[0001] 本申请为2010年12月23日提交的、发明名称为“用于基因治疗和药物递送的生物可降解聚合物、其复合物及与其相关的方法”的PCT申请PCT/SG2010/000487的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2012年8月16日，申请号为201080064013.5。

[0002] 本发明涉及用于基因治疗和药物递送的生物可降解聚合物，并且更尤其是其与生物活性分子的复合物。

[0003] 基因治疗的最近进展导致亟需用于基因转染的较便宜、非细胞毒载体材料的更宽广的选择。载体材料在细胞外环境中应该包裹和保护基因货物(cargo)，将其转运过细胞膜，并在细胞内的适当位点释放该货物。通常，将载体材料分为病毒载体和非病毒载体。病毒载体在基因递送和表达方面具有良好的功效。然而，它们时常引起免疫学副反应，其生产昂贵，并且其局限于封装基因。

[0004] 非病毒载体包括阳离子聚合物和阳离子脂质(脂质复合物(lipoplex))。由于其潜在的低生产成本和分子设计的灵活性，这些材料作为病毒载体的替代物引起越来越多的关注。阳离子聚合物和阳离子脂质能静电结合至负电荷的遗传物质，以形成具有减少的净电荷的载体-基因复合物。所述复合物可潜在地促进遗传物质有效地转染至细胞中。

[0005] 理想地，聚合物-基因复合物应经胞吞作用进入细胞的胞浆。溶酶体中的酶可分解基因，在输入进溶酶体之前，复合物必须从酸性内体逃逸至细胞溶胶中。对于所述行为的关键设计特征是调整聚合物载体的胺残基，以提供缓冲能力，这引起内体的渗透膨胀和破裂，释放生物活性货物和/或生物活性货物-载体复合物(即聚合物复合物(polyplex))至胞浆中(质子海绵假说)，并由此启动基因转染。例如，阳离子聚合物如聚(乙烯亚胺)(PEI)上游离的胺残基可有效缓冲内体中的质子，引起内体的渗透膨胀和破裂。将PEI认为是具有优秀转染效率的良好的非病毒载体。这归因于其高的电荷密度和高密度的近中性仲胺位点，高电荷密度促进紧密复合物的形成，高密度的近中性仲胺位点提供缓冲能力。然而，PEI是不可生物降解的，并且还认为其具有高细胞毒性。因此，基于阳离子聚合物的合成转染载体设计中的挑战是实现低细胞毒性和高转染效率。已报道聚(β-氨基酯)(PBAEs)、修饰的PEIs、聚(氨基酸)、聚(β-氨基磺酰胺)(PBASs)、基于聚(L-赖氨酸)(PLL)的树枝状聚合物(dendrimers)和聚(酰氨基胺)(PAMAM)树枝状聚合物作为有效的非病毒载体，用于安全的基因递送。然而，所述聚合物有数个待解决的问题，尤其在合成方法方面。经缩聚作用制备的PBAEs和PBASs具有相对宽的分子量分布，PEI及其衍生物通常含有一些难以控制的枝状结构，树枝状聚合物需要多个步骤，以产生需要的分子量，并且基于氨基酸的聚合物具有高的生产成本，这归因于昂贵的原料。

[0006] 经静电相互作用的聚合物-基因复合物形成是用于遗传物质的有效的运输和保护策略，然而，该紧密包裹还存在卸装基因的问题。已探究了多个策略，以便于生物活性货物的释放，所述策略包括可降解的系统、可逆的交联、适当带电的阳离子聚合物、分级自组装的pH-敏感的三元共聚物和大量电荷移位(charge-shifting)策略。

[0007] 存在对用于基因转染和药物递送的较便宜的、较小细胞毒的、更易生物降解的合成载体的持续需求。所述载体应具有可预测的分子量和低的多分散性，并与生物活性分子特别是核苷酸形成可逆的细胞外复合物。

[0008] 因此，在一实施方案中，公开了可生物降解的阳离子聚合物，其包含：

[0009] 通过开环聚合而衍生自第一种环状羰基单体的第一种重复单元，其中超过0%的第一种重复单元包含含有季胺基团的侧链基团；

[0010] 衍生自用于开环聚合的单体二元醇引发剂的亚单元；和

[0011] 任选的封端(endcap)基团。

[0012] 在另一实施方案中，公开了形成可生物降解的阳离子聚合物的方法，其包括：

[0013] 形成第一种混合物，该混合物包含第一种环状羰基单体、催化剂、加速剂、单体二元醇引发剂和任选的溶剂，其中所述第一种环状羰基单体包含能与叔胺反应形成季胺的一价离去基团；

[0014] 形成第一种聚合物，其包含通过开环聚合而衍生自第一种环状羰基单体的第一种重复单元；

[0015] 任选地封端第一种聚合物，以形成前体聚合物；和

[0016] 用叔胺处理该前体聚合物，以形成阳离子聚合物，其中超过0%的衍生自第一种环状羰基单体的第一种重复单元包含含有季胺的侧链基团。

[0017] 在另一实施方案中，公开了形成可生物降解的阳离子嵌段共聚物的方法，其包括：

[0018] 形成反应混合物，该反应混合物包含催化剂、加速剂、单体二元醇引发剂和任选的溶剂；

[0019] 将第一种环状羰基单体加入到反应混合物中并通过开环聚合反应，顺序地随后将第二种环状羰基单体加入到反应混合物中并通过开环聚合反应，从而形成第一种嵌段共聚物，其中第一种环状羰基单体包含能与叔胺反应形成季胺的一价离去基团，并且第二种环状羰基单体不能与叔胺反应形成任何季胺；

[0020] 任选地封端第一种嵌段共聚物，从而形成前体嵌段共聚物；和

[0021] 用叔胺处理前体嵌段共聚物，形成阳离子聚合物，其中阳离子聚合物含有衍生自第一种环状羰基单体的第一种重复单元，并且超过0%的第一种重复单元包含含有季胺的侧链基团。

[0022] 在另一实施方案中，公开了聚合物复合物，其包含：

[0023] 带负电荷的生物活性物质；和

[0024] 可生物降解的阳离子聚合物，该可生物降解的阳离子聚合物包含：

[0025] 通过开环聚合而衍生自第一种环状羰基单体的第一种重复单元，其中超过0%的第一种重复单元包含含有季胺基团的侧链基团；

[0026] 衍生自用于开环聚合的单体二元醇引发剂的亚单元；和

[0027] 任选的封端基团。

[0028] 在另一实施方案中，公开了形成用于处理细胞的聚合物复合物的方法，其包括：

[0029] 使含有可生物降解的阳离子聚合物的第一种含水混合物与含有带负电荷的生物活性物质的第二种含水混合物接触，以形成含有聚合物复合物的第三种含水混合物，其中可生物降解的阳离子聚合物包含：通过开环聚合而衍生自第一种环状羰基单体的第一种重复单元、衍生自用于开环聚合的单体二元醇引发剂的亚单元和任选的封端基团，其中超过0%的第一种重复单元包含含有季胺基团的侧链基团。

[0030] 在另一个实施方案中，公开了处理细胞的方法，其包括：

[0031] 使细胞与聚合物复合物的纳米颗粒接触，所述聚合物复合物包含可生物降解的阳离子聚合物和带负电荷的生物活性物质；其中可生物降解的阳离子聚合物包含：通过开环聚合而衍生自第一种环状羰基单体的第一种重复单元、衍生自用于开环聚合的单体二元醇引发剂的亚单元和任选的封端基团，其中超过0%的第一种重复单元包含含有季胺基团的侧链基团。

[0032] 从下面的详述、附图和附随的权利要求书，本领域技术人员将明白和理解本发明的上述及其他特征和优点。

[0033] 图1是实施例15的阳离子聚合物与DNA制备的聚合物复合物在不同pH和各种N/P比率下的琼脂糖凝胶电泳试验的摄影图。

[0034] 图2是显示在pH7.0、6.0和5.0制备的聚合物复合物的N/P比率和颗粒尺寸之间的关系的柱状图。

[0035] 图3是显示在pH7.0、6.0和5.0制备的聚合物复合物的N/P比率和ζ电位(zeta potential)之间的关系的柱状图。

[0036] 图4是柱状图，其比较在不同pH和N/P比率装配的聚合物复合物在HepG2人肝癌细胞株中的荧光素酶表达水平。还显示了DNA和PEI/DNA对照。

[0037] 图5是比较不同pH和N/P比率的细胞生存力的柱状图。

[0038] 详述

[0039] 公开了可生物降解的阳离子聚合物，其与生物活性分子形成纳米尺寸的复合物，并且其比其它载体例如聚(乙烯亚胺)(PEI)具有更低的细胞毒性。通过具有能与叔胺反应以形成含有季胺的基团的一价离去基团例如烷基卤化物或磺酸酯的第一种环状羰基单体的开环聚合(ROP)衍生得到阳离子聚合物。选择其它环状羰基单体作为前者的稀释剂，以提供疏水性和/或为聚合物提供电荷移位能力。阳离子聚合物可以是密集荷电的，并因此自由地溶解于水中，或者具有两亲性，在水溶液中形成纳米颗粒。所述开环方法使得能够精确控制聚合物的分子量，实现低的多分散性，并且其可与许多官能团相容。用于形成含有季胺的基团的与叔胺反应可以在开环聚合之前或之后进行，更特别是在聚合之后进行。季胺化作用伴随有阳离子聚合物的最小交联(如果有的话)。环状羰基单体的示例包括环状碳酸酯单体和内酯，包括交酯，它们开环以分别形成包含碳酸酯和酯重复单元的聚合物。季胺位于聚合物的侧链，并且如果需要，季胺可直接连接至聚合物主链上。带正电荷的季胺基团提供与带负电荷的生物活性物质的键合力。在一实施方案中，叔胺是双叔胺，并且阳离子聚合物包含含有季胺和叔胺的侧链基团。侧链叔胺基团提供缓冲力，以促进生物活性物质从聚合物复合物释放。可使用其它官能团，以促进生物活性物质从聚合物复合物释放，所述官能团例如仲胺基团、甲基顺丁烯二酰胺基团、酯基团和亚胺基团。能移位电荷的阳离子聚合物还可促进生物活性物质的释放。在电荷移位中，聚合物复合物进入细胞后，通过阳离子聚合物侧链的无电荷基团转变成带负电荷的基团，从而降低阳离子聚合物的净正电荷。能移位电荷的阳离子聚合物除季胺之外可包含例如潜在的羧酸基团如缩醛酯。在内体环境的温和酸性条件下，缩醛酯可被水解，形成羧酸基团。在细胞溶胶的更强碱性条件下，羧酸基团成为离子化的，从而降低阳离子聚合物的净正电荷，并使得释放带负电荷的生物活性物质的。对于具体的生物活性物质，环状羰基单体的开环聚合使得能够调整阳离子聚合物的电荷移位能力。阳离子聚合物可以是线性的或支链的，并可被容易地修饰，以调整电荷和缓冲强度。阳离子聚合物与基因一起形成具有大约10nm至大约250nm平均颗粒尺寸的复合物(即聚合物复合物)。

[0040] 美国材料试验协会(American Society for Testing and Materials)将术语“可生物降解的”定义为由生物活性尤其是酶作用引起的降解，其引起物质化学结构的显著变化。对于本文的目的，根据ASTM D6400，如果在180天内，物质进行60%的生物降解，则物质是“可生物降解的”。

[0041] 对于本文的目的，“货物”可以是与公开的阳离子聚合物形成可逆的纳米尺寸的复合物的任何生物活性物质，条件是复合物经胞吞进入细胞，并且复合物在细胞内的预期位点释放生物活性物质。生物活性物质包括生物分子(例如DNA、基因、肽、蛋白质、酶、脂质、磷脂和核苷酸)、天然的或合成的有机化合物(例如药物、染料、合成聚合物、寡聚体和氨基酸)、无机物质(例如金属和金属氧化物)、上述物质的放射性变体和上述物质的组合。“生物活性的”意指能以预期的方式改变细胞的化学结构和/或活性的物质，或者相对于另一种细胞类型能以预期的方式选择性改变一种细胞类型的化学结构和/或活性的物质。作为一示例，一种需要的化学结构的改变可能是将基因掺入细胞的DNA中。需要的活性改变可能是转染基因的表达。另一细胞活性的改变可能是需要的激素或酶的诱导生产。或者，需要的活性改变可能是一种细胞类型相对于另一种细胞类型的选择性死亡。对生物活性物质引起的细胞活性的相对变化未加以限制，前提是该变化是需要的和有用的。并且，对所谓的“货物”未施加限制，前提是当从复合物释放时，该货物诱导有用的细胞应答。

[0042] 在环状羰基单体的通式的下述描述中，“第一种环状羰基单体”指第一种类型的环状羰基单体，其包含能与叔胺反应而形成含有季胺的基团的一价离去基团。术语“第二种环状羰基单体”指第二种类型的环状羰基单体，其不含能与叔胺反应而形成含有任何季胺的基团的一价离去基团。在其它方面，第一种和第二种环状羰基单体可具有选自任何下述式的结构。

[0043] 环状羰基单体可独立地选自通式(1)的化合物：

[0044]

[0045] 其中t是0-6的整数，并且当t是0时，标记为4和6的碳通过单键连接在一起。各Y是二价基团，其独立地选自 和 其中破折号“-”表示连接位点。在文
1 1 1
中后面的两个基团还表示为-N(Q)-和-C(Q)2-。各Q是一价基团，其独立地选自氢、卤化物、羧基、含有1-30个碳的烷基、含有6-30个碳原子的芳基或者具有结构 的基团，
1 1 1 1 1 1 1
其中M是选自-R 、-OR、-NHR、-NRR或-SR 的一价基团，其中破折号表示连接位点，并且
1
各R是一价基团，其独立地选自含有1-30个碳的烷基或者含有6-30个碳的芳基。一个或
1
多个Q基团可进一步包含能与叔胺反应而形成含有季胺(即与四个碳键合的带正电荷的季铵离子)的基团的一价离去基团。一价离去基团的非限制性示例包括烷基卤化物形式的卤化物(例如烷基氯化物、烷基溴化物或烷基碘化物)、磺酸酯(例如甲苯磺酸酯或甲磺酸
1 1
酯)和环氧化物。各Q基团可以独立地是支链的或者非支链的。各Q 基团还可以独立地包含其它的官能团，包括酮基、醛基、烯基、炔基、含有3-10个碳的脂环族环、含有2-10个碳的杂环、醚基、酰胺基、酯基和上述其它官能团的组合。杂环可包含氧、硫和/或氮。两个或
1 1 1
更多个Q基团可一起形成环。式(1)的第一种环状羰基单体包含一个或多个Q 基团，该Q基团包含能与叔胺反应而形成含有季胺的基团的一价离去基团。式(1)的第二种环状羰基单体不含能与叔胺反应而形成含有任何季胺的基团的官能团。

[0046] 能开环聚合的更具体的环状羰基单体具有通式(2)的结构：

[0047]

[0048] 其中Q2是一价基团，其独立地选自氢、卤化物、羧基、含有1-30个碳的烷基、含有1 1 1 1 1 1
6-30个碳原子的芳基和具有结构 的基团，其中M是选自-R 、-OR、-NHR、-NRR
或-SR1的一价基团，其中各R1是一价基团，其独立地选自含有1-30个碳的烷基和含有6-30个碳的芳基；R2是一价基团，其独立地选自含有1-30个碳的烷基和含有6-30个碳的芳基；
并且Q3是选自氢、含有1-30个碳的烷基和含有6-30个碳的芳基的一价基团。在一实施方案中，各Q2是氢，Q3是甲基或乙基基团，并且R2是含有1-30个碳的烷基基团。式(2)的第一
2
种环状羰基单体包含含有能与叔胺反应而形成含有季胺的基团的一价离去基团的R基团。
式(2)的第二种环状羰基单体不含能与叔胺反应而形成含有任何季胺的基团的官能团。

[0049] 另一种更具体的环状羰基单体具有通式(3)：

[0050]

[0051] 其中各Q4是一价基团，其独立地选自氢、卤化物、羧基、含有1-30个碳的烷基、含有6-30个碳原子的芳基和具有结构 的基团，其中M1是选自-R1、-OR1、-NHR1、-NR1R11 1
或-SR的一价基团，其中各R 是一价基团，其独立地选自含有1-30个碳的烷基和含有6-30个碳的芳基；并且u是1-8的整数。所述内酯环可任选地包含碳-碳双键；也就是说，任选地，式(3)的 基团可独立地表示 基团。所述内酯环还可包含杂原子例如氧、氮、硫
1 1 1
或其组合；也就是说，任选地，式(3)的 基团可独立地表示-O-、-S-、-NHR或-NR R
1
基团，其中R具有上文所述的相同定义。式(3)的第一种环状羰基单体包含含有能与叔胺
4
反应而形成含有季胺的基团的一价离去基团的一个或多个Q基团。式(3)的第二种环状羰基单体不含能与叔胺反应而形成含有任何季胺的基团的官能团。在一实施方案中，u是1-6
4
的整数，并且各Q是氢。

[0052] 另一个更具体的环状羰基单体是通式(4)的二 烷二羰基：

[0053]5

[0054] 其中各Q是一价基团，其独立地选自氢、卤化物、羧基、含有1-30个碳的烷基、含1 1 1 1 1 1
有6-30个碳原子的芳基和具有结构 的基团，其中M是选自-R 、-OR、-NHR、-NRR
1 1
或-SR的一价基团，其中各R 是一价基团，其独立地选自含有1-30个碳的烷基和含有6-30
6
个碳的芳基；各R是一价基团，其独立地选自氢、含有1-30个碳的烷基和含有6-30个碳的
5
芳基；并且各v独立地是1-6的整数。式(4)的第一种环状羰基单体包含一个或多个Q基
6
团和/或Q基团，其包含能与叔胺反应而形成含有季胺的基团的一价离去基团。式(4)的第二种环状羰基单体不含能与叔胺反应而形成含有任何季胺的基团的官能团。在一实施方
5 6
案中，各v是1，各Q是氢，且各Q 是含有1-6个碳的烷基基团。

[0055] 所述环状羰基化合物可具有一个或多个不对称碳中心，其可以以异构体富集的形式，作为R-异构体或S-异构体存在。此外，各不对称碳中心可独立地以80%或以上，更尤其是90%的对映异构体过量存在。

[0056] 具有烷基卤化物形式的一价离去基团的式(1)或(2)环状羰基单体的示例包括表1的环状单体。

[0057] 表1.

[0058]

[0059] 式(2)环状羰基单体的其它示例包括表2的化合物。所述化合物可例如用作表1的卤化物单体的开环聚合的共聚单体，以形成随机共聚物或者嵌段共聚物。

[0060] 表2.

[0061]

[0062]

[0063] 式(3)的环状羰基单体的示例包括表3的化合物。

[0064] 表3.

[0065]

[0066]

[0067] 式(4)的环状羰基单体的示例包括表4的化合物。

[0068] 表4.

[0069]

[0070]

[0071] 如上所述，对于基因物质来讲，经静电作用的复合体形成是有效的包裹策略；然而，转染后的释放通常是困难的，由此转染率可能是低的。为了克服所述问题，可利用电荷移位策略，其中环状羰基单体包含潜在的羧酸基团。这意指阳离子聚合物包含悬垂的保护的羧酸，其可在大约pH 5(相应于内体环境的pH)转化成羧酸。潜在的羧酸基团的示例是缩醛保护的羧酸基团，文中还称为缩醛酯基团。缩醛酯基团具有通式(5)的结构

[0072]

[0073] 其中*-表示至环状羰基基团的键，并且Rc和Rd是独立地包括1-20个碳的一价基c d团。在一实施方案中，R是甲基，且R 是乙基。在另一实施方案中，第二种环状羰基单体是MTCOEE：

[0074]

[0075] 当共聚至阳离子聚合物时，衍生自MTCOEE的重复单元包含酸性内体环境中易于脱保护的侧链缩醛酯。一旦释放至胞浆，得到的阳离子聚合物的羧酸基团可去质子化，因此中和载体上的净电荷，并潜在地促进生物活性物质的释放。衍生自MTCOEE的阳离子聚合物能够结合DNA，以形成具有90-110nm平均直径的自组装纳米颗粒。

[0076] 促进内体释放的另一策略涉及稳定生物活性货物的非共价的相互作用，例如利用包含氟化的叔醇基团的环状羰基单体。已知氟化的叔醇基团与磷酸酯及相关结构结合，但是具有比静电相互作用低的相互作用能量，并因此更易于释放。

[0077] 可通过从溶剂例如乙酸乙酯中重结晶或者通过其它已知的纯化方法来纯化上述的单体，特别注意的是要从所述单体除去尽可能多的水。单体含水量可以是单体重量的1-10,000ppm，1-1,000ppm，1-500ppm，并最尤其是1-100ppm。

[0078] 上述环状羰基单体(至少其中一个包含能与叔胺反应形成季胺的一价离去基团)进行开环聚合形成第一种聚合物。第一种聚合物是能启动与相同或不同的环状羰基单体或者环状羰基单体的混合物的链增长来形成嵌段共聚物的活聚合物。将第一种聚合物任选地用封端剂处理，以防止进一步链生长，并稳定反应性的末端基团。然后，将产生的前体聚合物用叔胺处理，以形成阳离子聚合物。第一种聚合物、前体聚合物和阳离子聚合物可以以无规立构、间同立构或全同立构形式产生。具体的立构规整度取决于环状单体、异构体纯度和反应条件。

[0079] 或者，可通过含有季胺基团和叔胺基团的环状羰基单体的开环聚合来得到阳离子聚合物。然而，这些单体更难制备，更不稳定，并且相应的聚合物倾向于是更多分散的。因此，季铵化反应在开环聚合之后进行。

[0080] 在最简单的实例中，第一种聚合物是从包含第一种环状羰基单体、催化剂、加速剂、单体二元醇引发剂和任选的溶剂的反应混合物制备的同聚物，所述第一种环状羰基单体包含能与叔胺反应形成含有季胺的基团的一价离去基团。在一实施方案中，催化剂和加速剂是相同的物质。例如，可单独利用1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)而无其它催化剂进行一些开环聚合。通常在惰性气氛例如氮气或氩气下、于反应器中进行开环聚合。可通过在惰性溶剂(例如苯、甲苯、二甲苯、环己烷、正己烷、二氧六环、氯仿和二氯乙烷)中的溶液聚合或者通过本体聚合来进行所述聚合。ROP反应温度可以是从大约环境温度至250℃。通常，在大气压下，将反应混合物加热0.5-72小时，以实现聚合，形成包含第一种聚合物的第二种混合物。衍生自单体二元醇引发剂的亚单元连接至由其生长各开环聚合物链的末端。然后，任选地将第一种聚合物封端，以形成前体聚合物。然后，将前体聚合物与叔胺反应，以形成阳离子聚合物，其中超过0%的衍生自第一种羰基单体的重复单元包含含有季胺的侧链基团。

[0081] 第一种聚合物还可以是通过含有例如第一种环状羰基单体和疏水性的第二种环状羰基单体的混合物开环聚合形成的随机共聚物。可将该随机的第一种聚合物封端，以形成随机的前体共聚物。在该情况下，衍生自引发剂的亚单元和含有封端基团的末端重复单元可与衍生自单体之一的重复单元连接。然后，将随机前体共聚物用叔胺处理，以形成随机的阳离子共聚物，其中超过0%的衍生自第一种环状羰基单体的重复单元包含含有季胺的基团。衍生自第二种环状羰基单体的重复单元不包含能与叔胺反应形成任何季胺的一价离去基团。应该理解：如果需要，反应混合物可包含第一种类型和/或第二种类型的其它环状羰基单体。

[0082] 更尤其是，第一种聚合物是由例如第一种环状羰基单体和疏水性的第二种环状羰基单体顺序开环聚合形成的嵌段共聚物，以形成第一种嵌段共聚物。然后，任选地将第一种嵌段共聚物封端，以形成前体嵌段共聚物。然后，将前体嵌段共聚物用叔胺处理，以形成阳离子嵌段共聚物，其中超过0%的衍生自第一种环状羰基单体的重复单元包含含有季胺的侧链基团。同前，衍生自第二种环状羰基单体的重复单元不包含能与叔胺反应形成季胺的一价离去基团。根据开环聚合的顺序，衍生自单体二元醇引发剂的亚单元可连接至衍生自第一种环状羰基单体的第一种重复单元或者连接至衍生自第二种羰基单体的第二种重复单元。在一实例中，首先将第一种环状羰基单体聚合，形成嵌段共聚物的第一个嵌段，并且其次将第二种环状羰基单体聚合，形成嵌段共聚物的第二个嵌段。在所述实例中，阳离子嵌段共聚物包含衍生自第一种环状羰基单体的亲水核心嵌段(其与衍生自单体二元醇引发剂的亚单元连接)和衍生自第二种羰基单体的疏水外部嵌段(其任选被封端)。在另一个实例中，首先将第二种环状羰基单体聚合，其次将第一种环状羰基单体聚合。在该实例中，阳离子嵌段共聚物包含连接至衍生自二元醇引发剂的亚单元的含有第二种重复单元的疏水核心嵌段和任选封端的亲水外部嵌段。如果需要，可利用第一种环状羰基单体、第二种环状羰基单体、不同的环状羰基单体或其组合从未封端链的活末端生长其它的嵌段。该嵌段共聚物是两亲的，在水溶液中形成自组装的纳米尺寸的颗粒。

[0083] 用于ROP聚合的示例性的催化剂包括金属氧化物例如四甲氧基锆、四异丙氧基锆、四异丁氧基锆、四正丁氧基锆、四叔丁氧基锆、三乙氧基铝、三正丙氧基铝、三异丙氧基铝、三正丁氧基铝、三异丁氧基铝、三仲丁氧基铝、单仲丁氧基-二异丙氧基铝、乙酰乙酸乙基铝二异丙酯(ethyl acetoacetate aluminum diisopropylate)、三(乙基乙酰乙酸)铝、四乙氧基钛、四异丙氧基钛、四正丙氧基钛、四正丁氧基钛、四仲丁氧基钛、四叔丁氧基钛、三异丙氧基镓、三异丙氧基锑、三异丁氧基锑、三甲氧基硼、三乙氧基硼、三异丙氧基硼、三正丙氧基硼、三异丁氧基硼、三正丁氧基硼、三仲丁氧基硼、三叔丁氧基硼、三异丙氧基镓、四甲氧基锗、四乙氧基锗、四异丙氧基锗、四正丙氧基锗、四异丁氧基锗、四正丁氧基锗、四仲丁氧基锗和四叔丁氧基锗；卤化化合物，例如五氯化锑、氯化锌、溴化锂、氯化锡(IV)、氯化镉和三氟化硼乙醚；烷基铝，例如三甲基铝、三乙基铝、氯化二乙基铝、二氯化乙基铝和三异丁基铝；烷基锌，例如二甲基锌、二乙基锌和二异丙基锌；叔胺，例如三丙烯胺、三乙胺、三正辛胺和苄基二甲基胺；杂多酸，例如磷钨酸、磷钼酸、硅钨酸，及其碱金属盐；锆化合物，例如锆酸氯化物(zirconium acid chloride)、辛酸锆、硬脂酸锆和硝酸锆。更具体而言，催化剂是辛酸锆、四烷氧基锆或三烷氧基铝化合物。

[0084] 其它ROP催化剂包括可以为具有受控的、可预期的分子量和窄的多分散性的聚合物提供平台的不含金属的有机催化剂。环状酯、碳酸酯和硅氧烷的ROP的有机催化剂的实例是4-二甲基氨基吡啶、膦类、N-杂环卡宾(NHC)、双功能氨基硫脲、磷腈、脒和胍。在一实施方案中，催化剂是N-(3,5-三氟甲基)苯基-N’-环己基-硫脲(TU)：

[0085]

[0086] 其它不含金属的ROP催化剂包含至少一个1,1,1,3,3,3-六氟丙烷-2-醇-2-基(HFP)。单一氢键供体催化剂具有式(6)：

[0087] R2–C(CF3)2OH (6)

[0088] R2表示氢或含有1至20个碳的一价基团，例如烷基、被取代的烷基、环烷基、被取代的环烷基、杂环烷基、被取代的杂环烷基、芳基、被取代的芳基或其组合。表5列出了示例性的单一氢键供体催化剂。

[0089] 表5.

[0090]

[0091] 双氢键供体催化剂具有两个HFP基团，由通式(7)表示：

[0092]

[0093] 其中R3是含有1至20个碳的二价桥连基团，例如亚烷基、被取代的亚烷基、亚环烷基、被取代的亚环烷基、亚杂环烷基、被取代的亚杂环烷基、亚芳基、被取代的亚芳基和其2
组合。代表性的式(7)的双氢键催化剂包括表6所列的那些。在特定实施方案中，R是亚芳基或被取代的亚芳基，HFP基团占据芳香环上彼此为间位的位置。

[0094] 表6.

[0095]

[0096] 在一 实施 方案 中，催 化剂 选自 4-HFA-St、4-HFA-Tol、HFTB、NFTB、HPIP、3,5-HFA-MA、3,5-HFA-St、1,3-HFAB、1,4-HFAB及其组合。

[0097] 还关注包含与载体结合的含HFP基团的催化剂。在一实施方案中，所述载体包括聚合物、交联聚合物小珠、无机颗粒或金属颗粒。含HFP的聚合物可以通过已知方法形成，所述方法包括含HFP的单体(例如甲基丙烯酸酯单体3,5-HFA-MA或苯乙烯基单体3,5-HFA-St)的直接聚合。可以进行直接聚合(或与共聚单体聚合)的含HFP的单体
中的官能团包括丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、α,α,α-三氟甲基丙烯酸酯、α-卤代甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺基、甲基丙烯酰胺基、降冰片烯、乙烯基、乙烯醚和本领域已知的其它基团。这类可聚合的含HFP的单体的典型实例可以在下列文献中找到：Ito等人,Polym.Adv.Technol.2006,17(2),104-115,Ito 等 人 ,Adv.Polym.Sci.2005,172,37-245,Ito等 人 ,US20060292485,Maeda 等 人 .WO2005098541,Allen 等 人 .US20070254235, 和Miyazawa等人.WO2005005370。或者，预形成的聚合物和其它固体载体表面可以通过经由连接基团将含HFP的基团化学键合到聚合物或载体上而进行修饰。这类聚合物或载体的实例参考M.R.Buchmeiser,编辑.“Polymeric Materials in Organic Synthesis and Catalysis”(有机合成和催化中的聚合物质),Wiley-VCH,2003,M.Delgado和
K.D.Janda“Polymeric Supports for Solid Phase Organic Synthesis”(固相有机合成的聚合载体),Curr.Org.Chem.2002,6(12),1031-1043,A.R.Vaino和K.D.Janda“Solid Phase Organic Synthesis:A Critical Understanding of the Resin”(固相有机合成：树脂的关键理解),J.Comb.Chem.2000,2(6),579-596,D.C.Sherrington“Polymer-supported Reagents,Catalysts,and Sorbents:Evolution and Exploitation–A Personalized View”(以聚合物为载体的试剂、催化剂和吸附剂：演变和开发-个人观点),J.Polym.Sci.A.Polym.Chem.2001,39(14),2364-2377,和T.J.Dickerson等人.“Soluble Polymers as Scaffold for Recoverable Catalysts and Reagents”(可溶性聚合物作为可回收催化剂和试剂的支架),Chem.Rev.2002,102(10),3325-3343。连接基团的实例包括C1-C12烷基、C1-C12杂烷基、醚基、硫醚基、氨基、酯基、酰胺基或其组合。还关注包含通过离子缔合与聚合物或载体表面上带有相反电荷的位点结合的含HFP的带电荷基团的催化剂。

[0098] ROP反应混合物包含至少一种催化剂，当适宜时，包含数种催化剂一起。ROP催化剂以相对于环状羰基单体而言1/20至1/40,000摩尔、优选1/1,000至1/20,000摩尔的比例添加。

[0099] 开环聚合在加速剂、特别是氮碱的存在下进行。下文列出了示例性的氮碱加速剂，包括吡啶(Py)、N,N-二甲基氨基环己烷(Me2NCy)、4-N,N-二甲基氨基吡啶(DMAP)、反式1,2-双(二甲基氨基)环己烷(TMCHD)、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)、
1,5,7-三氮杂二环[4.4.0]癸-5-烯(TBD)、7-甲基-1,5,7-三氮杂二环[4.4.0]癸-5-烯(MTBD)、(-)-司巴丁(Sp)、1,3-双(2-丙基)-4,5-二甲基咪唑-2-亚基(Im-1)、1,3-双(2,4,6-三甲基苯基)咪唑-2-亚基(Im-2)、1,3-双(2,6-二异丙基苯基(咪唑-2-亚基
(Im-3)、1,3-双(1-金刚烷基)咪唑-2-亚基(Im-4)、1,3-二异丙基咪唑-2-亚基(Im-5)、
1,3-二叔丁基咪唑-2-亚基(Im-6)、1,3-双(2,4,6-三甲基苯基)-4,5-二氢咪唑-2-亚基(Im-7)、1,3-双(2,6-二异丙基苯基)-4,5-二氢咪唑-2-亚基、1,3-双(2,6-二异丙基苯基)-4,5-二氢咪唑-2-亚基(Im-8)或其组合，如表7所示。

[0100] 表7.

[0101]

[0102]

[0103] 在一实施方案中，加速剂具有两个或三个氮，每个氮能够作为路易斯碱参与，例如在结构(-)-司巴丁中。较强的碱通常提高聚合速率。

[0104] ROP反应混合物还包含引发剂。引发剂通常包括亲核物质例如醇、胺和硫醇。引发剂可以是单功能的、双功能的或者多功能的例如树枝状的、聚合的或者相关的结构。单功能的引发剂可包括具有保护的官能团的亲核物质，所述保护的官能团包括硫醇、胺、酸和醇。醇引发剂可以是任何适当的醇，包括一元醇、二元醇、三元醇或其它多元醇，前提是醇的选择不会不利地影响聚合产率、聚合物分子量、与生物活性物质的复合和/或所需的产物聚合物的机械和物理性质。醇还可以是多功能的，除一个或者多个羟基基团之外，包含卤化物、醚基、酯基、酰胺基或其它官能团。示例性的醇包括甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、戊基醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一醇、月桂醇、十三醇、肉豆蔻醇、十五醇、十六醇、十七醇、硬脂醇、十九醇和其它饱和的脂肪醇、环戊醇、环己醇、环庚醇、环辛醇和其它环状脂肪醇、苯酚、取代的苯酚、苄醇、取代的苄醇、苯二甲醇、三羟甲基丙烷、糖、聚(乙二醇)、丙二醇、衍生自寡聚醇的醇功能化的嵌段共聚物或者衍生自支链醇的醇功能化的支链聚合物或其组合。在一实施方案中，ROP引发剂是单体二元醇，其选自乙二醇类、丙二醇类、氢醌类和间苯二酚类。甚至更尤其是，引发剂是BnMPA，一种在环状碳酸酯单体制备中所用的前体：

[0105]

[0106] 开环聚合反应可在利用或者不利用溶剂的条件下进行。任选的溶剂包括二氯甲烷、氯仿、苯、甲苯、二甲苯、氯苯、二氯苯、三氟甲苯、石油醚、乙腈、戊烷、己烷、庚烷、2,2,4-三甲基戊烷、环己烷、乙醚、叔丁基甲醚、异丙醚、二氧六环、四氢呋喃或包含上述溶剂之一的组合。当存在溶剂时，适当的单体浓度是大约0.1-5摩尔/升，并更尤其是大约
0.2-4摩尔/升。在一具体的实施方案中，用于开环聚合的反应混合物是无溶剂的。

[0107] 开环聚合可在大约环境度或者更高的温度下进行，更尤其是在15℃-200℃的温度下，并更特别是20℃-200℃的温度下进行。当反应以本体(in bulk)进行时，聚合在50℃或者更高的温度、并更特别是100℃-200℃的温度下进行。反应时间因溶剂、温度、搅拌速率、压力和设备而变化，但是一般来讲，聚合在1-100小时内完成。

[0108] 无论在溶液中还是以本体完成，聚合在惰性(即干燥)气氛和在100-500MPa(1-5atm)的压力下、更通常在100-200MPa(1-2atm)的压力下进行。反应完成后，可利用减压除去溶剂。

[0109] 催化剂以基于环状羰基单体总摩尔量的大约0.2-20mol%、0.5-10mol%、1-5mol%或者1-2.5mol%的量存在。

[0110] 氮碱加速剂以基于环状羰基单体总摩尔量的0.1-5.0mol%、0.1-2.5mol%、0.1-1.0mol%或者0.2-0.5mol%的量存在。如上所述，在一些情况下，催化剂和氮碱加速剂可以是相同的化合物，这取决于具体的环状羰基单体。

[0111] 基于醇引发剂中每一羟基基团的等价分子量(equivalent molecular weight)计算引发剂的量。羟基基团以基于环状羰基单体总摩尔量的0.001-10.0mol%、0.1-2.5mol%、0.1-1.0mol%和0.2-0.5mol%的量存在。例如，如果引发剂的分子量是100g/摩尔，并且引发剂具有2个羟基基团，那么每个羟基基团的等价分子量是50g/摩尔。如果聚合需要5mol%羟基基团/摩尔单体，那么引发剂的量是0.05x50=2.5g/摩尔单体。

[0112] 在一具体的实施方案中，催化剂以大约0.2-20mol%的量存在，氮碱加速剂以0.1-5.0mol%的量存在，并且基于引发剂中每羟基基团等价分子量，引发剂的羟基基团以
0.1-5.0mol%的量存在。

[0113] 如上所述，第一种聚合物是活聚合物。第一种聚合物包含末端羟基基团、末端巯基基团或者末端胺基团，它们每一个可启动ROP链生长。因此，将第一种聚合物封端，以防止进一步链生长和/或稳定主链。在聚合物化学中良好地确立了封端物质和技术。这些包括例如用于将末端羟基基团转化成酯的物质，例如羧酸酸酐、羧酸酰氯或反应活性的酯(例如对硝基苯基酯)。在一实施方案中，将第一种聚合物用乙酸酐处理，以将链用乙酰基基团封端，形成前体聚合物。

[0114] 第一种聚合物和/或前体聚合物可具有根据分子排阻色谱测定的至少2500g/mol、更尤其是4000g/mol-150000g/mol、并甚至更尤其是10000g/mol-50000g/mol的数均分子量Mn。在一实施方案中，第一种聚合物和/或前体聚合物具有10000至20000g/mol的数均分子量Mn。第一种聚合物和/或前体聚合物还具有窄的多分散性指数(PDI)，通常是1.01-1.35，更特别是1.10-1.30，并甚至更特别是1.10-1.25。第一种聚合物和/或前体聚合物可以是同聚物、随机共聚物或嵌段共聚物。在一实施方案中，阳离子聚合物是聚酯同聚物、随机聚酯共聚物、聚碳酸酯同聚物、随机聚碳酸酯共聚物或者随机聚酯碳酸酯共聚物。

[0115] 可通过选择性沉淀除去催化剂，或者在固体负载的催化剂的情况中，可简单地经过滤除去催化剂。第一种聚合物可以以基于第一种聚合物和残留催化剂的总重量的超过0wt.%(重量百分数)的量含有残留的催化剂。基于第一种聚合物和残留催化剂的总重量，残留的催化剂的量还可以低于20wt.%、低于15wt.%、低于10wt.%、低于5wt.%、低于1wt.%或者最尤其是低于0.5wt.%。类似地，前体聚合物可以以基于前体聚合物和残留催化剂的总重量的超过0wt.%的量含有残留的催化剂。基于前体聚合物和残留催化剂的总重量，残留的催化剂的量还可以是低于20wt.%、低于15wt.%、低于10wt.%、低于5wt.%、低于1wt.%或者最尤其是低于0.5wt.%。

[0116] 前体聚合物包含衍生自第一种环状羰基单体的第一种重复单元。第一种重复单元包含含有反应性的一价离去基团的侧链基团，当用叔胺处理时，其产生包含含有季胺的基团的阳离子聚合物。对叔胺的结构未施加限制，前提是该叔胺能与超过0%、10%或以上、20%或以上、30%或以上、40%或以上、50%或以上、60%或以上、70%或以上或者更特别是80%或以上的第一种重复单元的一价离去基团反应，形成含有季胺的侧链基团。

[0117] 叔胺可包含一个氮例如三烷基胺，包括但不限于三甲胺、三乙胺、三丙胺等。叔胺还可包括另外的官能团，特别是羧酸基团，例如3-(N,N-二甲基氨基)丙酸。在此类情况下，阳离子聚合物将包含第一种重复单元，所述重复单元包含含有季胺和羧酸基团的侧链基团。

[0118] 叔胺还可包括同位素富集形式的叔胺，例如三甲胺-14C、三甲胺-15N、三甲胺-15N、13 15
三甲基- C3-胺、三甲基-d9-胺和三甲基-d9-胺- N。叔胺还可包含适合于靶向特定细胞类型例如癌症细胞的放射性基团。放射性基团可含有重金属放射性同位素。

[0119] 更具体地讲，叔胺是通式(8)的双叔胺：

[0120]

[0121] 其中L″是含有2-30个碳的二价连接基团，并且各一价的Rb基团独立地选自含有b1-30个碳的烷基或者含有6-30个碳的芳基。各R基团可以独立地是支链的或者非支链的。
b
各R基团可以独立地包含其它的官能团，例如酮基、醛基、羟基、烯基、炔基、含有3-10个碳的脂环族环、含有2-10个碳的杂环、醚基、酰胺基、酯基和上述其它官能团的组合。杂环可b
包含氧、硫和/或氮。两个或更多个R基团还可一起形成环。代表性的L″基团包括-(CH2)z′-(其中z′是2-30的整数)、-(CH2CH2O)z″CH2CH2-(其中z″是1-10的整数)、-CH2CH2SCH
2CH2-、-CH2CH2SSCH2CH2-、-CH2CH2SOCH2CH2-和-CH2CH2SO2CH2CH2-。L″还可包含含有3-20个碳的一价或二价脂环族环、含有6-20个碳的一价或二价芳环、酮基、醛基、羟基、烯基、炔基、含有2-10个碳的杂环、醚基、酰胺基、酯基和上述官能团的组合。杂环可包含氧、硫和/或氮。
双叔胺还可包括同位素富集形式的双叔胺，例如其氘、碳-13和/或氮-15富集的形式。

[0122] 更具体的双 叔胺包括N,N,N′,N ′-四甲基-1,2-乙二 胺(TMEDA)、N,N,N′,N′-四甲基-1,3-丙二胺(TMPDA)、N,N,N′,N′-四甲基-1,4-丁二胺(TMBDA)、N,N,N′,N′-四乙基-1,2-乙二胺(TEEDA)、N,N,N′,N′-四乙基-1,3丙二胺(TEPDA)、
1,4-双(二甲基氨基)环己烷、1,4-双(二甲基氨基苯)、N,N,N′,N′-四乙基-1,4-丁二胺(TEBDA)、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、4,4-二吡啶基-1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷(DABCO)、4-吡咯烷子基吡啶、1-甲基苯并咪唑及其组合。在一实施方案中，双叔胺是TMEDA。

[0123] 在适当的有机溶剂例如二甲基亚砜(DMSO)中用叔胺处理前体聚合物，以形成阳离子聚合物。利用相对于一价离去基团而言过量的叔胺，在无水条件下，于环境温度或者升高的温度进行所述反应。一般来讲，对于前体聚合物中的每摩尔一价离去基团，使用2-10摩尔的量的叔胺；更特别是对于前体聚合物中的每摩尔一价离去基团，使用3-8摩尔的量的叔胺；甚至更特别是对于前体聚合物中的每摩尔一价离去基团，使用3-5摩尔的量的叔胺。带正电荷的季胺与置换的离去基团形成盐，置换的离去基团变成带负电荷的抗衡离子。或者。如果需要，利用已知的方法，带负电荷的抗衡离子可以与另外的更适当的带负电荷的抗衡离子进行离子交换。

[0124] 通过在有机溶剂例如四氢呋喃中的一次或多次沉淀，随后过滤和真空干燥，分离得到阳离子聚合物。超过0%的第一种重复单元包含含有季胺基团的侧链基团。当用双叔胺处理前体聚合物时，超过0%的第一种重复单元包含含有季胺基团和叔胺基团的侧链基团。当用含有羧基的叔胺处理前体聚合物时，超过0%的衍生自第一种环状羰基单体的第一种重复单元包含含有季胺和羧酸的侧链基团。季胺基团以衍生自第一种环状羰基单体的侧链一价离去基团的超过0%的量存在于阳离子聚合物中。更具体地讲，季胺基团以衍生自第一种环状羰基单体的侧链一价离去基团的10%-100%、20%-100%、30%-100%、40%-100%、50%-100%、60%-100%、70%-100%或者80%-100%的量存在于阳离子聚合物中。当用双叔胺处理前体聚合物时，叔胺基团以前体聚合物的第一种重复单元中的一价离去基团的超过0%的量存在于阳离子聚合物中，更特别是以前体聚合物的第一种重复单元中的一价离去基团的10%-100%、20%-100%、30%-100%、40%-100%、50%-100%、60%-100%、70%-100%或者80%-100%的量存在于阳离子聚合物中。

[0125] 阳离子聚合物可具有根据分子排阻色谱测定的至少2500g/mol、更尤其是4000g/mol-150000g/mol，并甚至更尤其是10000g/mol-50000g/mol的数均分子量Mn。在一实施方案中，阳离子聚合物具有10000g/mol-20000g/mol的数均分子量Mn。阳离子聚合物还具有窄的多分散性指数(PDI)，通常是1.01-1.35，更特别是1.10-1.30，并甚至更特别是1.10-1.25。

[0126] 更具体地讲，阳离子聚合物是包含由第一种环状羰基单体和第二种环状羰基单体的顺序开环聚合衍生的两亲性嵌段共聚物。阳离子聚合物可包含与衍生自多元醇引发剂的亚单元连接的两个或更多个嵌段共聚物链。两个或更多个嵌段共聚物链中的每一个包含疏水嵌段和亲水嵌段，并且可任选地将两个或更多个嵌段共聚物链中的每一个封端。在一实施方案中，阳离子嵌段共聚物包含：含有衍生自第一种环状羰基单体的第一种重复单元的亲水核心嵌段，其中第一种重复单元与衍生自多元醇引发剂的亚单元连接，和含有衍生自第二种环状羰基单体的第二种重复单元的疏水外部嵌段。在另一实施方案中，环状羰基单体的顺序聚合被颠倒。也就是说，阳离子嵌段共聚物包含：含有衍生自第二种环状羰基单体的第二种重复单元的疏水核心嵌段，其中第二种重复单元与衍生自多元醇引发剂的亚单元连接，和含有与疏水核心嵌段连接的衍生自第一种环状羰基单体的第一种重复单元的亲水外部嵌段。在一实施方案中，多元醇引发剂是单体二元醇。

[0127] 在水溶液中，阳离子聚合物自组装成具有例如10nm-500nm、10nm-250nm、50nm-200nm、50nm-150nm、50nm-120nm、并且甚至更特别是50nm-100nm的平均颗粒尺寸的纳米颗粒，如用装备有在658nm的He-Ne激光束(散射角度：90°)的动态光散射
(Brookhaven Instrument Corp.，Holtsville，NY，U.S.A.)测量。对于每个样品，将颗粒尺寸测量重复进行5次，并将颗粒尺寸报道为5次读数的平均值。对于前述颗粒尺寸，水溶液可具有5.0-8.0的pH。

[0128] 形成可生物降解的阳离子聚合物的方法包括形成含有第一种环状羰基单体、催化剂、加速剂、单体二元醇引发剂和任选的溶剂的第一种混合物，其中第一种环状羰基单体包含能与叔胺反应形成季胺的一价离去基团；通过开环聚合，形成包含衍生自第一种环状羰基单体的第一种重复单元的第一种聚合物；任选地将第一种聚合物封端，以形成前体聚合物；和用叔胺处理前体聚合物，以形成阳离子聚合物，其中超过0%的衍生自第一种环状单体的第一种重复单元包含含有季胺的侧链基团。在一实施方案中，叔胺是双叔胺，并且侧链基团包含季胺和叔胺。在另一实施方案中，双叔胺选自N,N,N′,N′-四甲基-1,2-乙二胺(TMEDA)、N,N,N′,N′-四甲基-1,3-丙二胺(TMPDA)、N,N,N′,N′-四甲基-1,4-丁二胺(TMBDA)、N,N,N′,N′-四乙基-1,2-乙二胺(TEEDA)、N,N,N′,N′-四乙基-1,3丙二胺(TEPDA)、1,4-双(二甲基氨基)环己烷、1,4-双(二甲基氨基苯)、N,N,N′,N′-四乙基-1,4-丁二胺(TEBDA)、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、4,4-二吡啶基-1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷(DABCO)、4-吡咯烷子基吡啶、1-甲基苯并咪唑及其组合。在另一实施方案中，叔胺包含羧基，并且第一种重复单元包含含有季胺和羧酸的侧链基团。在另一实施方案中，第一种混合物包含疏水的第二种环状羰基单体，并且阳离子聚合物是包含经开环聚合衍生自第二种环状羰基单体的第二种重复单元的随机共聚物；其中第二种环状羰基单体不包含能与叔胺反应形成季胺的一价离去基团。在另一实施方案中，第二种重复单元包含侧链缩醛酯基团。

[0129] 形成可生物降解的阳离子嵌段共聚物的另一种方法包括：形成含有催化剂、加速剂、单体二元醇引发剂和任选的溶剂的反应混合物；将第一种环状羰基单体加入到反应混合物中并通过开环聚合反应，顺序地随后将第二种环状羰基单体加入到反应混合物中并通过开环聚合反应，从而形成第一种嵌段共聚物，其中第一种环状羰基单体包含能与叔胺反应形成季胺的一价离去基团，并且第二种环状羰基单体不能与叔胺反应形成季胺；任选地封端第一种嵌段共聚物，从而形成前体嵌段共聚物；和用叔胺处理前体嵌段共聚物，以形成阳离子聚合物，其中阳离子聚合物含有衍生自第一种环状羰基单体的第一种重复单元，并且超过0%的第一种重复单元包含含有季胺的侧链基团。在一实施方案中，所述的顺序反应以相反的顺序进行，形成第一种嵌段共聚物。在另一实施方案中，利用羧酸酸酐将第一种嵌段共聚物封端，从而形成末端酯基。在另一实施方案中，阳离子嵌段聚合物含有衍生自第二种环状羰基单体的第二种重复单元，并且该第二种重复单元包含侧链缩醛酯基团。在另一实施方案中，引发剂是选自乙二醇类、丙二醇类、氢醌类和间苯二酚类的单体二元醇。在另一实施方案中，引发剂是BnMPA。在另一实施方案中，一价离去基团选自卤化物、磺酸酯和环氧化物。在另一实施方案中，叔胺是双叔胺，并且侧链基团包含季胺和叔胺。在另一实施方案中，双叔胺选自N,N,N′,N′-四甲基-1,2-乙二胺(TMEDA)、N,N,N′,N′-四甲基-1,3-丙二胺(TMPDA)、N,N,N′,N′-四甲基-1,4-丁二胺(TMBDA)、N,N,N′,N′-四乙基-1,2-乙二胺(TEEDA)、N,N,N′,N′-四乙基-1,3丙二胺(TEPDA)、1,4-双(二甲基氨基)环己烷、1,4-双(二甲基氨基苯)、N,N,N′,N′-四乙基-1,4-丁二胺(TEBDA)、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、4,4-二吡啶基-1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷(DABCO)、4-吡咯烷子基吡啶、1-甲基苯并咪唑及其组合。

[0130] 一般来讲，经开环聚合得到的阳离子聚合物包含与引发剂上起始位点数目一样多的支链。此外，阳离子聚合物包含与封端之前顺序开环聚合的数目一样多的嵌段，应当理解的是连续开环聚合利用不同的环状羰基单体组成进行。

[0131] 阳离子聚合物与带负电荷的生物活性物质例如基因、核苷酸、蛋白质、肽、药物或其组合形成复合物(聚合物复合物)。在pH5.0-8.0的水溶液中，复合物自组装成具有例如10nm-500nm、10nm-250nm、50nm-200nm、50nm-150nm、50nm-120nm、并且甚至更特别是50nm-100nm平均颗粒尺寸的纳米颗粒，如用装备有658nm He-Ne激光束(散射角度：90°)的动态光散射(Brookhaven Instrument Corp.，Holtsville，NY，U.S.A.)所测量的。通过轻轻混合，以不同的N/P比率，制备聚合物/DNA复合物。颗粒尺寸分析之前，让复合物溶液稳定30分钟。对于每个样品，将颗粒尺寸测量重复进行5次，并将颗粒尺寸报道为5次读数的平均值。在一实施方案中，生物活性物质是带负电荷的遗传物质，并且该聚合物复合物被紧密包裹，这归因于带负电荷的遗传物质和阳离子聚合物上的带相反电荷基团之间的强烈相互作用。纳米尺寸的复合物诱导0%-15%的溶血，更特别是无溶血，并且具有0%-20%的细胞毒性或者更特别是没有细胞毒性。在另一个实施方案中，生物活性物质是药物。

[0132] 还公开了制备用于处理细胞的聚合物复合物的方法，所述方法包括使含有可生物降解的阳离子聚合物的第一种含水混合物与含有带负电荷的生物活性物质的第二种含水混合物接触，以形成包含聚合物复合物的第三种含水混合物，其中可生物降解的阳离子聚合物包含：经开环聚合衍生自第一种环状羰基单体的第一种重复单元、衍生自用于开环聚合的单体二元醇引发剂的亚单元和任选的封端基团，其中超过0%的第一种重复单元包含含有季胺基团的侧链基团。聚合物复合物在pH5.0-8.0具有50-500nm的颗粒尺寸。

[0133] 另外公开了处理细胞的方法，其包括使细胞与聚合物复合物的纳米颗粒接触，所述聚合物复合物包含可生物降解的阳离子聚合物和带负电荷的生物活性物质；其中可生物降解的阳离子聚合物包含：经开环聚合衍生自第一种环状羰基单体的第一种重复单元、衍生自用于开环聚合的单体二元醇引发剂的亚单元和任选的封端基团，其中超过0%的第一种重复单元包含含有季胺基团的侧链基团。在一实施方案中，可生物降解的聚合物是两亲性嵌段共聚物。在pH5.0-8.0，纳米颗粒可具有50-500nm的颗粒尺寸。在一实施方案中，带负电荷的生物活性物质是基因。可使细胞在体外暴露于聚合物复合物，体外暴露于聚合物复合物随后置于动物体中，或者体内(例如动物或人)暴露于聚合物复合物。在另一实施方案中，带负电荷的生物活性物质是分子药物或蛋白质。在另一实施方案中，聚合物复合物不诱导溶血。在另一实施方案中，纳米颗粒不具有细胞毒性。

[0134] 示例性的可商购药物包括13-顺式-维甲酸、2-CdA、2-氯脱氧腺苷、5-阿扎胞苷、5-氟尿嘧啶、5-FU、6-巯嘌呤、6-MP、6-TG、6-硫鸟嘌呤、Abraxane、Accutane 放线菌素-D、Adriamycin Adrucil Afinitor Agrylin Ala-Cort 阿地白介素、阿仑单抗、ALIMTA、阿利维A酸、Alkaban-AQ Alkeran 全反式维甲酸、α干
扰素、六甲蜜胺、氨甲蝶呤、氨磷汀、氨鲁米特、阿那格雷、Anandron 阿那曲唑、阿糖胞嘧啶、Ara-C、Aranesp Aredia Arimidex Aromasin Arranon 三氧化二
砷、门冬酰胺酶、ATRA、Avastin 阿扎胞苷、BCG、BCNU、苯达莫司汀、贝伐单抗、贝沙罗汀、BEXXAR 比卡鲁胺、BiCNU、Blenoxane 博来霉素、硼替佐米、白消安、Busulfex
TM
C225、亚叶酸钙、Campath Camptosar 喜树碱-11、卡培他滨、Carac 、卡铂、卡莫司汀、卡莫司汀糯米纸囊剂(Carmustine Wafer)、Casodex CC-5013、CCI-779、CCNU、CDDP、CeeNU、Cerubidine 西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、顺铂、噬橙菌因子(Citrovorum Factor)、克拉屈滨、可的松、Cosmegen CPT-11、环磷酰胺、Cytadren 阿糖胞苷、阿糖胞苷脂质体、Cytosar-U Cytoxan 达卡巴嗪、Dacogen、放线菌素D、达贝泊汀α、达沙替尼、道诺霉素、柔红霉素、盐酸柔红霉素、柔红霉素脂质体、DaunoXome Decadron、地西他滨、Delta-Cortef Deltasone 地尼白介素2(Denileukin Diftitox)、
TM
DepoCyt 、地塞米松、醋酸地塞米松、地塞米松磷酸钠Dexasone、右雷佐生、DHAD、DIC、TM
Diodex、多西他赛、Doxil 多柔比星、多柔比星脂质体、Droxia 、DTIC、DTIC-DomeTM TM TM
Duralone Efudex Eligard 、Ellence 、Eloxatin 、Elspar Emcyt 表
柔比星、阿法依泊汀、爱必妥、埃罗替尼、欧文氏菌属L-门冬酰胺酶、雌莫司汀、氨磷汀(Ethyol)、Etopophos 依托泊苷、磷酸依托泊苷、Eulexin 依维莫司、Evista 依
西美坦、Fareston Faslodex Femara 非格司亭、氟尿苷、Fludara 氟达拉滨、
Fluoroplex 氟尿嘧啶、氟尿嘧啶(乳膏)、氟甲睾酮、氟他胺、亚叶酸、FUDR 氟维司TM
群、G-CSF、吉非替尼、吉西他滨、吉姆单抗奥佐米星、Gemzar、Gleevec 、Gliadel Wafer、GM-CSF、戈舍瑞林、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、HalotestinHerceptin Hexadrol、Hexalen 六甲密胺、HMM、Hycamtin Hydrea Hydrocort
Acetate 氢化可的松、氢化可的松磷酸钠、氢化可的松琥珀酸钠、磷酸氢化可的松、羟基脲、Ibritumomab、Ibritumomab Tiuxetan Idamycin 伊达比星、Ifex IFN-α异环磷酰胺、IL-11IL-2甲磺酸伊马替尼、咪唑甲酰胺干扰素-α、干扰素α-2b(PEG缀合物)、白细胞介素-2、白细胞介素-11、Intron A (干扰素α-2b)、Iressa 伊立替康、异维A酸、TM
Ixabepilone、Ixempra 、K Kidrolase(t)、Lanacort Lapatinib、L-门冬酰胺酶、LCR、来那度胺(Lenalidomide)、来曲唑、亚叶酸(Leucovorin)、Leukeran、LeukineTM、亮丙立德、Leurocristine、LeustatinTM、脂质体Ara-C、Liquid Pred 洛莫司汀、L-PAM、L-沙可来新、Lupron Lupron Depot Matulane Maxidex、氮芥、盐酸氮芥、Medralone
TM
Medrol Megace 甲地孕酮、醋酸甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、美司钠、Mesnex 、
甲氨蝶呤、甲氨蝶呤钠、甲泼尼龙、Meticorten 丝裂霉素、丝裂霉素-C、米托蒽醌、TM
M-Prednisol MTC、MTX、Mustargen Mustine Mutamycin Myleran Mylocel 、
Mylotarg Navelbine 奈拉滨、Neosar NeulastaTM、Neumega Neupogen
Nexavar Nilandron 尼鲁米特、Nipent 氮芥、Novaldex Novantrone 奥
TM
曲肽、醋酸奥曲肽、Oncospar Oncovin Ontak Onxal 、Oprevelkin、Orapred
Orasone 奥沙利铂、紫杉醇、蛋白结合的紫杉醇、帕米膦酸盐、帕米单抗、PanretinTM
Paraplatin Pediapred PEG干扰素、培门冬酶、培非司亭、PEG-INTRON 、PEG-L-门冬酰胺酶、PEMETREXED、喷司他丁、苯丙氨酸氮芥、Platinol Platinol-AQ 泼尼
松龙、泼尼松、Prelone 丙卡巴肼、PROCRIT Proleukin 含卡莫司汀植入物的
Prolifeprospan 20、Purinethol 雷洛昔芬、Revlimid Rheumatrex Rituxan
利妥昔单抗、Roferon-A (干扰素α-2a) Rubex 柔红霉素盐酸盐、Sandostatin
TM
Sandostatin LAR 沙格司亭、Solu-Cortef Solu-Medrol 索拉非尼、SPRYCEL 、
STI-571、链佐星、SU11248、舒尼替尼、Sutent 他莫昔芬、Tarceva Targretin
Taxol Taxotere Temodar 替莫唑胺、Temsirolimus、替尼泊苷、TESPA、沙立度
胺、Thalomid TheraCys 硫鸟嘌呤、Thioguanine Tabloid Thiophosphoamide、
Thioplex 塞替派、TICE Toposar 托泊替康、托瑞米芬、Torisel 托西莫
TM
单抗、曲妥单抗、Treanda 维甲酸、Trexall 、Trisenox TSPA、TYKERB VCR、
TM TM
Vectibix 、Velban Velcade VePesid Vesanoid Viadur 、Vidaza
长春碱、硫酸长春碱、Vincasar Pfs 长春新碱、长春瑞滨、酒石酸长春瑞滨、VLB、TM
VM-26、Vorinostat、VP-16、Vumon Xeloda Zanosar Zevalin 、Zinecard
Zoladex 唑来膦酸、Zolinza和Zometa。

[0135] 可以用非病毒载体转染的任何细胞可用上述复合物处理。具体而言，细胞是真核细胞、哺乳动物细胞，更特别是啮齿动物和人细胞。细胞可以来自不同组织，包括胚外或胚胎干细胞、全能或多能细胞、分裂或未分裂细胞、实质或上皮细胞、无限增殖化或转化细胞等。细胞可以是干细胞或分化细胞。分化的细胞类型包括脂肪细胞、成纤维细胞、肌细胞、心肌细胞、内皮细胞、树突细胞、神经元、神经胶质、肥大细胞、血细胞和白细胞(例如红细胞、巨核细胞(megakaryotes)、淋巴细胞如B、T-淋巴细胞和天然杀伤细胞、巨噬细胞、中性白细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、血小板、粒细胞)、上皮细胞、角质形成细胞、软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、肝细胞以及内分泌腺或外分泌腺的细胞和感觉细胞。

[0136] 上述复合物可以用作非病毒转染载体。靶基因不限于任意特定类型的靶基因或核苷酸序列。例如，靶基因可以是细胞基因、内源基因、癌基因、转基因或病毒基因、或者翻译或未翻译的RNA。示例性的可能的靶基因包括：转录因子和发育基因(例如粘着分子、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂、Wnt家族成员、Pax家族成员、翼状螺旋家族成员、Hox家族成员、细胞因子/淋巴因子及它们的受体、生长/分化因子及它们的受体、神经递质及它们的受体)；癌基因(例如ABLI、BCLI、BCL2、BCL6、CBFA2、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、ERBB2、ETSI、ETV6、FGR、FOS、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCLI、MYCN、NRAS、PIMI、PML、RET、SKP2、SRC、TALI、TCL3和YES)；肿瘤抑制基因(例如APC、BRAI、BRCA2、CTMP、MADH4、MCC、NFI、NF2、RBI、TP53和WTI)；和酶(例如ACP去饱和酶和羟化酶、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、ATP酶、醇脱氢酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、过氧化氢酶、环加氧酶、脱羧酶、糊精酶、DNA和RNA聚合酶、半乳糖苷酶、葡糖氧化酶、GTP酶、解旋酶、整合酶、胰岛素酶、转化酶、异构酶、激酶、乳糖酶、脂肪酶、脂氧化酶、溶菌酶、过氧化物酶、磷酸酶、磷脂酶、磷酸化酶、蛋白酶和肽酶、重组酶、逆转录酶、端粒酶、包括RNA和/或蛋白质组分以及拓扑异构酶)。

[0137] 下面的实施例表明由有机催化的开环聚合产生的可生物降解的聚碳酸酯和聚(酯碳酸酯)共聚物是有效的非病毒基因载体。可生物降解的含卤素碳酸酯和与胺的简单季铵化反应的组合提供了形成用作多功能的基因载体的阳离子聚合物的通用途径。根据靶的结构和施用的类型，前体聚合物的卤化物可以是变化的。前体聚合物特别是那些具有氯化物残基的前体聚合物与基因一起形成包裹的复合物，并且该聚合物复合物显示低的细胞毒性。阳离子聚碳酸酯可自组装成具有疏水核和带正电荷的表面的胶束纳米颗粒。因此，它们还可以用于小分子药物和蛋白质的递送，并用于药物和基因或者药物和蛋白质的同时递送。

[0138] 实施例

[0139] 用于聚合物合成的物质

[0140] 在反应中所用的THF、DMF和二氯甲烷是通过溶剂干燥系统(Innovative)得到的。根据R.C.Pratt，B.G.G.Lohmeijer，D.A.Long，P.N.P.Lundberg，A.Dove，H.Li，C.G.Wade，R.M.Waymouth和J.L.Hedrick，Macromolecules，2006，39(23)，7863-7871报道的那样制备N-(3,5-三氟甲基)苯基-N’-环己基-硫脲(TU)，并通过在干燥的THF中与CaH2搅
拌，过滤，并真空除去溶剂进行干燥。按照下文所述制备BisMPA苄基酯(BnMPA)，并通过溶解于干燥的THF中，与CaH2搅拌、过滤，并真空除去溶剂而进一步干燥。将乙酸酐、DMSO、N,N,N’,N’-四甲基-1,2-乙二胺(TMEDA)、1,8-二氮杂二环[5,4,0]十一碳-7-烯(DBU)和(-)-司巴丁与CaH2搅拌、真空蒸馏，然后在分子筛 上贮存。使用前，将L-丙交酯和D-丙交酯(Purac，99%)从干燥的甲苯中重结晶3次。使用前，将三亚甲基碳酸酯(TMC)从甲苯中共沸干燥。其它试剂按所收到那样使用。

[0141] 用于聚合物的物理化学和生物鉴定的物质

[0142] 乙酸、乙酸钠、聚乙烯亚胺(PEI，支链的，重均分子量Mw25kDa)、琼脂糖、溴化乙锭(ethidium bromide)和3-[4,5-二甲基噻唑基-2]-2,5-二苯基四唑 溴化物(MTT)均购自西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)，并按所收到那样使用。HPLC级别的超纯水获自J.T.Baker(U.S.A.)。磷酸盐缓冲盐水(PBS)和三-硼酸-EDTA(TBE)缓冲液购自1st BASE(马来西亚)，并在使用前稀释成期望浓度。报告基因裂解缓冲液和荧光素底物购自Promega(U.S.A.)。DMEM生长培养基、胎牛血清(FBS)、青霉素和链霉素都购自Invitrogen Corporation(U.S.A.)。编码由巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的6.4kb荧火虫荧光素酶(pCMV-荧光素酶VR1255C)的质粒DNA是由Car Wheeler，Vical(U.S.A.)善意提供的，将其在大肠杆菌(E.coli)DH5α中扩增，并用Qiagen(Dutch)提供的Endofree Giga质粒纯化试剂盒纯化。从ATCC(U.S.A.)得到HepG2细胞株，并在供应商的推荐条件下生长。

[0143] 单体合成

[0144] 对于功能性生物可降解单体而言的特别有用的合成子是衍生自2,2-双(羟甲基)丙酸(bis-MPA)的环状碳酸酯单体的所谓MTC家族。Bis-MPA提供了获得5-甲基-5-羧基-1,3-二 烷-2-酮(MTCOH)及其衍生物的容易的路线，如流程1所示。

[0145] 流程I.

[0146]

[0147] 该方法与(甲基)丙烯酸酯衍生的方法相似，其已经被证明产生能够进行开环聚合的功能性单体的广泛选择。2,2-双(羟甲基)丙酸(BisMPA)首先被转化为(i)苄酯BnMPA(文中还用作聚合引发剂)，随后BnMPA与三光气反应(ii)形成环状羰基单体
MTCOBn。使MTCOBn脱苄基(iii)，产生环状羰基羧酸MTCOH。对于由MTCOH形成酯显示了两条路线。在第一条路线中，(iv)，将MTCOH用适宜的羧基活化剂如二环己基碳二亚胺(DCC)处理，其与ROH反应，一步形成MTCOR。或者，可使MTCOH首先转化(v)为酰氯MTCCl，随后将MTCCl在碱存在下用ROH处理(vi)，形成MTCOR。两条路线都是说明性的，而不表示限于此。以下条件对于流程1中所示的反应而言是典型的：(i)苄基溴(BnBr)、KOH、DMF、100℃、
15小时，bis-MPA的苄酯的产率62%；(ii)三光气、吡啶、CH2Cl2、-78℃至0℃、MTCOBn的产率95%；(iii)Pd/C(10%)、H2(3atm)、EtOAc、室温、24小时、MTCOH的产率99%；(iv)ROH、DCC、THF、室温、1至24小时；(v)(COCl)2、THF、室温、1小时、MTCCl的产率99%；(vi)ROH、NEt3、RT、3小时、MTCOR的产率。

[0148] 利用上述的流程，MTCCl与3-溴丙醇、3-氯丙醇、2-碘乙醇和乙醇反应，形成相应的MTCOPrBr、MTCOPrCl、MTCOEtI和MTCOEt。经重结晶或者快速色谱(乙酸乙酯/己烷)纯化，以高收率(>85%)纯化卤代酯。将MTCOEt用作用于稀释作用的非功能化的相似物(counterpart)，并用于引入自组装聚合物的疏水嵌段。

[0149] 实施例1.5-甲基-5-(3-氯丙基)氧基羧基-1,3-二 烷-2-酮(MTCOPrCl)的制备，mw236.65

[0150]

[0151] 将催化量(3滴)的DMF加入到MTCOH(11.1g,69mmol)的THF溶液中(200mL)，随后在N2气氛下，历经20min，慢慢加入草酰氯(7.3mL，87mmol)的THF(100mL)溶液。将溶液搅拌1小时，用N2流鼓泡，以除去挥发物，并真空蒸发，得到中间体。

[0152] 历经30min，将3-氯-1-丙醇(5.4mL,76mmol)和吡啶(6.2mL,65mmol)在干燥THF(50mL)中的混合物滴加到中间体的干燥THF溶液(100mL)中，期间用冰/盐浴保持溶液温度低于0℃。将反应混合物在室温继续再搅拌3小时后，将其过滤并蒸发滤液。将残留物溶解在二氯甲烷中并用1NHCl水溶液、饱和的NaHCO3水溶液、盐水和水洗涤，用MgSO4搅拌过夜，并蒸发溶剂。使粗产物穿过硅胶柱，用乙酸乙酯和己烷梯度洗脱(50/50-80/20)，得到无色油状的产物，其缓慢固化成白色固体(9.8g,60%)。

[0153] 实施例2.5-甲基-5-(3-溴丙基)氧基羧基-1,3-二 烷-2-酮(MTCOPrBr)的制备，mw281.10.

[0154]

[0155] 根据实施例1的方法，以45mmol的规模，使用3-溴-1-丙醇作为醇制备1
MTCOPrBr。将产物经柱色谱纯化，并随后重结晶，得到白色晶体(6.3g,49%)。H NM
R(400MHz,CDCl3):δ4.69(d,2H;CH2OCOO),4.37(t,2H;OCH2),4.21(d,2H;CH2OCOO
13
),3.45(t,2H;CH2Br),2.23(m,2H;CH2),1.33(s,3H;CH3). C NMR(100MHz,CDCl3)
:δ171.0,147.3,72.9,63.9,40.2,31.0,28.9,17.3。

[0156] 实施例3.5-甲基-5-(2-碘乙基)氧基羧基-1,3-二 烷-2-酮(MTCOEtI)的制备，mw314.08.

[0157]

[0158] 根据实施例1的方法，以45mmol的规模，使用2-碘乙醇作为醇制备MTCOEtI，并将1
其经柱色谱纯化，随后重结晶，得到浅黄色晶体(7.7g,54%)。H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.7
3(d,2H;CH2OCOO),4.45(t,2H;OCH2),4.22(d,2H;CH2OCOO),3.34(t,2H;CH2I),1.38(s,3H;CH
13
3). C NMR(100MHz,CDCl3):δ170.5,147.3,72.8,65.6,40.3,17.5,-0.3.

[0159] 有机催化的开环聚合

[0160] 在有机催化剂N-(3,5-三氟甲基)苯基-N’-环己基-硫脲(TU)和1,8-二氮杂二环[5,4,0]十一碳-7-烯(DBU)存在下，利用2,2-双(羟甲基)丙酸苄酯(BnMPA)作为
引发剂在二氯甲烷中于室温进行开环聚合(1-2小时)，以得到含有悬挂物3-卤代丙基酯的前阳离子聚合物，其具有与进料比率([M]0/[I]0)一致的分子量、窄的多分散性(1.1–1.2)和末端基团的正确度。为了避免反应期间在胺存在下由末端羟基引起的中伤而断裂聚合物链，将前体用乙酸酐乙酰化24小时至48小时。

[0161] 下面制备的ROP聚合物具有通式(9)：

[0162]1

[0163] 其中L′是衍生自引发剂的亚单元，w是L′上启动基团的数目，M是环状羰基单2 1 2
体，M是另一种环状单体，E′是封端基团，并且a:b是M :M的摩尔比率。起始的ROP聚合
1 2
物还被称为前体聚合物。在嵌段共聚物的制备中，首先加入M，随后加入M。对于随机共聚
1 2
物，应该理解：可将单体M或M 连接至引发剂L′。用BnMPA(一种二元醇)启动各聚合；
因此w=2，并且形成两条聚合物链，其通过衍生自引发剂的亚单元来连接。利用乙酸酐，将各聚合物链用乙酰基基团封端。

[0164] 聚碳酸酯

[0165] 实施例5.MTCOPrCl的聚合

[0166]

[0167] 将 MTCOPrCl(501mg,2.1mmol)、BnMPA(4.7mg,0.02mmol, 引 发 剂 )和TU(37.2mg,0.1mmol)溶 解 于二 氯 甲 烷(1mL)中，并 将该 溶 液 转移 至 含 有DBU(15.2mg,0.1mmol)的小瓶中，以在室温启动聚合([M]0/[I]0=100)。2小时后，
将乙酸酐(72.4mg,0.71mmol)加入到混合物中，并将混合物搅拌48小时(转化
率～95%)。然后，将溶液在冷甲醇中沉淀两次，并将沉淀物离心和真空干燥。收
1
率 :466mg(93%),GPC(THF):Mn12200g/mol,PDI1.17,H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.
39-7.29(m,5H;Ph),5.16(s,2H;PhCH2),4.38-4.19(br, ～ 350H;CH2OCOO,OCH2聚
合 物 ),3.64-3.55(m, ～ 117H;CH2Cl 聚 合 物 ),2.15-2.07(m, ～ 114H;CH2聚 合物),2.06(s,6H;OCH3，乙酰基末端),1.27(br,～169H;CH3聚合物).

[0168] 实施例6.MTCOPrBr的聚合

[0169]

[0170] 将 MTCOPrBr(288mg,1.0mmol)、BnMPA(4.4mg,0.01mmol, 引 发 剂 )和TU(9.8mg,0.03mmol)溶 解 于二 氯 甲 烷(1mL)中，并 将该 溶 液 转移 至 含 有DBU(3.3mg,0.02mmol)的小瓶中，以在室温启动聚合([M]0/[I]0=52)。2小时后，将乙酸酐(96.9mg,0.95mmol)加入到混合物中，并搅拌两夜(转化率94%)。然后，将溶液在冷甲醇中沉淀两次，并将沉淀物离心和真空干燥。收率:265mg(92%),GPC(THF):Mn11700g/mol,PDI1.11,1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.38-7.28(m,5H;Ph),5.17(s,2H;PhCH2),4.40-4.17(m, ～
348H;CH2OCOO,OCH2聚合 物),3.53-3.36(m,～111H;CH2Br 聚合物),2.23-2.15(m, ～
111H;CH2聚合物),2.06(s,6H;OCH3，乙酰基末端),1.30-1.24(br,～169H;CH3聚合物).[0171] 实施例7.MTCOEtI的聚合

[0172]

[0173] 将 MTCOEtI(312mg,1.0mmol)、BnMPA(4.4mg,0.02mmol, 引 发 剂 )和TU(9.4mg,0.03mmol)溶 解 于二 氯 甲 烷(1mL)中，并 将该 溶 液 转移 至 含 有DBU(3.3mg,0.02mmol)的小瓶中，以在室温启动聚合([M]0/[I]0=51)。2小时后，将乙酸酐(107.2mg,1.05mmol)加入到混合物中，并搅拌两夜(转化率94%)。然后，将溶液在冷甲醇中沉淀两次，并将沉淀物离心和真空干燥。收率:268mg(86%),GPC(THF):Mn10500g/mol,PDI1.22,1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.37-7.31(m,5H;Ph),5.17(s,2H;PhCH2),4.44-
4.36(m,～92H;OCH2聚合物),4.36-4.24(m,～178H;CH2OCOO聚合物),3.35-3.27(m,～
89H;CH2I聚合物),2.07(s,6H;OCH3，乙酰基末端),1.34-1.24(br,～144H;CH3聚合物).[0174] 实施例8.TMC和MTCOPrCl的嵌段聚合

[0175]

[0176] 将 TMC(108mg,1.0mmol, 指 定 为 M1)、BnMPA(11mg,0.05mmol) 和TU(17.5mg,0.05mmol)溶 解 于 二 氯 甲 烷 (1mL)中，并 将 该 溶 液 转 移 至 含 有DBU(7.3mg,0.05mmol)的小瓶 中，以在 室温启动 聚合([M]0/[I]0=20)。经 NMR确
证第一种单体(M1)完全消耗(3小时，转化率97%)后，将反应混合物转移至含有
MTCOPrCl(603mg,2.55mmol)(用于第二次聚合的第二种单体M2)的小瓶中([M2]0/[I]0=50)，并再搅拌18小时(转化率96%)。然后，向混合物中加入乙酸酐(117mg,1.15mmol)，
并搅拌两夜。然后，将溶液在冷甲醇中沉淀两次，并将沉淀物离心和真空干燥。收
1
率:640mg(90%),GPC(THF):Mn12000g/mol,PDI1.19,H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.38-7.30(m,5H;Ph),5.17(s,2H;PhCH2),4.33-4.26(m,～208H;CH2OCOO,OCH2P(MTCprCl)),4.26-4.20(m,～
70H,CH2OCOOPTMC),3.63-3.56(m,～73H;CH2ClP(MTCprCl)),2.15-2.00(m,～111H;CH2P(MTCprCl),CH
2PTMC,OCH3，乙酰基末端),1.27(br,～107H,CH3P(MTCprCl)).

[0177] 聚酯-聚碳酸酯嵌段共聚物

[0178] 实施例9.LLA和MTCOPrBr的嵌段聚合

[0179] 在下面的制备中，没有显示L-丙交酯(LLA)的立体化学。

[0180]

[0181] 将 L- 丙 交 酯 (146mg,1.0mmol)(LLA)、BnMPA(12mg,0.05mmol) 和TU(9.0mg,0.024mmol)溶解于二氯甲烷(1mL)中，并将该溶液转移至含有(-)-司巴
丁(3.0mg,0.013mmol)的小瓶中，以在室温启动聚合([M]0/[I]0=20)。经NMR确证
第一种单体完全消耗(1.5小时，转化率96%)后，将含有聚酯的反应混合物转移至
含有MTCOPrBr(427mg,1.52mmol)的小瓶中，将其再转移至用于第二次聚合的含有
TU(9.7mg,0.026mmol)和DBU(4.1mg,0.027mmol)的小瓶中([M2]0/[I]0=29)。将该第二种反应混合物再搅拌1小时(转化率97%)。然后，向混合物中加入乙酸酐(205mg,2.01mmol)，并搅拌两夜。然后，将溶液在冷甲醇中沉淀两次，并将沉淀物离心和真空干燥，以得到
1
聚酯-聚碳酸酯嵌段共聚物。收率:524mg(90%),GPC(THF):Mn12200g/mol,PDI1.14,H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.38-7.28(m,5H;Ph),5.22-5.09(m, ～ 35H;PhCH2,CHPLA),4.38-
4.19(m, ～ 158H;CH2OCOO,OCH2P(MTCprBr)),3.48-3.41(m, ～ 56H,CH2Br),2.23-2.14(m, ～
55H;CH2),2.06(s,6H;OCH3，乙酰基末端),1.61-1.52(m,～106H;CH3PLA),1.32-1.27(br,～
86H,CH3P(MTCprBr)).

[0182] 实施例10.DLA和MTCOPrBr的嵌段聚合

[0183] 根据与实施例9相同的方法，但是加入D-丙交酯(DLA)代替L-丙交酯(LLA)作1
为第一种单体，制备该聚合物。收率：503mg(87%),GPC(THF):Mn12400g/mol,PDI1.13.H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.38-7.28(m,5H;Ph),5.22-5.09(m, ～ 39H;PhCH2,CHPLA),4.38-
4.19(m, ～ 195H;CH2OCOO,OCH2P(MTCprBr)),3.48-3.41(m, ～ 63H,CH2Br),2.23-2.14(m, ～
62H;CH2),2.06(s,6H;OCH3乙酰基末端),1.61-1.52(m,～119H;CH3PLA),1.32-1.27(br,～
97H,CH3P(MTCprBr))

[0184] 随机聚碳酸酯共聚物

[0185] 实施例11.MTCOEt和MTCOPrBr的随机聚合

[0186]

[0187]

[0188] 上面结构中的方括号表明衍生自MTCOPrBr或MTCOEt的重复单元之一可键合至衍生自引发剂的亚单元，以及乙酰基基团。

[0189] 将MTCOPrBr(282mg,1.0mmol)、MTCOEt(188mg,1.0mmol)、BnMPA(9.0mg,0.04mmol)和TU(18.7mg,0.05mmol)溶解 于二 氯甲烷(1mL) 中，并将 该溶 液转移 至含 有DBU(7.8mg,0.05mmol)的小瓶中，以在室温启动聚合([M]0/[I]0=50)。2小时后，将乙酸酐(194mg,1.90mmol)加入到混合物中，并搅拌两夜(转化率93%)。然后，将溶液在冷甲醇中沉淀两次，并将沉淀物离心和真空干燥。收率：370mg(77%),GPC(THF):Mn11400g/
1
mol,PDI1.20,H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.37-7.31(m,5H;Ph),5.16(s,2H;PhCH2),4
.35-4.24(m, ～ 247H;CH2OCOO,OCH2PMTC(prBr)),4.23-4.14(m, ～ 56H;OCH2PMTC(Et)),3.48-
3.41(m,～ 47H;CH2Br),2.23-2.14(m, ～47H;CH2PMTC(prBr)),2.06(s,6H;OCH3，乙酰基末端),1.30-1.20(m,～227H;CH3,CH2CH3PMTC(Et)).

[0190] 阳离子聚合物的制备

[0191] 使前阳离子卤代-功能化的聚合物(即起始的ROP聚合物)与N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TMEDA)在DMSO中反应，以提供相应的阳离子聚合物。测试了多种双胺，但是就可行的试剂仅选择叔胺，因为伯胺和仲胺引起聚碳酸酯骨架的显著缩减。

[0192] 实施例12.

[0193]

[0194] 将实施例5的同聚物(427mg,[Cl]=1.77mmol)溶解于DMSO(8mL)中，并与TMEDA(1.1mL,7.22mmol)混合，并在90℃搅拌6h。然后，将混合物在THF中沉淀两次，并
1
经离心收集沉淀物和真空干燥。收率：546mg(86%),GPC(DMF):Mn11300g/mol,PDI1.27,H NMR(400MHz,MeOH-d4):δ7.42-7.32(br,5H;Ph),5.19(s,2H;PhCH2),4.45-4.17(m, ～+
252H;CH2OCOO,OCH2聚合物),3.63-3.44(br,～149H;CH2N聚合物),3.27-3.18(br,～
+
210H;NCH3聚 合 物 ),2.85-2.76(br, ～ 73H;CH 2N 聚 合 物 ),2.36-2.30(br, ～
213H;NCH3聚合物),2.28-2.17(br,～70H;CH2聚合物),2.06(s,3H;OCH3，乙酰基末
端),1.34-1.25(br,～119H;CH3聚合物),1.22(s,3H;CH3末端基团).

[0195] 实施例13

[0196]

[0197] 将 TMEDA(0.38mL,2.5mmol) 加 入 到 实 施 例 6 中 形 成 的 聚 合 物(177mg,[Br]=0.62mmol)的DMSO溶液(3mL)中。将溶液在室温搅拌过夜，并在THF中1
沉淀两次，并将沉淀物离心和真空干燥。收率：220mg(88%),H NMR(400MHz,MeOH-d
4):δ7.42-7.30(br,5H;Ph),5.20(s,2H;PhCH2),4.46-4.13(m, ～ 266H,CH2OCOO,OCH2+ +
聚 合 物 ),3.66-3.42(br, ～168H;CH2N聚 合 物),3.28-3.17(br, ～ 243H;N CH3聚合 物 ),2.87-2.75(br, ～ 84H;NCH2聚 合 物 ),2.37-2.29(br, ～ 251H;NCH 3聚合物),2.30-2.16(br,～85H;CH2聚合物),2.07(s,6H;OCH3乙酰基末端),1.37-1.23(br,～
133H;CH3聚合物).

[0198] 实施例14

[0199]

[0200] 除了用实施例7中制备的聚合物之外，利用实施例13描述的相同方法以1
201mg的规模，制备该阳离子聚合物。收率：211mg(77%),H NMR(400MHz,D2O):δ7.4
9-7.31(m,5H;Ph),5.22(s,2H;PhCH2),4.69-4.56(br, ～ 68H;OCH2),4.47-4.23(m, ～+ +
176H;OCOCH2),3.90-3.76(br, ～ 74H;N CH2),3.66-3.51,(br, ～ 78H;OCH2CH2N )+
,3.29-3.15(br, ～ 220H;NCH3),2.93-2.82(br, ～ 76H;NCH2),2.33-2.23(br, ～
222H;NCH3),2.07(s,6H;CH3乙酰基),1.38-1.20(br,～124H;CH3).

[0201] 实施例15

[0202]

[0203] 向实施例8中形成的聚合物(578mg,[Cl]=1.93mmol)的DMSO溶液(10mL)中，加入TMEDA(1.27mL,8.5mmol)。将反应混合物在90℃搅拌6h，并在THF中沉淀两次。将
1
沉淀物离心并真空干燥。收率：735mg(92%),GPC(DMF):Mn15700g/mol,PDI1.27,H NMR(400MHz,MeOH-d4):δ7.41-7.32(br,5H;Ph),5.19(br,2H;PhCH2),4.48-4.13(br, ～+
388H;CH2OCOO,OCH2聚合物),3.65-3.45(br,～179H;CH2N聚合物),3.28-3.18(br,～
+
270H;NCH3聚合物),2.87-2.77(br,～88H;NCH2聚合物),2.38-2.30(br,～272H;NCH3聚合物),2.28-2.16(br,～88H;CH2聚合物),2.08-1.98(m,～44H;CH2聚合物,OCH3乙酰基末端),1.35-1.25(br,～149H,CH3聚合物).

[0204] 实施例16

[0205]

[0206] 将实施例9中形成的聚合物(406mg,[Br]=1.07mmol)和TMEDA(0.65mL,4.3mmol)混合于DMSO(4.0mL)中，在室温搅拌过夜，并在THF中沉淀两次。将沉淀物离心并真1
空 干 燥。 收 率：515mg(97%),H NMR(400MHz,MeOH-d4):δ7.42-7.30(br,5H;Ph引 发剂),5.29-5.11(m,～ 42H;PhCH2引 发 剂,CHPLA),4.49-4.15(br,～ 204H,CH2OCOO,OCH2+ +
聚 合 物 ),3.67-3.43(br, ～123H,CH2N聚 合 物),3.29-3.15(br, ～ 177H,N CH3聚合 物 ),2.85-2.74(br, ～ 61H,NCH2聚 合 物 ),2.37-2.28(br, ～ 189H,NCH 3聚合物),2.29-2.15(br,～62H,CH2聚合物),2.06(s,6H,OCH3乙酰基末端),1.60-1.50(m,～
128H;CH3PLA),1.35-1.24(br,～103H,CH3).

[0207] 实施例17

[0208] 根据实施例16中所用的方法，将实施例10的聚合物用TMEDA处理，得到阳1
离子聚合物，区别是衍生自DLA而不是LLA的亚单元。收率：497mg(96%),H NMR(4
00MHz,MeOH-d4):δ7.42-7.31(br,5H;Ph 引 发 剂 ),5.24-5.13(m, ～ 41H;PhCH2引发+
剂,CHPLA),4.46-4.18(m, ～206H,CH2OCOO,OCH2聚合 物),3.66-3.45(br,～124H,CH 2N+
聚 合 物 ),3.28-3.18(br, ～ 173H,NCH3聚 合 物 ),2.84-2.75(br, ～ 57H,NCH 2聚合 物 ),2.35-2.28(br, ～ 175H,NCH3聚 合 物 ),2.28-2.16(br, ～ 59H,CH 2聚 合物),2.06(s,6H,OCH3乙 酰 基 末 端 ),1.59-1.52(m,～121H;CH3PLA),1.35-1.25(br, ～
110H,CH3).

[0209] 实施例18

[0210]

[0211] 将TMEDA(0.40mL,2.69mmol)加入到实施例11的聚合物(342mg,[Br]=0.67mmol)的DMSO溶液(3mL) 中。将溶 液在 室温搅 拌过 夜，并在THF/ 己烷(3:1)的 混1
合物中沉淀两次，并将沉淀物离心，并真空干燥。收率：377mg(90%),H NMR(4
00MHz,MeOH-d4):δ7.41-7.35(br,5H;Ph),5.19(s,2H;PhCH2),4.42-4.23(m, ～
253H,CH2OCOO,OCH2PMTC(prBr-N)),4.28-4.13(m, ～ 56H;OCH2PMTC(Et)),3.64-3.49(br, ～+ +
96H;CH2N),3.28-3.19(br,～142H;NCH3),2.84-2.75(br,～52H;NCH2),2.35-2.28(br,～
145H;NCH3),2.29-2.17(br, ～ 49H;CH2PMTC(prBr-N)),2.06(s,6H;OCH3乙 酰基 末端),1.35-1.19(m,～234H;CH3聚合物).

[0212] 电荷移位聚合物

[0213] 实施例19

[0214]

[0215] 将 5-甲 基-5-(1- 乙 氧 基 乙 基 ) 氧 基 羧 基 -1,3- 二 烷 -2- 酮(MTCOEE;62mg,0.27mmol)、MTCOPrBr(212mg,0.75mmol)、BnMPA(4.6mg,0.02mmol)
和TU(19.4mg,0.05mmol)溶解 于二 氯甲烷(1mL) 中，并将 该溶 液转移 至含 有
DBU(7.4mg,0.05mmol)的小瓶中，在室温启动聚合([M]0/[I]0=50)。2.5小时后，将溶液在冷甲醇中沉淀，并将沉淀物离心，并真空干燥。收率：241mg(87%),GPC(THF):Mn11800g/
1
mol,PDI1.19,H NMR(400MHz,丙酮-d6):δ7.45-7.32(m,5H;Ph),5.96(q,～12H;CH(OEE)),5.20(s,2H;PhCH2),4.42-4.22(m,～333H;CH2OCOO,OCH2聚合物),3.75-3.48(m,～128H;OCH2(OEE),CH2Br),2.27-2.16(m,～87H;CH2(OPrBr)),1.35(d,～44H;CHCH3(OEE)),1.33-1.23(m,～
182H;CH3聚合物),1.22-1.08(m,～69H;CH3(OEE)).a:b=1.0:3.1.

[0216] 实施例20.实施例19的季铵化

[0217]

[0218] 将三甲胺气体(394mg,6.7mmol)填充到浸于干冰/丙酮浴的实施例19的聚合物(202mg,[Br]=0.56mmol)的乙腈溶液(4mL)中。然后，将溶液温热至室温，并继续搅拌18h，然后真空除去乙腈和过量的气体。将浓缩的残留物真空干燥(～90%胺化)。收
1
率：200mg(85%),H NMR(400MHz,MeOH-d4):δ7.43-7.32(m,5H;Ph),6.02-5.93(m, ～ 6H;
CH(OEE)),5.21(s,2H;PhCH2),4.48-4.11(m,～267H;CH2OCOO和CH2O聚合物),3.75-3.64(m,～+ +
15H;OCH2CH3(OEE)),3.63-3.45(m, ～ 78H;NCH2(PAB)),2.29-2.15(b, ～ 298H;NCH3(PAB)),2.3
2-2.15(b,～68H;CH2(PAB)),1.41-1.35(d,～19H;CHCH3(OEE)),1.35-1.23(m,～122H;CH3聚合物),1.24-1.10(m,～46H;CH2CH3(OEE)).Mn(NMR)=14700g/mol.

[0219] 将前体聚合物(实施例5-11和19)及其相应的阳离子聚合物(实施例12-18和20)的聚合物制备总结在表8中。

[0220] 表8.

[0221]a

[0222] 用BnMPA启动每一聚合。b 1

[0223] 对于嵌段共聚，首先加入M 。c

[0224] 用TMEDA进行季胺化。

[0225] 表9总结前体聚合物(实施例5-11和19)及其相应的阳离子聚合物(实施例12-18和20)所得到的分析数据(数均分子量Mn、多分散性指数(PDI)、%收率、卤化物X向季胺的%转化率)。

[0226] 表9.

[0227]

[0228] a利用聚苯乙烯标准品经GPC(THF)所测定的。

[0229] b从NMR谱的积分比计算的。

[0230] c卤代基团向季胺的转化率。

[0231] 通过具有可预测分子量的窄分散的同聚物、随机聚合物和嵌段共聚物的合成表明有机催化系统(TU/DBU)的有用性。多分散性为1.11-1.22。前体聚合物具有10500-12400的数均分子量Mn。阳离子聚合物具有13100-19433的数均分子量Mn。卤化物向季胺的转化率是大约84%-100%。

[0232] 前体聚合物与胺的反应性取决于侧链的卤化物。尽管实施例5的聚合物(X=Cl)可在乙腈中、室温下容易地与三甲胺形成季胺，但是用TMEDA(4当量TMEDA/当量[Cl])生产实施例12的阳离子聚合物需要极性更强的溶剂例如DMSO和加热(90℃)。相比之下，利用TMEDA在DMSO或乙腈中，可将实施例6(X=Br)和实施例7(X=I)的前体聚合物在室温分别转化成实施例13和14的相应阳离子聚合物。在与TMEDA的反应速率方面，发现溴化物和碘化物的反应性之间几乎没有差异。

[0233] 氯、溴和碘的反应性差异可有助于嵌段共聚物尤其是两亲性嵌段共聚物的设计，以形成含有阳离子聚碳酸酯片段的胶束。如上所示，可形成含有在两端的阳离子亲水片段(实施例15-17)和疏水核的阳离子嵌段共聚物。疏水核包含衍生自三亚甲基碳酸酯(TMC)或丙交酯(LLA或DLA)的重复单元。然而，发现衍生自LLA和DLA的疏水核在需要加热的TMEDA季胺化反应期间是热不稳定的，特别是对于连有氯化物离去基团的聚碳酸酯亚单元。因此，可使用所述单体，以形成具有溴化物或碘化物离去基团的前体聚合物，该前体聚合物可与TMEDA在室温反应。对于含有氯化物离去基团的前体聚合物，含有衍生自TMC的聚(三亚甲基碳酸酯)的疏水嵌段在TMEDA季铵化反应中所用的升高的温度下是相对稳定的。

[0234] 卤素的反应性还可影响荷电聚合物的稳定性。尽管大约90%的卤素基团被转化，但是即使当使用过量的TMEDA时，将所有的侧链卤化物基团转化成季胺是困难的，这是由于反应平衡、立体位阻和电荷排斥。未反应的烷基卤化物基团是潜在的与侧链最末端的叔胺反应的交联位点。因为其低反应性，衍生自含氯化物的前体聚合物的阳离子聚合物是非常稳定的，而衍生自含溴化物或碘化物的前体聚合物的阳离子聚合物包含少量的不溶物质。然而，在产生衍生自实施例11的随机前体聚合物的实施例18的阳离子聚合物的反应中未观察到交联。当共聚单体摩尔比率MTCOEt:MTCOPrBr是1:1时，实施例18的阳离子聚合物在水中显示良好的溶解性。

[0235] 物理化学和生物化学测试

[0236] 用于制备聚合物/DNA和PEI/DNA复合物的通用方法

[0237] 将聚合物溶解于超纯水(HPLC级别，pH7.0)或20mM乙酸钠缓冲液(pH5.0或6.0)中，并将PEI溶解于超纯水中。为了获得预期的N/P比率(阳离子聚合物的胺基团摩尔数与DNA的磷酸酯基团摩尔数的比率)，通过混合等体积的聚合物或PEI和DNA溶液而直接形成复合物。为了保证聚合物或PEI与DNA分子之间完全的静电作用，一旦混合，在用于进一步研究之前，将溶液在室温平衡30分钟。

[0238] 凝胶阻滞测试

[0239] 以不同的N/P比率，制备聚合物/DNA复合物的各种制剂。平衡后，在80mV条件下，将复合物在0.5x TBE缓冲液中的1%琼脂糖凝胶(每50mL琼脂糖溶液用4μL的0.5μg/mL的溴化乙锭染色)上电泳移动60分钟。TBE缓冲液的储备溶液含有53g TRIS碱(HOCH2)3CNH2；27.5g硼酸和20ml0.5M的乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)。在使用之前，将TBE储备溶液稀释0.5x。然后，在UV照明器(Chemi Genius,Evolve,新加坡)上分析凝胶，以显示相对于裸露(naked)DNA的位置而言，复合的DNA的位置。

[0240] 颗粒尺寸和ζ电位分析

[0241] 根据N/P1、5、10、20、30、40和50，制备聚合物/DNA复合物。温育30分钟后，将100微升复合物溶液用1mL超纯水或者20mM乙酸钠缓冲液(pH5.0或pH6.0)稀释11倍。
将用超纯水或乙酸钠缓冲液稀释成相同浓度的裸露DNA用作对照。分析之前，使稀释的复合物溶液稳定30分钟。分别利用装备有658nm的He-Ne激光束(散射角度：90°)的动态光散射(Brookhaven Instrument Corp.，Holtsville，NY，U.S.A.)和Zetasizer(Malvern Instrument Ltd.,Worchestershire,UK)测量聚合物/DNA复合物的颗粒尺寸。对于每一样品，将颗粒尺寸和ζ电位测量重复5次，并且将数据报道为5次读数的平均值。

[0242] 细胞毒性测试

[0243] 在37℃、5%CO2气氛下，将HepG2细胞维持在补加有10%FBS(胎牛血清)、100微克/mL青霉素和100单位/mL链霉素的DMEM生长培养基中。为了评价聚合物/DNA复合物对HepG2细胞的细胞毒性，应用标准的MTT(二甲基噻唑基二苯基四唑 盐)分析方案。在96孔板上，将细胞以1x104细胞/孔的密度播种，并让其生长24小时，以实现60%-70%的汇合。根据上述的方法制备DNA复合物。还制备与复合物溶液浓度相同的裸露DNA溶液。将各孔置换100微升新鲜生长培养基，并用10微升复合物溶液处理。以每N/P比率8孔重复地进行细胞毒性测试。温育4小时后，将孔置换新鲜培养基，并再温育68小时。一旦用100微升新鲜培养基和20微升MTT溶液(5mg/mL在PBS缓冲液中)置换各孔，将细胞再温育4小时。最后，除去所用的培养基，并将各孔中所加入的紫色甲 结晶用150微升DMSO溶解。
将甲 /DMSO溶液的100微升等分部分从各孔中转移至新的96-孔板，并利用微板分光光度计(BioTek Instruments Inc,Winooski,VT,U.S.A.)在550nm和690nm波长测量吸收度(A)。为了测量不同N/P比率的相对细胞生存力，将受处理细胞中的甲 溶液的吸收度与对照细胞的进行比较：

[0244] 细胞生存力=[(A550–A690)样品/(A550–A690)对照]x100%

[0245] 利用的Student’s t-检验在p<0.05，对数据就显著性差异进行统计学分析。

[0246] 体外基因表达4

[0247] 在HepG2细胞内研究聚合物/DNA复合物的体外基因转染。将细胞以8x10细胞/孔的密度接种于24-孔板上，并用0.5mL DMEM(达尔伯克氏改良的伊格尔氏培养基(Dulbecco’s modified Eagle′s medium))生长培养基培育24小时，直到60%-70%的汇合。将各孔的细胞用新鲜生长培养基置换，并随后用50微升复合物溶液(含有2.5微克DNA)转染。转染4小时后，将所用的培养基用新鲜的培养基置换，并再培育细胞。68小时后除去培养基，并将细胞用PBS缓冲液(磷酸盐缓冲盐水，含有137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM磷酸氢二钠(podium phosphate dibasic)、2mM磷酸二氢钾，pH7.4)冲洗后，加入0.2mL1x报告基因裂解缓冲液。进行两个冷冻(-80℃，持续30分钟)和融化循环后，将细胞溶解物在14,000rpm和4℃下离心10分钟，以除去细胞碎片。将上清液(20微升)与100微升荧光素底物缓冲液混合，并利用光度计(Lumat LB9507,Mandel Scientific Inc,安大略省，加拿大)立即测量其荧光强度(以相对光单位RLU给出)。相对于通过BCA蛋白测试测定的上清液的蛋白浓度，将RLU读数标准化，以得到整体表达效率。

[0248] 在所有体外基因表达试验中，将裸露的DNA用作阴性对照。将PEI/DNA复合物用作阳性对照，并且PEI/DNA复合物在最佳N/P比率(即10)制备，在该比率，PEI诱导高的基因表达，还提供超过50%的细胞生存力。将各N/P比率的荧光素酶表达效率表示为6个重复孔的平均值。利用Student’s t-检验进行统计学分析。p<0.05时，认为差异是统计学显著的。

[0249] 上面制备的两亲性聚合物(实施例12至18)可在水溶液中形成胶束状纳米颗粒。作为典型实例，通过将聚合物直接溶解于20mM的乙酸钠缓冲液(pH6.0)中，实施例15的阳离子聚合物形成具有370nm尺寸和34mVζ电位的纳米颗粒。基于实施例15的阳离子聚合物的聚合物复合物显示强的DNA结合能力。图1是显示利用实施例15的阳离子聚合物在不同pH和各种N/P比率下制备的聚合物复合物的琼脂糖凝胶电泳结果的照片。对于在pH7制备的聚合物复合物，在N/P=4下观察到了DNA移动的完全阻滞。对于在pH6或pH5制备的聚合物复合物，在N/P=3下观察到了DNA移动的完全阻滞。在较低的pH，更多的叔胺被质子化，提高了阳离子聚合物的DNA结合能力。并且，聚合物复合物具有低于150nm的颗粒尺寸和在高N/P比率下的正ζ电位，这对于细胞摄取是有利的。

[0250] 图2是显示在pH7.0、6.0和5.0下制备的聚合物复合物的N/P比率和颗粒尺寸之间的关系的柱状图。对于pH5.0和pH6.0，随着N/P比率的增加(5-50)，颗粒尺寸降低，其中对于pH5.0，从110nm至大约80nm；对于pH6.0，从大约250nm至大约100nm。对于pH7.0，在1-50的N/P比率下，颗粒尺寸保持相对恒定或者稍微的增加(大约120nm至150nm)。

[0251] 图3是显示在pH7.0、6.0和5.0下制备的聚合物复合物的N/P比率和ζ电位之间的关系的柱状图。对于高的N/P比率和较低的pH值，ζ电位是最高的，这表明在较低的pH下，聚合物复合物具有较高的正电荷密度，并因此具有更大的DNA结合能力。

[0252] 图4是比较在不同pH和N/P比率下形成的聚合物复合物在HepG2人肝癌细胞株中的荧光素酶表达水平的柱状图。也显示了DNA和PEI/DNA对照。在3个pH条件中，pH7
6.0得到最高的基因表达水平，其在N/P30是1.1×10RLU/mg蛋白质。如图2和3中所示，当在pH7.0和pH 6.0下制备时，尽管聚合物复合物在高的N/P比率(例如30-50)下具有相似的颗粒尺寸，但是在pH 6.0下形成的聚合物复合物具有较高的ζ电位。不受理论束缚，较高的ζ电位可提高聚合物复合物和带负电荷细胞膜之间的相互作用，促进聚合物复合物的细胞摄取，并由此提高基因表达效率。设计叔胺，以为聚合物复合物的内体逃逸提供质子海绵作用。与pH 6.0相比，在pH 5.0更多的叔胺被质子化，这会减弱质子海绵作用，并致使观察到较低的基因表达水平。

[0253] 在图5的柱状图中显示了细胞生存力数据。尽管聚合物复合物诱导的最高基因表达水平(在pH 6.0和N/P 30下)比PEI在其最佳N/P比率(即N/P10)下介导的基因表达水平低，但是所述聚合物复合物比PEI/DNA复合物具有明显更低的细胞毒性。例如，所公开的聚合物复合物的细胞生存力是96%，但是PEI/DNA复合物的细胞生存力仅是64%。提高的生存力归因于所公开的聚合物的更大的生物可降解性。

[0254] 其它具体的实施方案

[0255] 在一具体实施方案中，可生物降解的两亲性阳离子聚合物包含a)含有各自的第一末端、各自的第二末端和各自的第一种重复单元的两条聚合物链和b)含有两个主链杂原子的单体连接基团，所述杂原子独立地选自氧、氮和硫；其中i)两条聚合物链的各自的第一末端各自连接至两个主链杂原子之一，ii)各自第二末端任选地包含各自的封端基团，和iii)各自的第一种重复单元包含各自的第一主链官能团，所述官能团独立地选自酯、碳酸酯、氨基甲酸酯、脲、硫代氨基甲酸酯、硫代碳酸酯或二硫代碳酸酯，并且超过0%的各自的第一种重复单元包含各自的侧链季胺基团。在另一个实施方案中，所述两个主链杂原子是氧原子。在另外一个实施方案中，在pH5.0-8.0的水溶液中的阳离子聚合物自组装成纳米颗粒，通过利用658nm的He-Ne激光束和90°的散射角度的动态光散射测定，所述纳米颗粒具有10nm-500nm的平均颗粒尺寸。在另外一个实施方案中，根据ASTMD6400，阳离子聚合物是可生物降解的。在另外一个实施方案中，第一种侧链还包含各自的叔胺基团。在另外一个实施方案中，两条聚合物链包含各自的第二种重复单元，所述第二种重复单元包含i)独立选自酯、碳酸酯、氨基甲酸酯、脲、硫代氨基甲酸酯、硫代碳酸酯或二硫代碳酸酯的各自的第二主链官能团和ii)包含各自潜在羧酸基团的各自第二侧链，所述潜在羧酸基团能在内体环境中形成羧酸基团。在另外一个实施方案中，两条聚合物链是嵌段共聚物链。

[0256] 在另一个具体实施方案中，聚合物复合物包含带负电荷的生物活性物质和上述可生物降解的两亲性阳离子聚合物。

[0257] 在另一个具体实施方案中，形成聚合物复合物的方法包括：使含有上述可生物降解的两亲性阳离子聚合物的第一种含水混合物与含有带负电荷的生物活性物质的第二种含水混合物接触，以形成含有聚合物复合物的第三种含水混合物。

[0258] 在另一个具体实施方案中，处理细胞的方法包括使细胞与上述聚合物复合物的纳米颗粒接触。

[0259] 在另一个具体实施方案中，形成可生物降解的阳离子聚合物的方法包括形成第一种混合物，其包含i)第一种环状羰基单体，ii)有机催化剂，iii)加速剂，iv)包含两个亲核引发剂基团的单体引发剂，所述两个亲核引发剂基团独立地选自醇、胺和硫醇，以及v)任选的溶剂，其中第一种环状羰基单体包含能与叔胺反应形成季胺的一价离去基团；搅拌第一种混合物，从而形成含有经开环聚合衍生自第一种环状羰基单体的第一种重复单元的第一种聚合物；任选地封端第一种聚合物；和用叔胺处理第一种聚合物或者封端的第一种聚合物，从而形成阳离子聚合物，其中超过0%的衍生自第一种环状羰基单体的第一种重复单元包含含有季胺的侧链基团。

[0260] 本文所用的术语仅仅是为了描述具体实施方案的目的，而不意欲限制本发明。如本文所用的单数形式“一个”、“一种”或实体本身还意欲包括复数形式，上下文另有清楚地指示除外。还应当理解，术语“包括”和/或“包含”和/或“含有”当在本申请中使用时说明所述特征、整数、步骤、操作、元素和/或组分的存在，但是不排除一个或多个其它特征、整数、步骤、操作、元素、组分和/或其集合的存在或加入。

[0261] 下文权利要求书中所有方法或步骤的相应结构、物质、动作和等同物以及功能元素意欲包括用于进行功能的任何结构、物质或动作以及其它所要求的元素，如明确要求保护的那样。已经给出了本发明的描述用于解释和描述目的，但是不意欲是穷举的或者将本发明限制为所公开的形式。多种变通和改变对于本领域普通技术人员而言将是显而易见的，而没有背离本发明的范围和宗旨。选择和描述实施方案是为了更好地解释本发明的原理和它们的实际应用以及使其他本领域普通技术人员理解本发明。