产物；(d)活化步骤(c)产物的游离羧基；(e)用摩尔过量的式 NH2-Y-NH2的二胺氨解步骤(d)的产物；和(f)任选使用式 HOOC-X-COOH的二酸衍生物和式NH2-Y-NH2的二胺重复步骤(c)-(e)，其中所 述X和Y取代基和在任何前面氨解和酰化步骤中所用的X和Y取代 基相同或不同。
在本发明的另一方面，n’为0的式(III)的链通过下面步骤合成： (a)用摩尔过量的式HOOC-X-COOH的二酸衍生物酰化式Z-Q载体 化合物的氨基或羟基，其中Z为H2N-或HO-；Q为连接基或目标分 子；所述载体为一固相、基体或表面；(b)活化步骤(a)产物的游离羧 基；(c)用摩尔过量的式NH2-Y-NH2的二胺氨解步骤(b)的产物；和(d) 任选使用式HOOC-X-COOH和NH2-Y-NH2重复步骤(a)-(c)，其中所 述X和Y取代基和在任何前面酰化和氨解步骤中所用的X和Y取代 基相同或不同。
本发明的另一方面为具有精确重复单元数目的水溶性有机聚酰 胺基组成，所述组成具有式(IV)：
[U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’]q-V式中n为1-100的整数；n’为0或1；q为一个1到10的整数；X和 Y为无反应性官能基的二价有机基团或者不存在并相同或不同，并 且对于每个所述重复单元可各不相同；Y’为无反应性官能基的二价 有机基团或者不存在；V选自：其性质有待修饰或增强并且具有任 选的二价间隔基或连接基的一价或多价目标分子；具有多价连接基 的报道基团；反应性基团；和具有多价连接基的端基，所述端基选 自-OH、-NH2、-H和-Z-Q-载体，其Z为二价间隔基诸如-NH-、-O-或不存在，Q为连接基或目标分子，所述载体为固相、基体或表面； U选自：其性质有待修饰或增强并且具有任选的二价间隔基或连接 基的目标分子；端基；肽链；保护基；载体和反应性基团。
本发明的又一方面是具有精确重复单元数目的水溶性有机聚酰 胺基均一组成，所述组成具有式(IV)：
[U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’]q-V式中n为1-100的整数；n’为0或1；q为一个1到10的整数；X和 Y为无反应性官能基的二价有机基团或者不存在并相同或不同，并 且对于每个所述重复单元可各不相同；Y’为无反应性官能基的二价 有机基团或者不存在；V选自：为少于50个氨基酸残基的肽并且具 有任选的二价间隔基或连接基的目标分子；具有多价连接基的报道 基团；反应性基团；和具有多价连接基的端基，所述端基选自-OH、 -NH2、-H和-Z-Q-载体，其Z为二价间隔基诸如-NH-、-O-或不存在， Q为连接基或目标分子，所述载体为固相、基体或表面；U选自：为 少于50个氨基酸残基的肽并且具有任选的二价间隔基或连接基的目 标分子；端基；肽链；保护基；载体和反应性基团；其中U或V的 至少一个是目标分子。
本发明的再一方面提供合适用于合成水溶性有机聚酰胺基链的 试剂的试剂盒和含有这种试剂或其性质有待修饰或增强并且具有任 选的二价间隔基或连接基的这种链和目标分子的试剂盒。
具体实施方案的说明
在生物化学和医学中，需要生物相容的分子链在其末端显示出 结合模量(参见例如Kramer等人的上述文献；Peters等人，Science 282：1439(1998)；Johnson等人在上述Chemistry & Biology中的文章和 Terskikh等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：1663-1668(1997))，有时 为了其它目的也是如此(Zalipsky，Bioconjugate Chemistry，上述)。理 想情况下，这些链应具有规定的结构，即具有规定的长度，而不是 不同长度链的混合物。多肽链提供了一种可能性，但主要是易受水 解蛋白剪切并可能证明是免疫原性的。聚乙二醇(“PEG”)提供了另一 种可能性。
本发明提供了一种制备结合了多肽(精确长度，便于合成)和 PEG(柔韧、两亲、非免疫原性、对蛋白酶不敏感)两者优点的新类型 的生物适合的聚合物的方法并由此可用于代替合成和半合成结构的 常规多肽或PEG分子间隔基。
通过本发明方法，人们不再局限于极少的商品PEG连接基的标 准长度，长度可非常接近地微调。本方法也方便地使用商品物质， 易于自动化，并消除了保护和去保护步骤。此外，正如期望的PEG 基分子那样，本发明方法生产的聚酰胺完全溶于水和有机溶剂如二 甲基甲酰胺，但不溶于乙醚。
本发明进一步提供了一种基于精确数目重复单体单元的酰胺键 形成构建的精确长度的水溶性有机聚合物基链以及制备这种链的方 法。众多有机前体可用于本发明的链。为了说明而非限定，本发明 可由含-CH2CH2O-单元的参考单体来说明，其得到的产物称为聚乙二 醇基(“PEG-基)链。但是，应理解此处所谓的“PEG-基”链意欲指 任何“水溶性聚合物基”链或“水溶性有机”链。此外，由于所述 连接基或链通过形成酰胺键来构建，所以应理解本发明的水溶性聚 合物基链也可适当地称为“水溶性有机聚酰胺基”链。术语“连接 基”和“链”可替换使用，因为本发明的链可用于将目标连接在一 起和连接到单个目标上。
因此，本发明提供了以精确数目的单体单元为基础的精确长度 的水溶性有机聚酰胺基链。非常短的精确长度的化学链被用于构建(优 选在固相上)这些精确长度的水溶性有机聚酰胺基链。具体地说，本 发明使用精确长度的非常短的链来构建精确长度的PEG基链。这种 短链易于通过本领域技术人员已知的方法合成。此外，这些非常短 的链的一些可通过商业渠道获得并且如Wilbur等人在Bioconjugate Chemistry 8：572-584(1997)中所述已经用于短PEG连接基的溶液合 成。
本发明也涉及通过共价连接此处所述的精确长度的聚酰胺基链 化学修饰目标分子和表面(如金或玻璃)的方法。这些链具体可用于增 强目标分子的性能，用于将另外的分子(诸如荧光团、金属螯合剂或 其它报道基团、或药物分子)结合到目标分子上，或将几个较小的目 标分子连接在一起而形成具有增强的性能的较大分子(二聚物、三聚 物、四聚物和更高级的低聚物)。本发明也尝试使用所述水溶性有机 聚酰胺基链修饰用于生物传感器和其它用途的表面诸如金或玻璃或 塑料。
术语“目标分子”是指其性能有待通过连接此中所述精确长度 的水溶性有机聚酰胺基链改进或增强的一价或多价目标分子，特别 是大分子。这种目标分子可以是分子量至少为100并高至10000或 10000以上的有机分子(包括生物源的分子以及具有无机组分的有机 分子)。一般这种有机分子具有至少1000的分子量，更常具有约 1000-2000的分子量。通常所述目标分子是生物学上重要的蛋白质、 多肽、肽、氨基酸、核酸、脂质体或治疗剂。目标分子的例子(用于 说明而非限定)包括血浆蛋白质诸如血纤蛋白原、免疫球蛋白或其片 断、激素诸如胰岛素、细胞因子诸如肿瘤坏死因子和酶诸如组织纤 溶酶原激活物。所述目标分子可衍生自天然或重组来源或可以是合 成物诸如荧光团、金属螯合剂或其它报道基团。当所述目标分子是 多价时，它可与几个本发明的链相连。为了容许目标分子的进一步 增强或修饰，目标分子可在其和所述链之间具有多价连接基。
在本发明的另一实施方案中，用LiAlH4或乙硼烷还原聚酰胺链 提供了一种新类型的多胺，它可以具有哌嗪的有用性质(参见例如 Ferrari等人，Gene Ther.4：1100-1106(1997))同时也可对结构(线性、长 度、疏水性、电荷间距)进行总的控制。
一般，本发明方法是三步固相法，涉及商业可得的二胺(或衍生 物)，如下式(I)所示的短二胺单体：
            NH2-Y-NH2和商业可得的此中称为“二酸衍生物”的可酰化的活化形式(诸如环 酐)的二酸，如下面的式(II)所示的短二酸单体：
            HOOC-X-COOH。
所述X和Y取代基独立地选自无反应性官能基的二价有机基团 或不存在。X和Y可相同或不同。适用的二价有机基团是非反应性 基团诸如取代或未取代、分支或线性、脂族或芳族基团诸如苯基或 C1-C10亚烷基部分、C1-C10烷基基团或其组合，并可任选含有一个或 多个杂原子。示例性的二价有机基团包括(用于说明而非限定)烷基基 团诸如-(CH2)2-和-(CH2)6-；含杂原子的烷基基团诸如 -(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-、-[(CH2)3-O-(CH2)2-(CH2)2-O-(CH2)3-]-、-CH2-O-CH2-和-CH2-N(CH3)-CH2-等。
此中所用的术语“反应性官能基”是指(用于说明而非限定)任何 游离氨基、羧基、硫羟、烷基卤、羟基或醛基。重要的是所述短单 体原料没有任何干扰后文详细描述的本发明的酰化、活化和氨解步 骤的官能度。但是，如果反应性官能基受保护而达到非反应性，那 么这种反应性官能基可存在于X或Y上，例如可存在受保护的氨基。 例如，X和Y取代基可含有受叔丁氧基羰基(Boc)保护的氨基。但是， 应注意的是9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)并不十分适合作为在X或Y中 氨基的保护基，因为它不耐受氨解条件。
优选式(I)和(II)的单体为对称的，所以也优选X和Y取代基为对 称的，否则端基(氨基或羧基)会不同，从而导致非均一性。例如琥珀 酸(以其酸酐形式，其中X取代基为基团-CH2CH2-)是对称的，在酰化 中只会形成一种酰胺产物HOOCCH2CH2CO-NH-，因此是一种适合的 二酸。甲基琥珀酸酐能形成两种产物HOOCCH(Me)CH2CO-NH-和 HOOCCH2CH(Me)CO-NH-，因此是不那么适合的酸。
优选所述式(I)或(II)的短单体为水溶性聚合物基单体，从而使X、 Y或两者取代基为含约1到5个聚合物基团的精确长度的二价有机 基团。在一个优选实施方案中，X或Y或两者为含约1到5个 PEG(-CH2CH2O-)基团的二价有机基团。对称可通过审慎地选择例如 在-CH2CH2CH2(OCH2CH2)pCH2-中的末端基团来保持，其中对于给定 的式(I)或(II)的化合物来说p为1到5的整数但取一独立的值。许多 其它基团适合用于本发明中代替PEG基团。它们包括(用于说明而非 限定)亚甲基、丙二醇和其低聚物(即(-CH2CH2CH2O-)p)、-CH2CH2O-和-CH2CH2CH2O-基团的限定共聚物、四氢呋喃的限定低聚物和乙烯 基吡咯烷酮的限定低聚物。
最有用的一种精确长度的短PEG基对称二胺是4，7，10-三氧杂- 1，13-十三烷二胺(Fluka Chemicals，Buchs，Switzerland)：
               NH2-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH24，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺是式(I)的二胺单体，式中Y包含三个 聚乙二醇基团(-OCH2CH2-)并且具有对称式：
-(CH2CH2CH2-O-CH2CH2)-O-(CH2CH2-O-CH2CH2CH2)-。
这种物质的一个合乎需要的特性是其如上所示的那样提供有三 个PEG基团并且基本上免除了具有一、二、四或甚至五个PEG基团 的同系化合物。这可作为当单体单元被说成“精确长度”时所需情 况的例子。由这种物质制备的聚酰胺也是精确长度的，只要其以非 连续步骤制备并且并非通过不受控制的与二酸的聚合而不象常规方 法那样进行。其被称为PEG-基链或连接基，甚至PEG单元(-OCH2CH2-) 处处被酰胺键或其它基团间断。
类似于4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺但具有一个、两个、四个 或甚至五个PEG基团的单体单元也可易于通过本领域人员已知的方 法合成。这种单体基本上消除了具有不同数目PEG基团的均匀化合 物。
也可用于本发明中的精确长度的一种非PEG基二胺是下式的 4，9-二氧杂-1，12-十二烷二胺：
              NH2-(CH2)3-O(CH2)4-O-(CH2)3-NH2其由Johnson等人描述于Bioconjugate Chemistry 8：447-452(1997)。 这里，Y具有对称式：
          -[(CH2)3-O-(CH2)2]-[(CH2)2-O-(CH2)3]-。
该文章例举了二酸组分的活性形式诸如HOOC-CH2OCH2-COOH和HOOC-CH2N(CH3)CH2-COOH的酸酐。
可用于本发明方法中的另一种非PEG基二胺是1，6-二氨基己 烷，NH2-(CH2)6-NH2(“DAH”)。此外，有许多商业可得的二酸和二胺， 其广泛详细地描述于通过引用并入本文的上述Hai等人的文章中。正 如下面将描述的，可以通过选择每一步适合的二酸和二胺能够调节 因子诸如沿所述链长方向的疏水性(这里使用二胺如1，6-二氨基己烷 说明)、向链末端加入反应性基团如成肟基团和通过肽合成标准技术 延长链。
优选的式(II)的二酸包括(用于说明而非限定)HOOC-CH2CH2-COOH。
通常，本发明方法是三步固相方法，涉及式(I)的二胺和二酸的 衍生物，所述二酸具有式(II)，这里显示的为含氨基树脂(NH2-树脂) 的情况。这种方法并不需要使用保护基。步骤1是一酰化步骤，它 使用一种二酸的衍生物：
        HOOC-X-COOH+NH2-树脂→HOOC-X-CONH-树脂
步骤2是一活化步骤，其使用例如羰基二咪唑：
HOOC-X-CONH-树脂+羰基二咪唑→咪唑基-CO-X-CO-NH-树脂
最终，步骤3是一氨解步骤，其使用一种二胺：
NH2-Y-NH2+咪唑基-CO-X-CO-NH-树脂→NH2-Y-NH-CO-X- CO-NH-树脂
在本发明的优选方法中，存在X和Y的至少一个，并更优选两 个都存在。但是，本发明并不打算使用X、Y或两者都不存在的式(I) 和(II)的化合物。一种特殊情况是-CO-代替-CO-X-CO-的二酸碳酸的 情况，重复单元变成-NH-Y-NH-CO-，然后产物应更准确地称为聚脲， 其为一种类型的聚酰胺。在这种特殊的情况下，使用为二活性碳酸 简便(convenient)形式的羰基二咪唑将酰化步骤和活化步骤合并成一 个步骤：
     羰基二咪唑+NH2-树脂→咪唑基-CO-NH-树脂
所述咪唑基-CO-NH-树脂然后可直接使用一种二胺进行氨解：
NH2-Y-NH2+咪唑基-CO-NH-树脂→NH2-Y-NH-CO-NH-树脂
如上所示，式(I)和(II)的单体单元被用于构建精确长度(即具有精 确数目的重复单体单元-NH-Y-NH-CO-X-CO-)的链。在本发明的一个 方面，每轮这种合成使用相同的式(I)的二胺NH2-Y-NH2和相同的式(II) 的二酸HOOC-X-COOH。因此，在本发明的一个方面，式(I)和(II)的 单体单元被用于构建具有精确数目的重复单元的水溶性有机聚酰胺 基链，所述链具有式(III)：-(NH-Y-NH-CO-X-CO)n-(NH-Y’-NH)n’-， 其中n为1-100的整数；n’为0或1；X和Y为无反应性官能基的二 价有机基团或不存在并且可相同或不同，并且对于各所述重复单元 而言可各不相同；Y’为无反应性官能基的二价有机基团或不存在。
需要着重指出的是如果需要，则X取代基、Y取代基或两者可 在合成的每个步骤中各不相同，并且无需到处一样。在所述连接基 的合成中，X和/或Y不同具有几个原因，最重要的一个原因是调节 沿连接基长度方向的疏水性的能力，包括使连接基的一部分如一端 比其它部分更亲水或疏水。这易于通过在链合成的其后循环过程中 使用一个或多个不同的式(I)的二胺NH2-Y-NH2和/或一个或多个不同 的式(II)的二酸HOOC-X-COOH来达到，即在每个酰化和氨解步骤中 可独立地选择X和Y取代基。
在另一个优选的实施方案中，X和Y取代基中至少一个包含约 1到5个-CH2CH2O-基团。这通过将式(I)或(II)或两者作为PEG基单 体来达到。这样X可具有式-a-(CH2CH2O)p-b-和/或Y可具有式 -a’-(CH2CH2O)p’-b’-，其中a、a’、b和b’为无反应性官能基的二价有机 基团或不存在并且可相同或不同。优选a、a’、b和b’取代基从而如 上所述保持单体单元的对称。整数p和p’为约1到5，但可为0。一 种优选的本发明的聚酰胺基连接基具有下式(III)的一种变体：
  -{NH-Y-NH-CO-a-(CH2CH2O)p-b-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-，
  -{NH-a’-(CH2CH2O)p’-b’-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-或 -{NH-a’-(CH2CH2O)p’-b’-NH-CO-a-(CH2CH2O)p-b-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-这里a、a’、b、b’、p和p’和上面的定义相同。或者，如果所述聚酰 胺基连接基被用于非药用目的，那么p和p’可以为0。需要着重指出 的是对于所述连接基每个合成步骤中的二酸组分和二胺组分而言，a、 a’、b、b’、p和p’均独立地变化，正如上述式(III)的情况。这样式 -a-(CH2CH2O)p-b-的X和式-a’-(CH2CH2O)p’-b’-的Y在沿本发明的连接基 的长度方向可显示出多种组合。导入这种变化的一个原因是使得沿 连接基长度方向的疏水性和亲水性变化，另一个原因可能是例如用 为-CH2N(CH3)CH2-的X导入带电基团。
下面精确长度链说明本发明，并不以任何方式构成对本发明的 限定。一个特别优选的本发明的链是式(III)的PEG基链，式中Y为 -a’-(CH2CH2O)p’-b’-，其a’为-CH2-、b’为-(CH2)3-，并且p’为3，n’为0 并且X为-(CH2)2-：
  -{NH-CH2-(CH2CH2O)3-(CH2)3-NH-CO-(CH2)2-CO}n-其也可写成：
  -{NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-CO-(CH2)2-CO}3-
该链也可称为-(‘PEG’-succ)n-链，其中‘PEG’代表式 -NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-，succ代表式-CO-(CH2)2-CO-。这种链的例子 包括-(‘PEG’-succ)3-和-(‘PEG’-succ)8-。
所述-(‘PEG’-succ)n-链也是那些在每个重复单体单元中X和Y取 代基保持相同的本发明的链的示例。其它这种链包括例如-(‘PEG’- succ)n-‘PEG’-诸如(‘PEG’-succ)16-‘PEG’-和-(‘DAH’-succ)n-，其中‘DAH’ 代表式-NH-(CH2)6-NH-。
在重复单体单元中X和Y取代基不同的本发明的链的例子包括 例如-(‘DAH’-succ-‘PEG’-succ)n-和-(‘DAH’-succ-‘PEG’-succ)z-‘DAH’- succ-‘PEG’-，其中z为1-49的整数。尽管在这些实例中使用的有两 个Y取代基，但是应理解可在本发明的链中使用两个以上的不同Y 取代基。此外，在这些实例中X保持相同；但是应理解X也可正如 所述Y取代基一样变化。
式(III)的聚酰胺链可容易地作为一个中心重复单元 -(NH-Y-NH-CO-X-CO)-并入到水溶性有机聚酰胺基成分或物质即“产物”中。因 此，在本发明的一个实施方案中，单个V或U取代基(如下定义)可 通过连接一个或多个本发明的链修饰或增强。这种具有精确重复单 元数目的水溶性有机聚酰胺基组成具有式(IV)：
[U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’]q-V这里：n为1-100的整数；n’为0或1；q为1-10的整数；X和Y为 无反应性官能基的二价有机基团或不存在并可相同或不同，并可随 每个所述重复单元独立地变化；Y’为无反应性官能基的二价有机基 团或不存在；V选自其性能有待修饰或增强并且具有一任选的二价 间隔基或连接基的一价或多价目标分子；具有多价连接基的报道基 团；反应性基团；和具有多价连接基的端基，所述端基选自-OH、-NH2、 -H和-Z-Q-载体，这里Z为二价间隔基诸如-NH-、-O-或可不存在，Q 为连接基或目标分子，并且所述载体是一固相、基体或表面；U选 自其性能有待修饰或增强并且具有一任选的二价间隔基或连接基的 目标分子；端基；肽链、保护基团、载体、和反应基团；正如上面 所述，X和Y取代基可在所述链的合成中改变。
在其最简单的形式即q为1的情况下，式(IV)的组成包括通过本 发明的链连接的U和V基团：U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-V。
应理解本发明描述了链及其合成方法，而基团U和V只以实例 的形式描述，其并不构成对本发明的限定。V可为一价或多价目标 分子，其性能有待修饰或增强并且具有一任选的二价间隔基或连接 基诸如肟连接基。V也可以是报道基团诸如具有多价连接基的荧光 团或金属螯合剂。此中所用的术语“多价”意欲指大于一的价位， 并包括术语“二价”。
V还可以是一个诸如为本领域人们熟悉的反应基，例如适合于 聚合物的交联或生物分子的缀合的反应基。其例子包括(用于说明而 非限定)溴乙酰基、氨酰基诸如酪氨酰基或丝氨酰基、氨基氧基乙酰 基、乙醛酰基、巯基乙酰基、巯基丙酰基。此外，Bioconjugate Techniques， Hermanson，G.T.，Academic Press，San Diego，1996中描述了许多可用 于生物分子缀合的基团。
V也可以是具有多价连接基的端基，所述端基选自-OH、-NH2、 -H和-Z-Q载体，这里Z为二价间隔基诸如-NH-、-O-或可不存在，Q 为连接基或目标分子，并且所述载体是一固相、基体或表面诸如(用 于说明而非限定)天然树脂和合成树脂；细胞和膜；硅集成电路片； 传感器集成电路片；金、玻璃、塑料和其它生物传感器表面；和组 织培养平板。
适合的作为“Q”取代基或连接到目标分子的间隔基/连接基的 二价有机基团的例子包括(用于说明而非限定)Sasrin连接基 -CH2(C6H3(OCH3))-O-CH2-、-C(O)O-CH2(C6H3(OCH3))-O-CH2-、氨基 氧乙酰基(NH2OCH2CO-)连接基、-COCH2ON＝CH-CO、 -CH＝NOCH2CO-等。
正如上面所指出的，Q取代基可以为目标分子。一般，当目标 分子为使用为人们熟知的固相技术合成的肽并且构成用于所述连接 基合成的Z-Q载体试剂的一部分时可以是这种情况。端基可含有通 过与目标分子结合的反应基(诸如烷基硫醇)。这种反应基受到保护(或 通过构建PEG基连接基后的正交保护/去保护策略连接)。正交保护 策略为本领域人员所熟悉。参见Methods in Enzymology第289卷。 在一优选的实施方案中，V为其性质有待通过本发明的连接基修饰 或增强的一价或多价目标分子，例如大分子或固相或基体。
U选自：其性质有待修饰或增强并具有任选的二价间隔基或连 接基诸如肟连接基的目标分子；选自H-、HC(O)CO-、NH2OCH2CO-和脂族酰基的端基；肽链，包括单肽链或多肽链；保护基诸如Boc 或Fmoc；载体诸如一固相或基体；和如上所述的反应基。
在一优选的实施方案中，至少一个U或V是其性质有待通过与 精确长度的聚酰胺基连接基连接来修饰或增强的目标分子。这种如 上定义的“目标分子”是有机分子，优选为生物学上重要的蛋白质、 多肽、肽、核酸、脂质体或治疗剂。在另一优选的实施方案中，至 少一个U或V是为少于50个氨基酸残基的肽并且具有一任选的二价 间隔基或连接基的目标分子。
下面的组成用于本发明的说明，但并不以任何方式构成对本发 明的限定。示例性的式(IV)的组成包括：
H-(‘PEG’-succ)n-‘PEG’-H，其U和V为氢端基并且n为例如7；
H-Ser-(“PEG’-succ)n-‘PEG’-Ser-H，其U和V为氨基酸并且n为 例如16；
(肽)-肟-(‘PEG’-succ)n-‘PEG’-肟-(肽)，其中U和V为具有肟连接 基的肽，例如具有-COCH2ON＝CH-CO-连接基的红细胞生成素模拟肽 (“EMP”)，诸如
     酰胺-GRLPQCVWTMPGNHCAYLGG-
-COCH2ON＝CHC(O)-(‘PEG’-succ)n-‘PEG’-C(O)CH＝NOCH2CO-
-GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-酰胺(SEQ ID NO：1)， 并且n为例如12或16；
H-(‘PEG’-succ)n-Leu-PAM树脂，式中U为H，并且V为-Z-Q 载体，这里Z不存在，Q为一氨基酸残基(Leu)，载体为PAM树脂；
H-Tyr-(‘PEG’-succ)n3-Leu-OH，式中U为氨基酰基基团(Tyr-)，V 为一个氨基酸残基(Leu)，n为例如3；
肽-Lys(NH2OCH2CO-(‘PEG’-succ)n)-NH2，式中U为氨基氧乙酰 基基团(NH2OCH2CO-)，V为具有一连接基-Lys酰胺的目标肽分子， 例如H-Ser-Val-Trp-Arg-Trp-Leu-Pro-Tyr-Asp-Lys-Iyr-Glu-Lys (NH2OCH2CO-(‘PEG’-succ)8)-NH2(SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：3加上 作为部分连接基的赖氨酸)，n为例如8；
H-Ser-(‘PEG’-succ)n-Abu-OH，式中U为氨酰基基团(Ser-)，V为 目标分子氨基丁酸，n为例如8；
H-(‘DAH’-succ-‘PEG’-succ)n-‘DAH’-succ-‘PEG’-H，其中U和V 均为氢端基，n为例如3；
肽-(‘PEG’-succ)n-Lys(AoA)-酰胺(SEQ ID NO：6)，式中AoA为 氨基氧乙酰基，并且n为例如8。目标肽分子可以为例如- ADGACRNPWC-(SEQ ID NO：6)；和
正如上面所述，本发明的链可用于修饰各种目标肽，特别是少 于50个氨基酸残基并具有适合的端基如(用于说明而非限定)- GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-(SEQ ID NO：1)；- SVWRWLPYDKYE-(SEQ ID NO：3)；和-ADGACRNPWC-(SEQ ID NO：6)的肽，从而提供均匀组成。
本发明组成也可利用几个链来形成分支结构。例如一种示例性 组成是式(IV)的支化组成，其中U为氨基酰基(Ser-)，V为多价目标 分子Lys2Lys-NHCH2CH2SH。赖氨酸“树”首先被合成，其具有四 个游离氨基。四次循环产生四个式H-Ser-(‘PEG’-succ)4-的连接基，每 个连接基连接到四个游离氨基中的一个上：(H-Ser-(‘PEG’- succ)4)4Lys2Lys-NHCH2CH2SH。
分支组成的另一例子是式(IV)的均匀分支组成(其U为具有肟连 接基的肽，V为一种氨基酸(Lys))：(肽)-肟-(‘PEG’-succ)n-Lys((肽)-肟- (‘PEG’-succ)n)酰胺，这里一种示例性的肽为- GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-(SEQ ID NO：1)并且n为例如2。
分支组成的再一个例子为式[肽-(‘PEG’-succ)n-Lys(肟)酰 胺]qLys2Lys-NHCH2CH2S-CH2C(O)NH-报道基团的均匀分支组成，式 中U为目标肽，V为具有多价连接基-Lys(AoA)酰胺-Lys2Lys- NHCH2CH2S-CH2C(O)NH-的报道基团，例如[肽-(‘PEG’-succ)8-Lys(肟) 酰胺]4Lys2Lys-NHCH2CH2S-CH2C(O)NH-荧光素，其中存在四个目标 肽分子的拷贝，例如-ADGACRNPWC-(SEQ ID NO：6)。
式(III)的聚酰胺精确长度链(其中n’为0)易于通过涉及酰化步 骤、活化步骤和氨解步骤的如方案I-A所示的三步合成法容易地合 成。固相合成的标准技术(Fieds，ed.，Solid phase peptide synthesis，Meth. Enzymol.289)可与适当编程的ABI 430A仪器或自制的设备一起使 用。所述反应也可相当容易地手工完成，尽管比较费时费事。在所 述二酸碳酸的特定情况下，酰化和活化步骤如上所述的那样一起进 行。
在本发明的一个实施方案中，具有精确数目重复单元并具有式 (III)的水溶性有机聚酰胺基链(其中n’为1)：
          -{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}-(式中：n为1-100的整数；X和Y为无反应官能基的二价有机基团 或不存在并且相同或不同，并且对于各所述重复单元可各不相同；Y’ 为无反应官能基的二价有机基团或不存在)通过包括下面的步骤的方 法合成：(a)用摩尔过量的试剂L-CO-L’(这里L和L’为离去基团并 且可相同或不同)酰化式Z-Q-载体化合物(这里Z为H2N-或HO-；Q 为连接基或目标分子；载体为固相、基体或表面)的氨基或羟基；(b)用 摩尔过量的具有式NH2-Y’-NH2的二胺氨解步骤(a)的产物；(c)用摩 尔过量的具有式HOOC-X-COOH的二酸衍生物酰化步骤(b)的产物； (d)活化步骤(c)的产物的游离羧基；(e)用摩尔过量的具有式 NH2-Y-NH2的二胺氨解步骤(d)的产物；和(f)任选使用具有式 HOOC-X-COOH的二酸衍生物和具有式NH2-Y-NH2的二胺重复步骤(c)-(e)，其 中所述X和Y取代基可与用于任何所述前面氨解和酰化步骤的X和 Y取代基相同或不同。
该方法包括裂解例如在一试剂盒中用一适合载体包装的与所述 载体结合的连接基以便随后连接到目标分子上。但是，所述方法也 包括Q为含可裂解部分的连接基或通过含可裂解部分的连接基结合 到载体上的目标分子，并且所述方法还包括裂解可裂解部分而从载 体释放精确长度的水溶性有机聚酰胺基链的步骤。
此中所用术语“可裂解部分”是指能被选择性裂解而从固相释 放聚酰胺基连接基或目标分子的部分。可裂解部分必须能在适于本 发明的酰化、活化和氨解步骤的条件下抗裂解。这种可裂解部分为 本领域技术人员所熟悉。
任选的重复步骤可利用X和Y取代基没有变化的二酸和二胺， 从而产生相同重复单元的链诸如：… -{NH-Y1-NH-CO-X1-CO}-{NH-Y1-NH-CO-X1-CO}-{NH-Y1-NH-CO-X1-CO}-…。但是，分别使用其 Y或X取代基与前面氨解或酰化步骤所用不同的至少一种二酸或至 少一种二胺将提供重复单元不同的链，诸如：
    …-{NH-Y1-NH-CO-X1-CO}-{NH-Y1-NH-CO-X2-CO}-
    -{NH-Y2-NH-CO-X2-CO}-{NH-Y2-NH-CO-X3-CO}-…
本发明的一种优选方法如下面的方案I-A所示。
方案I-A
酰化步骤
使用适合于固相肽合成的树脂，例如Z-Q-载体，这里Z为NH2-或HO-并且Q和上面Q的定义相同，但一般是一个二价有机基团。 活化形式的式(II)的二酸衍生物HOOC-X-COOH被用于酰化连接到所 述载体上的氨基(或羟基)。其中X为-CH2CH2-的式(II)二酸琥珀酸 HOOC-CH2-CH2-COOH的环酐特别适用于所述的酰化步骤。在使用 环酐的情况下：
   NH2-Q-载体+环酐→HOOC-X-CO-NH-Q-载体 或
   HO-Q-载体+环酐→HOOC-X-CO-O-Q-载体 在本发明的一种典型的酰化步骤中，树脂首先在一适合的溶剂中溶 胀，然后通过在室温下涡动混合用过量活化形式的二酸(其溶解于适 合的溶剂中)酰化。按照本领域技术人员熟知的肽合成技术(Methods in Enzymology 289卷)，通常加入一种碱诸如N，N-二-异丙基乙胺(“DIEA”) 或4-二甲基氨基吡啶(“DMAP”)和添加剂诸如N-羟基苯并三唑 (“HOBT”)帮助酰化。当酰化羟基树脂(例如来自瑞士Bachem的Sasrin 树脂)时，优选存在DMAP并且酰化重复第二次而使酰化完全。当酰 化氨基树脂(NH2-Q-载体)时，建议在进行活化步骤前进行Kaiser试验 (Kaiser等人，Analyt.Biochem.84：595(1970)或Methods in Enzymology 289卷54页)来证实酰化完成。使用过量酰化试剂以便促使反应完全， 否则会与固相肽合成的情况那样会使缺乏大量重复单元的链在几次 循环后积累。
例如，将氨基树脂如Boc-Leu-Pam树脂(0.5g，约0.3mmol)在二 甲基甲酰胺(“DMF”)中溶胀、去保护而形成H-Leu-Pam树脂。然后通 过在室温下涡动混合10到30分钟用4毫摩尔琥珀酸酐(“SA”)酰化树 脂。将SA溶解于8毫升DMF(Burdick and Jackson高纯级)中，其为 0.5M的HOBT溶液，并往其中加入400微升DIEA。排出并用DMF 洗涤树脂后，进行Kaiser茚三酮试验以检验酰化是否完成。如果没 有完成，则重复酰化步骤。
如果使用裸树脂(例如Sasrin，Bachem)，则可使用O.5M DMAP 代替HOBT，偶联时间约为30分钟(使用氨基树脂时为10分钟)并将 偶联步骤重复一次。
活化步骤
活化步骤涉及游离羧基的活化，即没有连接到链上的羧基的活 化。当在酰化步骤中使用环酐时这种活化步骤是必需的，因为没有 连接到链上的羧基是游离羧基(在方案II讨论的酰化步骤中使用双活 化二酸的情况下)。活化的结果是往游离羧基上连接一个离去基团：
HOOC-X-CO-NH-Q-载体+试剂→L-CO-X-CO-NH-Q-载体 或
HOOC-X-CO-O-Q-载体+试剂→L-CO-X-CO-O-Q-载体 用于这种活化步骤的试剂是本领域人员所熟悉的(Methods in Enzymology 289卷并在此中作为参考)将一个离去基团“L”连接到 游离羧基上的试剂。优选使用过量的活化剂来使基本上所有羧基都 被活化并因此避免缺乏大量重复单元的链的累积。适合的试剂是那 些可过量使用而没有副反应的试剂，其包括碳酰二咪唑(“CDI”，其产 生混合的酐咪唑基-CO-O-CO-X-等或酰基咪唑咪唑基-CO-X-等)和二 琥珀酰亚胺基碳酸酯(其产生羟基琥珀酰亚胺酯)。也可成功地使用活 化剂诸如O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓(uronium)六氟 磷酸盐(“HATU”)并且只以比游离羧基稍为过量的量使用。
在本发明的一典型活化步骤中，在排出并用适合的溶剂洗涤树 脂后，用活化剂诸如CDI活化游离羧基，但因为CDI对湿度敏感所 以要小心适当地存贮CDI。例如，在排出并用DMF洗涤树脂后，在 涡动混合下用8毫摩尔CDI(Fluka)在8毫升DMF中的溶液活化游离 羧基30分钟。
事实上用CDI的活化可看成为两步过程，首先羧酸用CDI活化 羧酸形成咪唑基酸酐(这里“im”是咪唑基)：
HOOC-X-CO-NH-Q-载体+im-CO-im→im-CO-O-CO-X-CO-NH- Q-载体
然后这种酸酐可与替代的咪唑分子反应而形成：
im-CO-X-CO-NH-Q-载体 其在氨解步骤中通过氨解产生：
NH2-Y-NH-CO-X-CO-NH-Q-载体 或者所述酸酐可经直接氨解产生同样的产物：
NH2-Y-NH-CO-X-CO-NH-Q-载体 两种途径均形成所需的产物。参见Aslam等人，Bioconjugation，387 页(Macmillan Reference，1998)。
氨解步骤
所述氨解步骤涉及均匀长度的式(I)的二胺NH2-Y-NH2：
NH2-Y-NH2+L-CO-X-CO-NH-Q-载体→NH2-Y-NH-CO-X-CO- NH-Q-载体 或
NH2-Y-NH2+L-CO-X-CO-O-Q-载体→NH2-Y-NH-CO-X-CO-O-Q- 载体 在本发明的一典型氨解步骤中，在排出并用适合的溶剂洗涤后，用 大过量的式(I)的二胺氨解树脂结合的物质。在充分洗涤后，Kaiser茚 三酮试验显示了特征蓝色，氨基树脂可进行下一轮的酰化/活化/氨解 循环处理。
一种二胺即4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺特别良好地适用于所 述氨解步骤。
例如，在简短地排出并用DMF洗涤后，在涡动混合下用PEG 基二胺(例如4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺，Fluka，4ml二胺用4ml DMF(0.5M的HOBT溶液)预混合)氨解树脂结合的咪唑30到60分 钟。用DMF充分清洗后，Kaiser试验显示出特征蓝色，所述氨基树 脂可进行下一轮的酰化/活化/氨解循环，即洗涤后，氨基可再用SA 酰化来伸长所述链等。需要着重指出的是一些疏水二胺如1，6-二氨基 己烷可能需要在所有三个步骤(酰化、活化和氨解)中使用N-甲基吡 咯烷酮代替DMF。
所述酰化、活化和氨解步骤因此可再重复一次以便加入第二个 -NH-Y-NH-CO-X-CO-单元，形成：
(NH2-Y-NH-CO-X-CO)-(NH-Y-NH-CO-X-CO)-NH-Q-载体 或
(NH2-Y-NH-CO-X-CO)-(NH-Y-NH-CO-X-CO)-O-Q-载体 等。一次酰化、活化和氨解步骤的循环得到(NH2-Y-NH-CO-X-CO)-Z-Q-载体。几个重复的酰化、活化和氨解步骤的循环产生式(III)的链： -(NH-Y-NH-CO-X-CO)n-(这里n’为0)，或式(IV)的产物： [U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n]q-V，这里例如U为H并且V为-Z-Q-载体，n’为0 并且n为重复循环的次数。例如，当使用琥珀酸酐和4，7，10-三氧杂- 1，13-十三烷二胺进行两次的酰化、活化和氨解循环时，所述合成提 供了一种如下的示例性的PEG基连接基：
    -(NH-CH2-(CH2CH2O)3-(CH2)3-NH-CO-(CH2)2-CO)2-或产物：
    U-(NH-CH2-(CH2CH2O)3-(CH2)3-NH-CO-(CH2)2-CO)2-V这里U为H并且V为-Z-O-载体。
在本发明的另一实施方案中，具有精确数目重复单元并具有式 (III)的水溶性有机聚酰胺基链(其n’为1)：
            -{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-(式中：n为1-100的整数；X和Y为无反应官能基的二价有机基团 或不存在并且相同或不同，并且各所述重复单元可各不相同)通过包 括下面步骤的方法合成：(a)用摩尔过量的具有式HOOC-X-COOH 的二酸衍生物酰化式Z-Q-载体化合物(这里Z为H2N-或HO-；Q为 连接基或目标分子；载体为固相、基体或表面)的氨基或羟基；(b)活 化步骤(a)的产物的游离羧基；(c)用摩尔过量的具有式NH2-Y-NH2的二胺氨解步骤(b)的产物；和(d)任选使用HOOC-X-COOH和 NH2-Y-NH2重复步骤(a)-(c)，其中所述X和Y取代基可与用于所述任何前 面酰化和氨解步骤的X和Y取代基相同或不同。
如上所述，该方法也包括裂解连接在载体上的连接基或通过作 为连接基Q存在的可裂解部分或在将目标分子连接到载体上的连接 基中的可裂解部分将连接基从载体裂解。另外，这种方法也考虑在 合成步骤中使用相同或不同的X和Y取代基。
本发明的另一种优选方法如下面的方案I-B所示，其为方案I-A 的变体，其中省略了第一循环中的酰化步骤，但后面的循环中则包 括酰化步骤。这样，方案I-B包括一个活化步骤和一个氨解步骤，接 着一个或多个酰化/活化/氨解步骤的循环。所用的反应和试剂与方案 I-A中描述的相同。
方案I-B
活化步骤
使用一种适合于固相肽合成的树脂，优选具有适合的酸-可裂解 羟基连接基的树脂如Sasrin树脂(HO-CH2-(C6H3(OCH3))-O-CH2-树脂) 或具有氨基的树脂。首先，将树脂在一适合的溶剂中溶胀。然后， 在本发明的一典型的首先活化的步骤中，活化式Z-Q-载体树脂的羟 基(或氨基)。用试剂诸如CDI的活化是用仍具有离去基团的基团酰化 羟基(或氨基)(HO-变成im-CO-O-，NH2-变成im-CO-NH-)：
HO-CH2(C6H3(OCH3))-O-CH2-载体+试剂→L-COO- CH2((C6H3(OCH3))-O-CH2-载体 式中L为离去基团。
排出和洗涤后，可重复所述活化步骤。
氨解步骤
氨解步骤如上所述，其中将均一长度的式(I)的二胺NH2-Y’-NH2加入到经活化的树脂中。例如，在简短地排出和洗涤后，如上所述 将树脂结合的物质用PEG-基二胺氨解而得到：
H-HN-Y’-NH-CO-O-CH2(C6H3(OCH3))-O-CH2-载体
酰化/活化/氨解步骤
一个酰化/活化/氨解循环将产生：
H-[HN-Y-NH-CO-X-CO]-HN-Y-NH-CO-O-CH2(C6H3(OCH3))-O-CH2-载体等，重复所示三个步骤酰化/活化/氨解的循环直到连接基达到所需的 长度。这产生式(III)的连接基：
-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-(式中n’为1)和式(IV)的产物：
[U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’]q-V(式中U为H，V为-Z-Q-载体)。
在羟基树脂的情况下，通过末端氨基甲酸的脱羧从树脂裂解将 形成式(IV)的产物(其中U和V为H)：
       H-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}-H
在氨基树脂的情况下，从树脂裂解将形成式(IV)的产物(其中U 为H并且V为CONH2)：
    H-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}-CONH2V也可认为是H，其通过二价连接基-CONH-连接。    
方案I-A和I-B所述的酰化/活化/氨解循环可使用相同或不同的 二酸和二胺重复多次。因为低聚是定量进行的，一次一步，所以有 机会在任何阶段改变二胺和二酸组分(例如使用其中X为-(CH2)4-的二 酸代替X为-(CH2)2的二酸)并由此控制疏水性和长度。
一旦所需次数的循环达到了所需的连接基长度，可使用固相合 成的标准技术使链延长(例如用肽)。
可编程肽自动合成器来进行所述各步骤。一旦组装了所需的链， 可在端氨基上合成肽。因为在所述链的构建中没有使用保护基，可 在以标准方法(Fields，上述)从树脂裂解前使用标准Boc(叔丁氧羰基) 或Fmoc(芴甲氧基羰基)技术进行这种链延长。或者，可在从树脂裂 解前或后，通过标准技术(Rose，J.Am.Chem.Soc.116：20(1994))将端 基用氨基氧乙酰基或醛前体修饰。所述PEG基链包含醚键和酰胺键， 两者均可适于常规的肽去保护和裂解技术，包括液态氟化氢(“HF”)。
通过肽化学标准技术从树脂裂解和纯化后的产物具有式(IV)：
[U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’]q-V并且包含具有精确数目式(III)重复单元的水溶性有机聚酰胺基链：
     -{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-应该指出的是本发明循环中的酰化和活化步骤类似于常规的固相肽 合成循环的酰化步骤并不干扰常规的可能在所述连接基或产物中的 取代基上存在的通常的保护基，无论所述保护基是Boc-、Fmoc-、丁 基-或苄基基的基团。但是，氨解步骤涉及过量的伯胺，因此会影响 氨基的Fmoc保护和色氨酸的甲酰基保护，所以在计划合成时应考虑 这个情况。
本发明的另一合成反应涉及两个步骤：酰化和氨解。通过在酰 化步骤中使用过量双活化的二酸，无需在氨解步骤前活化游离酸基， 正如方案II所示。
方案II
酰化步骤
在使用双活化二酸(诸如酰氯或活性酯，由“L”表示，其中L 为离去基团)酰化连接到适用于固相肽合成的树脂上的氨基(NH2-Q-载 体或HO-Q-载体)情况下：
NH2-Q-载体+L-CO-X-CO-L(过量)→L-CO-X-CO-NH-Q-载体 或
HO-Q-载体+L-CO-X-CO-L(过量)→L-CO-X-CO-O-Q-载体
重要的是使用相对于存在的氨基过量的酰化剂以避免有利于“桥 连”副反应，依此同一二价酸衍生物酰化两个氨基。这种桥连物质 不能参与氨解和链延长并带来收率的损失以及出现必须在从载体裂 解产物后除去的杂质。
一种特殊的情况是当所述二酸为碳酸的情况。碳酰二咪唑是这 种二酸的适合的双活化形式。它的使用分别产生了咪唑基-CO-NH-Q-载体和咪唑基-CO-O-Q-载体。
氨解步骤
所述氨解步骤涉及加入均一长度的式(I)的二胺NH2-Y-NH2：
NH2-Y-NH2+L-CO-X-CONH-Q-载体→NH2-Y-NH-CO-X- CONH-Q-载体
然后如上面方案I中所述将酰化和氨解步骤重复几次。
重要的是在每个方案I和II的反应步骤中使用足量的反应剂溶 液来使树脂形成淤浆。因为随着循环次数的增加树脂极大地溶胀， 优选使用类似于上面方案中所述的绝对浓度并依此调节体积。此外， 当以约0.3毫摩尔的树脂开始时，对于合成较长的链来说优选使用8 毫升以上的溶液。溶胀度取决于所用载体或树脂的类型(组成、交联 度等)，还取决于取代(即多少mmol/g)以及长度。因此，液体(溶液) 量不足可能导致达不到定量偶合。尽管酰化步骤易于通过Kaiser试 验监测，但活化步骤则较难跟踪。当一次循环中活化步骤不完全时， 在随后的循环中活化仍旧进行，而导致缺失，即产物可能缺失一个 重复单元-(CO-X-CO-NH-Y-NH)-。过量反应剂的使用能消除这个问 题。术语“过量”是指二酸(或衍生物)、活化剂和二胺试剂的摩尔过 量：对于二酸、活化剂和二胺来说分别优选约3-20倍、10-40倍和 20-200倍的摩尔过量；更优选约4-15、15-30和40-180倍的摩尔过 量；最优选约5-14、20-28和50-150倍的摩尔过量。
有许多树脂适用于固相肽合成并因此也良好地适用于本发明的 合成方案。这些树脂可从商业渠道获得或通过标准技术合成，其包 括例如叔丁氧羰基-Leu-O-CH2-苯基(乙酰胺基)树脂(“Boc-Leu-PAM” 树脂，Bachem，Bubendorf，瑞士)、9-芴甲氧基羰基-半胱胺-Sasrin树 脂(“Fmoc”-半胱胺-Sasrin树脂，Bachem)、Fmoc-氨基丁酸-Sasrin树脂 (Bachem)、Fmoc-Lys(4-甲基三苯甲基)-甲基二苯甲基胺树脂(“Fmoc- Lys(Mtt)-MBHA”树脂)等。上述的任何树脂均可氨基去保护并用于采 用二酸衍生物的酰化。
类似地，诸如Sasrin(Bachem)、Wang或PAM的羟基树脂可直 接用二酸衍生物酰化。或者，诸如Sasrin(Bachem)、Wang或PAM 的羟基树脂可通过CDI活化而形成im-CO-O-CH2-连接基-树脂，注 意在Sasrin的情况下，其形成im-CO-O-CH2-(C6H3(OCH3))-O-CH2-树 脂。参见Bethel等人，J.Biol.Chem.254：2572-2574(1979)。这种活化 的羟基树脂可用二胺氨解形成上面Bethel等人所述的NH2-Y-NH- CO-O-Q-树脂。
在正交保护的二氨基树脂诸如Fmoc-Lys(Mtt)-MBHA-树脂的情 况下，在酰化前一般只有一个氨解去保护。否则，二酸衍生物诸如SA 可直接与树脂诸如Sasrin偶联而形成具有可用于活化的游离羧基的 树脂。氨基去保护后的树脂可通过式NH2-Q-载体说明，式中Q为二 价有机基团，例如-CH(R’)-CO-(式中R’为氨基酸侧链，正如在去保 护Boc-Leu-的情况下)、-CH2-CH2S-(在去保护Fmoc-半胱胺的情况 下)、-CH2-CH2-CH2CO-(在去保护的Fmoc-氨基丁酸的情况下)、 -CH(CH2-CH2-CH2-CH2NH-Mtt)CO-(在Fmoc-去保护的Fmoc-Lys(Mtt) 的情况下)，或者可代表侧链保护的多肽，在这种情况下NH2-Q-载体 的NH2基团被认为是指先前在载体上合成的多肽的游离氨基。NH2-Q- 载体也可用于代表MBHA树脂。当树脂由HO-Q-载体表示时，Q为 设计用来在从树脂裂解上述链时，从酰化(酯连接)链释出端羧基的连 接基团。这种基团为人们所熟悉(Methods in Enzymology 289卷)并被 结合到可从Bachem和其它供应商购置的PAM树脂和Sasrin树脂中。 然后使用适合于具体所用树脂的标准技术从树脂裂解出产物。载体 可以是例如工业PAM、Sasrin或MBHA树脂的聚苯乙烯树脂，或用 于固相肽合成和在Methods in Enzymology 289卷提及的其它类似载 体。但是，也考虑载体的其它物质和结构。
在本发明的另一实施方案中，发现一旦活化树脂用二胺氨解形 成NH2-Y-NH-CO-X-CO-O-Q-载体，就可用二酸衍生物酰化游离氨基 并且聚酰胺延长过程可进行许多次循环而得到良好收率的所需产 物。这与某些副反应如两个活化基团通过二胺的桥连会很快使技术 上不可行的情况不同。在通过标准技术从树脂裂解后，聚酰胺释放 出端氨基，可供官能化(例如产生对称分子)。
如上所述，本发明的聚酰胺基链可用于修饰目标分子或物质如 表面。这些链可与大分子的残基如多肽的氨基酸残基偶联而不会剧 烈改变残基上存在的电荷或没有就地导入可能干扰大分子结合性能 的基团，这些链通过在各种条件下(特别是在生理学相关的条件下)稳 定的键连接。特别适用于将本发明的PEG基链与多肽和蛋白质相连 的途径包括如通过引用并入本文的Rose等人的欧洲专利0243929中 所述的那样通过在多肽链的氨基端和羧基端的腙和肟化学连接。
按照本发明的一个优选实施方案，蛋白质和其它有机目标分子 可通过缀合本发明的精确长度水溶性有机聚合物基链如此中所述的 PEG基链来化学修饰。由于通过水溶性聚合物的连接赋予了所需的 性能，这种蛋白质缀合物的生产是有意义的。这些所需的性能包括 增大的在水溶液中的溶解度、提高的存贮稳定性、降低的免疫原性、 增加的对酶降解的抗性、增宽的各种给药系统的相容性和增加的体 内半衰期。当所述多肽被用作注入体内的治疗剂或当所述多肽被用 于非医学用途诸如用于检测和/或定量目标化合物的测定(通常是免疫 测定)时，用PEG或其它水溶性聚合物进行的多肽的修饰带来的这些 性能特别有意义。
“修饰的”目标分子或物质是通过缀合一个或多个本发明的聚 酰胺基链来修饰的分子或物质。本发明的“均匀”修饰的组成是指 基本上所有修饰目标分子或物质具有基本相同的聚酰胺基链，即不 存在连接的聚合物分子量范围的化学组成。例如，本发明的PEG基 链可具有以式(III)的X、Y或两种取代基形式存在的-(CH2CH2O)p-基 团，产生下式：
-{NH-Y-NH-CO-a-(CH2CH2O)p-b-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-，
-{NH-a’-(CH2CH2O)p’-b’-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-，或
-{NH-a’-(CH2CH2O)p’-b’-NH-CO-a-(CH2CH2O)p-b-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-一个这种示例性链具有下面的PEG基式：
-(NH-CH2-(CH2CH2O)3-(CH2)3-NH-CO-(CH2)2-CO)n-在均匀组成中存在的PEG基链均具有相同的p或p’整数值并且所述 组成会基本上不包括具有不同p或p’值的同系PEG基链。需要着重 理解其参照是在给定单体单元诸如-{NH-Y-NH-CO-a-(CH2CH2O)p-b-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-或-{NH-a’-(CH2CH2O)p’-b’-NH-CO-X-CO}-内的 一个常数p或p’。也可能在不同的循环选择具有不同p或p’值的单 体单元，并且确实也可能在合成的每个循环改变a、a’、b、b’、p、p’ 和X并仍获得均一组成。
本发明的聚酰胺基链通过如肟键的共价缀合连接到目标分子 上。“共价缀合”或“缀合”是指通过生物缀合物化学的标准技术(上 述的Bioconjugate Techniques)，特别是通过在Rose等人的欧洲专利 0243929中所述的N-和C-端标记技术将聚酰胺基链连接到目标分子 上。例如，PEG基链可包含能与蛋白质上的醛基反应形成肟键的端 氨基氧乙酰基(NH2OCH2CO-)基团，或者它可包含与蛋白质上的氨基 氧基(例如通过如Werlen等人在Cancer Research 56：809-815(1996)中 所述用BrCH2CO-NHCH2CH2NHCOCH2ONH2将硫醇烷基化导入)反 应的乙醛酰基(O＝CHCO-)，或者它可包含能烷基化蛋白质上的硫醇 的溴乙酰基。或者，在PEG基链和目标分子之间的缀合可通过在链(例 如其中V为-OH并且n’为O)上的端羧基的活化(例如用一种二酰亚胺 和N-羟基琥珀酰亚胺)和在目标分子上的氨基(诸如赖氨酸侧链)的酰 化来实施，或者缀合可通过在目标分子上的羧基的活化(例如用水溶 性碳化二亚胺)接着通过加入具有游离氨基的PEG基链(例如其中，U 为H)来实施。
如果修饰分子被用于抗原的或免疫原性的目的，本领域技术人 员都知道所用的任何间隔基不应是强免疫原性的。如果缀合聚合物 将被用于结合目的，任何间隔基基团应能增强或至少不影响诸如结 合、亲和力、产品稳定性或溶解性的性质。
本发明提供了一种制备用一个或多个精确长度的聚乙二醇基链 修饰的蛋白质的方法。更具体地说，描述了用一个或多个精确长度 的聚乙二醇基链在温和条件下修饰大分子目标诸如蛋白质、肽、其 它有机化合物诸如塑料或含大分子的表面的方法和化合物。
一种优选的缀合方法是以标准化学为基础的，其以下面的方式 进行。PEG基链具有在合成时连接的氨基氧基乙酰基(例如通过用活 化的Boc-氨基氧基乙酸酰化)、消除保护并且使用固相肽合成的标准 技术(Methods in Enzymology 289卷和实施例)将PEG基链从树脂上裂 解、纯化和鉴定。目标分子具有末端丝氨酸或苏氨酸残基，其按照Rose， J.Am.Chem.Soc.116：30-33(1994)和欧洲专利0243929在温和条件下 用高碘酸氧化成乙醛酰基。将氨基氧基组分和醛组分在室温和弱酸 性pH(2到5)下以1-10mM的浓度在水溶液中以大致相等的比例混 合，通过反相高压液相色谱(HPLC)和电子喷雾离子化质谱(ES-MS)跟 踪缀合反应(肟化反应)。反应速度取决于浓度、pH和空间因素，但 在通常几小时内处于平衡，而平衡极有利于缀合物(Rose等， Bioconjugate Chemistry 7：552-556(1996))。一种组分稍微过量(最高至 五倍)迫使缀合反应向完成方向移动。如上对肟的所述，进行产物的 分离和鉴定。肽和小蛋白质(如胰岛素)可通过反相HPLC纯化(Rose，J. Am.Chem.Soc.，上述和Rose等人，Bioconjugate Chemistry，上述)， 而较大蛋白质(例如抗体和它们的片断)最好通过离子交换色谱纯化或 通过凝胶过滤技术纯化，诸如Werlen等人，Cancer Research 56：809-815 (1996)中所述的对三肟的纯化。
缀合的另一种方法以下面的方式进行。PEG基链在购自Bachem 的Sasrin树脂上合成。使用树脂生产商(Bachem)推荐的方法，通过用 1％TFA的二氯甲烷溶液重复处理，从树脂上裂解所述链并将所裂解 的链的溶液用吡啶甲醇溶液中和。假定为多肽的情况那样，在室温 下(没有加热)蒸发掉溶剂并将裂解的链纯化后，将连接到树脂上的羧 基活化(例如用HATU)并通过肽化学标准技术偶联到目标分子(或表 面)上的亲核基团(如氨基)上。
如果需要，可通过本领域普通技术人员熟悉的各种纯化方法诸 如大小排阻色谱法、疏水作用色谱法、离子交换层析、制备性等电 聚焦等将修饰的目标分子或物质从反应混合物中纯化出来。大分子 纯化、特别是蛋白质纯化的通用方法和原理可参见例如Scopes的 “Protein Purification：Principles and Practice”，第二版，Springer-Verlag， New York，NY(1987)，其通过引用并入本文。
如上所述，本发明的PEG基连接基具体可用于增强目标分子或 物质的性能。例如，已有许多文献报道了在蛋白质上偶联水溶性聚 合物、特别是聚乙二醇的优点，包括在生理pH下(此时，天然蛋白 质不溶或只部分溶解)，提高修饰蛋白质(与天然蛋白质相比)的溶解 性、降低由天然蛋白质产生的免疫应答、增加药物动力学分布、增 加贮存期限和增加生物半衰期。更概括地讲，本发明具体在生物学 上重要的目标分子如多肽情况下的一项重要优点是大分子可通过连 接PEG或水溶性聚合物基连接基修饰但基本不会降低或影响大分子 的生物活性。术语“生物活性”包括酶活性、结合受体(包括抗体)的 能力、结合配体的能力、诱导免疫应答的能力、产生治疗效果的能 力等。
本发明的另一优点是通过本发明的精确长度PEG基链修饰的大 分子如多肽基本上是均一化合物，不像通过连接几个不同长度的水 溶性聚合物[如含-(CH2CH2O)m-基团的聚合物，其中聚合物间的m值 差异很大]制备的化合物。因此，本发明提供了具有缀合水溶性聚合 物带来的优点而又减少了修饰带来的均一性的损失的修饰目标。均 一性对于生物药物降低批次间差异和便于产品开发、鉴定、结果的 表达(均匀化合物而非混合物)和获得管理部门批准是及其重要的。
目标多肽包括单克隆和多克隆抗体；激素；细胞因子，包括集 落刺激因子诸如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；干细胞生长因子；淋 巴因子；IL-2和IL-3；生长因子，包括PDGF，EGF；肽激素，包括 hGH和红细胞生成素；凝血因子，包括因子VIII；免疫原；酶和酶 抑制剂；配体；疫苗抗原等。目标多肽可从其天然源、遗传工程细 胞分离或通过各种体外合成方法生产。下面专利申请(其通过引用并 入本文)报告了各种生物上重要的蛋白质的PEG基修饰：美国专利 4179337、4609546、4261973、4055635、3960830、4415665、4412989、 4002531、4414147、3788948、4732863和4745180；EP 152847、1984 年1月11日公开的EP 98110和JP 5792435。未修饰状态的这些蛋白 质是如此中所述用于修饰的目标分子。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在此中可互换使用，是指 天然存在或重组形式以及其它与天然存在的肽或蛋白质形式足够相 同而具有类似生物或化学活性的非天然存在肽或蛋白质形式。
尽管本发明的链可称为“连接基”，本发明也考虑在无需连接 另一分子的目标分子上使用这些链。因此，单个目标大分子可连接 单个式(III)的链而形成式(IV)的产物(其q为1)：
U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-V以致U(或V)为目标分子并且V(或U)为端基。在本发明的另一实施 方案中，单个目标分子具有几个在各种位置与其连接的式(III)的链。
在以连接基的功能使用本发明的链时，相同或不同的两个目标 分子连接于单个式(III)的链，从而在式(IV)的产物中基团U和V相同 或不同但均为目标大分子。后一种实施方案可称为具有“哑铃形” 结构。
因此，本发明的另一实施方案提供了经本发明的PEG基链修饰 的目标分子。此中它们被称为“聚合物缀合物”。如上所讨论，优 选目标分子为多肽，更优选为具有生物重要性的多肽。
本发明也考虑通过与不同实施方案的PEG基链的反应，由一个 或多个不同的本发明的PEG基链修饰的个别的目标分子。此外，个 别目标分子可在目标分子的单个位置上用多个PEG基链修饰。
特别有意义的是使用本发明的PEG基连接基以便修饰用作药物 和用于测定的多肽。用于测定的多肽包括特异性结合的蛋白质、由 特异性结合的蛋白质识别的多肽和酶。特异性结合的蛋白质是指抗 体、激素受体、凝集素等。术语“抗体”意欲包括具有天然免疫球 蛋白序列的多克隆和单克隆抗体、合成抗体衍生物等。此外，可将 抗体修饰而结合任何不同的标记物、荧光的、放射性的、酶的、生 物素/抗生物素蛋白等。合成抗体衍生物包括经突变和选择用于改变 结合特异性的天然免疫球蛋白序列、通过遗传修饰细菌产生的各种 源于免疫球蛋白基因的多肽(一般为单链)、为了包含修饰的恒定区而 修饰的抗体等；这种基于抗体形成的原理的合成的抗体衍生物的一 篇综述文章为Winter等人，Nature，349：293-299(1991)。一种抗体是 球蛋白型的糖蛋白，其应答抗原的给药而在动物体中形成并能与所 述抗原特异结合。它们也被称为免疫球蛋白。抗体片断可保留一些 选择性结合其抗原或半抗原的能力。与抗原或半抗原结合的能力通 过抗原结合试验测定(参见例如Antibodys：A Laboratory Manual， Harlow和Lane编，Cold Spring Harbor，New York(1988)，其通过引用 并入本文)。这种抗体片断包括(但不限于)Fab、Fab’和(Fab’)2。天然 抗体是从动物或从动物或杂交动物(杂交瘤)细胞系分离的抗体。
目标大分子多肽也可以通过原核微生物或已用天然或修饰的多 肽-编码DNA序列转化的真核细胞(优选人类起源)生产。目标多肽也 可通过噬菌体信息库技术鉴定，然后如实施例那样化学合成。其中 氨基酸序列保持基本一致[即序列相同，或其不同处在于一个或多个 氨基酸的改变(缺失、加入、取代)，而这种改变不会引起诱变修饰蛋 白质和天然蛋白质间实际不利的功能不同]的天然存在多肽的变体可 在此中使用。
当此中所述的任何目标分子如多肽、水溶性聚合物和其衍生物 存在于(或分离自)各种pH下的水溶液时，会自然形成这类分子的盐。 所有具所示生物活性的肽和其它大分子的盐均被认为在本发明的范 围内。例子包括羧酸残基的碱金属、碱土金属和其它金属的盐、氨 基残基的酸加成盐(如HCl)、通过相同分子内的羧酸和氨基残基间的 反应形成的两性离子。
如上所述，目标分子可以是核酸，包括(用于说明而非限定)核苷 酸、低聚核苷酸和线性或环化、单链或双链DNA和RNA。为了增 强核酸的性能诸如增强测定条件下的迁移率，通常需要将一聚合物 链导入到核酸中。这已经通过使用环氧乙烷基连接基获得了成功(参 见例如Grossman等人的美国专利5777096)。因此，可以期待用本发 明的精确长度PEG基链修饰的核酸具有类似增强的性能。
所述目标分子也可以是脂质体。脂质体具有许多用途，但是特 别有意义的是作为药物传递的载体。为了增强脂质体的性能，通常 需要将功能化合物诸如蛋白质、肽等导入到脂质体表面。因为这已 经通过使用其它PEG基连接基达到(参见例如Tagawa等人的美国专 利5556948号)，所以期待用本发明的精确长度PEG基链修饰的脂质 体具有类似的增强性能。
此外，本发明的PEG基链也可连接到基质或固相诸如(用于说明 而非限定)硅集成电路片或传感器集成电路片或金或玻璃的表面或其 它生物传感器表面、组织培养板、细胞或膜、或合成或天然树脂上。 人们可通过使用导入到固相中的互补官能基化学选择性地将PEG基 链配位到固相上。这种固相可易于通过交替浸渍于式(I)的二胺浴和 式(II)的二酸衍生物浴(中间插入活化浴和洗涤浴)而将本发明的PEG 基链连接到其表面。
当目标分子用作人和兽的有效治疗剂时，如用于癌症治疗和传 染病治疗时，所述修饰的目标分子一旦生产和纯化就可混入到这种 用途的药用组合物中。
用作兽药时，治疗剂可以是任何防止或减轻疾病或稳定或减轻 动物病情的分子。治疗剂可包括(但不限于)抗肿瘤抗生素、抗病毒蛋 白质、放射性同位素、药剂或毒素。可以期待用此中所述的聚酰胺 基链修饰的治疗剂具有与未修饰的治疗剂相同或类似的生物活性但 改善了上面讨论的性能。
所述修饰治疗剂可在无毒、惰性药学可接受的含水载体介质中 配制。“药学可接受的载体”是指任何标准药用载体诸如磷酸盐缓 冲的盐水；水；或乳液如油/水乳液；可能包括各种类型的润湿剂。 所述修饰治疗剂可在无毒、惰性药学可接受的含水载体介质中配制， 所述介质的优选pH范围为3到8，更优选为6到8。当用于体内治 疗时，经灭菌的修饰治疗剂组合物将包括溶解于具可接受pH的水缓 冲液(复制后)中的修饰蛋白质。这种修饰治疗剂可用各种赋形剂诸如 氨基酸、聚合物、多元醇、糖、缓冲剂、保存剂、其它蛋白质等配 制。具体例子包括：辛基苯氧基聚乙氧基乙醇化合物；聚乙二醇单 硬脂酸酯化合物；聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯；蔗糖；果糖；右 旋糖；麦芽糖；葡萄糖；葡聚糖；甘露糖醇；山梨醇；肌醇；半乳 糖醇；木糖醇；乳糖；海藻糖；牛或人血清清蛋白；柠檬酸盐；乙 酸盐；林格溶液和Hank氏溶液；生理盐水；磷酸盐；半胱氨酸；精 氨酸；肉碱；丙氨酸；甘氨酸；赖氨酸；缬氨酸；亮氨酸；聚乙烯 基吡咯烷酮；聚乙二醇等。优选这种制剂在4℃下稳定至少6个月。
组合物形式的修饰治疗剂可用本领域人员熟悉的方法对受治疗 者给药，这里“给药”是指供给受治疗者有效量的化合物或药用组 合物。给药的方法包括(但不限于)经口、静脉、经皮和肠胃外给药。 给药可在整个治疗过程中连续或间歇进行。决定给药的最有效方式 和剂量的方法为本领域技术人员熟知并且随用于治疗的化合物或组 合物、治疗目的和受治疗动物或病人的不同而不同。所述组合物可 包含其它增加有效性或促使达到具体目标分子的所需量的化合物。 所述组合物必须能安全地用于经所选途径给药、无菌和有效。为保 持无菌性和增加修饰治疗剂的稳定性，所述组合物可冻干和在使用 前复制。
所述制剂优选适合于以治疗有效量对人或动物肠胃外给药。所 述量可通过使用所关注病情的动物模型临床前试验获得的体内效能 数据或与体内效能相关的普遍接受的体外测定来决定。
以试剂盒的形式提供本发明的聚酰胺基链也是有意义的，可提 供感兴趣的目标分子的方便和可重复的修饰。所述试剂盒可包括含 有本发明的聚酰胺基链的溶液、缓冲剂、反应指示化合物、说明书、 蛋白质浓度测量试剂(如用于Bradford测定)等。试剂溶液优选以预定 量提供。或者，所述试剂盒可包括含有用于合成聚酰胺基链的衍生 物形式的二酸的溶液和含二胺的溶液以及上述的材料。所述试剂盒 也可包含其性能有待改进或增强的目标分子。
试剂盒可包含一系列与已知分子量和组成的目标分子连接的已 知组成、分子量和构型(是否为单聚合物、双聚合物或多聚合物)的聚 酰胺基链单一溶液(或粉末形式)，其可用作例如作为评估缀合反应的 完成和/或收率的标准物或用于提供分子量标准物。
一种可用于合成具有精确数量重复单元的水溶性有机聚酰胺基 链的优选试剂盒包括：(a)Z-Q-载体，其中Z为H2N-或HO-；Q为连 接基或目标分子；并且所述载体为固相、基体或表面；(b)具有式 HOOC-X-COOH的二酸或其衍生物；和(c)具有式NH2-Y-NH2的二 胺；所述链具有下式：
       -{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-式中n为1-100的整数；n’为0或1；X和Y为无反应性官能基的 二价有机基团或者不存在并相同或不同，并且随每个所述重复单元 可各不相同；Y’为无反应性官能基的二价有机基团或者不存在。
另一种示例性的本发明的试剂盒也可用于增强或修饰目标分子 并且包括(a)用于合成具有精确数量重复单元的水溶性有机聚酰胺基 链的试剂，所述链具有下式：
       -{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-式中n为1-100的整数；n’为0或1；X和Y为无反应性官能基的 二价有机基团或者不存在并相同或不同，并且随每个所述重复单元 可各不相同；Y’为无反应性官能基的二价有机基团或者不存在；包 括(i)Z-Q-载体，其中Z为H2N-或HO-；Q为连接基或目标分子；并 且所述载体为固相、基体或表面；(ii)具有式HOOC-X-COOH的二 酸或其衍生物，其中X为无反应性官能基的二价有机基团或者不存 在；和(iii)具有式NH2-Y-NH2的二胺，其中Y为无反应性官能基的 二价有机基团或者不存在；和(b)其性能有待修饰和增强的目标分子， 并且其具有任选的二价间隔基或连接基。
前述的试剂盒可进一步包括一个或多个下面物质：至少一种式 HOOC-X-COOH的另外的二酸或其衍生物，式中X取代基与第一种 二酸中的X取代基不同；至少一种具有式NH2-Y-NH2的另外的二胺， 式中Y取代基与第一种二胺中的Y取代基不同；和一种选自碳酰二 咪唑、二琥珀酰亚胺基碳酸酯和O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四 甲基脲鎓六氟磷酸盐的活化剂。
本发明的另一实施方案是可用于增强或修饰目标分子的试剂 盒，其包括：(a)具有精确数量重复单元的水溶性有机聚酰胺基链， 所述链具有下式：
        -{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-式中：n为1-100的整数；n’为0或1；X和Y为无反应性官能基的 二价有机基团或者不存在并相同或不同，并且随每个所述重复单元 可各不相同；Y’为无反应性官能基的二价有机基团或者不存在；和(b) 其性能有待修饰或增强的目标分子，并且其具有任选的二价间隔基 或连接基。
本发明的修饰目标分子或物质可用于诊断目的的改进试剂盒或 改进的测定试剂，例如用于结合测定如免疫测定。例如，携带有抗 原肽的修饰的目标分子组成提供了固相免疫测定中增高的检测灵敏 度。较大的、二价或多价修饰物质可更易于结合到诸如用于免疫测 定的多孔板的表面。多价物质可具有增强得多的结合亲和力(例如上 面Terskikh等人所述)，并且PEG基链可用于装配合成的多价结构物 (参见实施例)。修饰目标分子、特别是含多个PEG基链的目标分子 可用于使用信号放大步骤进行分析物检测的体外测定，如像分支DNA 基测定。放大通过向单一分析物分子连接多个PEG基链(而不是单一 PEG基链)来获得，其中连接到每个PEG基链上的报道基团都在随后 的测定步骤中有助于检测信号。增加血细胞比容的治疗剂可通过本 发明的PEG基聚酰胺连接基连接两个红细胞生成素模拟肽制备(实施 例11和12)。
本发明还提供PEG基链的体外用途。PEG基链可用于“标记” 目标分子，从而可进行目标分子的随后检测和/或各种方式的定量。 最简单来说，连接PEG基链可让人们进行简单的大小分离而将PEG 基链标记的目标分子与混合物中的其它分子分离。显然人们可在该 方法中简单地通过改变聚合物的方式利用有机聚合物的不同物理化 学性质的优点。例如，微疏水的PEG基链可容许进行基于疏水性的 分离，或者人们可使用按需要选择或排斥PEG基链的聚合物结合柱。 此外可选择或修饰PEG基链从而使其可直接检测。这赋予了所述PEG 基链可包含多个可检测位点(或重复单元)的优点，从而使每个存在于 聚合物中的位点被检测系统结合或识别，从而导致检测信号的放大。
实施例
缩写词
Abu               氨基丁酸
amu               原子质量单位
AoA               氨基氧基乙酰基
Boc               叔丁氧基羰基
2BrZ              2-溴苄氧基羰基
Bzl               苄基
CDI           羰基二咪唑
DAH           1，6-二氨基己烷，H2N-(CH2)6-NH2
‘DAH’       DAH的残基
DCM           二氯甲烷
DIEA          二异丙基乙胺
DMAP          4-二甲基氨基吡啶
DMF           二甲基甲酰胺
EMP           红细胞生成素模拟肽
EPO           红细胞生成素
Fmoc          9-芴基甲氧基羰基
HATU          O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲
          鎓六氟磷酸盐
HF            氟化氢
HOBT          N-羟基苯并三唑
MALDI-TOF     矩阵辅助的行程激光解吸离子化时间
MBHA          甲基二苯甲基胺
Mtt           4-甲基三苯甲基
NMP           N-甲基吡咯烷酮
OSu           羧酸或Fmoc保护基的N-羟基琥珀酰亚胺
      酯
PAM           苯基(乙酰胺基)甲基，即严格地为-
      C6H4CH2CONHCH2C6H4-(聚苯乙烯)，如Boc-Leu-
      OCH2-PAM
PEG           聚乙二醇，-CH2CH2O-的低聚物
‘PEG’       -NH-CH2CH2CH2-(OCH2CH2)3-CH2NH-，其
      为PEG基二胺的残基，NH2CH2CH2CH2-       (OCH2CH2)3-CH2NH2
SA            C4H4O3，琥珀酸酐
succ        -COCH2CH2CO-，琥珀酸的残基
t-Bu        叔丁基
TFA         三氟乙酸
TFMSA       三氟甲磺酸
实施例1
H-(‘PEG’-succ)3-Leu-PAM树脂的合成
在H-Leu-PAM树脂(Bachem)上进行‘PEG’-succ-的三个循环，得 到：
H-[NHCH2CH2CH2-(OCH2CH2)3-CH2NH-CO-CH2CH2CO]3-Leu- PAM树脂。
将0.5g(约0.3mmol)Boc-Leu-PAM树脂(Bachem，瑞士)在DMF 中溶胀并在一台ABI 430A肽合成器上用TFA去保护。排出TFA并 将树脂以常规方式用DMF洗涤。这产生准备用于酰化的H-Leu-PAM 树脂(以其TFA盐的形式)。有时这种产物被写成H-Leu-OCH2-PAM 树脂，有时为H-Leu-PAM树脂，但是两者均指标准的PAM肽合成 树脂。
这里“Leu”是亮氨酸的残基(-NH-CH(C4H9)-CO-)，该产物正确 的写法为“H-Leu-PAM”树脂，而非经常使用的“Leu-PAM”。与此 类似方式以及正如上面缩写词部分所指出的，‘PEG’为残基( -NHCH2CH2CH2-(OCH2CH2)3-CH2NH-)，并且类似地当在末端时，所 述端基(这里为氢)应显示出来。
酰化：将如上制备的H-Leu-PAM树脂在DMF中溶胀、排出并 用4毫摩尔SA在室温下，涡流搅拌30分钟酰化。将SA溶解于8 毫升的DMF(Burdick and Jackson高纯级)中，其为0.5M的 HOBT(Fluka)溶液并往其中加入400微升的DIEA。排出并用DMF 洗涤树脂后，Kaiser茚三酮试验表明酰化完全。
活化：将游离羧基用8毫摩尔CDI(Fluka)在8毫升DMF中活 化30分钟。
氨解：在简短排出并用DMF洗涤后，将树脂结合的imidazolide 用‘PEG’基二胺NH2CH2CH2CH2-(OCH2CH2)3-CH2NH2(4ml二胺与 4ml为0.5M HOBT溶液的DMF预混)氨解。用DMF充分清洗后， Kaiser试验显示出特征蓝色并且这种氨基树脂可供下一次的酰化/活 化/氨解循环。
再重复两次所述酰化、活化和氨解循环而得到H-(‘PEG’-succ)3- Leu-PAM树脂。产物通过进一步的链延长并接着如实施例2所述的 那样裂解来鉴定。
实施例2
H-Tyr-(‘PEG’-succ)3-Leu-OH的合成
将来自实施例1的H-(‘PEG’-succ)3-Leu-PAM树脂的第三个‘PEG’ 的树脂结合氨基使用标准HBTU活化和DIEA作为碱在ABI 430A上 用Boc-Tyr(2BrZ)酰化，然后将树脂以正常方式处理以去保护/裂解(用 TFA去除Boc、用HF在5％对甲苯酚的存在下在0℃60分钟去除 苄基侧链保护2BrZ并从树脂上裂解)。蒸发掉HF后，用-20℃乙醚 提取对甲苯酚。将得到的树脂饼和产物溶于50％乙腈中并将树脂滤 除。通过冷冻干燥将产物从滤液中分离。反相高效液相色谱(Nucleosil 300 5μm C8柱，250×4mm id，0.6mL/min，溶剂A为1g TFA/1升 水，溶剂B为1g TFA溶解于100ml水后用乙腈稀释成1升，梯度 为从100％A到100％B)分析表明只有一个主组分，其通过电子喷雾 离子化质谱鉴定为所要的H-Tyr-(‘PEG’-succ)3-Leu-OH(实测质量 1201.5，计算值为1201.6)。
实施例3
H-Ser-(‘PEG’-succ)8-Abu-OH的合成
以类似于实施例1中所述的方式在Abu-Sasrin树脂上进行PEG- succ的八个循环而得到：
H-[NHCH2CH2CH2-(OCH2CH2)3-CH2NH-CO-CH2CH2CO]8-Abu- Sasrin树脂
用Fmoc-Ser(t-Bu)酰化第八个‘PEG’的树脂结合氨基。树脂的一 部分用哌啶Fmoc去保护并然后用TFA处理以除去丁基侧链保护和 从树脂上裂解。另一部分如生产商(Bachem)建议的那样使用1％TFA 的DCM溶液从树脂上裂解，完全去除Fmoc和丁基保护。已知(参见 Bachem提供的关于Sasrin树脂的小册子)Sasrin树脂易于减慢(24小 时)二胺的氨解，导致作为酰胺的生长链的释放和树脂上羟基的释出。 虽然在所述氨解中这种反应只发生小的程度，但在随后的步骤中任 何释出的链均被洗涤掉并且因此不会污染产物。
两种产物均给出非常纯净的色谱图，并且其质谱分析得到预期 的质量：Fmoc-Ser(But)-(‘PEG’-succ)8-Abu-OH在分别相应于M＋4H +和M＋3H+的m/z 722.9和963.5处给出了信号，得到质量为 2887.5，计算值为2887.5；H-Ser-(‘PEG’-succ)8-Abu-OH在分别相应 于M＋5H+、M＋4H+和M＋3H+的m/z 523.0、653.6和871.0处 给出信号，得到质量为2609.3，计算值为2609.2。在质谱图中没有 观察到缺-CH2CH2O-(44amu)的痕量物质，其足够的强度表明杂质低 至1％的水平。
完全受保护的产物可良好地溶解于水/乙腈/TFA的HPLC溶剂系 统中。这是一种所期待的聚乙二醇的性质，而完全保护的肽通常不 溶于大多数溶剂。正如大家所熟悉的，具有末端游离羧酸的受完全 保护的产品对于在片断缩合(汇集合成)中活化和偶联是有用的。Ser 基团的去保护后，可用高碘酸在非常温和的条件下将其氧化而提供 适合于形成非肽键(如肟)的醛基。这种氧化和肟化由Rose在上述的 J.Am.Chem.Soc.中描述。
实施例4
(H-Ser-(‘PEG’-succ)4)4Lys2Lys-NHCH2CH2SH的合成
将Fmoc-半胱胺Sasrin树脂(Bachem，200mg，0.51mmol/g)进行 Fmoc去保护(由于如所述的氨基数目的增加，取比通常更少的树脂)。 成对进行Fmoc-Lys(Fmoc)的两个循环而产生具有四个游离氨基(代替 原来的一个)的赖氨酸“树”。
如实施例1所述在树脂上进行四个‘PEG’-succ循环。然后将树 脂用Fmoc-Ser(t-Bu)酰化、Fmoc-去保护并然后在三异丙基硅烷的存 在下用TFA处理除去丁基和从树脂上裂解。通过HPLC分离所需产 物(H-Ser-(‘PEG’-succ)4)4Lys2Lys-NHCH2CH2SH并通过质谱鉴定(质量 5647.9)。所述硫醇在pH7的磷酸盐缓冲液中用5-碘乙酰氨基荧光素 (Fluka)烷基化而形成所期待的携带荧光团的烷基化四分支产物。通过 HPLC分离产物并通过质谱鉴定。它给出了分别相应于M+9H+、 M＋8H+、M＋7H+、M＋6H+和M＋5H+的在m/z 671.9、755.7、 863.5、1007.1和1208.2处的信号，得到6037.0的质量，计算值6037.2。 所述Ser残基可通过温和高碘酸处理(其并不影响荧光团)氧化并且如 上面的Rose在J.Am.Chem.Soc.中所述的那样与肽或其它携带氨基 氧基的分子形成四肟。
分支产物(H-Ser-(‘PEG’-succ)4)4Lys2Lys-NHCH2CH2SH的收率比 用线性‘PEG’-succ甚至那些具有8个重复单元的低聚物获得的收率低 得多，可能是由于在分支结构情况下被二胺近处分隔的活性羧基的 增强的桥连倾向。为此，当通过肟化构建分支结构时，可能优选缩 合例如含线性‘PEG’-succ化合物(肽)-(PEG’-succ)n-‘PEG’- COCH2ONH2与分支的(O＝CHCO-)4Lys2-Lys-NH2而不是缩合(肽)- COCH2ONH2与分支的含‘PEG’-succ化合物(O＝CHCO-(‘PEG’- succ)4)4Lys2Lys-NH2。
实施例5
肽二聚物：(肽)-肟-(‘PEG-succ)16-‘PEG’-肟-(肽)的合成
在该实施例中使用未修饰的Sasrin树脂(0.25mmole，Bachem)。 用SA(10摩尔)在5ml含1摩尔DMAP的DMF中酰化树脂结合的 羟基40分钟。重复这种酰化反应以确保Sasrin树脂的羟基的高度酰 化。在这个阶段的产物为HOOC-CH2CH2-CO-O-CH2(C6H3(OCH3))-O-CH2-聚苯乙烯，其为如方案1所述的HOOC-X-CO-O-Q-载体的形式， 其中Q为Sasrin连接基-CH2(C6H3(OCH3))-O-CH2-，所述载体为Sasrin 珠的聚苯乙烯，X为-CH2CH2-。
用DMF洗涤后，用8毫摩尔CDI在8毫升DMF中活化所述酸 的游离羧基30分钟。
如实施例1所述用‘PEG’氨解活化树脂。如实施例1那样再进 行7个‘PEG’-succ循环。(在另一情况下，再进行5个而不是7个循 环)。
然后在标准条件下使用HBTU/DIEA用Boc-Ser(Bzl)酰化端氨 基。通过用1％TFA/DCM溶液多次处理，如Sasrin生产商推荐的那 样用吡啶甲醇溶液中和每个等份样来从树脂上转移所述链。这个阶 段通过在室温下旋转蒸发分离产物Boc-Ser(Bzl)-(‘PEG’-succ)7-‘PEG’- COCH2-CH2CO-OH，或更简单Boc-Ser(Bzl)-(‘PEG’-succ)8-OH并通过 反相HPLC纯化。(在另外的情况下，制备Boc-Ser(Bzl)-(‘PEG’- succ)6-OH)。在标准条件下用HATU(一当量)NMP溶液活化羧基10 分钟并将活化化合物用‘PEG’(半当量，以有利于‘PEG’的两个氨基 的酰化)氨解2天。通过反相HPLC分离产物并通过电子喷雾离子化 质谱鉴定为对称化合物：
Boc-Ser(Bzl)-(‘PEG’-succ)8-‘PEG’-(succ-‘PEG’)8-Ser(Bzl)Boc 其也可写成：
   Boc-Ser(Bzl)-(‘PEG’-succ)16-‘PEG’-Ser(Bzl)Boc 在上面结构中，可理解对称中心‘PEG’的两个端氨基用Boc-Ser(Bzl)- (‘PEG’-succ)8-己酰化：右手Ser(Bzl)因此为-CO-CH(CH2OBzl)NH-而 不是更常见的-NH-CH(CH2OBzl)CO-，因此Ser残基显示为斜体以表 明这个情况。实测质量为5613(计算值5612.9)。在所述另一情况下产 物是对称化合物：
Boc-Ser(Bzl)-(‘PEG’-succ)6-‘PEG’-(succ-‘PEG’)6-Ser(Bzl)Boc 其也可写成：
    Boc-Ser(Bzl)-(‘PEG’-succ)12-‘PEG’-Ser(Bzl)Boc 并且实测质量为4403.4(计算值4403.4)。
通过用TFA(每毫克20微升TFA)以标准方法处理4分钟后加入 三氟甲烷磺酸(每毫克2微升)在室温下处理25分钟除去保护基(Boc， Bzl)。将去保护的物质沉淀并用预先冷却到-20℃的乙醚洗涤三次而 得到对称的化合物：
H-Ser-(‘PEG’-succ)8-‘PEG’-(succ-‘PEG’)8-Ser-H 或
H-Ser-(‘PEG’-succ)16-‘PEG’-Ser-H 其通过反相HPLC分离并通过电子喷雾离子化质谱鉴定：实测质量 为5232，计算值为5232.4。
可将未保护的丝氨酸基如上面Rose，J.Am.Chem.Soc.所述用 HIO4氧化形成端醛基：
NH2-CH(CH2OH)-C(O)-(‘PEG’-succ)8-‘PEG’-(succ-‘PEG’)8- C(O)CH(CH2OH)NH2+HIO4→O＝CH-C(O)-(‘PEG’-succ)8-‘PEG’ (succ-‘PEG’)8-C(O)CH＝O
在标准肟化条件下加入NH2OCH2C(O)-肽得到哑铃形二肟：
肽-COCH2ON＝CHC(O)-(‘PEG’-succ)8-‘PEG’-(succ-‘PEG’)8- C(O)CH＝NOCH2CO-肽 其也可写成：
肽-COCH2ON＝CHC(O)-(‘PEG’-succ)16-‘PEG’- C(O)CH＝NOCH2CO-肽 或    
  (肽)-肟-(‘PEG’-succ)16-‘PEG’-肟-(肽) 其可通过HPLC分离并通过质谱鉴定。
适合使用的肽序列的例子是上面的Johnson等人在Chemistry & Biology中所述的肽序列：-Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala-Cys-His-Met-Gly- Pro-Met-Thr-Trp-Val-Cys-Gln-Pro-Leu-Arg-Gly-(SEQ ID NO：1)。
这种肽与分子量约3400的连接基的二聚显示出导致生物活性约 1000倍的提高。实施例7描述了这种肽如何以适合的形式(氨基氧基 乙酰基和二硫键存在)生产而供肟化成氧化PEG连接基。
实施例6
与PEG连接基结合的肽：(肽)-Lys(NH2OCH2CO-(‘PEG’-succ)8-)- 酰胺的合成
在该实施例中使用MBHA树脂(0.5毫摩尔，Novabiochem，瑞 士)。树脂结合的氨基在标准条件下用Fmoc-Lys(Mtt)酰化。去除Fmoc 基后(20％哌啶的DMF溶液，20分钟)，在实施例1的条件下增加八 个‘PEG’-succ循环。第八个‘PEG’基的端氨基用Boc-Glu(Ochxl)酰化。 然后用等份的1％TFA/DCM溶液去除Mtt基(但不是Boc基)直到不 再有黄色释放出来。在使用标准Boc化学、用序列：
   H-Ser-Val-Trp-Arg-Trp-Leu-Pro-Tyr-Asp-Lys-Tyr-(SEQ ID NO：2) 延伸所述肽前将游离氨基用Fmoc-O-Su(1毫摩尔在4毫升含0.4毫 升N-甲基吗啉的DMSO中，1小时；用Kaiser试验检查并且如果需 要重复酰化，但是第二次只使用0.2毫升N-甲基吗啉)。 在上面Terskikh等人的文献中已描述了序列H-Ser-Val-Trp-Arg-Trp- Leu-Pro-Tyr-Asp-Lys-Tyr-Glu-(SEQ ID NO：3)。当适合留间隔时这种 肽的五个拷贝提供了五个数量级的与病理细胞系更好的结合。
Fmoc基团(和在色氨酸的侧链上的甲酰基)用哌啶的DMF溶液 去除，并且游离氨基用Boc-NHOCH2CO-OSu酰化(完全和以上所述 的Fmoc-O-Su偶联相同)。Boc基团用TFA去除，树脂用10％ DIEA/DMF溶液中和、用DMF洗涤后用DCM洗涤并接着用 1∶1DCM∶MeOH洗涤并高真空下干燥。如实施例2那样进行用HF的 裂解和产物分离。通过反相HPLC分离的产物通过电子喷雾离子化 质谱鉴定：H-Ser-Val-Trp-Arg-Trp-Leu-Pro-Tyr-Asp-Lys-Tyr-Glu- Lys(NH2OCH2CO-(‘PEG’-succ)8)-NH2(SEQ ID NO：4)，实测质量 4261.9，计算值4261.1。
只使用4个‘PEG’-succ循环如上制备具更短连接基的化合物。 这种化合物具有3051.5的实测质量，计算值为3051.6。
这些具有PEG基连接基和氨基氧基乙酰基(NH2OCH2CO-)的肽 被用于肟化反应来使用上面Rose在J.Am.Chem.Soc.中所述的化学 制备二聚物和更高级的聚肟。
实施例7
肽二聚物：(肽)-肟-(‘PEG’-succ)2-Lys-((肽)-肟-(‘PEG’-succ)2)酰胺 的合成
在该实施例中使用MBHA树脂(0.5毫摩尔，Novabiochem，瑞 士)。在ABI 430A仪器上通过标准Boc化学将序列：Gly-Gly-Leu- Tyr-Ala-Cys-His-Met-Gly-Pro-Met-Thr-Trp-Val-Cys-Gln-Pro-Leu-Arg- Gly-(SEQ ID NO：1)(Johnson等，Chemistry & Biology，见上面)、接着 将Boc-氨基乙酸偶联到树脂上。通过两个30分钟的用10毫升混合 物[巯基乙醇(6ml)和DIEA(3ml)在DMF(21ml)中]的处理除去His 侧链的二硝基苯基。用DMF洗涤树脂后，以标准方法用TFA除去 Boc基团，然后通过两次用水(2ml)和乙醇胺(2.4ml)在DMF(35.6ml) 中的混合物(每次10ml)处理由色氨酸上除去甲酰基。树脂用DMF充 分清洗后，用DCM洗涤并接着用1∶1DCM∶MeOH洗涤，排出并高真 空干燥。用HF裂解和去保护，如实施例2那样进行产物分离。电子 喷雾离子化质谱分析表明产物具有所期待的NH2OCH2CO-Gly-Gly- Leu-Tyr-Ala-Cys-His-Met-Gly-Pro-Met-Thr-Trp-Val-Cys-Gln-Pro-Leu- Arg-Gly-NH2(SEQ ID NO：1)的质量(实测值2250.8，计算值2249.7)。
如下形成二硫键。将48毫克上述肽(约21.3微摩尔)溶解于48 毫升水中并用氢氧化铵溶液将pH调节到7.0(玻璃电极)。加入25当 量0.92M过氧化氢贮备液。室温下30分钟后，用0.5毫升乙酸酸化 该溶液并立即注入制备反相HPLC中。二硫键的形成由损失两个质 量单位证实：实测值2247.8，计算值2247.7。
在该实施例中使用MBHA树脂(0.5毫摩尔，Novabiochem，瑞 士)。树脂结合的氨基在标准条件下用Fmoc-Lys(Fmoc)酰化。去除Fmoc 基后(20％哌啶的DMF溶液，20分钟)，在实施例1的条件下增加两 个‘PEG’-succ循环。然后用Boc-Ser(Bzl)酰化‘PEG’基的端氨基。在 用TFA除去Boc基并将树脂洗涤和干燥后，用液体氟化氢处理树脂 并按实施例2的方法将产物分离。反相HPLC分析表明为单一主产 物，其通过电子喷雾离子化质谱鉴定为所期待的产物(实测质量为 1529.4，计算值为1528.8)：H-Ser-‘PEG’-succ-‘PEG’-succ-Lys(H-Ser- ‘PEG’-succ-‘PEG’-succ)-NH2。
产量为180mg纯化产物。在Gaertner等人在Bioconjugate Chemistry 3：262-268(1992)的所述条件下，将端丝氨酸残基在咪唑缓 冲剂(340mg咪唑溶于100ml水中，用6M HCl调节到pH 6.95)和乙 腈的混合物7∶2(体积)中用高碘酸氧化。通过反相HPLC分离氧化(二 醛)产物后，通过质谱鉴定：发现分别相应于期待的二醛、二醛一水 合物和二醛二水合物的质量1466.9、1484.9和1502.9(计算值分别为 1466.8、1484.8、1502.8)：
O＝CH-CO-‘PEG’-succ-‘PEG’-succ-Lys(O＝CH-CO-‘PEG’-succ- ‘PEG’-succ)NH2
在以0.1％TFA用0.1％TFA在90％乙腈中的梯度的制备HPLC 分离后，通过在室温下旋转蒸发回收二醛至约10mM的浓度(所述氧 化为定量氧化)。
二醛用两倍过量的：NH2OCH2CO-Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala-Cys-His- Met-Gly-Pro-Met-Thr-Trp-Val-Cys-Gln-Pro-Leu-Arg-Gly-NH2(SEQ ID NO：1)(具有二硫键)在室温下肟化(按照Rose.，K.，1994)18小时而导 致这种肽和二醛间的期待的二肟的形成。通过反相HPLC分离这种 二肟并通过质谱鉴定：实测质量为5926.0，计算值为5926.0。
实施例8
H-(‘PEG’-succ)7-‘PEG’-H的合成
在DMF中溶胀后，将Sasrin树脂(0.3毫摩尔)用CDI(8毫摩尔 于8毫升NMP中，NMP为0.5M的4-二甲基氨基吡啶溶液)活化30 分钟、排出并再次活化。将活化树脂用‘PEG’氨解，然后用SA酰化 并如前所述(除了洗涤步骤中用NMP代替DMF外)用于制备H- (‘PEG’-succ)7-‘PEG’-CO-O-CH2-C6H3(OCH2)-树脂。用TFA裂解30分 钟从树脂裂解出产物并用冷乙醚(在其冰点)沉淀。通过制备反相HPLC 分离产物。电子喷雾质谱显示其质量为2437.18±0.81。对于对称的 H-(‘PEG’-succ)7-‘PEG’-H来说其质量计算值为2436.98。
实施例9
H-(‘DAH’-succ-‘PEG’-succ)3-‘DAH’-succ-‘PEG’-H的合成
除了在替换的氨解循环中使用‘DAH’代替‘PEG’外，该实施例与 实施例8的步骤类似。这样，在Sasrin树脂上制得(‘DAH’-succ- ‘PEG’-succ)3-‘DAH’-succ-‘PEG’。尽管当使用更亲水的‘PEG’二胺工 作时优选DMF，但是当使用疏水二胺如DAH工作时，在实施例1 和5-7的方法中使用NMP代替DMF是有益的。用TFA从树脂裂解 并用冷乙醚(在其冰点)沉淀后，通过反相HPLC将产物分离。电子喷 雾质谱显示其质量为1920.78±0.59。H-(‘DAH’-succ-‘PEG’-succ)3- ‘DAH’-succ-‘PEG’-H的质量计算值为1920.49。
实施例10
聚酰胺稳定性评价
将实施例8和9生产的化合物以1mg/ml的浓度分别溶解于1％ 碳酸氢铵溶液中。在不同的试管中，将这些溶液用胰蛋白酶、糜蛋 白酶和弹性蛋白酶(酶∶底物比率1∶100，37℃)处理。以一定间隔抽出 等份试样(20微升)并用HPLC分析。即使24小时后，也没有消化发 生，而在相同条件下胰岛素用酶的对照培育表明只在4小时后就发 生广泛地消化。因此聚酰胺比多肽对蛋白酶的作用稳定得多。相反， 来自上面Terskikh等人所用的骆驼抗体的铰链区的肽酰胺H-Pro-Gln- Pro-Gln-Pro-Lys-Pro-Gln-Pro-Gln-Pro-Gln-Pro-Gln-Pro-Lys-Pro-Gln- Pro-Lys-Pro-Glu-Pro-Glu-NH2(SEQ ID NO：5)尽管对糜蛋白酶和弹性 蛋白酶稳定，但它在24小时后就被胰蛋白酶深度消化。
实施例11
A、EMP-二聚物(工业PEG)的合成和HPLC/质谱分析
此中称为“工业EMP-二聚物”的EMP二聚物使用此中称为“工 业EMP二聚物”并表示为O＝CH-工业PEG-CH＝O的平均相对分子 量3400的工业PEG二醛连接基(Shearwater Polymers)制备。携带AoA 基的单体肽(Johnson等，Chemistry & Biology，同上)NH2OCH2CO- GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-酰胺(SEQ ID NO：1)和二硫键通过 Boc化学使用标准技术在MBHA树脂(上述的Fields和上述的Rose，J. Am.Chem.Soc.和实施例7)上合成。然后将肽从树脂裂解并用HF(含 5％对甲苯酚，0℃ 60分钟)去保护，用乙醚沉淀并通过制备HPLC 纯化。然后用工业PEG连接基进行肟化而得到二聚物：酰胺- GRLPQCVWTMPGMHCAYLGG-COCH2ON＝CH-工业PEG- CH＝NOCH2CO-GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-酰胺(SEQ ID NO：1 的二聚物)。斜体字用于指示所示的是非常规取向(C到N端而非常规 的N到C端)的一种肽。肟化如下进行：将2.4mg EMP肽(1.06微摩 尔；比醛基1.2倍过量)溶解于0.2ml水中并加入到溶解于0.45ml乙 酸盐缓冲液(0.15M，反离子钠，6M盐酸胍)的1.5mg(0.44微摩尔) PEG-二醛中。在室温下暗处保存16小时后，通过制备HPLC进行产 物分离并通过分析HPLC和MALDI-TOF质谱进行鉴定。
这种EMP-二聚物的反相HPLC色谱图和质谱分析利用MAIDI- TOF技术(其产生单质子化物质)，因为对于在电子喷雾四极仪(其生 产多质子化物质)上的谱图分析太复杂。
前人用来自相同供应商的PEG制备的这种二聚物的工作(Johnson 等，Chemistry & Biology，同上)证实了在EPO决定的细胞增殖测定中 的0.1nM的ED50值，这比所述肽单体低1000倍。尽管其具有纯的 色谱图，但质谱图显示有40个以上的组分，每个相差PEG重复单元 -CH2CH2O-，即44amu的间隔。不可能通过HPLC分离各组分。在 相应于具78个-CH2CH2O-基的分子的分布的中心处(8024amu)的质量 峰与所宣称的PEG的相对分子量(3400，即77个重复单元，231个键， 发现这里为±20个重复单元或60个键)一致。
B、EMP-二聚物(精确长度PEG)的合成和HPLC/质谱分析
此中称为“精确长度EMP-二聚物”的EMP二聚物使用此中称 为“精确长度EMP二聚物”的一种本发明的精确长度PEG基聚酰胺 链制备。所述精确长度EMP-二聚物具有比工业EMP-二聚物更长的 长度。
所述精确长度EMP-二聚物是基于对称的聚酰胺连接基-(‘PEG’- succ)6-‘PEG’-(succ-‘PEG’)6-并如下合成。
使用上述的技术在Sasrin树脂(Bachem)上制备所述PEG聚酰胺 连接基Boc-Ser(Bzl)-(‘PEG’-succ)6-OH。按树脂生产商的建议用1％ TFA的DCM溶液自所述树脂上裂解所述物质并用制备HPLC纯化。 搅拌下往Boc-Ser(Bzl)-(PEG-succ)6-OH(9.7毫克，4.4微摩尔)的NMP 溶液中加入HATU试剂(1.6毫克，4.4微摩尔)和用NMP稀释10倍 的DIEA溶液(15微升，8.8微摩尔)。在相应于羧酸基预活化5分钟 后，将活性酯用PEG基二胺(4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺，‘PEG’， 用NMP稀释100倍，24微升，1.15微摩尔)氨解过夜。得到的对称 Boc-Ser(Bzl)-(‘PEG’-succ)6-‘PEG’-(succ-‘PEG’)6-Ser(Bzl)-Boc直接通 过制备HPLC纯化(产量7毫克，1.6微摩尔，73％)。用标准TFMSA 裂解方法(300微升TFA 4分钟，接着加入30微升TFMSA 25分钟) 去除两个Boc基和苄基。产物用冷乙醚(在其熔点，存在少量固态醚) 沉淀，用冷乙醚洗涤三次并在干燥器中干燥。将去保护连接基Ser- (‘PEG’-succ)6-‘PEG’-(succ-‘PEG’)6-Ser的Ser残基如上面Rose，J.Am. Chem.Soc.中所述氧化成乙醛酰官能基(O＝CH-CO-)。第二个Ser被写 成斜体字以指示该连接基是对称的：第一个Ser为 NH2-CH(CH2OH)CO-，第二个Ser为-CO-CH(CH2OH)-NH2，即指示非常 规途径循环。
将得到的二醛连接基再通过HPLC纯化。将具有形成的二硫键 的氨基氧基乙酰基-EMP肽衍生物溶液(96微升，21.3mM/0.1M乙酸 盐缓冲液，pH 4.0，反离子钠；比醛基1.5倍过量)与二醛(200微升， 3.5mM/水)混合并让其在室温下反应48小时。通过反相HPLC分离 二聚产物：酰胺-GRLPQCVWTMPGMHCAYLGG-COCH2ON＝CH-CO- (‘PEG’-succ)12-‘PEG’-CH＝NOCH2CO- GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-酰胺(一种SEQ ID NO：1的二聚 物)，产量为1.2毫克(20％收率)，并且通过分析HPLC和电子喷雾离 子化质谱鉴定。斜体字用于指示所示的是非常规取向(C到N端而非 常规的N到C端)的一种肽。
尽管所述精确长度EMP-二聚物具有比工业EMP-二聚物更多的 键(243比231)和42个-CH2CH2O-单元，但所述精确长度EMP-二聚 物均匀得多。在质谱图上没有具太少-CH2CH2O-重复(44个质量单位) 物质的信号。只稍微比主信号强的信号是由于钠和钾的阳离子化， 而这种阳离子化是电子喷雾离子化质谱的常见特征。其实测质量(8417) 非常接近于8420的理论值。它证明了可以制备具有更长和更短的链： 16和4个-‘PEG’-succ-重复单元的二聚物。使用上至-(‘PEG’-succ)8- ‘PEG’-(succ-‘PEG’)8-的间隔基获得了优良的色谱图和质谱图。
实施例12
在细胞培养测定(人类白血病的UT-7 EPO依赖性细胞系)中测定 具不同长度连接基的精确长度EMP-二聚物的EPO活性。重组EPO 和EMP单体肽包括其中作为对照，所述单体在表1中表示为“mono”。
在所述精确长度EMP-二聚物中的短连接基(在表1中表示为“s”) 为-(‘PEG’-succ)2-‘PEG’-(succ-‘PEG’)2-。中度连接基(在表1中表示为 “m”)为-(‘PEG’-succ)6-‘PEG’-(succ-‘PEG’)6-，而长连接基(在表1中 表示为“1”)为-(‘PEG’-succ)8-‘PEG’-(succ-‘PEG’)8-。
        表1每个肽样品的平均OD 浓度(μM)    OD     OD     OD     OD
         m      s      l     mono   1×10-1  .884   .930   .891   .878 3.33×10-2 .902   .925   .890   .673 1.11×10-2 .876   .935   .906   .373 3.70×10-3 .888   .919   .931   .210 1.24×10-3 .916   .798   .838   .078 4.12×10-4 .805   .756   .848   .078 1.37×10-4 .760   .534   .835   .089 4.57×10-5 .637   .299   .695   .089 1.52×10-5 .597   .194   .632   .089 5.08×10-6 .712   .171   .525   .089 1.69×10-6 .641   .298   .614   .089 5.65×10-7 .469   .163   .547   .089 1.88×10-7 .363   .117   .502   .089 6.27×10-8 .350   .114   .356   .089 2.09×10-8 .287   .088   .231   .089 6.97×10-9 .280   .089   .193   .089 2.32×10-9 .246   .083   .217   .089 7.74×10-10 ----- .099   .194   .089 2.58×10-10 ----- .129   .170   .089 阴性对照    .089   .076   .074   .090
         表2重组EPO样品的平均OD
        EPO(ng/ml)          OD
         50               .917
         16.7             .920
         5.56             .885
         1.85             .878
         .617             .650
         .206             .362
         .0686            .179
         .0229            .124
         .00762           .108
         .00254           .101
        阴性对照          .078
从上面的结果明显可以看出表3所示的ED50(产生50％最大响应 的有效剂量)值。
                   表3
           物质              ED50(pM)
         EMP单体              20000
         重组EPO                25
         EMP-s(短二聚物)       100
         EMP-m(中二聚物)        1
         EMP-l(长二聚物)       0.1
表3表明连接了中和长聚酰胺链的EMP二聚物在细胞测定中比 重组蛋白质标准具有高得多的活性。
实施例13
下面实验探索分支结构的用途，在其构建中使用了非PEG的聚 合物。
本发明的PEG基聚酰胺被用于合成此中被称为“化学体”的 peptabody的化学变体(Terskikh等人，同上)。通过标准技术(上面所述 的Fields的技术和上面的Rose在J.Am.Chem.Soc.中所述的技术)在 Fmoc-Lys(Mtt)-MBHA树脂(0.5mmol)上合成带一个AoA基团的单体 肽H-ADGACRNPWC-(‘PEG’-succ)8-Lys(AoA)-酰胺(SEQ ID NO：6)。 简要地说，去除Fmoc保护，进行PEG’-succ的8个循环，然后将 Boc-Cys(4-MeBzl)偶联到端氨基上。去除Mtt保护(进行多轮的1％ TFA/DCM处理直到溶液不再发黄)并将氨基用Fmoc-OSu(2mmol在 5ml具作为碱的N-甲基吗啉的DMF中)酰化。通过Boc化学反应将 肽链延伸到N-端。用10％哌啶/DMF处理7分钟去除Fmoc保护， 因为更强的条件导致在Asp-Gly处形成琥珀酰亚胺。这种哌啶处理从 Trp吲哚上去除了甲酰基保护。氨基用Boc-AoA-OSsu(0.6mmol在5 ml含作为碱的N-甲基吗啉的无水DMSO中，没有更强的条件或Trp 的酰化或Boc-NHOCH2CO-的N的酰化发生)酰化。从树脂裂解并用 HF去保护后，通过HPLC纯化，如对于EMP肽所述用过氧化氢形 成二硫键，通过HPLC分离产物并通过分析HPLC和电子喷雾离子 化质谱鉴定：实测质量为3709.1，理论质量为3709.4。
以Fmoc-半胱胺-Sasrin树脂(Bachem)为起始并偶联两轮的Fmoc- Lys(Fmoc)以及随后偶联Boc-Ser(t-Bu)，通过标准技术制备四价拷贝 Ser-Lys(Ser)-Lys(Ser-Lys(Ser))-NHCH2-CH2SH。去保护和裂解(270mg 树脂，2.7ml TFA，30mim，过滤，在氮气流下蒸发到小体积，用冷 乙醚沉淀)后，产物通过HPLC纯化。将该硫羟如下进行烷基化：往 磷酸盐缓冲溶液(2.5ml，0.25M磷酸盐，pH 7.0，1mM EDTA)中首先混 入1ml纯化的拷贝(10mM水溶液)并立即混入5-碘乙酰氨基荧光素 (Fluka，1ml，10mM/DMF)。暗处放置90分钟后，将荧光素标记的拷 贝用HPLC纯化，得到7.8mg产物，66％的收率。将Ser残基氧化 并通过HPLC分离后，将四乙醛酰基荧光素标记的拷贝(28μl，3.4mM/ 水)在室温下用H-ADGACRNPWC-(‘PEG’-succ)8-Lys(AoA)-酰胺(SEQ ID NO：6)(二硫化物形式，66μl，6mM/0.1M乙酸盐缓冲液，pH4.0，反 离子钠，比每个存在的醛基1.04倍过量)肟化48小时。产物通过HPLC 纯化并用分析HPLC和电子喷雾离子化质谱鉴定：[肽-(‘PEG’-succ)8- Lys(肟)酰胺]4Lys2Lys-NHCH2CH2S-CH2C(O)NH-荧光素，其中所述 “肽”为-ADGACRNPWC-(SEQ ID NO：6)。
与上面Terskikh等人的peptabody类似，这种四聚产物被称为四 聚化学体。这种四聚化学体的HPLC色谱图和质谱图显示结合到BCL1 肿瘤细胞系(Terskikh等人，同上)的源于噬菌体的肽 ADGACRNPWC-(SEQ ID NO：6)的四个拷贝(具有半胱氨酸间的二硫 键)。与具有五个肽、72个键的连接基长度和没有报道基团的85000 相对分子量的Terskikh peptabody相比，所述的化学体具有4个结合 肽、167个键的PEG-聚酰胺间隔基长度和一个荧光素报道基团和 15858(实测值；接近15839的理论值)的相对分子量。在质量15521 处的一个小信号相应于一个存在缺失32的一个单-“PEG”-succ-重 复单元的非常小的组分。
这种缺失在固相肽合成中是常见的，由于采用了标准肽化学方 法，期待偶合步骤的优化(更高的浓度、更长的时间、更高的温度、 更好的溶剂、添加剂诸如4，4’-二甲基氨基吡啶)来产生更长的链，特 别是由于用这些无位阻且非常易溶的化合物，应不存在难以用肽建 立并通常伴随着β-结构形成的序列。
噬菌体源的肽因此可在生物相容的链的端点显示在整个合成分 子上，而不会有重组表达和重折叠的问题。通过上述方法，化学体 可容易地用ADGACRNPWC(SEQ ID NO：6)以及用噬菌体肽 SVWRWLPYDKYE(SEQ ID NO：3)制备，而具有相应序列的相应 peptabodies不能以可溶形式产生(Terskikh等人，同上)。宽范围的精 确制备的二聚物和多价结构诸如化学体现可容易地通过此中所述的 方法合成。
在该说明书中提及的所有出版物和专利申请均以相同程度通过 引用并入本文，如同每个出版物或专利申请被具体和单独通过引用 并入本文一样。
现已将本发明进行了全面说明，本领域技术人员应理解在没有 背离所附权利要求书的精神或范围下可对本发明进行许多改变和修 正。
序列表 <110>Gryphon Sciences <120>精确长度的聚酰胺链 <130>GRFN-029/03WO <140> <141> <150>60/124，266 <151>1999-03-11 <150>60/105，261 <151>1998-10-22 <150>60/098，351 <151>1998-08-28 <160>6 <170>PatentIn Ver.2.0 <210>1 <211>20 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：合成 <400>1 Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys Gln   1               5                  10                  15 Pro Leu Arg Gly              20 <210>2 <211>11 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：合成 <400>2 Ser Val Trp Arg Trp Leu Pro Tyr Asp Lys Tyr   1               5                  10 <210>3 <211>12 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：合成 <400>3 Ser Val Trp Arg Trp Leu Pro Tyr Asp Lys Tyr Glu   1               5                  10 <210>4 <211>13 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：合成 <400>4 Ser Val Trp Arg Trp Leu Pro Tyr Asp Lys Tyr Glu Lys   1               5                  10 <210>5 <211>24 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：合成 <400>5 Pro Gln Pro Gln Pro Lys Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Lys   1               5                  10                  15 Pro Gln Pro Lys Pro Glu Pro Glu              20 <210>6 <211>10 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：合成 <400>6 Ala Asp Gly Ala Cys Arg Asn Pro Trp Cys   1               5                  10