[0002] 本申请要求2012年4月3日提交的美国临时申请系列No.61/619,860的优先权，该临时申请系列No.61/619,860要求2009年9月23日提交的美国
专利申请系列No.12/532,740的优先权，这些申请的主题以引用方式全文并入本文。
技术领域
[0003] 本申请涉及具有补体途径抑制功能的人源化
嵌合抗体及其
抗原结合
片段，该抗体及其抗原结合片段具有降低的效应器功能和免疫原性。本
发明的人源化嵌合单克隆抗体选择性地阻断因子B与C3b的结合，但不会抑制经典的激活途径。这些抗体不能抑制C3b与C5的相互作用，因此在抑制旁路途径中具有独特的功能。此类抗体可用于
治疗其中补体旁路途径起到病理学作用的
疾病迹象。
背景技术
[0004] 补体系统是通过3条不同的途径激活的：经典途径、凝集素途径和补体旁路途径(AP)。经典途径是通过抗原-抗体复合物激活的。凝集素途径是经典途径的改变，旁路途径是通过外来物质、人工表面、死亡组织、细菌、死亡
酵母细胞来激活的。
[0005] 补体经典途径对于宿主防御对抗病原体是重要的。经典途径的激活产生C3a、C4a、C5a和C5b-9分子，它们响应于宿主防御而激活多种细胞。在致病条件下，作为旁路途径的激活结果，形成过敏毒素C3a、C5a，并形成组织破坏C5b-9分子，它们还被称为膜攻击复合物(MAC)。这些分子通过细胞激活而介导
炎症并释放炎症介质。除了C5b-9作为细胞溶解性孔隙形成复合物的作用，强有
力的证据表明亚溶解MAC的沉积在炎症中可以起到重要的作用。
[0006] 补体旁路途径在病理学炎症中被激活。发现C3a、C5a和C5b-9
水平的升高与多种急性和慢性疾病状况有关。这些炎症分子激活嗜中性粒细胞、单核细胞和血小板。因此，抑制疾病诱导的AP激活在疾病中(其中补体激活在疾病病理学中起作用)对于临床益处而言是重要的。
[0007] 补体系统除了在免疫防御中的基本作用以外，其在许多临床状况中会促使组织损伤。补体
生物化学级联中所包括的活性对宿主组织呈现潜在的威胁。实例包括不加选择地释放可能导致宿主细胞溶解的破坏性的酶。因此，迫切需要研发防止这些不利作用的治疗有效性的补体
抑制剂。
[0008] 在其中AP激活有助于疾病病理学的疾病状况下，在血清、
血浆、血液或代表了疾病的其他体液中发现C3a、C5a和C5b-9的水平升高。这些分子的每一种分子通过不同机制的生产和抑制对于疾病都是重要的。用于抑制活性C3转化酶形成的一种可能的机制是通过使用抗C3b抗体。因此，通过耗尽C3b、中和C3b、C3c或使C3b失活来阻断/抑制或阻止AP激活仍为重要的治疗策略。
[0009] 本发明涉及研发得到的人源化的嵌合抗体序列，该抗体序列是新型的，并且提供与因子C3b的靶向结合。C3b与B结合、但是C3b与C5不结合受到此类抗体的抑制。C3a、C5a和C5b-9都驱使发炎，并且还会放大AP激活过程。与C3b结合并阻止B的相互作用的抗C3b剂包括但不限于单克隆和多克隆的抗体，嵌合的、人源化的、全人类、及纳米抗体，全长的及它们的片段，包括IgG、Fab、Fab'、F(ab’)2和IgGs。适体、小分子和SiRNA还可以中和与C3b与B的结合，并阻止AP诱导生产的C3a、C5a和C5b-9的生产。结果，细胞激活、炎症和炎症介质的释放也都被阻止。由于AP激活与多种急性和慢性人类疾病关联，所以使用抗C3b剂进行阻断还将阻断炎症的过程，这可以为使用抗C3b单克隆抗体治疗的
哺乳动物提供临床益处。
[0010] 补体是与发病机理有关的多种因子之一，并且可以为临床控制提供有效点的重要的病理机制。越来越多地认识到补体介导的组织损伤在多种疾病状态中的重要性，意味着需要有效的补体抑制药品。尽管如此，目前完全缺乏人类用途的、特异性地靶向及抑制补体激活的批准药品。
[0011] 根据可利用的临床和检索数据，显示在大多数的急性和慢性环境中，C3a和C5a的生产是通过补体途径的激活来介导的。在临床环境下，独立地显示C3a和C5a都有所涉及，研发用于所有途径的合适的抑制方法是非常理想的。已知过敏毒素C3a和C5a均激活白细胞和血小板。细胞激活的频繁指示剂在白细胞上是细胞表达的CD11b，在血小板上是CD62P。多种炎症分子的释放是通过血小板-白细胞的结合(由这些激活标志物所介导的)所引发的。此类缀合物形成的一个结果是由血液循环中除去血小板，这是可能有助于发展成血小板减少症的现象。
[0012] 本发明计划通过使用抗C3b抗体来抑制C3b在病理学状况中的功能活性及其程序性作用。
[0013] 发明概述
[0014] 本发明涉及通过限制C3的裂解、以及限制C3b与因子B的结合及C3b与解备素的结合来抑制C3b依赖的补体激活的方法。与因子B结合以抑制C3b与因子B的结合的抗体是已知的。与C3b结合并且仅抑制旁路途径的激活的抗体被涵盖在本发明的范围内。C3依赖的补体激活可以通过C3抑制剂分子来抑制。
[0015] 在本发明的一个方面中，C3抑制剂分子可以包括整个或片段的抗C3抗体。片段的抗C3抗体可以为Fa,F(ab)2,Fv或单链Fv。抗C3抗体可以为单克隆的、多克隆的、嵌合的或去免疫的，并且具有结合C3及其片断的能力。本发明公开了抗C3抗体和C3b抗体用于治疗多种疾病状况(与有问题的补体激活系统有关)的用途。
[0016] 在另一个方面中，本发明涉及在受试对象中抑制C3b依赖的补体激活的不利作用的方法。该方法包括向所述的受试对象
给药一定量的有效抑制C3b依赖的补体激活的C3b抑制剂。就这一点而言，短语“C3b依赖的补体激活”是指激活所有3种补体途径。在本发明的一些方面中，C3b抑制剂为抗C3b抗体或其片段，在其他的方面中，抗C3b抗体具有降低的效应器功能。在其他的方面中，C3b抑制剂为C3b抑制肽。本发明的方法、组合物和药剂可以用于在哺乳动物的受试对象中体内抑制C3b依赖的补体激活的不利作用，其中所述的哺乳动物受试对象包括遭受急性或慢性病理学状况的人类，其中在疾病的病理学中，涉及不适的补体激活。
[0017] 在另一个方面中，本发明创建了抗C3b抗体，该抗体包含互补性决定区1至3(CDR1至3)与构架区(FR1至FR4)的多种组合。CDR包含轻链与重链的组合。CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3及构架区可用于治疗上述提及的疾病状况，在该疾病状况中，补体旁路途径起到一定的作用。包含CDR(其在可变区的
氨基酸序列内为任何顺序)的抗体被涵盖在本发明的范围内。这样，本发明涵盖了所讨论的序列，以及CDR或构架区中任何的序列变化，只要保持90％的序列一致性即可。此类抗体仅以化学计量比为1:1与C3b分子结合，这意味着通过使用该抗体，人类可以评价血浆样品中的激活百分率。
[0019] 图1示出了2种补体途径；经典途径和补体旁路途径。该图示将2种途径分开，并且2种途径没有在C3b处汇合。
[0020] 图2示出了识别和选择克隆的筛选测试，其中所述的克隆仅抑制C3b与B的结合，但不抑制C3b与解备素的结合。
[0021] 图3示出了抗C3b与底物结合的C3b的饱和结合亲和力。
[0022] 图4示出了抗C3b与C3c以高亲和力的结合。
[0023] 图5示出了抗C3b与C3dg的结合的缺乏。
[0024] 图6示出了缺乏对解备素与C3b结合的抑制。
[0025] 图7示出了抗C3b在正常人类血清中抑制补体旁路途径。
[0026] 图8示出了抗C3b不能抑制补体的经典途径。
[0027] 图9示出了抗C3bIgG通过抑制包含络合物PC3bBb的解备素的形成来抑制C3转化酶的形成。
[0028] 图10示出了抗C3bFab2通过抑制新形成的C3b的形成来抑制C3转化酶的形成。
[0029] 图11示出了抗C3bFab2在炎症的
全血模型中抑制C3a的形成。
[0030] 图12示出了抗C3bFab2在全血的炎症模型中抑制SC5b-9的形成。
[0031] 图13示出了抗C3bFab2在全血的炎症模型中抑制TNF-α的形成。
[0032] 图14示出了嵌合抗C3bFab与底物结合的C3b的结合。
[0033] 图15示出了嵌合抗C3bFab在正常的人类血清中抑制AP激活。
[0034] 图16示出了抗C3b与C3b的结合具有的计量关系为1比3.2。
[0035] 图17示出了抗C3b鼠重链(SEQ ID NO.1)和抗C3b鼠轻链(SEQ ID NO.2)。
[0036] 图18示出了SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10。
[0037] 图19示出了SEQ ID NO:11至SEQ ID NO:24。
[0038] 图20示出了SEQ ID NO:25至SEQ ID NO:32。
[0039] 图21示出了SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:40。
[0040] 图22示出了SEQ ID NO:41至SEQ ID NO:48。
[0041] 发明详述
[0042] 标准的术语(包括本领域的技术人员使用的那些)是普通的且标准的，并且已经无条件地在整个申请中使用。
[0043] 为了描述本发明，提供以下定义以便就在
说明书和
权利要求书中使用的术语提供清晰度。
[0044] 如本文所用，术语“旁路途径”是指补体激活，其在传统上被认为起始于对补体因子C3自发蛋白
水解产生C3b，其是通过例如
真菌和酵母菌细胞壁的酵母聚糖、革兰氏阴性外膜的脂多糖(LPS)和兔红细胞，以及由许多纯多糖、兔红细胞、病毒、细菌、动物
肿瘤细胞、寄生虫和破损细胞刺激的。
[0045] 如本文所用，术语“抗体”涵盖抗体和抗体片段，其特异性地与C3b或者其多肽或部分结合，其中所述的抗体来源于任何生产该抗体的哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔或灵长动物，包括人类)。示例性的抗体包括多克隆、单克隆和重组抗体；多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人源化的抗体；鼠抗体、嵌合(即，小鼠-人、小鼠-灵长动物、灵长动物-人)、单克隆抗体，和抗独特性抗体；以及去免疫化的抗体；并且可以为它们任何完整的分子或片段。
[0046] 如本文所用，术语“抗体片段”是指由全长的抗C3b抗体衍生的或者与全长抗C3b抗体相关的部分，通常包括其抗原结合区或可变区。抗体片段的示例性实例包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab’)2和Fv片段；scFv片段；双体；线性抗体；单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。
[0047] 如本文所用，术语“适体”是指与特定靶物结合的核酸分子。
[0048] 如本文所用，术语“C3b依赖的补体激活”是指通过所有可能的途径发生的补体激活。
[0049] 如本文所用，术语“C3b抑制剂”是指与C3b结合或相互作用的、并且有效抑制C3b依赖的补体激活的任何
试剂，包括抗C3b抗体及其C3b结合片段，天然和合成的肽。在本发明的方法中使用的C3b抑制剂可以将C3b依赖的补体激活(由此降低其所有的激活)降低超过20％。在一个实施方案中，C3b抑制剂将补体激活降低超过90％。
[0050] 如本文所用，“嵌合抗体”是指包含可变结构域和互补性决定区的重组
蛋白质，其中所述的可变结构域和互补性决定区衍生自非人类物种(例如啮齿动物)的抗体，同时抗体分子的剩余部分衍生自人类抗体。
[0051] 如本文所用，术语“经典途径”是指(1)由与外来粒子结合的抗体所引发的C1复合物的补体激活，该过程需要结合识别分子C1q；还指(2)通过抗原-抗体复合物的形成所发生的补体激活。
[0052] 如本文所用，“人源化的抗体”为嵌合抗体，其包含符合特异性互补性决定区的最小序列，其中所述的互补性决定区衍生自被移植到人类抗体构架中的非人类免疫球蛋白。人源化的抗体通常为重组蛋白质，其中仅抗体的互补性决定区是非人类起源的。如本文所用，术语“凝集素途径”是指通过血清和非血清的
碳水化合物结合蛋白质(包括甘露聚糖结合凝集素(MBL)和
纤维胶凝蛋白)的特异性结合而发生的补体激活。
[0053] 如本文所用，“膜攻击复合物”(“MAC”)是指5种终末补体成分(C5-C9)的复合物，该复合物插入并破坏膜。此外，MAC还可以称为C5b-9和SC5b-9。
[0054] 如本文所用，“受试对象”包括所有哺乳动物，包括但不限于狗、猫、
马、绵阳、山羊、奶
牛、兔、猪、人类、非人类灵长动物、和啮齿动物。此外，旁路途径除了在补体激活中作为独立途径而被广泛认可的作用以外，其还为最初通过经典途径和凝集素途径所引发的补体激活提供放大环。在这种旁路途径介导的放大机制中，激活产生的C3转化酶(C4b2b)(由经典途径或凝集素途径的补体级联得到)将C3切割成C3a和C3b，并由此提供可以在形成C3bBb(旁路途径的C3转化酶)中发生沉淀的C3b。
[0055] 如本文所用，“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域以单链多肽形式呈现。通常，Fv多肽进一步包含在VH和VL结构域之间的多肽连接体，其能够使scFv形成用于抗原结合所需的结构。
[0056] 本发明的抗体为用于治疗人类疾病的人源化的嵌合抗C3b单克隆抗体(mAb)，和抗原结合片段。本发明的抗体可以提供用于满足这种需要的高亲和力抗体。本发明的抗C3b单克隆抗体可以结合C3b，并且可以抑制C3b与因子B的结合。
[0057] 具有特征性CDR的动物和
植物衍生的抗C3b单克隆抗体被涵盖在本发明的范围内，其中所述的特征性CDR可以结合C3b并可以抑制C3b与因子B的结合。与本发明的抗体的CDR之间同源性超过60％的CDR被涵盖在本发明的范围内。用于生成人源化的嵌合抗C3b抗体的小鼠单克隆抗体被涵盖在本发明的范围内。
[0058] 本发明的抗体与
现有技术的不同之处在于：本发明的抗体(1)不抑制补体的经典途径；(2)可以以0.33:1的摩尔当量与目标蛋白质结合；(3)可以与C3b发生交联反应，但是不与C3发生交联反应；以及(4)可以抑制C3a、C5a、C5b-9和TNF-α的生产。本发明的抗体针对C3b而产生，并因此不与C3a发生交联反应，其中所述的C3a为完整C3分子的片段。
[0059] C3b为经典途径和旁路途径C3转化酶的一部分，因此预计抗C3b会抑制这2种途径。本发明的抗体仅抑制旁路途径，而对经典途径的激活无影响。所述的这些抗体可以抑制因子B与C3b的结合，而不影响经典途径。这些抗体可以专
门抑制旁路途径，而不影响经典途径上的放大环。
[0060] 本发明的抗体可以抑制新的C3转化酶的形成。这些抗体可以抑制因子B与C3b的结合，而不影响经典途径。这些抗体可以专门抑制旁路途径，而不影响经典途径上的放大环。
[0061] 可以根据抗C3b抗体中和由于旁路途径的激活而产生的C3b的能力来选择该抗C3b抗体。1:1的摩尔当量表明仅30％的C3被转化为C3b。在全血炎症模型中所测得的被激活的C3的总量可以为30％至40％、至高达50％。
[0062] 本发明的抗体可以不影响经典途径的激活。因此，本发明的单克隆抗体不能抑制经典途径。本发明的抗体mAb可以结合C3b上的区域，其中所述的C3b通过与因子B蛋白质的结合而仅与AP激活有关。
[0063] 本发明的另一个方面涉及包含mAb的重链和轻链的CDR1、CDR2和CDR3，或者它们的组合的抗体。重链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:12,14和16中。轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:19,21和23中，其中所述的抗体特异性地结合人类C3c和/或C3b。
[0064] 所述的抗体可以为例如嵌合抗体、人源化的抗体、人类抗体、人源化的抗体或嵌合抗体。可变区内的CDR可以具有90％的相似性至99％的相似性。
[0065] 本发明的另一个方面在于所述的抗体可以为适体或其DNA片段。与全长抗体类似，所述的适体也可以结合C3b，从而阻止PC3bBb复合物或BC3b复合物的形成。
[0066] 本发明的抗体、本发明的CDR和本发明的构架列于图27-31中。
[0067] 本发明的抗体可以是治疗性的。鼠、嵌合的、人源化的和灵长源抗体目前被认为是治疗性的。但是，在科学的最新进展中，所述的抗体还可以被其他类型的抗体样分子替代，其中抗体样分子的相互作用可以在低的pMole至高的pMole，直至低的nMole范围内。
[0068] 嵌合抗体和人源化的抗体都具有人类构架恒定区。人源化的和人类的构架区是天然人类构架区或非天然的人类构架区，以便增加所述的CDR区的亲和力和效力。恒定区可以存在或不存在于所述的抗体中。可以利用多种方法在植物、细节和哺乳动物细胞系统中生产具有和不具有恒定区的抗体。
[0069] 抗C3b抗体的功能活性被定义为抗C3b抗体在不影响经典途径的放大环的条件下仅抑制AP激活的能力。本发明的这些抗体能够(1)抑制B与C3b的结合；(2)减少PC3bBb形成和/或C3bBb形成；(3)降低游离C3b的浓度；(4)减少C3b的形成；(5)减少C3a、C5a和C5b-9的形成；(6)减少单核细胞CD11b的表达；(7)减少嗜中性粒细胞CD11b的表达(8)减少血小板CD62P的表达；(9)减少白细胞-血小板缀合物的形成；(10)减少肿瘤
坏死因子α(TNF)；以及(11)减少嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的形成。
[0070] 此外，本发明提供了这样的方法，该方法用于抑制由C3b依赖的补体激活所衍生的旁路途径的不利作用。C3b抑制剂可以作为主要疗法单独使用，或者作为增强其他治疗的益处的补体与其他方法结合使用。
[0071] 抑制剂可以为小分子、适体、DNA片段、代表了CDR结构域的小肽、SiRNA。这些抑制剂抑制了备解素与C5、C9和C3b(与C5有关)的结合。
[0072] 本发明提出了抗C3b抗体用于抑制补体生物化学级联的新用途。本发明描述了C3b作为治疗靶物用于抑制与所有补体途径有关的细胞损伤的用途。
[0073] 疾病状况
[0074] 在本发明的另一个方面中，所述的抗体可以用于在遭受急性或慢性病理学损伤的受试对象(包括人类)中通过旁路途径体内抑制补体激活。本发明可以关乎以下疾病、紊乱、损伤和治疗来使用，包括但不限于：
[0075] 体外循环疾病和紊乱：心
肺转流术后的炎症、手术后的肺功能紊乱、心肺转流术、血液
透析、白细胞清除术、
血浆置换、血小板去除法、肝素诱导的体外LDL沉淀(HELP)、灌注后综合征、体外膜式
氧合(ECMO)、心肺转流术(CPB)、灌注后综合征、全身炎性反应综合征和多器官衰竭。
[0076] 心
血管疾病和紊乱：急性冠脉综合征、Kawaski病(动脉炎)、多发性大动脉炎、过敏性紫癜性肾炎、血管渗漏综合征、经皮
冠状动脉介入治疗(PCI)、心肌梗死、急性心肌梗死后缺血
再灌注损伤、动脉粥样硬化、脉管炎、免疫复合物脉管炎、与类
风湿性关节炎有关的脉管炎(也称为恶性类风湿性关节炎)、系统性红斑狼疮相关性脉管炎、脓毒病、动脉炎、
动脉瘤、心肌病、扩张型心肌病、
心脏手术、外周血管疾病、肾血管疾病、心血管疾病、脑血管疾病、肠系膜/肠血管疾病、糖尿病血管病、静脉气栓(VGE)、Wegener肉芽肿、肝素诱导的体外膜肺氧合和Behcet综合征。
[0077] 骨/肌骨骼疾病和紊乱：关节炎、炎性关节炎、非炎性关节炎、类风湿性关节炎、儿童类风湿性关节炎、全身发病型幼年类风湿性关节炎、骨关节炎、骨质疏松症、系统性红斑狼疮(SLE)、Behcet综合征和Sjogren综合征。
[0078] 移植疾病和紊乱：移植排斥反应、异种移植排斥反应、移植物抗宿主病、器官或移植物的异种移植、器官或移植物的同种移植和超急排斥反应。
[0079] 眼/眼科疾病和紊乱：干、湿性年龄相关性黄斑变性(AMD)、脉络膜神经血管病(CNV)、
视网膜损伤、糖尿病视网膜病、糖尿病视网膜微血管病变、眼的组织胞浆菌病、葡萄膜炎、糖尿病黄斑水肿、糖尿病视网膜病、糖尿病视网膜微血管病变、病理性近视、网膜中央静脉阻塞(CRVO)、
角膜新生血管形成、视网膜新生血管形成、视网膜色素上皮细胞(RPE)、眼的组织胞浆菌病和Purtscher视网膜病。
[0080] 溶血/血液病和紊乱：脓毒病、
全身炎症反应综合征(SIRS)、
失血性休克、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、灾难性抗磷脂抗体综合征(CAPS)、冷凝集素病(CAD)、自身免疫性血小板减少性紫癜(TTP)、内毒素血症、溶血性尿毒综合征(HUS)、非典型溶血尿毒综合征(aHUS)、阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)、脓毒病、感染性休克、镰状细胞血症、溶血性贫血、高嗜酸性粒细胞综合征和抗磷脂抗体综合征(APLS)。
[0081] 呼吸/肺疾病和紊乱：哮喘、Wegener肉芽肿、输血相关急性肺损伤(TRALI)、抗肾小球基底膜疾病(Goodpasture疾病)、嗜酸性粒细胞性肺炎、过敏性肺炎,过敏性支气管炎、支气管扩张瘀血、
反应性气道病综合征、
呼吸道合胞体病毒(RSV)感染、副流感
病毒感染、鼻病毒感染,腺病毒感染、变应性支气管肺曲菌病(ABPA)、肺结核、肺寄生虫病、成人呼吸窘迫综合征、慢性阻塞性肺疾患(COPD)、肉状瘤病、肺气肿、支气管炎、囊性纤维化、间质性肺病、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、输血相关急性肺损伤、缺血/再灌注急性肺损伤、
棉纤维吸入性肺炎、肝素诱导的体外膜肺氧合、过敏性休克和
石棉诱导的炎症。
[0082] 中枢和外周神经系统/神经性疾病和紊乱：多发性硬化(MS)、重症肌无力(MG)、重症肌无力、多发性硬化、格林-巴利综合征、Miller-Fisher综合征、中风、中风后再灌注、Alzheimer疾病、多灶性运动神经病(MMN)、脱髓鞘作用、Huntington疾病、
肌萎缩(ALS)、Parkinson疾病、视
乳头变性疾病(DDD)、脑膜炎、脑膜炎颅神经损伤、变异型
克雅氏病(vCJD)、急性特发性犬类多神经病、脑/脑床上(包括但不限于大出血、炎症和水肿)和神经性
疼痛。
[0083] 创伤诱导的损伤和紊乱：失血性休克、血量减少性休克、脊髓损伤、神经元损伤、脑创伤、脑缺血再灌注、
挤压伤、
伤口愈合、严重的烧伤和冻伤。
[0084] 肾脏疾病和紊乱：肾缺血再灌注损伤、肾丝球肾炎(PSGN)、Goodpasture疾病、膜性肾炎、Berger疾病/IgA肾病、系膜增生性肾小球肾炎、膜性肾小球肾炎、膜增生性肾小球肾炎(肾小球膜毛细血管性肾小球肾炎)、急性感染后肾小球肾炎、肾小球肾炎、狼疮性肾炎、过敏性紫癜性肾炎和肾皮质坏死(RCN)。
[0085] 器官的再灌注损伤和紊乱：包括但不限于心、脑、肾和肝。
[0086] 繁殖和泌尿生殖器疾病和紊乱：膀胱疼痛的疾病和障碍、感觉膀胱疾病和紊乱、自然流产、男性和女性的不孕不育疾病、妊娠疾病、母胎耐受、先兆子痫、泌尿生殖道炎症性疾病、胎盘功能不全的疾病和紊乱、流产的疾病和紊乱、慢性膀胱炎和间质性膀胱炎。
[0087]
皮肤/皮肤病学的疾病和紊乱：烧伤、牛皮癣、特应性皮炎(AD)、嗜酸细胞性海绵层水肿、荨麻疹、热伤害、类天疱疮、获得性大疱性表皮松解症、自身免疫性大疱性皮肤病、大疱性类天疱疮、硬皮病、血管性水肿、遗传性血管水肿(HAE)、多形性红斑、妊娠疱疹、Sjogren综合征、皮肌炎和疱疹样皮炎。
[0088] 胃肠疾病和紊乱：Crohn疾病、Celiac疾病/乳糜泄、Whipple疾病、肠缺血、炎性肠病和溃疡性结肠炎。
[0089] 内分泌疾病和紊乱：桥本氏甲状腺炎；幼淋巴细胞性甲状腺炎；压力和焦虑；影响催乳素、生长或胰岛素样生长因子、促肾上腺皮质
激素释放的其他疾病；胰腺炎；Addison疾病；糖尿病状况，包括但不限于1型和2型糖尿病；1型糖尿病；肉状瘤病；糖尿病视网膜微血管病变；非肥胖型糖尿病(IDDM)；血管病；IDDM或2型糖尿病的神经病或视网膜病并发症；和胰岛素抵抗。
[0090] 恶性病的治疗：由化疗和放疗引起的疾病和紊乱。
[0091] 在本发明的另一个实例中，本发明的抗体治疗损伤，例如缺血再灌注损伤(I/R)。I/R损伤的病理生理学是复杂的，并且具有有助于该过程的至少2个主要的因素：补体激活和嗜中性粒细胞刺激伴养自由基介导的损伤。
[0092] 在整个研究中，越来越多的证据表明补体在I/R损伤中作为重要的介质用于抑制补体的激活，其已经在多种I/R动物模型中成功限制了组织破坏和损伤。在早期研究中，在灌注眼镜蛇毒因子后，C3被耗尽，这被报道在肾和心的I/R过程中是有利的。但是可溶形式的补体受体1(sCR1)是第一补体特异性抑制剂，其用于
预防C5b-9络合物沿着冠状内皮的心肌I/R损伤降低的沉积，和在再灌注后降低的白细胞浸润，和心肌I/R变细梗死过程中的sCRl治疗相关。在骨骼肌或肠缺血后，缺乏C3的动物通常具有较少的局部组织坏死。
[0093] 膜攻击复合物是补体定向损伤的最有意义的媒介物，并且具有C5
缺陷的动物研究显示在I/R损伤的模型中局部和远端损伤减少。补体激活的抑制剂(可溶性Crry(补体受体相关的基因Y))显示在鼠肠再灌注发作之前和之后给药该抑制剂，会有效地对抗损伤。在骨骼肌缺血模型中，当在再灌注开始之后给予可溶性补体受体1(sCR1)时，使用该可溶性补体受体1还会减少肌肉损伤。在心肌I/R的猪模型中，在再灌注之前，使用针对过敏毒素C5a的单克隆抗体(“MoAb”)进行治疗的动物显示梗塞减轻。使用C5MoAb治疗大鼠证明梗塞面积减小、嗜中性粒细胞渗透以及心肌凋亡。
[0094] 在另一个实例中，就某些紊乱而言，可以在再灌注之前和/或再灌注过程中和/或再灌注之后给药C3b抑制剂，其中所述的紊乱包括但不限于：主动脉瘤修复、器官移植、或者断裂或受伤的四肢或手足的复位。可以通过动脉内、颅内、静脉内、皮下、肌肉内或其他
肠胃外给药的不同方式给药C3b抑制剂。对于非肽能的抑制剂潜在地以口服形式给药，最合适的是通过动脉内或静脉内给药。给药可以周期性地重复，这可以由医生根据最佳治疗效果来确定。
实施例[0095] 实施例1
[0096] 除非另作说明，所有试剂均以高品质使用。所有的补体蛋白质、旁路途径和经典途径的缓冲液、检测抗体和红细胞均得自Complement Technologies(Tyler,TX)或Quidel Corporation(SanDiego,CA)。流式细胞术抗体得自BD Biosciences,San Jose,CA。TMB底物得自Kirkegaard&Perry Limited,Gaithersberg,MD。所有二级抗体均得自American Qualex,San Clemente,CA,BSA，而其他的试剂均得自Sigma-Aldrich,St Louise,MO。
[0097] ELISA平板读取器(SpectraMax 190和250)得自Molecular Devices，流式细胞仪为FACS Calibur。Varity 3D程序用于数据分析。使用MicroCal Origin程序进行曲线拟合。溶血的动力学测试使用SectraMax,Molecular Devices来运行。ELISA平板得自Corning Costar,Lowell,MA。
[0098] 人源化的嵌合抗体包含亲代鼠单克隆抗体的CDR，序列为SEQ ID No 1和SEQ ID No 2，其呈现于本申请中。对小鼠注射人类C3b(Complement Technology,Tyler,TX)，并针对C3b的结合和AP抑制活性来筛选小鼠血清。使用标准的程序，将由备解素阳性小鼠得到的脾细胞与骨髓瘤细胞融合。使用有限稀释技术，将融合细胞克隆成单一的细胞群。使96孔板中的细胞生长，并利用备解素的结合和旁路途径的抑制来测试上清液。识别阻断AP激活的细胞，并使用抑制C5b-9形成的那些细胞进一步筛选。根据7D11，将这些克隆分类，其中所述的7D11以高亲和力抑制因子B与C3b的结合。利用蛋白水解消化将完整的IgG转化为Fab、Fab'、Fab2'片段。生产7D11的杂交瘤细胞系保藏在American Type Culture Collection(“ATCC”)，其编号为PTA-8806。
[0099] 抗C3b IgG以高亲和力与人类C3b和C3c结合，但不与C3dg结合
[0100] 抗C3b IgG与C3b的亲和力为低的pM至低的nM。抗体及其片段以高亲和力与C3b和C3c结合。在4℃下，将聚苯乙烯微量滴定板过夜涂覆处于
磷酸盐缓冲液(PBS)中的人类因子C3b。在吸入C3b溶液后，将孔用处于PBS中的1％牛血清
白蛋白(BSA)(Sigma-Aldrich,St.Louis,Mo.)在室温下封闭1小时。不具有肽或C3b涂料的孔作为背景对照。将处于封闭溶液中的单克隆抗C3b抗体IgG、Fab2和Fab的等分液加入到C3b涂覆的孔中，并将其温育1小时以便发生结合。在室温下温育1小时时间后，使用PBS将平板冲洗5次，并与过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠单克隆抗体温育。温育后，冲洗平板，并使用TMB试剂识别结合的过氧化物酶。
[0101] 如所示，抗C3b与C3b(图3)和C3c(图4)结合。抗体结合位点不在C3dg中(图5)。
[0102] 实施例2：抗C3b IgG不抑制备解素C3b的相互作用
[0103] 抗C3b IgG与C3b的亲和力为低的pM至低的nM。抗体及其片段以高亲和力与C3b和C3c结合。这些抗体及其片段不抑制备解素与C5的结合。在4℃下，将聚苯乙烯微量滴定板过夜涂覆处于磷酸盐缓冲液(PBS)中的人类因子C3b。在吸入C3b溶液后，将孔用处于PBS中的1％牛血清白蛋白(BSA)(Sigma-Aldrich,St.Louis,Mo.)在室温下封闭1小时。不具有肽或C3b涂料的孔作为背景对照。将处于封闭溶液(包含2nM生物素化的备解素)中的单克隆抗C3b抗体IgG、Fab2和Fab的等分液加入到C3b涂覆的孔中，并将其温育1小时以便发生结合。在室温下温育1小时时间后，使用PBS将平板冲洗5次，并与过氧化物酶缀合的neutavidin温育。温育后，冲洗平板，并使用TMB试剂识别结合的过氧化物酶。
[0104] 如所示，抗C3b IgG不抑制备解素与C3b的结合，表明在C3b上不同于备解素位点的位点与结合有关。
[0105] 实施例3：抗C3b IgG、F(ab')2和Fab会抑制旁路途径(AP)依赖的兔红细胞(rRBC)溶解
[0106] 本红细胞溶解的测试是基于rRBC表面上终末补体复合物的形成。结果，rRBC溶解。在900nm下光散色的程序性降低是红细胞溶解的直接量度。通常，rRBC在包含5mM MgCl2的凝胶巴比妥缓冲液中与正常人类血清温育。在这些条件下，rRBC的表面会引发正常人类血清中旁路途径的激活。旁路途径的激活导致C5b-9复合物在rRBC的表面上形成。预计抑制C5b-9复合物形成的试剂会抑制细胞的溶解。为了评价抗C3b抗体及其片段的作用，将各种浓度的IgG、F(ab’)2和Fab在37℃下，在具有固定浓度的兔红细胞的AP缓冲液中与正常人类血清(10％NHS)在
温度受控的ELISA平板读取器(能够在900nm下读数)中温育。测量900nm下光散色的程序性降低(由于完整细胞的溶解)作为时间的函数。使用SpectraMax190平板读取器和SoftMax
软件记录并分析数据。就计算而言，在各浓度的IgG、F(ab’)2和Fab下计算总的抑制情况，并将结果表示为未溶解对照的％。使用MicroCal Origin软件，在反曲线图中绘制各浓度下的数据。
[0107] 如图7所示，在CI50能够抑制红细胞溶解的正常人类血清中，IgG抗C3b能够抑制AP依赖的rRBC溶血。抗体能够以大约69nM的IC50抑制溶解。
[0108] 实施例4：抗C3b单克隆抗体未抑制经典激活途径
[0109] 本发明的单克隆抗体不能抑制宿主防御所需的经典途径。将抗体致敏的
绵羊红细胞与1％或10％正常的人类血清在包含
钙(5mMCaCl2/MgCl2)缓冲液的凝胶巴比妥缓冲液中温育。抗体致敏的绵羊细胞会激活经典途径。结果，在被指控溶解的红细胞的表面上形成C5b-9。我们测试1％和10％正常的人类血清。在这2种条件下，抗C3b会抑制红细胞溶解。在典型的测试中，将红细胞在CP缓冲液中，在1％/10％正常的人类血清中温育，从而使补体激活发生。CP激活的结果是在红细胞的表面上形成C5b-9，从而使细胞发生溶解。在700nm下测量由于细胞溶解而导致的光散射的程序性降低，作为时间的函数。
[0110] 如图8所示，抗C3b IgG在2种血清浓度下均不会抑制抗体致敏的绵羊细胞的溶解。所有血清对照均显示一些作用。这些结果表明抗C3b抗体能够选择性地抑制补体旁路途径，而不会影响经典突进的激活。
[0111] 实施例5：抗C3b IgG及其片段能够抑制补体旁路途径中C3转化酶(PC3bBb)的形成
[0112] 通过得自伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhosa)的脂多糖在正常人类血清中激活补体旁路途径。我们使用这种范例来证明本发明的抗备解素抗体是否能抑制PC3bBb的形成。在抗备解素抗体及其片段存在和缺乏下，我们测量P、C3b、Bb和C5b-9的沉积情况。使用合适的抗体检测C3和C5转化酶的形成。在抗备解素抗体存在下，注意到C3和C5转化酶的形成以剂量依赖的方式受到抑制。在典型的测试中，将聚苯乙烯微量滴定板孔用处于PBS中的2μg/50μl的LPS(得自伤寒沙门氏菌的脂多糖)过夜涂覆。将孔与处于PBS中的1％BSA温育，以封闭孔中未占据的位点。在室温下封闭2小时并使用PBS冲洗后，将处于AP缓冲液中的正常人类血清(10％)与浓度改变的抗体和片段混合。将混合物在LPS涂覆的孔上温育。将平板在37℃下温育2小时，从而使补体AP激活发生。温育后，使用PBS充分冲洗平板，并使用合适的抗体检测C3转化酶的成分。我们使用在封闭溶液中1:2000稀释的兔抗人C3c，在封闭溶液中1:2000稀释的山羊抗人P，在封闭溶液中1:500稀释的山羊抗人因子Bb，以及在封闭溶液中1:2000稀释的HRPO缀合的抗人C5b-9检测C3b。在室温下，将平板与各自的抗体温育1小时。在温育后，使用PBS冲洗平板，并使用在封闭溶液中1:2000稀释的过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体(用于检测C3b)和在封闭溶液中1:2000稀释的过氧化物酶标记的兔抗山羊抗体(用于检测P)来检测结合的抗体。所有的平板在使用PBS充分洗涤后，使用TMB显色。使用1M正磷酸淬灭蓝色。图9证明了对P沉积以剂量依赖的方式进行抑制。
[0113] 图9示出了对P沉积以剂量依赖的方式进行抑制，图9示出了对形成的沉积以剂量依赖的方式进行抑制。这些数据提供了抗C3b单克隆抗体阻止转化酶形成并抑制AP激活的直接证据。
[0114] 图6：抗C3b在全血中抑制了旁路途径和细胞激活
[0115] 抗C3b抗体可以用于体外循环过程中，例如受试对象中的心肺转流术(CPB)和/或透析过程。在这些过程中，循环血液可以由受试对象的血管流经
导管，并返回至受试对象的血管中。所述的导管可以具有腔面，该腔面包含在受试对象的血液中导致补体激活、血小板激活、白细胞激活、或者血小板-白细胞粘附中的至少一种的材料。抗C3b抗体可以以有效减少补体激活、血小板激活、白细胞激活、或者血小板-白细胞粘附(由循环血液流通导管中所导致)中的至少一种的量引入到受试对象的血流中。可以使受试对象的血液在抗C3b抗体或其片段的引入步骤之前和/或引入过程中和/或引入之后流通过导管。优选的是，抗备解素抗体减少了补体成分C3向补体成分C3a和C3b的旁路途径依赖的转化，和/或C5b-C9的旁路途径依赖的形成，和/或旁路途径依赖的白细胞激活。
[0116] 全血管圈模型证明
生物材料诱导的AP激活。该模型模拟了心肺转流术和透析的体外循环模型。新分离的人类血液收集于50mL聚丙烯管中，该管中装有5单位/mL肝素作为抗凝剂。使用包含各种浓度的抗C3b的Plasmalyte-148稀释肝素化的血液。将管圈的一半装入2.0mL稀释的血液，并在体外过程中使用的聚丙烯管中以37°垂直旋转。在温育和旋转后，将血液样品转移至2.0mL管中。此外，将这些血液样品的等分液保存用于流式细胞仪。将剩余的血量离心(在4℃下4000xg离心5分钟)，并收集血浆样品。补体激活的抑制：管圈的塑料表面激活了旁路途径。结果形成C3a、C5a和C5b-9。使用商业化的ELISA方法可以测量到水平升高至基线以上。使用C3a&C5b-9
试剂盒(Quidel)和兔红细胞溶解测试针对补体活性来评价经历管圈后的血浆样品。生物材料表面诱导的旁路途径激活的结果是，C3转化为C3a和C3b。同样，C5被切割成C5a和C5b。
[0117] 图11证明了C3a的形成以剂量依赖的方式受到抑制(IC50为31μg/ml)。抗C3b抑制了C5b-9形成，如图12所示。
[0118] 实施例7：在体外循环后，由NM9405对TNF-α形成的抑制
[0119] 激活的单核细胞释放TNF-α，其为炎症的炎症介质。单核细胞通过C3a被激活。在体外循环中，抗C3b处理的血液样品证明TNF-α以剂量依赖的方式受到抑制。
[0120] TNF-α为与多种疾病病理学有关的、有效的炎症细胞因子。TNF-α为炎症前细胞因子，其募集其他炎症介质从而恶化炎症应答，并导致细胞凋亡、以及细胞和组织的损伤。TNF-α的抑制为用于抑制炎症应答的重要标志物。有效的抗TNF药品和生物学在疾病中提供重要的益处。在经历管圈循环后，血浆样品还经历TNF-α测试(BD-Biosciences)。
[0121] 如图13所示，抗C3b证明TNF-α的形成以剂量依赖的方式受到抑制，观察其IC50为大约44μg/ml。
[0122] 实施例8：单克隆抗体的生产
[0123] 对于鼠单克隆抗体的生产，本领域的那些技术人员已经进行了描述，并且为常规惯例。通常，以可以生产单克隆抗体的方式对小鼠给予抗原，在本实施例的情况下为C3b蛋白质。通过CDR移植并使用基因恒定区来生产人源化的嵌合抗体。基于旁路途径抑制测试来选择对C3b具有特异性的鼠单克隆抗体。而且，C3b也是经典途径的一部分，出人意料地，这种抗C3b抗体不能抑制经典途径，而仅抑制旁路途径。鼠抗体被转
化成人源化的嵌合抗体。
[0124] 实施例9：嵌合抗C3b单克隆抗体与C3b结合
[0125] 嵌合抗C3b抗体Fab与底物结合的C3b结合。在4℃下，将聚苯乙烯微量滴定板孔(96孔中结合力平板，Corning Costar,Cambridge,Mass.)过夜涂覆处于磷酸盐缓冲液pH7.4(PBS)中的C3b(2μg/50μl/孔，complement technology,Tyler,Tx)。在吸入C3b溶液后，将孔用包含1％牛血清白蛋白(BSA；SigmaChemical)的PBS在室温下封闭1小时。不具有C3b涂料的孔作为背景对照。将封闭溶液中的嵌合抗体的等分液加入到C3b涂覆的ELISA孔中。使用过氧化物酶缀合的抗人IgG轻链抗体来检测结合的嵌合抗体的量。
[0126] 图14示出了2个克隆与底物结合的C3b结合。
[0127] 实施例10：嵌合抗C3b单克隆抗体会抑制旁路途径
[0128] 嵌合抗C3b抗体Fab与C3b结合，并抑制红细胞的旁路途径依赖的溶解。该测试与实施例3中所述的相同。
[0129] 实施例11：抗C3b单克隆抗体以0.33比1(抗体比C3b)的比例中和C3b
[0130] 将各种浓度的抗C3b抗体加入到固定浓度的正常人类血清中。将血清-抗体混合物加入到兔红细胞中，并经历红细胞测试，如实施例3所示。所述的抗体在较高的浓度下会抑制红细胞溶解，其反曲点为大约1000nM浓度的抗体。存在的C3的总量为3200nM。这些数据表明抗体与C3的化学计量比为0.33比1。
[0131] 实施例12：鼠CDR以CDR移植到人类的构架区中
[0132] 将鼠CDR移植到不同的构架中，从而生成如图17和18所示的人源化抗体。构架和CDR都被包含在图19中，构架被包含在图20、21和22中。
