人源化或嵌合CD3抗体
阅读：798发布：2020-05-11
专利汇可以提供人源化或嵌合CD3抗体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及结合CD3的人源化或 嵌合 抗体 。此外涉及双特异性抗体、组合物、药物组合物、所述抗体在 治疗 疾病 中的用途和治疗的方法。，下面是人源化或嵌合CD3抗体专利的具体信息内容。
1.结合人CD3的人源化或嵌合抗体，其中所述抗体包含结合区，所述结合区包含重链可变(VH)区，其中所述VH区在具有CDR1 SEQ ID NO: 1、CDR2 SEQ ID NO: 2和CDR3 SEQ ID NO: 3所示的CDR序列的参考抗体的三个CDR序列之一中包含突变，所述突变位于选自以下的位置之一：T31M、T31P、N57、H101、G105、S110和Y114，其中所述位置根据SEQ ID NO: 4的参考序列进行编号。
2.权利要求1的抗体，其中与具有CDR1 SEQ ID NO: 1、CDR2 SEQ ID NO: 2和CDR3 SEQ ID NO: 3所示的VH CDR序列的参考抗体相比，所述抗体对人CD3的结合亲和力降低或增加。
3.权利要求1至2中任一项的抗体，其中所述抗体包含T31M或T31P突变。
4.权利要求1至2中任一项的抗体，其中所述抗体包含位置N57的突变。
5.权利要求1、2和4中任一项的抗体，其中所述抗体包含N57E突变。
6.权利要求1至2中任一项的抗体，其中所述抗体包含位置H101的突变。
7.权利要求1、2和6中任一项的抗体，其中所述抗体包含H101G或H101N突变。
8.权利要求1至2中任一项的抗体，其中所述抗体包含位置G105的突变。
9.权利要求1、2和8中任一项的抗体，其中所述抗体包含G105P突变。
10.权利要求1至2中任一项的抗体，其中所述抗体包含位置Y114的突变。
11.权利要求1、2和10中任一项的抗体，其中所述抗体包含Y114M、Y114R或Y114V突变。
12.权利要求1至2中任一项的抗体，其中所述VH区包含选自以下的CDR1、CDR2和CDR3序列：
a) SEQ ID NO: 54, 2, 3 [T31M]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；
b) SEQ ID NO: 58, 2, 3 [T31P]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；
c) SEQ ID NO: 1, 106, 3 [N57E]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；
d) SEQ ID NO: 1, 2, 176 [H101G]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；
e) SEQ ID NO: 1, 2, 184 [H101N]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；
f) SEQ ID NO: 1, 2, 220 [G105P]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；
g) SEQ ID NO: 1, 2, 236 [S110A]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；
h) SEQ ID NO: 1, 2, 244 [S110G]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；
i) SEQ ID NO: 1, 2, 284 [Y114M]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；
j) SEQ ID NO: 1, 2, 292 [Y114R]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；
k) SEQ ID NO: 1, 2, 298 [Y114V]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；和
l) 在三个CDR序列中与a)至k)中所示的三个CDR序列中的任何一个总共具有至少90％或至少95％氨基酸序列同一性的CDR1、CDR2和CDR3序列，条件是CDR1、CDR2和CDR3序列不具有SEQ ID NO: 1、2、3所示的序列。
13.权利要求1至2中任一项的抗体，其中所述VH区包含选自以下的CDR1、CDR2和CDR3序列：
a) SEQ ID NO: 54, 2, 3 [T31M]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；
b) SEQ ID NO: 58, 2, 3 [T31P]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；
c) SEQ ID NO: 1, 106, 3 [N57E]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；
d) SEQ ID NO: 1, 2, 176 [H101G]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；
e) SEQ ID NO: 1, 2, 184 [H101N]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；
f) SEQ ID NO: 1, 2, 220 [G105P]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；
g) SEQ ID NO: 1, 2, 236 [S110A]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；
h) SEQ ID NO: 1, 2, 244 [S110G]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；
i) SEQ ID NO: 1, 2, 284 [Y114M]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；
j) SEQ ID NO: 1, 2, 292 [Y114R]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；
k) SEQ ID NO: 1, 2, 298 [Y114V]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列，和
l) a)至k)中所述的CDR1、CDR2和CDR3序列，其在三个CDR序列中总共具有至多5个另外的突变或置换，至多4个另外的突变或置换，至多3个另外的突变或置换，至多2个另外的突变或置换，或至多1个另外的突变或置换，并且所述突变或置换优选不改变对人CD3的结合亲和力。
14.权利要求13的抗体，其中所述另外的突变或置换是保守的，物理的或功能性的氨基酸。
15.权利要求1至2中任一项的抗体，其中所述VH区具有选自以下的VH序列：
a) SEQ ID NO: 55[T31M]所示的VH序列，
b) SEQ ID NO: 59 [T31P]所示的VH序列，
c) SEQ ID NO: 107 [N57E]所示的VH序列
d) SEQ ID NO: 177 [H101G]所示的VH序列，
e) SEQ ID NO: 185 [H101N]所示的VH序列，
f) SEQ ID NO: 221 [G105P]所示的VH序列，
g) SEQ ID NO: 237 [S110A]所示的VH序列，
h) SEQ ID NO: 245 [S110G]所示的VH序列，
i) SEQ ID NO: 285 [Y114M]所示的VH序列，
j) SEQ ID NO: 293 [Y114R]所示的VH序列，
k) SEQ ID NO: 299 [Y114V]所示的VH序列，和
l) 与a)至k)中所示的任何一个序列具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％的氨基酸序列同一性的VH序列。
16.权利要求1至2中任一项的人源化或嵌合抗体，其中所述VH区具有选自以下的VH序列：
a) SEQ ID NO: 55[T31M]所示的VH序列，
b) SEQ ID NO: 59 [T31P]所示的VH序列，
c) SEQ ID NO: 107 [N57E]所示的VH序列
d) SEQ ID NO: 177 [H101G]所示的VH序列，
e) SEQ ID NO: 185 [H101N]所示的VH序列，
f) SEQ ID NO: 221 [G105P]所示的VH序列，
g) SEQ ID NO: 237 [S110A]所示的VH序列，
h) SEQ ID NO: 245 [S110G]所示的VH序列，
i) SEQ ID NO: 285 [Y114M]所示的VH序列，
j) SEQ ID NO: 293 [Y114R]所示的VH序列，和
k) SEQ ID NO: 299 [Y114V]所示的VH序列。
17.前述权利要求中任一项的抗体，其中所述结合区包含轻链可变(VL)区，其中所述VL区包含具有SEQ ID NO: 6、GTN和7所示的CDR序列的CDR1、CDR2和CDR3区。
18.前述权利要求中任一项的抗体，其中所述结合区包含轻链可变(VL)区，其中所述VL区选自：
a) SEQ ID NO:8所示的VL序列；
b) SEQ ID NO:10所示的VL序列；或
c) 与a)至b)所示的任一序列具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％氨基酸序列同一性的VL序列。
19.权利要求17的抗体，其中所述VL区包含具有SEQ ID NO: 6、GTN和7所示序列的CDR1、CDR2和CDR3区，并且其中所述VH区包含具有选自以下的CDR序列的CDR1、CDR2和CDR3区：
a) SEQ ID NO: 54, 2, 3 [T31M]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；
b) SEQ ID NO: 58, 2, 3 [T31P]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；
c) SEQ ID NO: 1, 106, 3 [N57E]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；
d) SEQ ID NO: 1, 2, 176 [H101G]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；
e) SEQ ID NO: 1, 2, 184 [H101N]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；
f) SEQ ID NO: 1, 2, 220 [G105P]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；
g) SEQ ID NO: 1, 2, 236 [S110A]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；
h) SEQ ID NO: 1, 2, 244 [S110G]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；
i) SEQ ID NO: 1, 2, 284 [Y114M]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；
j) SEQ ID NO: 1, 2, 292 [Y114R]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；和
k) SEQ ID NO: 1, 2, 298 [Y114V]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列。
20.前述权利要求中任一项的抗体，其中人CD3是如SEQ ID NO: 399所述的人CD3ε。
21.前述权利要求中任一项的抗体，其中所述抗体对具有SEQ ID NO: 402的人CD3ε肽的结合亲和力对应于1.6 x10-8M至9.9x10-8 M或1.0x10-7至9.9x10-7M的KD值，如通过生物层干涉测量法测定的。
22.前述权利要求中任一项的抗体，其中所述抗体对具有SEQ ID NO: 402的人CD3ε肽的结合亲和力对应于1.4 x10-8至1.0 x10-8 M或9.9x10-9至1 x10-9M的KD值，如通过生物层干涉测量法测定的。
23.前述权利要求中任一项的抗体，其中所述抗体是人源化抗体。
24.前述权利要求中任一项的抗体，其中所述抗体是全长抗体。
25.前述权利要求中任一项的抗体，其中所述抗体具有选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的同种型。
26.前述权利要求中任一项的抗体，其中所述抗体是单价、二价或多价。
27.前述权利要求中任一项的抗体，其中所述抗体包含含有第一和第二免疫球蛋白重链的Fc区。
28.前述权利要求中任一项的抗体，其中所述抗体包含第一和第二免疫球蛋白重链，其中在所述第一和第二免疫球蛋白重链的至少一个中，在对应于根据EU编号的人IgG1重链的位置L234、L235、D265、N297和P331的位置上的一个或多个氨基酸分别不是L、L、D、N和P。
29.权利要求28的抗体，其中在所述第一和第二免疫球蛋白重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置D265的位置上的氨基酸不是D。
30.权利要求28的抗体，其中在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置N297的位置上的氨基酸不是N。
31.权利要求28的抗体，其中在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置L234和L235的位置上的氨基酸分别不是L和L。
32.权利要求28和31中任一项的抗体，其中在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置L234和L235的位置上的氨基酸分别是F和E；或A和A。
33.权利要求32的抗体，其中在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置L234和L235的位置上的氨基酸分别是F和E。
34.权利要求32的抗体，其中在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置L234和L235的位置上的氨基酸分别是A和A。
35.权利要求27的抗体，其中在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分别不是L、L和D。
36.权利要求35的抗体，其中在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分别是F、E和A；或A、A和A。
37.权利要求35-36中任一项的抗体，其中在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分别是F、E和A。
38.权利要求35-36中任一项的抗体，其中在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分别是A、A和A。
39.权利要求28的抗体，其中在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置L234、L235、D265、N297和P331的位置上的氨基酸分别是F、E、A、Q和S。
40.双特异性抗体，其包含权利要求1-39中任一项的抗体的第一结合区，和与所述第一抗原结合区结合不同的靶标的第二结合区。
41.权利要求40的双特异性抗体，其中所述抗体包含第一和第二重链。
42.权利要求40-41中任一项的双特异性抗体，其中所述第一和第二重链各自至少包含铰链区、CH2和CH3区，其中在所述第一重链中对应于选自人IgG1重链的T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409的位置的位置上的至少一个氨基酸被置换，和在所述第二重链中对应于选自人IgG1重链的T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409的位置的位置上的至少一个氨基酸被置换，和其中所述第一和所述第二重链未在相同的位置上被置换。
43.权利要求42的双特异性抗体，其中在所述第一重链中对应于人IgG1重链的F405的位置上的氨基酸是L，和在所述第二重链中对应于人IgG1重链的K409的位置上的氨基酸是R，或反之亦然。
44.权利要求40-43中任一项的双特异性抗体，其中所述第一结合区依照权利要求1-27中任一项，和所述第二结合区与所述第一结合区结合不同的靶标。
45.与包含重链可变(VH)区的参考抗体相比降低结合人CD3的抗体的结合亲和力的方法，其中所述VH区包含SEQ ID NO: 1、2、3所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述方法包括在所述参考抗体的三个CDR序列之一中引入突变，所述突变选自以下位置之一的突变，所述位置选自T31M、T31P、N57、H101、S110和Y114，其中根据SEQ ID NO: 4的参考序列对位置进行编号。
46.权利要求45的方法，其中所述突变是T31M或T31P突变。
47.权利要求45的方法，其中所述方法包括在对应于位置N57的VH CDR2区中引入突变。
48.权利要求47的方法，其中所述位置N57的突变为N57E突变。
49.权利要求45的方法，其中所述方法包括在对应于选自H101、S110和Y114的位置的VH CDR3区中引入突变。
50.权利要求49的方法，其中所述VH CDR3区中的所述突变选自H101G、H101N、S110A、S110G、Y114M、Y114R和Y114V。
51.与包含重链可变(VH)区的参考抗体相比增加结合人CD3的抗体的结合亲和力的方法，其中所述VH区包含SEQ ID NO: 1、2、3所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述方法包括在对应于位置G105的VH CDR3中引入突变，其中所述位置根据SEQ ID NO: 4的参考序列进行编号。
52.权利要求51的方法，其中所述位置G105的突变是G105P突变。
53.权利要求45-52的方法，其中所述方法包括将至多5个另外的突变，至多4个另外的突变，至多3个另外的突变，至多2个另外的突变或至多1个另外的突变引入至SEQ ID NO:
1、2、3所示的参考抗体的VH区的CDR。
54.权利要求45至53中任一项的方法，其中结合亲和力增加或降低的抗体包含含有重链可变(VH)区的结合区，其中所述VH区包含选自以下的CDR1、CDR2和CDR3序列：
a) SEQ ID NO: 54, 2, 3 [T31M]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；
b) SEQ ID NO: 58, 2, 3 [T31P]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；
c) SEQ ID NO: 1, 106, 3 [N57E]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；
d) SEQ ID NO: 1, 2, 176 [H101G]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；
e) SEQ ID NO: 1, 2, 184 [H101N]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；
f) SEQ ID NO: 1, 2, 220 [G105P]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；
g) SEQ ID NO: 1, 2, 236 [S110A]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；
h) SEQ ID NO: 1, 2, 244 [S110G]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；
i) SEQ ID NO: 1, 2, 284 [Y114M]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；
j) SEQ ID NO: 1, 2, 292 [Y114R]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列；和
k) SEQ ID NO: 1, 2, 298 [Y114V]所示的CDR1, CDR2和CDR3序列。
55.权利要求45至54中任一项的方法，其中所述抗体对具有SEQ ID NO: 402的人CD3ε肽的结合亲和力对应于1.6 x10-8 M至9.9x10-8 M或1.0x10-7至9.9x10-7 M的KD值，如通过生物层干涉测量法测定的。
56.权利要求45至54中任一项的方法，其中所述抗体对具有SEQ ID NO: 402的人CD3ε肽的结合亲和力对应于1.4 x10-8至1.0 x10-8 M或9.9x10-9至1 x10-9 M的KD值，如通过生物层干涉测量法测定的。
57.权利要求45至57中任一项的方法，其中所述人CD3ε在T细胞上表达。
58.权利要求45至57中任一项的方法，其中所述人CD3ε为分离的形式，例如，分离的人CD3ε-肽。
59.编码权利要求1-44中任一项的一个或多个氨基酸序列的核酸构建体。
60.表达载体，其包含
(i) 编码权利要求1-16中任一项的人源化或嵌合抗体的重链序列的核酸序列；
(ii) 编码权利要求17-18中任一项的人源化或嵌合抗体的轻链序列的核酸序列；或(iii) (i)和(ii)两者。
61.宿主细胞，其包含权利要求60的表达载体。
62.权利要求61的宿主细胞，其中所述宿主细胞是重组真核、重组原核或重组微生物宿主细胞。
63.组合物，其包含权利要求1-27中任一项的抗体或权利要求28-44的双特异性抗体。
64.药物组合物，其包含权利要求1-27中任一项的抗体或权利要求28-44中任一项的双特异性抗体和药学上可接受的载体。
65.权利要求1-44中任一项所述的抗体、权利要求63所述的组合物或权利要求64所述的药物组合物，其用作药物。
66.权利要求1-44中任一项所述的抗体、权利要求63所述的组合物或权利要求64所述的药物组合物，其用作治疗癌症、感染性疾病或自身免疫性疾病的药物。
67.权利要求1-27中任一项所述的抗体、权利要求28-44所述的双特异性抗体、权利要求63所述的组合物或权利要求64所述的药物组合物，其用于治疗疾病。
68.权利要求1-27中任一项所述的抗体或权利要求28-44所述的双特异性抗体用于制备用于治疗疾病的药物的用途。
69.权利要求68的用途，用于治疗疾病，其中所述疾病是癌症、感染性疾病或自身免疫性疾病。
70.治疗疾病的方法，包括给予有需要的受试者权利要求1-27中任一项所述的抗体、权利要求28-44所述的双特异性抗体、权利要求63所述的组合物或权利要求64所述的药物组合物。
71.权利要求70的方法，其中所述疾病是癌症、感染性疾病或自身免疫性疾病。
72.诊断特征为涉及或积聚表达CD3的细胞的疾病的方法，包括给予受试者权利要求1-
27中任一项所述的抗体、权利要求63所述的组合物或权利要求64所述的药物组合物，任选地其中所述抗体被可检测试剂标记。
73.用于产生权利要求1-27中任一项的抗体的方法，包括以下步骤
a) 培养权利要求61-62中任一项的宿主细胞；和
b) 自培养基纯化所述抗体。
74.诊断组合物，其包含权利要求1-27中任一项的抗体或权利要求28-44中任一项的双特异性抗体。
75.用于在样品中检测CD3抗原或表达CD3的细胞的存在情况的方法，包括以下步骤：
a) 使所述样品与权利要求1-27中任一项的抗体或权利要求28-44中任一项的双特异性抗体在允许在所述抗体或双特异性抗体和CD3之间形成复合物的条件下接触；和b) 分析是否形成复合物。
76.用于在样品中检测CD3抗原或表达CD3的细胞的存在情况的试剂盒，其包含i) 权利要求1-27中任一项的抗体或权利要求28-44中任一项的双特异性抗体；和ii) 所述试剂盒的使用说明书。
77.抗个体基因型抗体，其结合权利要求1-27中任一项的抗体或权利要求28-44中任一项的双特异性抗体。
人源化或嵌合CD3抗体
发明领域
[0002] 发明背景
[0003] 分化簇3(CD3)已被了解很多年，因此在许多方面是关注对象。特别是，已知针对CD3或T-细胞受体复合物(CD3作为其一部分)产生的抗体。已经描述了重组嵌合CD3同种型变体以及多种人源化OKT3效应器功能变体抗体的体外表征[1]。
[0004] CD3抗体，例如muromonab-CD3已被广泛用于治疗急性同种异体移植排斥。此外，在缺少持续的免疫抑制药物疗法的情况下，在发生1型糖尿病后至少2年内，用抗-CD3单克隆抗体hOKT3γ1(Ala-Ala)治疗导致改进的C-肽反应和临床参数[2]。
[0005] 改进靶向抗体疗法的有前景的方法是通过递送特别针对表达抗原的癌细胞的细胞毒性细胞。已经描述了使用T细胞以有效杀死肿瘤细胞的这一概念[3]。然而，最初的临床研究相当令人失望，主要由于低的功效、严重的副作用(细胞因子爆发)和双特异性抗体的免疫原性[4]。设计和应用双特异性抗体的进展部分地克服了细胞因子爆发的最初障碍和改进了临床有效性，没有剂量限制的毒性[5]。
[0006] 例如，以一条臂靶向肿瘤细胞上的抗原和以另一条臂靶向例如T细胞上的CD3，并且含有提供Fc受体结合的活性Fc片段的某些双特异性抗体已显示诱导肿瘤细胞杀伤。在结合时，潜在形成结合抗体Fc区的T细胞、肿瘤细胞和效应细胞的复合物，导致杀死肿瘤细胞[4]。卡妥索单抗由小鼠IgG2a/大鼠IgG2b重链异源二聚体组成，和已经发现在腹膜内应用后成功用于治疗癌症-相关的腹水[6]。然而，小鼠/大鼠杂合体产生免疫原性[7]和不能在人类中应用于长期治疗。频繁治疗-相关的不良事件归因于卡妥索单抗诱导的细胞因子-释放-相关的症状(即发热、恶心、呕吐、发冷、心动过速和低血压)[8]-[9]，这涉及到卡妥索单抗由于其活性Fc片段引起的强效多克隆T细胞活化。另一种抗体是厄马索单抗(ertumaxomab)(HER2xCD3)，其在具有HER2表达的细胞系中诱导细胞毒性。厄马索单抗已经处于对转移性乳腺癌的II期临床开发中[10]-[11]。
[0007] CD3双特异性抗体和其它基于CD3双特异性抗体的形式的功效取决于双特异性抗体的几种性质，例如CD3臂的亲和力和/或第二臂的靶标亲和力和靶细胞上的靶标拷贝数。当CD3亲和力低时，一些CD3双特异性抗体显示出高效力(EpCamxCD3-Bortoletto 2002 PMID 12385030,MT103/Blinatumomab vs TandAb-Molhoj 2007 PMID 17083975)，而其它CD3双特异性使用高CD3亲和力显示高效力(Reusch 2015,Mabs,PMID 25875246)。在某些情况下需要高CD3亲和力，例如当提供给来自患者的离体扩增的活化T细胞包含抗CD3靶向臂和针对所选肿瘤相关抗原的第二臂的双特异性抗体时。在后一种情况下，当产品被输注回到患者体内以介导肿瘤细胞的细胞溶解时，CD3亲和力应该很高以保持与扩增的T细胞的相互作用(Reusch 2006 Clin CancerRes PMID 16397041)。然而，与低亲和力配体相比，抗CD3的高亲和力抗体在低拷贝数时在TCR触发中效力低得多，因为它们显示约1:1的化学计量和线性剂量-响应曲线，表明单一周期而不是T细胞应答的连续触发模式(Viola 1996 Science，PMID 8658175)。换句话说，CD3臂的低亲和力可以使T细胞从一个靶标和/或靶细胞灵活地移动到另一个(Hoffman 2005，PMID：15688411)。
[0008] 低CD3亲和力可潜在地防止双特异性抗体对T细胞的偏向定位(由于首次在循环中遇到)并因此改善生物分布并使对正常T细胞免疫应答的干扰最小化。根据第二臂的靶标和靶拷贝数、适应症和/或给药途径，可定制所需的CD3亲和力以增加产品的最大功效。覆盖一系列CD3亲和力的一组CD3变体对于由抗体产品满足这些特定定制的需求可为必不可少的。
[0009] 已经描述了与食蟹猴和/或恒河猴CD3有交叉反应的CD3抗体[12]-[13]，然而需要对所述交叉反应性抗体的进一步改进。
[0010] 发明简述
[0011] 本发明的目标是提供对CD3具有优化亲和力的人源化或嵌合CD3抗体。因此，本发明的目的是提供与参考抗体例如由VH序列SEQ ID NO:4和VL序列SEQ ID NO:8指定的抗体相比被优化的人源化或嵌合CD3抗体。因此，与由VH序列SEQ ID NO:4和VL序列SEQ ID NO:8指定的参考抗体相比，此类抗体可以具有降低或增加的对CD3的亲和力。本发明的另一个目的是提供与由VH序列SEQ ID NO:4和VL序列SEQ ID NO:8指定的抗体相比对CD3具有较低结合亲和力的抗体。本发明人发现，与参考抗体相比，与具有SEQ ID NO:4所示的VH区序列的参考抗体相比对SEQ ID NO:402所示的CD3肽具有降低的结合亲和力的抗体在体外和体内维持相同或类似的细胞毒性活性。本发明的另一个目的是提供与由VH序列SEQ ID NO:4和VL序列SEQ ID NO:8指定的参考抗体相比对CD3具有降低结合亲和力的CD3抗体，但保留与参考抗体相同的细胞溶解活性。本发明的另一个目的是提供与由VH序列SEQ ID NO:4和VL序列SEQ ID NO:8指定的抗体相比对CD3具有更高结合亲和力的抗体。
[0012] 在一个方面，本发明提供了结合人CD3的人源化或嵌合抗体，其中所述抗体包含含有重链可变(VH)区的结合区，其中所述VH区在具有CDR1 SEQ ID NO:1，CDR2 SEQ ID NO:2和CDR3 SEQ ID NO:3中所示的VH CDR序列的参考抗体的三个CDR序列之一中包含突变，所述突变位于选自以下的一个位置中：T31M，T31P，N57，H101，G105，S110和Y114，其中所述位置根据SEQ ID NO:4的参考序列进行编号。SEQ ID NO:4中的氨基酸根据从N端到C端方向上从第一个氨基酸到数字125的直接数字编号方案编号。图2中示出了对应于SEQ ID NO:4的位置的数字编号。此外，根据IMGT定义已经注释了VH CDR区。
[0013] 在本发明的一个实施方案中，与具有CDR1 SEQ ID NO:1，CDR2 SEQ ID NO:2和CDR3 SEQ ID NO:3所示的VH CDR序列的参考抗体相比，所述抗体对人CD3的结合亲和力降低或增加。
[0014] 在本发明的一些实施方案中，与参考抗体相比，对人CD3分子例如CD3肽例如SEQ ID NO:402具有降低的结合亲和力的抗体，可以与参考抗体一样对靶细胞具有相同的细胞溶解活性。
[0015] 在本发明的一个实施方案中，抗体在对应于SEQ ID NO:4的N57的位置包含突变。在一个实施方案中，突变是N57E。
[0016] 在本发明的一个实施方案中，抗体在对应于SEQ ID NO:4的H101G的位置包含突变。在一个实施方案中，突变是H101G或H101N。
[0017] 在本发明的一个实施方案中，抗体在对应于SEQ ID NO:4的G105的位置包含突变。在一个实施方案中，突变是G105P。
[0018] 在本发明的一个实施方案中，抗体在对应于SEQ ID NO:4的Y114的位置包含突变。在一个实施方案中，突变是Y114M，Y114R或Y114V。
[0019] 在一个实施方案中，本发明提供了结合人CD3的人源化或嵌合抗体，其中所述抗体包含含有重链可变(VH)区的结合区，其中所述VH区包含具有选自以下的CDR序列的CDR1、CDR2和CDR3区：
[0020] a)SEQ ID NO:12,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0021] b)SEQ ID NO:14,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0022] c)SEQ ID NO:16,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0023] d)SEQ ID NO:18,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0024] e)SEQ ID NO:20,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0025] f)SEQ ID NO:22,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0026] g)SEQ ID NO:24,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0027] h)SEQ ID NO:26,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0028] i)SEQ ID NO:28,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0029] j)SEQ ID NO:30,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0030] k)SEQ ID NO:32,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0031] l)SEQ ID NO:34,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0032] m)SEQ ID NO:36,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0033] n)SEQ ID NO:38,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0034] o)SEQ ID NO:40,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0035] p)SEQ ID NO:42,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0036] q)SEQ ID NO:44,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0037] r)SEQ ID NO:46,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0038] s)SEQ ID NO:48,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0039] t)SEQ ID NO:50,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0040] u)SEQ ID NO:52,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0041] v)SEQ ID NO:54,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0042] w)SEQ ID NO:56,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0043] x)SEQ ID NO:58,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0044] y)SEQ ID NO:60,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0045] z)SEQ ID NO:62,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0046] aa)SEQ ID NO:64,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0047] bb)SEQ ID NO:66,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0048] cc)SEQ ID NO:68,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0049] dd)SEQ ID NO:70,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0050] ee)SEQ ID NO:72,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0051] ff)SEQ ID NO:74,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0052] gg)SEQ ID NO:76,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0053] hh)SEQ ID NO:78,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0054] ii)SEQ ID NO:80,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0055] jj)SEQ ID NO:82,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0056] kk)SEQ ID NO:84,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0057] ll)SEQ ID NO:86,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0058] mm)SEQ ID NO:88,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0059] nn)SEQ ID NO:90,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0060] oo)SEQ ID NO:92,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0061] pp)SEQ ID NO:94,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0062] qq)SEQ ID NO:96,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0063] rr)SEQ ID NO:98,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0064] ss)SEQ ID NO:1,100,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0065] tt)SEQ ID NO:1,102,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0066] uu)SEQ ID NO:1,104,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0067] vv)SEQ ID NO:1,106,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0068] ww)SEQ ID NO:1,108,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0069] xx)SEQ ID NO:1,110,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0070] yy)SEQ ID NO:1,112,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0071] zz)SEQ ID NO:1,114,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0072] aaa)SEQ ID NO:1,116,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0073] bbb)SEQ ID NO:1,118,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0074] ccc)SEQ ID NO:1,120,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0075] ddd)SEQ ID NO:1,122,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0076] eee)SEQ ID NO:1,124,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0077] fff)SEQ ID NO:1,126,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0078] ggg)SEQ ID NO:1,128,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0079] hhh)SEQ ID NO:1,130,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0080] iii)SEQ ID NO:1,132,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0081] jjj)SEQ ID NO:1,134,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0082] kkk)SEQ ID NO:1,136,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0083] lll)SEQ ID NO:1,138,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0084] mmm)SEQ ID NO:1,140,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0085] nnn)SEQ ID NO:1,142,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0086] ooo)SEQ ID NO:1,144,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0087] ppp)SEQ ID NO:1,146,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0088] qqq)SEQ ID NO:1,148,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0089] rrr)SEQ ID NO:1,150,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0090] sss)SEQ ID NO:1,152,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0091] ttt)SEQ ID NO:1,154,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0092] uuu)SEQ ID NO:1,156,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0093] vvv)SEQ ID NO:1,158,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0094] www)SEQ ID NO:1,160,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0095] xxx)SEQ ID NO:1,162,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0096] yyy)SEQ ID NO:1,164,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0097] zzz)SEQ ID NO:1,166,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0098] aaaa)SEQ ID NO:1,168,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0099] bbbb)SEQ ID NO:1,2,170所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0100] cccc)SEQ ID NO:1,2,172所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0101] dddd)SEQ ID NO:1,2,174所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0102] eeee)SEQ ID NO:1,2,176所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0103] ffff)SEQ ID NO:1,2,178所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0104] gggg)SEQ ID NO:1,2,180所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0105] hhhh)SEQ ID NO:1,2,182所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0106] iiii)SEQ ID NO:1,2,184所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0107] jjjj)SEQ ID NO:1,2,186所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0108] kkkk)SEQ ID NO:1,2,188所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0109] llll)SEQ ID NO:1,2,190所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0110] mmmm)SEQ ID NO:1,2,192所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0111] nnnn)SEQ ID NO:1,2,194所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0112] oooo)SEQ ID NO:1,2,196所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0113] pppp)SEQ ID NO:1,2,198所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0114] qqqq)SEQ ID NO:1,2,200所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0115] rrrr)SEQ ID NO:1,2,202所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0116] ssss)SEQ ID NO:1,2,204所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0117] tttt)SEQ ID NO:1,2,206所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0118] uuuu)SEQ ID NO:1,2,208所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0119] vvvv)SEQ ID NO:1,2,210所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0120] wwww)SEQ ID NO:1,2,212所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0121] xxxx)SEQ ID NO:1,2,214所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0122] yyyy)SEQ ID NO:1,2,216所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0123] zzzz)SEQ ID NO:1,2,218所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0124] aaaaa)SEQ ID NO:1,2,220所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0125] bbbbb)SEQ ID NO:1,2,222所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0126] ccccc)SEQ ID NO:1,2,224所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0127] ddddd)SEQ ID NO:1,2,226所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0128] eeeee)SEQ ID NO:1,2,228所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0129] fffff)SEQ ID NO:1,2,230所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0130] ggggg)SEQ ID NO:1,2,232所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0131] hhhhh)SEQ ID NO:1,2,234所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0132] iiiii)SEQ ID NO:1,2,236所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0133] jjjjj)SEQ ID NO:1,2,238所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0134] kkkkk)SEQ ID NO:1,2,240所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0135] lllll)SEQ ID NO:1,2,242所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0136] mmmmm)SEQ ID NO:1,2,244所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0137] nnnnn)SEQ ID NO:1,2,246所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0138] ooooo)SEQ ID NO:1,2,248所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0139] ppppp)SEQ ID NO:1,2,250所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0140] qqqqq)SEQ ID NO:1,2,252所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0141] rrrrr)SEQ ID NO:1,2,254所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0142] sssss)SEQ ID NO:1,2,256所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0143] ttttt)SEQ ID NO:1,2,258所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0144] uuuuu)SEQ ID NO:1,2,260所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0145] vvvvv)SEQ ID NO:1,2,262所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0146] wwwww)SEQ ID NO:1,2,264所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0147] xxxxx)SEQ ID NO:1,2,266所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0148] yyyyy)SEQ ID NO:1,2,268所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0149] zzzzz)SEQ ID NO:1,2,270所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0150] aaaaaa)SEQ ID NO:1,2,272所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0151] bbbbbb)SEQ ID NO:1,2,274所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0152] cccccc)SEQ ID NO:1,2,276所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0153] dddddd)SEQ ID NO:1,2,278所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0154] eeeeee)SEQ ID NO:1,2,280所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0155] ffffff)SEQ ID NO:1,2,282所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0156] gggggg)SEQ ID NO:1,2,284所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0157] hhhhhh)SEQ ID NO:1,2,286所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0158] iiiiii)SEQ ID NO:1,2,288所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0159] jjjjjj)SEQ ID NO:1,2,290所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0160] kkkkkk)SEQ ID NO:1,2,292所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0161] llllll)SEQ ID NO:1,2,294所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0162] mmmmmm)SEQ ID NO:1,2,296所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0163] nnnnnn)SEQ ID NO:1,2,298所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；和
[0164] oooooo)SEQ ID NO:1、2、300所示的CDR1,CDR2和CDR3序列。
[0165] 即，在本发明的第一方面，本发明的发明人发现与参考抗体(例如由VH序列SEQ ID NO:4和VL序列SEQ ID NO:8指定的抗体)相比，所述序列的人源化或嵌合抗体对CD3肽SEQ ID NO:402具有优化的结合亲和力。如实施例7所示，由SEQ ID NO:4和VL序列SEQ ID NO:8-8指定的参考抗体对SEQ ID NO:402的CD3肽具有1.5x10 M的结合亲和力。在本发明的一些实施方案中，所述抗体对SEQ ID NO:402的CD3肽的结合亲和力低于1.5×10-8M，例如1.6×10-8M至9.9×10-8M的结合亲和力或例如1.0×10-7至9.9×10-7M的结合亲和力，如通过实施例7中表6中所述的生物层干涉测量法测定的。在本发明的一些实施方案中，所述抗体对SEQ ID NO:402的CD3肽的结合亲和力高于1.5×10-8M，例如1.4×10-8至1.0×10-8M，例如9.9×10-9至1×10-9M或例如9.9×10-9至1×10-9M。结合亲和力对应于KD值。
[0166] 在本发明的一个方面，本发明涉及结合人CD3的人源化或嵌合抗体，其中所述抗体包含含有重链可变(VH)区的结合区，其中所述VH区包含具有选自以下之一的CDR序列的CDR1、CDR2和CDR3区：
[0167] a)SEQ ID NO:54,2,3[T31M]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0168] b)SEQ ID NO:58,2,3[T31P]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0169] c)SEQ ID NO:1,106,3[N57E]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0170] d)SEQ ID NO:1,2,176[H101G]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0171] e)SEQ ID NO:1,2,184[H101N]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0172] f)SEQ ID NO:1,2,220[G105P]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0173] g)SEQ ID NO:1,2,236[S110A]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0174] h)SEQ ID NO:1,2,244[S110G]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0175] i)SEQ ID NO:1,2,284[Y114M]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0176] j)SEQ ID NO:1,2,292[Y114R]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0177] k)SEQ ID NO:1,2,298[Y114V]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；和
[0178] l)在三个CDR序列中与a)至k)中所示的三个CDR序列中的任何一个总共具有至少90％或至少95％氨基酸序列同一性的CDR1、CDR2和CDR3序列，条件是CDR1、CDR2和CDR3序列不具有SEQ ID NO:1、2、3所示的序列。
[0179] 另一方面，本发明涉及人源化或嵌合抗体，其中所述结合区包含轻链可变(VL)区，其中所述VL区包含具有SEQ ID NO:6,GTN,7所示的CDR的CDR1、CDR2和CDR3区。
[0180] 另一方面，本发明涉及与包含重链可变区(VH)区的参考抗体相比降低结合人CD3的抗体的结合亲和力的方法，其中所述VH区包含SEQ ID NO:1、2、3所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述方法包括在所述参考抗体的三个CDR序列之一中引入突变，所述突变选自以下位置之一中的突变，所述位置选自T31M、T31P、N57、H101、S110，S110和Y114，其中所述位置根据SEQ ID NO:4的参考序列进行编号。
[0181] 在本发明的一个实施方案中，所述方法包括在对应于T31M或T31P的VH区CDR1区序列中引入突变。在本发明的另一个实施方案中，所述方法包括在对应于N57E的VH区CDR2区中引入突变。在本发明的另一个实施方案中，所述方法包括在选自H101G，H101N，G105P，S110A，S110G，Y114M，Y114R或Y114V的VH区CDR3区中引入突变。
[0182] 在一个实施方案中，CD3是人CD3ε。
[0183] 在另一方面，本发明涉及双特异性抗体，其包含本发明的抗体的第一结合区，和与所述第一抗原结合区结合不同的靶标的第二结合区。
[0184] 在另一方面，本发明涉及编码一个或多个本发明的氨基酸序列的核酸构建体。
[0185] 在另一方面，本发明涉及表达载体，其包含(i)编码本发明的人源化或嵌合抗体的重链序列的核酸序列，(ii)编码本发明的人源化或嵌合抗体的轻链序列的核酸序列，或(iii)(i)和(ii)两者。
[0186] 在另一方面，本发明涉及包含本发明的表达载体的宿主细胞。
[0187] 在另一方面，本发明涉及包含本发明的抗体或双特异性抗体的组合物。
[0188] 在另一方面，本发明涉及包含本发明的抗体或双特异性抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。
[0189] 在另一方面，本发明涉及本发明的抗体或双特异性抗体、组合物或药物组合物，其用作药物。
[0190] 在另一方面，本发明涉及本发明的抗体或双特异性抗体、组合物或药物组合物，其用于治疗疾病。
[0191] 在另一方面，本发明涉及治疗疾病的方法，包括给予有需要的受试者本发明的抗体或双特异性抗体、组合物或药物组合物。
[0192] 另一方面，本发明涉及给予抗体或双特异性抗体的方法，其中所述抗体或双特异性抗体通过皮下或局部给予来给予。
[0193] 在一个方面，本发明涉及诊断特征为涉及或积聚表达CD3的细胞的疾病的方法，包括给予受试者本发明的人源化或嵌合抗体、组合物或药物组合物，任选地其中所述人源化或嵌合抗体用可检测试剂标记。
[0194] 在另一方面，本发明涉及用于产生本发明的抗体或双特异性抗体的方法，包括步骤：a)培养本发明的宿主细胞，和b)从培养基纯化抗体。
[0195] 在另一方面，本发明涉及包含根据本文公开的任一实施方案的抗体或双特异性抗体的诊断组合物。
[0196] 在一个实施方案中，诊断组合物是用于筛选和选择将从双特异性抗体治疗中获益的患者的伴侣诊断。
[0197] 在另一方面，本发明涉及用于检测样品中CD3抗原或表达CD3的细胞的存在情况的方法，包括步骤：a)使样品与本发明的抗体或双特异性抗体在允许所述抗体或双特异性抗体和CD3之间形成复合物的条件下接触，和b)分析是否已形成复合物。
[0199] 在另一方面，本发明涉及结合本发明的抗体的抗个体基因型抗体或抗个体基因型抗体对。
[0201] 图1：具有突变体与wtUniTE-huCD3-H1L1-T41K分子的结合比的热图。高于1的比率表示比wt更强的结合，而低于1的比率表示比wt更弱的结合。在用CD3/TCR-LC13转染的Freestyle 293-F细胞上测定结合。
[0203] 图3：通过流式细胞术测定的人源化CD3(UniTE-huCD3-H1L1-T41K)抗体的选定VH亲和变体的T细胞结合曲线。所描述的亲和变体涵盖野生型应答和不可检测应答之间的宽范围的T细胞结合能力。
[0204] 图4：通过流式细胞术测定的人源化CD3(UniTE-huCD3-H1L1-T41K)抗体的选定VH亲和变体的T细胞结合曲线，显示非常低的不可检测的T细胞结合。
[0205] 图5：通过流式细胞术测定的人源化CD3(BisG1-huCD3-H1L1-X-FEAL/1014-赫赛汀-FEAR)抗体的选定VH亲和变体的T细胞结合曲线。所描述的亲和变体涵盖野生型应答和不可检测应答之间的宽范围的T细胞结合能力。
[0206] 图6：通过阿尔玛蓝测定法测量的CD3亲和变体对实体肿瘤细胞系的细胞毒性。(A)NCI-N87细胞，效应细胞(T细胞)：肿瘤细胞(NCI-N87细胞)比率＝3:1，孵育48小时，n＝2个供体，(B)SKOV3细胞，T细胞：SKOV3细胞比率＝4:1，孵育48小时，n＝2个供体，(C)MDA-MB-231细胞，T细胞：MDA-MB-231细胞比率＝8：1，孵育48小时，n＝2个供体。所描绘的测试亲和变体涵盖野生型应答和对所有测试的肿瘤细胞系没有观察到的细胞毒性之间的广泛细胞毒性。
[0207] 图7：通过铬释放测定法测量的CD3亲和变体对血液学(Daudi)细胞系的细胞毒性。T细胞：Daudi细胞比率＝10：1，孵育24小时，1个供体。所描绘的测试亲和变体涵盖野生型应答之间广泛的细胞毒性和对所测试的肿瘤细胞系没有观察到的细胞毒性。
[0208] 图8：CD3xHER2双特异性抗体在NOD-SCID小鼠中的NCI-N87人PBMC共植入模型中的细胞毒性。在两种不同剂量水平的CD3亲和力抗体(0.5和0.05mg/kg)下，将HLA-A匹配的人未刺激的PBMC作为人T细胞来源与NCI-N87肿瘤细胞在NOD-SCID小鼠中共接种。人源化WT CD3(huCD3)和4种不同的CD3亲和变体(N57E，H101K，S110A，Y114M)经过测试。(A)用0.05mg/kg抗体(每组n＝4)处理后随时间推移的平均肿瘤体积。(B)用0.5mg/kg抗体(每组n＝4)处理后随时间推移的平均肿瘤体积。(C)在第0天用0.05mg/kg抗体处理后第44天的平均肿瘤体积(每组n＝4)。(D)在第0天用0.5mg/kg抗体处理后第44天的平均肿瘤体积(每组n＝4)。已经对C和D的数据进行了统计。
[0209] 发明详述
[0210] 一方面，本发明涉及对CD3具有优化亲和力的结合人CD3的人源化或嵌合抗体。因此，本发明的目的是提供与参考抗体例如由VH序列SEQ ID NO:4和VL序列SEQ ID NO:8指定的抗体相比优化的人源化或嵌合CD3抗体。本发明的另一个目的是提供与参考抗体例如由VH序列SEQ ID NO:4和VL序列SEQ ID NO:8指定的抗体相比具有优化的体内功效的抗体。本发明的另一个目的是提供与由VH序列SEQ ID NO:4和VL序列SEQ ID NO:8指定的抗体相比对CD3具有较低结合亲和力的抗体。本发明的另一个目的是提供与由VH序列SEQ ID NO:4和VL序列SEQ ID NO:8指定的抗体相比对CD3具有更高结合亲和力的抗体。
[0211] 在一个方面，本发明提供了结合人CD3的人源化或嵌合抗体，其中所述抗体包含含有重链可变(VH)区的结合区，其中所述VH区在具有CDR1 SEQ ID NO:1，CDR2 SEQ ID NO:2和CDR3 SEQ ID NO:3中所示的CDR序列的参考抗体的三个CDR序列之一中包含突变，所述突变位于选自以下的一个位置中：T31M，T31P，N57，H101，G105，S110和Y114，其中所述位置根据SEQ ID NO:4的参考序列进行编号。SEQ ID NO:4中的氨基酸根据从N端到C端方向上从第一个氨基酸到数字125的直接数字编号方案编号。图2中示出了对应于SEQ ID NO:4的位置的数字编号。此外，根据IMGT定义已经注释了CDR区。
[0212] 在本发明的一个实施方案中，与具有CDR1 SEQ ID NO:1，CDR2 SEQ ID NO:2和CDR3 SEQ ID NO:3所示的VH CDR序列的参考抗体相比，所述抗体对人CD3的结合亲和力降低或增加。
[0213] 在本发明的一些实施方案中，对CD3分子具有降低的结合亲和力的抗体，例如CD3肽，例如SEQ ID NO:402，与参考抗体相比，可以与参考抗体一样对靶细胞具有相同的细胞溶解活性。
[0214] 在本发明的一个实施方案中，抗体包含T31M或T31P突变。位置T31根据SEQ ID NO:4。
[0215] 在本发明的一个实施方案中，抗体在位置N57包含突变。位置N57根据SEQ ID NO:4。在一个实施方案中，突变是N57E。
[0216] 在本发明的一个实施方案中，抗体在位置H101包含突变。位置H101根据SEQ ID NO:4。在一个实施方案中，突变是H101G或H101N。
[0217] 在本发明的一个实施方案中，抗体在位置G105包含突变。位置G105根据SEQ ID NO:4。在一个实施方案中，突变是G105P。
[0218] 在本发明的一个实施方案中，抗体在位置Y114包含突变。位置Y114根据SEQ ID NO:4。在一个实施方案中，突变是Y114M，Y114R或Y114V。
[0219] 如实施例7所示，由SEQ ID NO:4和VL序列SEQ ID NO:8指定的参考抗体具有对应于KD值为1.5×10-8M的对SEQ ID NO:402的CD3肽的结合亲和力。
[0220] 在本发明的一些实施方案中，所述抗体对SEQ ID NO:402的CD3肽的结合亲和力低于1.5×10-8M，例如1.6×10-8M至9.9×10-8M的结合亲和力或例如1.0×10-7至9.9×10-7M的结合亲和力，如通过实施例7所述的生物层干涉测量法测定的。在本发明的一些实施方案中，所述抗体对SEQ ID NO:402的CD3肽的结合亲和力高于1.5×10-8M，例如1.4×10-8至1.0×10-8M，例如9.9×10-9至1×10-9M。
[0221] 在一个实施方案中，本发明提供了结合人CD3的人源化或嵌合抗体，其中所述抗体包含含有重链可变(VH)区的结合区，其中所述VH区包含具有选自以下的CDR序列的CDR1、CDR2和CDR3区：
[0222] a)SEQ ID NO:12,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0223] b)SEQ ID NO:14,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0224] c)SEQ ID NO:16,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0225] d)SEQ ID NO:18,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0226] e)SEQ ID NO:20,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0227] f)SEQ ID NO:22,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0228] g)SEQ ID NO:24,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0229] h)SEQ ID NO:26,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0230] i)SEQ ID NO:28,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0231] j)SEQ ID NO:30,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0232] k)SEQ ID NO:32,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0233] l)SEQ ID NO:34,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0234] m)SEQ ID NO:36,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0235] n)SEQ ID NO:38,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0236] o)SEQ ID NO:40,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0237] p)SEQ ID NO:42,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0238] q)SEQ ID NO:44,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0239] r)SEQ ID NO:46,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0240] s)SEQ ID NO:48,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0241] t)SEQ ID NO:50,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0242] u)SEQ ID NO:52,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0243] v)SEQ ID NO:54,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0244] w)SEQ ID NO:56,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0245] x)SEQ ID NO:58,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0246] y)SEQ ID NO:60,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0247] z)SEQ ID NO:62,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0248] aa)SEQ ID NO:64,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0249] bb)SEQ ID NO:66,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0250] cc)SEQ ID NO:68,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0251] dd)SEQ ID NO:70,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0252] ee)SEQ ID NO:72,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0253] ff)SEQ ID NO:74,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0254] gg)SEQ ID NO:76,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0255] hh)SEQ ID NO:78,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0256] ii)SEQ ID NO:80,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0257] jj)SEQ ID NO:82,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0258] kk)SEQ ID NO:84,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0259] ll)SEQ ID NO:86,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0260] mm)SEQ ID NO:88,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0261] nn)SEQ ID NO:90,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0262] oo)SEQ ID NO:92,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0263] pp)SEQ ID NO:94,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0264] qq)SEQ ID NO:96,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0265] rr)SEQ ID NO:98,2,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0266] ss)SEQ ID NO:1,100,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0267] tt)SEQ ID NO:1,102,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0268] uu)SEQ ID NO:1,104,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0269] vv)SEQ ID NO:1,106,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0270] ww)SEQ ID NO:1,108,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0271] xx)SEQ ID NO:1,110,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0272] yy)SEQ ID NO:1,112,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0273] zz)SEQ ID NO:1,114,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0274] aaa)SEQ ID NO:1,116,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0275] bbb)SEQ ID NO:1,118,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0276] ccc)SEQ ID NO:1,120,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0277] ddd)SEQ ID NO:1,122,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0278] eee)SEQ ID NO:1,124,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0279] fff)SEQ ID NO:1,126,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0280] ggg)SEQ ID NO:1,128,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0281] hhh)SEQ ID NO:1,130,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0282] iii)SEQ ID NO:1,132,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0283] jjj)SEQ ID NO:1,134,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0284] kkk)SEQ ID NO:1,136,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0285] lll)SEQ ID NO:1,138,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0286] mmm)SEQ ID NO:1,140,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0287] nnn)SEQ ID NO:1,142,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0288] ooo)SEQ ID NO:1,144,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0289] ppp)SEQ ID NO:1,146,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0290] qqq)SEQ ID NO:1,148,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0291] rrr)SEQ ID NO:1,150,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0292] sss)SEQ ID NO:1,152,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0293] ttt)SEQ ID NO:1,154,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0294] uuu)SEQ ID NO:1,156,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0295] vvv)SEQ ID NO:1,158,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0296] www)SEQ ID NO:1,160,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0297] xxx)SEQ ID NO:1,162,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0298] yyy)SEQ ID NO:1,164,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0299] zzz)SEQ ID NO:1,166,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0300] aaaa)SEQ ID NO:1,168,3所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0301] bbbb)SEQ ID NO:1,2,170所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0302] cccc)SEQ ID NO:1,2,172所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0303] dddd)SEQ ID NO:1,2,174所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0304] eeee)SEQ ID NO:1,2,176所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0305] ffff)SEQ ID NO:1,2,178所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0306] gggg)SEQ ID NO:1,2,180所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0307] hhhh)SEQ ID NO:1,2,182所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0308] iiii)SEQ ID NO:1,2,184所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0309] jjjj)SEQ ID NO:1,2,186所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0310] kkkk)SEQ ID NO:1,2,188所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0311] llll)SEQ ID NO:1,2,190所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0312] mmmm)SEQ ID NO:1,2,192所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0313] nnnn)SEQ ID NO:1,2,194所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0314] oooo)SEQ ID NO:1,2,196所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0315] pppp)SEQ ID NO:1,2,198所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0316] qqqq)SEQ ID NO:1,2,200所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0317] rrrr)SEQ ID NO:1,2,202所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0318] ssss)SEQ ID NO:1,2,204所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0319] tttt)SEQ ID NO:1,2,206所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0320] uuuu)SEQ ID NO:1,2,208所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0321] vvvv)SEQ ID NO:1,2,210所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0322] wwww)SEQ ID NO:1,2,212所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0323] xxxx)SEQ ID NO:1,2,214所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0324] yyyy)SEQ ID NO:1,2,216所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0325] zzzz)SEQ ID NO:1,2,218所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0326] aaaaa)SEQ ID NO:1,2,220所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0327] bbbbb)SEQ ID NO:1,2,222所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0328] ccccc)SEQ ID NO:1,2,224所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0329] ddddd)SEQ ID NO:1,2,226所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0330] eeeee)SEQ ID NO:1,2,228所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0331] fffff)SEQ ID NO:1,2,230所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0332] ggggg)SEQ ID NO:1,2,232所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0333] hhhhh)SEQ ID NO:1,2,234所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0334] iiiii)SEQ ID NO:1,2,236所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0335] jjjjj)SEQ ID NO:1,2,238所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0336] kkkkk)SEQ ID NO:1,2,240所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0337] lllll)SEQ ID NO:1,2,242所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0338] mmmmm)SEQ ID NO:1,2,244所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0339] nnnnn)SEQ ID NO:1,2,246所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0340] ooooo)SEQ ID NO:1,2,248所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0341] ppppp)SEQ ID NO:1,2,250所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0342] qqqqq)SEQ ID NO:1,2,252所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0343] rrrrr)SEQ ID NO:1,2,254所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0344] sssss)SEQ ID NO:1,2,256所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0345] ttttt)SEQ ID NO:1,2,258所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0346] uuuuu)SEQ ID NO:1,2,260所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0347] vvvvv)SEQ ID NO:1,2,262所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0348] wwwww)SEQ ID NO:1,2,264所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0349] xxxxx)SEQ ID NO:1,2,266所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0350] yyyyy)SEQ ID NO:1,2,268所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0351] zzzzz)SEQ ID NO:1,2,270所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0352] aaaaaa)SEQ ID NO:1,2,272所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0353] bbbbbb)SEQ ID NO:1,2,274所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0354] cccccc)SEQ ID NO:1,2,276所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0355] dddddd)SEQ ID NO:1,2,278所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0356] eeeeee)SEQ ID NO:1,2,280所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0357] ffffff)SEQ ID NO:1,2,282所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0358] gggggg)SEQ ID NO:1,2,284所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0359] hhhhhh)SEQ ID NO:1,2,286所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0360] iiiiii)SEQ ID NO:1,2,288所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0361] jjjjjj)SEQ ID NO:1,2,290所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0362] kkkkkk)SEQ ID NO:1,2,292所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0363] llllll)SEQ ID NO:1,2,294所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0364] mmmmmm)SEQ ID NO:1,2,296所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0365] nnnnnn)SEQ ID NO:1,2,298所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；和
[0366] oooooo)SEQ ID NO:1、2、300所示的CDR1,CDR2和CDR3序列。
[0367] 在一个实施方案中，本发明涉及结合人CD3的人源化或嵌合抗体，其中所述抗体包含含有重链可变(VH)区的结合区，其中所述VH区包含具有选自以下之一的CDR序列的CDR1、CDR2和CDR3区：
[0368] a)SEQ ID NO:54,2,3[T31M]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0369] b)SEQ ID NO:58,2,3[T31P]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0370] c)SEQ ID NO:1,106,3[N57E]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0371] d)SEQ ID NO:1,2,176[H101G]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0372] e)SEQ ID NO:1,2,184[H101N]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0373] f)SEQ ID NO:1,2,220[G105P]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0374] g)SEQ ID NO:1,2,236[S110A]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0375] h)SEQ ID NO:1,2,244[S110G]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0376] i)SEQ ID NO:1,2,284[Y114M]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0377] j)SEQ ID NO:1,2,292[Y114R]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0378] k)SEQ ID NO:1,2,298[Y114V]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；和
[0379] l)在三个CDR序列中与a)至k)中所示的三个CDR序列中的任何一个总共具有至少90％或至少95％氨基酸序列同一性的CDR1、CDR2和CDR3序列，条件是CDR1、CDR2和CDR3序列不具有SEQ ID NO:1、2、3所示的序列。
[0380] 在一个实施方案中，本发明涉及结合人CD3的人源化或嵌合抗体，其中所述抗体包含含有重链可变(VH)区的结合区，其中所述VH区包含具有选自以下之一的CDR序列的CDR1、CDR2和CDR3区：
[0381] a)SEQ ID NO:54,2,3[T31M]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0382] b)SEQ ID NO:58,2,3[T31P]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0383] c)SEQ ID NO:1,106,3[N57E]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0384] d)SEQ ID NO:1,2,176[H101G]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0385] e)SEQ ID NO:1,2,184[H101N]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0386] f)SEQ ID NO:1,2,220[G105P]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0387] g)SEQ ID NO:1,2,236[S110A]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0388] h)SEQ ID NO:1,2,244[S110G]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0389] i)SEQ ID NO:1,2,284[Y114M]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0390] j)SEQ ID NO:1,2,292[Y114R]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0391] k)SEQ ID NO:1,2,298[Y114V]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列，和
[0392] l)a)至k)中所述的CDR1、CDR2和CDR3序列，其在三个CDR序列中总共具有至多5个另外的突变或置换，至多4个另外的突变或置换，至多3个另外的突变或置换，至多2个另外的突变或置换，或至多1个另外的突变或置换，并且所述突变或置换优选不改变对人CD3的结合亲和力。
[0393] 在一个实施方案中，本发明涉及结合人CD3的人源化或嵌合抗体，其中所述抗体包含含有重链可变(VH)区的结合区，其中所述VH区包含选自以下的一个VH序列：
[0394] a)SEQ ID NO:13所示的VH序列；
[0395] b)SEQ ID NO:15所示的VH序列；
[0396] c)SEQ ID NO:17所示的VH序列；
[0397] d)SEQ ID NO:19所示的VH序列；
[0398] e)SEQ ID NO:21所示的VH序列；
[0399] f)SEQ ID NO:23所示的VH序列；
[0400] g)SEQ ID NO:25所示的VH序列；
[0401] h)SEQ ID NO:27所示的VH序列；
[0402] i)SEQ ID NO:29所示的VH序列；
[0403] j)SEQ ID NO:31所示的VH序列；
[0404] k)SEQ ID NO:33所示的VH序列；
[0405] l)SEQ ID NO:35所示的VH序列；
[0406] m)SEQ ID NO:37所示的VH序列；
[0407] n)SEQ ID NO:39所示的VH序列；
[0408] o)SEQ ID NO:41所示的VH序列；
[0409] p)SEQ ID NO:43所示的VH序列；
[0410] q)SEQ ID NO:45所示的VH序列；
[0411] r)SEQ ID NO:47所示的VH序列；
[0412] s)SEQ ID NO:49所示的VH序列；
[0413] t)SEQ ID NO:51所示的VH序列；
[0414] u)SEQ ID NO:53所示的VH序列；
[0415] v)SEQ ID NO:55所示的VH序列；
[0416] w)SEQ ID NO:57所示的VH序列；
[0417] x)SEQ ID NO:59所示的VH序列；
[0418] y)SEQ ID NO:61所示的VH序列；
[0419] z)SEQ ID NO:63所示的VH序列；
[0420] aa)SEQ ID NO:65所示的VH序列；
[0421] bb)SEQ ID NO:67所示的VH序列；
[0422] cc)SEQ ID NO:69所示的VH序列；
[0423] dd)SEQ ID NO:71所示的VH序列；
[0424] ee)SEQ ID NO:73所示的VH序列；
[0425] ff)SEQ ID NO:75所示的VH序列；
[0426] gg)SEQ ID NO:77所示的VH序列；
[0427] hh)SEQ ID NO:79所示的VH序列；
[0428] ii)SEQ ID NO:81所示的VH序列；
[0429] jj)SEQ ID NO:83所示的VH序列；
[0430] kk)SEQ ID NO:85所示的VH序列；
[0431] ll)SEQ ID NO:87所示的VH序列；
[0432] mm)SEQ ID NO:89所示的VH序列；
[0433] nn)SEQ ID NO:91所示的VH序列；
[0434] oo)SEQ ID NO:93所示的VH序列；
[0435] pp)SEQ ID NO:95所示的VH序列；
[0436] qq)SEQ ID NO:97所示的VH序列；
[0437] rr)SEQ ID NO:99所示的VH序列；
[0438] ss)SEQ ID NO:101所示的VH序列；
[0439] tt)SEQ ID NO:103所示的VH序列；
[0440] uu)SEQ ID NO:105所示的VH序列；
[0441] vv)SEQ ID NO:107所示的VH序列；
[0442] ww)SEQ ID NO:109所示的VH序列；
[0443] xx)SEQ ID NO:111所示的VH序列；
[0444] yy)SEQ ID NO:113所示的VH序列；
[0445] zz)SEQ ID NO:115所示的VH序列；
[0446] aaa)SEQ ID NO:117所示的VH序列；
[0447] bbb)SEQ ID NO:119所示的VH序列；
[0448] ccc)SEQ ID NO:121所示的VH序列；
[0449] ddd)SEQ ID NO:123所示的VH序列；
[0450] eee)SEQ ID NO:125所示的VH序列；
[0451] fff)SEQ ID NO:127所示的VH序列；
[0452] ggg)SEQ ID NO:129所示的VH序列；
[0453] hhh)SEQ ID NO:131所示的VH序列；
[0454] iii)SEQ ID NO:133所示的VH序列；
[0455] jjj)SEQ ID NO:135所示的VH序列；
[0456] kkk)SEQ ID NO:137所示的VH序列；
[0457] lll)SEQ ID NO:139所示的VH序列；
[0458] mmm)SEQ ID NO:141所示的VH序列；
[0459] nnn)SEQ ID NO:143所示的VH序列；
[0460] ooo)SEQ ID NO:145所示的VH序列；
[0461] ppp)SEQ ID NO:147所示的VH序列；
[0462] qqq)SEQ ID NO:149所示的VH序列；
[0463] rrr)SEQ ID NO:151所示的VH序列；
[0464] sss)SEQ ID NO:153所示的VH序列；
[0465] ttt)SEQ ID NO:155所示的VH序列；
[0466] uuu)SEQ ID NO:157所示的VH序列；
[0467] vvv)SEQ ID NO:159所示的VH序列；
[0468] www)SEQ ID NO:161所示的VH序列；
[0469] xxx)SEQ ID NO:163所示的VH序列；
[0470] yyy)SEQ ID NO:165所示的VH序列；
[0471] zzz)SEQ ID NO:167所示的VH序列；
[0472] aaaa)SEQ ID NO:169所示的VH序列；
[0473] bbbb)SEQ ID NO:171所示的VH序列；
[0474] cccc)SEQ ID NO:173所示的VH序列；
[0475] dddd)SEQ ID NO:175所示的VH序列；
[0476] eeee)SEQ ID NO:177所示的VH序列；
[0477] ffff)SEQ ID NO:179所示的VH序列；
[0478] gggg)SEQ ID NO:181所示的VH序列；
[0479] hhhh)SEQ ID NO:183所示的VH序列；
[0480] iiii)SEQ ID NO:185所示的VH序列；
[0481] jjjj)SEQ ID NO:187所示的VH序列；
[0482] kkkk)SEQ ID NO:189所示的VH序列；
[0483] llll)SEQ ID NO:191所示的VH序列；
[0484] mmmm)SEQ ID NO:193所示的VH序列；
[0485] nnnn)SEQ ID NO:195所示的VH序列；
[0486] oooo)SEQ ID NO:197所示的VH序列；
[0487] pppp)SEQ ID NO:199所示的VH序列；
[0488] qqqq)SEQ ID NO:201所示的VH序列；
[0489] rrrr)SEQ ID NO:203所示的VH序列；
[0490] ssss)SEQ ID NO:205所示的VH序列；
[0491] tttt)SEQ ID NO:207所示的VH序列；
[0492] uuuu)SEQ ID NO:209所示的VH序列；
[0493] vvvv)SEQ ID NO:211所示的VH序列；
[0494] wwww)SEQ ID NO:213所示的VH序列；
[0495] xxxx)SEQ ID NO:215所示的VH序列；
[0496] yyyy)SEQ ID NO:217所示的VH序列；
[0497] zzzz)SEQ ID NO:219所示的VH序列；
[0498] aaaaa)SEQ ID NO:221所示的VH序列；
[0499] bbbbb)SEQ ID NO:223所示的VH序列；
[0500] ccccc)SEQ ID NO:225所示的VH序列；
[0501] ddddd)SEQ ID NO:227所示的VH序列；
[0502] eeeee)SEQ ID NO:229所示的VH序列；
[0503] fffff)SEQ ID NO:221所示的VH序列；
[0504] ggggg)SEQ ID NO:223所示的VH序列；
[0505] hhhhh)SEQ ID NO:225所示的VH序列；
[0506] iiiii)SEQ ID NO:227所示的VH序列；
[0507] jjjjj)SEQ ID NO:229所示的VH序列；
[0508] kkkkk)SEQ ID NO:231所示的VH序列；
[0509] lllll)SEQ ID NO:233所示的VH序列；
[0510] mmmmm)SEQ ID NO:235所示的VH序列；
[0511] nnnnn)SEQ ID NO:237所示的VH序列；
[0512] ooooo)SEQ ID NO:239所示的VH序列；
[0513] ppppp)SEQ ID NO:241所示的VH序列；
[0514] qqqqq)SEQ ID NO:243所示的VH序列；
[0515] rrrrr)SEQ ID NO:245所示的VH序列；
[0516] sssss)SEQ ID NO:247所示的VH序列；
[0517] ttttt)SEQ ID NO:249所示的VH序列；
[0518] uuuuu)SEQ ID NO:251所示的VH序列；
[0519] vvvvv)SEQ ID NO:253所示的VH序列；
[0520] wwwww)SEQ ID NO:255所示的VH序列；
[0521] xxxxx)SEQ ID NO:257所示的VH序列；
[0522] yyyyy)SEQ ID NO:259所示的VH序列；
[0523] zzzzz)SEQ ID NO:261所示的VH序列；
[0524] aaaaaa)SEQ ID NO:263所示的VH序列；
[0525] bbbbbb)SEQ ID NO:265所示的VH序列；
[0526] cccccc)SEQ ID NO:267所示的VH序列；
[0527] dddddd)SEQ ID NO:269所示的VH序列；
[0528] eeeeee)SEQ ID NO:271所示的VH序列；
[0529] ffffff)SEQ ID NO:273所示的VH序列；
[0530] gggggg)SEQ ID NO:275所示的VH序列；
[0531] hhhhhh)SEQ ID NO:277所示的VH序列；
[0532] iiiiii)SEQ ID NO:279所示的VH序列；
[0533] jjjjjj)SEQ ID NO:281所示的VH序列；
[0534] kkkkkk)SEQ ID NO:283所示的VH序列；
[0535] llllll)SEQ ID NO:285所示的VH序列；
[0536] mmmmmm)SEQ ID NO:287所示的VH序列；
[0537] nnnnnn)SEQ ID NO:289所示的VH序列；
[0538] oooooo)SEQ ID NO:291所示的VH序列；
[0539] pppppp)SEQ ID NO:293所示的VH序列；
[0540] qqqqqq)SEQ ID NO:295所示的VH序列；
[0541] rrrrrr)SEQ ID NO:297所示的VH序列；
[0542] ssssss)SEQ ID NO:299所示的VH序列；和
[0543] tttttt)SEQ ID NO:301所示的VH序列。
[0544] 在一个实施方案中，本发明涉及结合人CD3的人源化或嵌合抗体，其中所述抗体包含含有重链可变(VH)区的结合区，其中所述VH区包含选自以下的一个VH序列：
[0545] a)SEQ ID NO:55[T31M]所示的VH序列，
[0546] b)SEQ ID NO:59[T31P]所示的VH序列，
[0547] c)SEQ ID NO:107[N57E]所示的VH序列，
[0548] d)SEQ ID NO:177[H101G]所示的VH序列，
[0549] e)SEQ ID NO:185[H101N]所示的VH序列，
[0550] f)SEQ ID NO:221[G105P]所示的VH序列，
[0551] g)SEQ ID NO:237[S110A]所示的VH序列，
[0552] h)SEQ ID NO:245[S110G]所示的VH序列，
[0553] i)SEQ ID NO:285[Y114M]所示的VH序列，
[0554] j)SEQ ID NO:293[Y114R]所示的VH序列，和
[0555] k)SEQ ID NO:299[Y114V]所示的VH序列。
[0556] 在本发明的一个实施方案中，人源化或嵌合抗体包含结合区，其中所述结合区包含轻链可变(VL)区，其中所述VL区包含具有选自以下的CDR序列的CDR1、CDR2和CDR3：
[0557] a)SEQ ID NO:6,GTN,7所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0558] b)SEQ ID NO:302,GTN,7所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0559] c)SEQ ID NO:304,GTN,7所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0560] d)SEQ ID NO:306,GTN,7所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0561] e)SEQ ID NO:308,GTN,7所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0562] f)SEQ ID NO:310,GTN,7所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0563] g)SEQ ID NO:312,GTN,7所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0564] h)SEQ ID NO:314,GTN,7所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0565] i)SEQ ID NO:316,GTN,7所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0566] j)SEQ ID NO:318,GTN,7所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0567] k)SEQ ID NO:320,GTN,7所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0568] l)SEQ ID NO:322,GTN,7所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0569] m)SEQ ID NO:324,GTN,7所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0570] n)SEQ ID NO:326,GTN,7所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0571] o)SEQ ID NO:328,GTN,7所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0572] p)SEQ ID NO:330,GTN,7所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0573] q)SEQ ID NO:6,GTN,332所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0574] r)SEQ ID NO:6,GTN,334所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0575] s)SEQ ID NO:6,GTN,336所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0576] t)SEQ ID NO:6,GTN,338所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0577] u)SEQ ID NO:6,GTN,340所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0578] v)SEQ ID NO:6,GTN,342所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0579] w)SEQ ID NO:6,GTN,344所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0580] x)SEQ ID NO:6,GTN,346所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0581] y)SEQ ID NO:6,GTN,348所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0582] z)SEQ ID NO:6,GTN,350所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0583] aa)SEQ ID NO:6,GTN,352所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0584] bb)SEQ ID NO:6,GTN,354所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0585] cc)SEQ ID NO:6,GTN,356所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0586] dd)SEQ ID NO:6,GTN,358所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0587] ee)SEQ ID NO:6,GTN,360所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0588] ff)SEQ ID NO:6,GTN,362所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0589] gg)SEQ ID NO:6,GTN,364所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0590] hh)SEQ ID NO:6,GTN,366所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0591] ii)SEQ ID NO:6,GTN,368所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0592] jj)SEQ ID NO:6,GTN,370所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0593] kk)SEQ ID NO:6,GTN,372所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0594] ll)SEQ ID NO:6,GTN,374所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0595] mm)SEQ ID NO:6,GTN,376所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0596] nn)SEQ ID NO:6,GTN,378所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0597] oo)SEQ ID NO:6,GTN,380所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0598] pp)SEQ ID NO:6,GTN,382所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0599] qq)SEQ ID NO:6,GTN,384所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0600] rr)SEQ ID NO:6,GTN,386所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0601] ss)SEQ ID NO:6,GTN,388所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0602] tt)SEQ ID NO:6,GTN,390所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0603] uu)SEQ ID NO:6,GTN,392所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；和
[0604] vv)SEQ ID NO:6,GTN,394所示的CDR1,CDR2和CDR3序列。
[0605] 在本发明的另一个实施方案中，人源化或嵌合抗体包含含有轻链可变(VL)区的结合区，其中所述VL区包含选自以下的VL序列之一：
[0606] a)SEQ ID NO:8所示的VL序列；和
[0607] b)SEQ ID NO:10所示的VL序列。
[0608] 本文使用的术语“抗体”意指免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段或其任一的衍生物，其在典型的生理条件下具有特异性结合抗原的能力，具有显著时间段的半寿期，例如至少约30分钟、至少约45分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约4小时、至少约8小时、至少约12小时、约24小时或更多、约48小时或更多；约3、4、5、6、7或更多天等，或任何其它相关功能定义的时间(例如足以诱导、促进、提高和/或调节与结合抗原的抗体有关的生理反应的时间和/或抗体足以募集效应器活性的时间)。与抗原相互作用的结合区(或本文也可使用的结合结构域，两个术语具有相同的含义)，包含免疫球蛋白分子的重链和轻链两者的可变区。抗体(Ab)的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞和T细胞)和补体系统的组分(例如C1q，补体活化经典途径的第一补体)。如上所述，本文使用的术语抗体，除非另外说明或上下文明确矛盾，否则包括保留与抗原特异性相互作用(例如结合)的能力的抗体的片段。已表明抗体的抗原-结合功能可通过全长抗体的片段实现。术语"抗体"内包括的结合片段的实例包括(i)Fab’或Fab片段，一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段，或描述于WO2007059782(Genmab A/S)中的单价抗体；(ii)F(ab')2片段，包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)基本上由VH和CH1结构域组成的Fd片段；和(iv)基本上由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但它们可使用重组方法通过合成的接头连接，所述接头使它们能够制成单一蛋白链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链抗体或单链Fv(scFv)，参见例如Bird等,Science 242,423-426(1988)和Huston等,PNAS USA 85,5879-5883(1988))。这样的单链抗体包括在术语抗体内，除非另外注明或上下文清楚指示。尽管这样的片段通常包括在抗体的含义内，但它们共同和各自独立地是本发明的独特特征，显示不同的生物学性质和功用。本发明语境中的这些和其它有用的抗体片段在本文进一步论述。还应理解，术语抗体，除非另外指示，还包括多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、嵌合抗体和人源化抗体，和通过任何已知技术提供的保留特异性结合抗原的能力的抗体片段(抗原-结合片段)，所述技术例如酶裂解、肽合成和重组技术。产生的抗体可具有任何同种型。
[0609] 本文使用的术语“免疫球蛋白重链”、“免疫球蛋白的重链”或“重链”意指免疫球蛋白的链之一。重链通常由重链可变区(本文简称为VH)和定义了免疫球蛋白的同种型的重链恒定区(本文简称为CH)构成。重链恒定区通常由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。重链恒定区可进一步包含铰链区。本文使用的术语“免疫球蛋白”意指一类结构相关的糖蛋白，其由两对多肽链组成，一对轻(L)链和一对重(H)链，所有四条链可能通过二硫键互相连接。免疫球蛋白的结构已被充分表征(参见例如[14])。在免疫球蛋白(例如IgG)的结构内，两条重链在所谓的“铰链区”中通过二硫键互相连接。与重链相同，各轻链通常由数个区构成：轻链可变区(本文简称为VL)和轻链恒定区(本文简称为CL)。轻链恒定区通常包含一个结构域CL。此外，VH和VL区可进一步细分为具有超变性的区(或超变区，其序列可高度可变和/或形成结构确定的环)，亦称为互补决定区(CDR)，其与称为框架区(FR)的更加保守的区交替。各VH和VL通常由三个CDR和四个FR构成，从氨基端至羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(见[15])。CDR序列可通过使用IMGT[16]-[17]提供的方法测定。
[0610] 本文使用的术语“同种型”是指免疫球蛋白(亚)类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM)或其任何同种异型，例如由重链恒定区基因编码的IgG1m(za)和IgG1m(f)[SEQ ID NO:407])。因此，在一个实施方案中，抗体包含IgG1类型或其任何同种异型的免疫球蛋白的重链。此外，各重链同种型可与kappa(κ)或lambda(λ)轻链组合。
[0611] 本文使用的术语“嵌合抗体”是指抗体，其中可变区来源于非人物种(例如来源于啮齿动物)和恒定区来源于不同的物种，例如人。嵌合抗体可通过抗体工程产生。“抗体工程”是用于不同类型的抗体修饰的通用术语，和其是技术人员众所周知的方法。具体而言，嵌合抗体可通过使用描述于[18]的标准DNA技术产生。因此，嵌合抗体可以是经遗传学工程改造的重组抗体。一些嵌合抗体可以是遗传学或酶学两者工程改造的。产生嵌合抗体在技术人员的知识内，因此产生本发明的嵌合抗体可通过本文所述的方法之外的其它方法实现。开发用于治疗应用的嵌合单克隆抗体以减少抗体免疫原性。它们可通常包含对目的抗原具有特异性的非人(例如鼠)可变区，和人恒定抗体重链和轻链结构域。在嵌合抗体的背景下使用的术语“可变区”或“可变结构域”是指包含免疫球蛋白的重链和轻链两者的CDR和框架区的区。
[0612] 本文使用的术语“人源化抗体”是指经遗传学工程改造的非人抗体，其包含人抗体恒定结构域和经修饰以包含高水平的与人可变结构域的序列同源性的非人可变结构域。这可通过移植一起形成抗原结合位点的六个非人抗体互补决定区(CDR)到同源的人受体框架区(FR)上实现(参见[19]-[20])。为了完全重建母体抗体的结合亲和力和特异性，可能需要置换母体抗体(即非人抗体)的框架残基到人框架区中(回复突变)。结构同源性建模可有助于鉴定框架区中对抗体的结合性质重要的氨基酸残基。因此，人源化抗体可包含非人CDR序列、任选地包含一个或多个突变至非人氨基酸序列的氨基酸回复突变的基本上的人框架区和完全的人恒定区。任选地，可应用不必然是回复突变的另外的氨基酸修饰以获得具有优选特征(例如亲和力和生物化学性质)的人源化抗体。
[0613] 根据本发明的任何方面或实施方案的人源化或嵌合抗体可称为“人源化或嵌合CD3抗体”、“本发明的人源化或嵌合抗体”、“CD3抗体”或“本发明的CD3抗体”，其全部具有相同的含义和目的，除非上下文另外矛盾。
[0614] 非人来源的抗体的氨基酸序列不同于人来源的抗体，和因此非人抗体当给予人患者时有可能产生免疫原性。然而，尽管抗体的非人来源，其CDR区段负责抗体结合其靶抗原的能力，和人源化目标在于保持抗体的特异性和结合亲和力。因此，进行非人治疗性抗体的人源化以使其在人中的免疫原性最小，而同时这样的人源化抗体保持非人来源的抗体的特异性和结合亲和力。
[0615] 本文使用的术语“结合区”是指能够结合任何分子例如多肽(例如存在于细胞、细菌或病毒体上)的抗体的区。
[0616] 本文使用的术语"结合”是指抗体与预定抗原或靶标的结合，当在BIAcore 3000仪器上通过例如表面等离子体共振(SPR)技术使用抗原作为配体和抗体作为分析物测定时，与它们的结合通常具有对应于约10-6M或更小、例如10-7M或更小、例如约10-8M或更小、例如约10-9M或更小、约10-10M或更小或约10-11M或甚至更小的KD的亲和力，和以对应于比其结合并非预定抗原或密切相关抗原的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)的亲和力低至少10倍、例如低至少100倍、例如低至少1,000倍、例如低至少10,000倍、例如低至少100,000倍的KD的亲和力结合预定抗原。亲和力更低的程度取决于抗体的KD，以致当抗体的KD极低时(即，抗体是高度特异的)，则抗原的亲和力低于非特异性抗原的亲和力的程度可以是至少10,000倍。本文使用的术语"KD"(M)是指特定抗体-抗原相互作用的离解平衡常数。
[0617] 本文使用的术语“人CD3”是指人分化簇3蛋白，其是T细胞共-受体(co-receptor)蛋白复合物的一部分，和由四种不同的链构成。CD3也存在于其它物种，和因此术语“CD3”可在本文中使用和不限于人CD3，除非上下文矛盾。在哺乳动物中，该复合物包含一条CD3γ(gamma)链(人CD3γ链Swissprot P09693或食蟹猴CD3γSwissprot Q95LI7)、一条CD3δ(delta)链(人CD3δSwissprot P04234或食蟹猴CD3δSwissprot Q95LI8)、两条CD3ε(epsilon)链(人CD3εSwissprot P07766；或食蟹猴CD3εSwissprot Q95LI5)、恒河猴CD3ε(Swissprot G7NCB9)，和一条CD3ζ-链(zeta)链(人CD3ζSwissprot P20963、食蟹猴CD3ζSwissprot Q09TK0)。这些链与称为T-细胞受体(TCR)的分子缔合，和在T淋巴细胞中产生活化信号。TCR和CD3分子一起构成TCR复合物。
[0618] 在技术人员的知识范围内的是，Swissprot编号所提及的氨基酸序列包括信号肽，其在蛋白质翻译后被除去。因此，细胞表面上存在的蛋白质，例如CD3，不包括信号肽。具体而言，表1中所列的氨基酸序列不含有这样的信号肽。表1中所列的这样的蛋白质可被称为“成熟蛋白质”。因此，SEQ ID NO:398显示成熟人CD3δ(delta)的氨基酸序列，SEQ ID NO:399显示成熟人CD3ε(epsilon)的氨基酸序列，SEQ ID NO:403显示成熟食蟹猴CD3ε的氨基酸序列，和SEQ ID NO:404显示成熟恒河猴CD3ε的氨基酸序列。因此，本文使用的术语“成熟”是指不包含任何信号或前导序列的蛋白质。
[0619] 众所周知的是，信号肽序列同源性、长度和切割位点位置在不同的蛋白质之间显著不同。信号肽可通过不同的方法测定，例如本发明的SEQ ID NO:399已根据SignalP应用(可获自http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)测定。
[0620] 在具体的实施方案中，本发明的人源化或嵌合抗体结合CD3的ε链，例如人CD3的ε链(SEQ ID NO:399)。在又一个具体的实施方案中，人源化或嵌合抗体结合人CD3ε(epsilon)(SEQ ID NO:402)的N-端部分的氨基酸1-27内的表位。在这样的具体实施方案中，抗体可甚至进一步与其它非人灵长类物种例如食蟹猴(食蟹猴CD3εSEQ ID NO:403)和/或恒河猴(恒河猴CD3εSEQ ID NO:404)交叉反应。
[0621] 与原始抗体相比，包含本文定义的CDR序列并进一步包含框架区的本发明的抗体，可在CDR序列之外的序列上不同，但仍保留完全结合能力。因此，本发明还涉及包含与本文所述的任何序列具有一定序列同一性的可变区的氨基酸序列的抗体。
[0622] 在本发明的背景中使用的术语“序列同一性”是指作为所述序列共有的相同位置数的函数的两个序列之间的同一性百分比(即％同源性＝相同位置数/位置总数x 100)，考虑了空位数和各空位的长度，其需要为两个序列的最佳比对而被引入。两个核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比可例如使用E.Meyers和W.Miller[21]的算法测定。此外，两个氨基酸序列之间的同一性百分比可使用Needleman和Wunsch算法[22]测定。多重比对优选使用Clustal W算法[23]进行(例如在VectorNTI 软件版本11.5；Invitrogen Inc.中所用的)。
[0623] 因此，在本发明的一个实施方案中，抗体包含含有重链可变(VH)区的结合区，其中所述VH区包含具有选自下组之一的三个CDR序列的CDR1、CDR2和CDR3区：
[0624] a)SEQ ID NO:54,2,3[T31M]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0625] b)SEQ ID NO:58,2,3[T31P]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0626] c)SEQ ID NO:1,106,3[N57E]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0627] d)SEQ ID NO:1,2,176[H101G]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0628] e)SEQ ID NO:1,2,184[H101N]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0629] f)SEQ ID NO:1,2,220[G105P]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0630] g)SEQ ID NO:1,2,236[S110A]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0631] h)SEQ ID NO:1,2,244[S110G]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0632] i)SEQ ID NO:1,2,284[Y114M]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0633] j)SEQ ID NO:1,2,292[Y114R]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0634] k)SEQ ID NO:1,2,298[Y114V]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；和
[0635] l)在三个CDR序列中与a)至k)中所示的三个CDR序列中的任何一个总共具有至少90％或至少95％氨基酸序列同一性的CDR1、CDR2和CDR3序列，条件是CDR1、CDR2和CDR3序列不具有SEQID NO:1、2、3所示的序列。
[0636] 如本文件序列表1中所示，VH区由125个氨基酸序列组成。因此，由其124个氨基酸位置与上面列出的第一VH序列之一相同的125个氨基酸组成的第二VH序列与所述第一VH序列具有99.2％的序列同一性。由其120个氨基酸位置与上面列出的第一VH序列之一相同的125个氨基酸组成的第二序列与所述第一VH序列具有96％的序列同一性。由其115个氨基酸位置与上面列出的第一VH序列之一相同的125个氨基酸组成的第二序列与所述第一VH序列具有92％的序列同一性。
[0637] 在其具体的实施方案中，VH区与所述组中指定的至少一个VH序列具有至少96％的氨基酸序列同一性。
[0638] 在本发明的一个实施方案中，突变位于VH区的框架区中。因此，在一些实施方案中，VH区的三个CDR序列与本发明的抗体100％相同，但氨基酸变化可能发生在VH区的框架区中。当CDR包含在SEQ ID NO:407的参考框中时，框架区中的此类氨基酸变化可优选地不改变抗体对CD3的结合亲和力。
[0639] 导致序列同一性变化的VH序列中的突变可优选是保守的，物理的或功能性的氨基酸。用相似氨基酸置换氨基酸可增加保持亲本抗体功能性的可能性。
[0640] 在本发明的一个实施方案中，抗体是人源化抗体。
[0641] 在本发明的一个实施方案中，抗体是全长抗体。
[0642] 本发明的人源化抗体可通过比较重链和轻链可变区氨基酸序列与人种系可变区序列的数据库，以鉴定具有合适的同源性程度的重链和轻链人序列用作人可变框架区而产生。可通过移植例如鼠CDR到框架区上(按上文所述鉴定)并且如果需要的话，通过回复突变(框架区中在指定位置上的一个或多个人氨基酸残基突变回到非人氨基酸)成可能对恢复抗体结合功效是关键的鉴定的特定鼠残基序列，来设计一系列人源化重链和轻链可变区。然后按应用计算机技术：iTopeTM和TCEDTM([24]、[25]和[26])所测定的，选择具有最低发生率的可能T细胞表位的变体序列。
[0643] 此外，本发明的人源化抗体也可以是“去免疫的”。去免疫可能是需要的，因为在蛋白序列例如本发明的人源化抗体内，当它们具有激活辅助T细胞的潜力时人T细胞表位的存在可增加免疫原性风险特征。辅助T细胞的这样的活化可通过去免疫而避免。去免疫可通过引入突变至人源化抗体的氨基酸序列进行，以除去T细胞表位而不显著减少抗体的结合亲和力。
[0644] 因此，在本发明的一个实施方案中，人源化抗体可通过包括以下步骤的方法产生：(i)比较非人完全可变重链序列和/或完全可变轻链序列与人种系序列的数据库，(ii)选择与非人序列具有最高同源性的人种系序列，以获得人源化序列，(iii)如果需要的话，通过回复突变优化人源化序列，和(iv)在合适的表达系统中表达序列。
[0645] 因此，本发明的全长抗体可通过包括以下步骤的方法产生：(i)比较非人可变重链序列和可变轻链序列与人种系序列的数据库，(ii)选择与非人序列具有最高同源性的人种系序列，(iii)移植非人CDR至选择的人种系，以获得人源化序列，(iv)如果需要的话，通过回复突变优化人源化序列，(v)鉴定恒定重链和轻链序列，和(vi)在合适的表达系统中表达完全重链序列和完全轻链序列。本发明的全长抗体因此可按实施例1所述产生。在技术人员的知识范围内的是，从CDR序列或完全可变区序列开始，产生全长抗体。因此，技术人员将知道如何产生本发明的全长抗体。
[0646] 本文使用的术语“完全重链序列”是指由可变重链和恒定重链序列组成的序列。
[0647] 本文使用的术语“完全轻链序列”是指由可变轻链和恒定轻链序列组成的序列。
[0648] 回复突变可通过标准DNA诱变引入。用于DNA诱变的这样的标准技术描述于[18]。或者，使用市售可得的试剂盒例如QuickchangeTM定点诱变试剂盒(Stratagene)，或需要的回复突变可通过从头的DNA合成引入。
[0649] 因此，在一个实施方案中，抗体是人源化抗体。
[0650] 嵌合抗体可通过用人来源的恒定区序列置换非人(例如鼠)抗体的所有恒定区序列产生。因此，完全非人可变区序列保留在嵌合抗体中。因此，本发明的嵌合抗体可通过包括以下步骤的方法产生：在合适的表达系统中表达非人可变重链(SEQ ID NO:405)、非人可变轻链序列(SEQ ID NO:406)、人恒定重链和人恒定轻链序列，和从而产生全长嵌合抗体。可使用备选方法。产生嵌合抗体的这样的方法在技术人员的知识范围内，和因此技术人员将知道，如何产生本发明的嵌合抗体。因此，为了制备本发明的嵌合抗体，将在非人(例如鼠)VH或VL序列中引入本发明的突变。
[0651] 因此，在一个实施方案中，抗体是嵌合抗体。
[0652] 在一个实施方案中，抗体是全长抗体。本文使用的术语“全长抗体”是指包含对应于在该同种型的野生型抗体中天然存在的那些的所有重链和轻链恒定和可变结构域的抗体(例如母体或变体抗体)。
[0653] 在一个实施方案中，抗体包含Fc区，所述Fc区包含第一和第二免疫球蛋白重链。
[0654] 本文使用的术语“Fc区”是指在从N-端至C-端的方向上包含至少铰链区、CH2区和CH3区的区。Fc区可进一步包含在铰链区的N-端的CH1区。
[0655] 本文使用的术语“铰链区”是指免疫球蛋白重链的铰链区。因此，例如人IgG1抗体的铰链区对应于根据Kabat中所述的Eu编号的氨基酸216-230。
[0656] 除非另外说明或上下文矛盾，否则恒定区序列的氨基酸在本文中根据Eu-编号索引进行编号(描述于[27])和可被称为“根据Kabat中所述的Eu编号”、“根据Kabat的Eu编号”或“根据Eu编号系统”。
[0657] 本文使用的术语“CH1区”或“CH1结构域”是指免疫球蛋白重链的CH1区。因此，例如人IgG1抗体的CH1区对应于根据Eu编号系统的氨基酸118-215。然而，CH1区也可以是本文所述的任何其它的亚型。
[0658] 本文使用的术语“CH2区”或“CH2结构域”是指免疫球蛋白重链的CH2区。因此，例如人IgG1抗体的CH2区对应于根据Eu编号系统的氨基酸231-340。然而，CH2区也可以是本文所述的任何其它的亚型。
[0659] 本文使用的术语“CH3区”或“CH3结构域”是指免疫球蛋白重链的CH3区。因此，例如人IgG1抗体的CH3区对应于根据Eu编号系统的氨基酸341-447。然而，CH3区也可以是本文所述的任何其它的亚型。
[0660] 在一个实施方案中，免疫球蛋白重链的同种型选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。免疫球蛋白重链可以是在各个免疫球蛋白类型内的任何同种异型，例如IgG1m(f)(SEQ ID NO:407)。因此，在一个具体的实施方案中，免疫球蛋白重链的同种型是IgG1或其任何同种异型，例如IgG1m(f)(SEQ ID NO:407)。
[0661] 当靶向作为T-细胞受体(TCR)的一部分的抗原CD3时，细胞杀死的T细胞特有机制是理想的。其它效应器功能，例如补体活化，可能是不需要的，和因此降低效应器功能是理想的。C1q结合是补体级联中的第一步，和因此用作抗体的补体依赖性细胞毒性(CDC)能力的指示物。如果C1q与抗体的结合可被避免，则补体级联的活化也可被避免。
[0662] 因此，在一个实施方案中，抗体包含已被修饰的Fc区，使得C1q与所述抗体的结合与野生型抗体相比减少至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％、至少99.9％或100％，其中C1q结合通过ELISA测定。在优选的实施方案中，抗体包含已被修饰的Fc区，使得与野生型抗体相比，C1q与所述抗体的结合降低至少99％至100％，其中C1q结合通过ELISA测定。
[0663] 本文使用的术语“修饰”是指与野生型Fc区的氨基酸序列不相同的Fc区的氨基酸序列。即，在野生型Fc区的指定位置的氨基酸残基已经被置换、缺失或插入，以改变例如对C1q的结合位点、对其它效应分子的结合位点或与Fc受体(FcR)的结合。氨基酸序列的这样的修饰可通过用保守氨基酸置换一个或多个氨基酸制备，或可通过用与野生型中存在的氨基酸在物理和/或功能上类似的可选择的氨基酸置换一个或多个氨基酸制备。置换也可通过用非保守氨基酸置换来制备。
[0664] 在本发明的背景下，氨基酸可描述为保守或非保守氨基酸，和可因此相应地分类。氨基酸残基还可分为通过可选择的物理和功能性质定义的类型。因此，氨基酸的类型可在一个或两个以下表格中反映：
[0665] 保守类型的氨基酸残基
[0667] 氨基酸残基的可选择的物理和功能分类
[0668]
[0669] 在本发明的背景下，抗体例如人源化或嵌合抗体中的置换如下表示：
[0670] 原始氨基酸–位置–置换的氨基酸；
[0671] 参照公认的氨基酸命名法，使用三字母代码或单字母代码，包括代码Xaa和X以指示任何氨基酸残基。因此，符号“L234F”或“Leu234Phe”意思是抗体包含在氨基酸位置234上亮氨酸被苯丙氨酸置换。
[0672] 在给定位置上氨基酸置换为任何其它氨基酸如下表示：
[0673] 原始氨基酸–位置；或例如“L234”。
[0674] 对于其中原始氨基酸和/或置换的氨基酸可包含一个以上但并非全部氨基酸的修饰，所述一个以上的氨基酸可通过“,”或“/”分开。例如在位置234上置换亮氨酸为苯丙氨酸、精氨酸、赖氨酸或色氨酸：
[0675] “Leu234Phe,Arg,Lys,Trp”或“Leu234Phe/Arg/Lys/Trp”或“L234F,R,K,W”或“L234F/R/K/W”或“L234至F,R,K或W”。
[0676] 在本发明的背景下这样的命名可互换使用，但具有相同的含义和目的。
[0677] 此外，术语“置换”包括置换成其它19种天然氨基酸中的任一个，或其它氨基酸，例如非天然氨基酸。例如，置换位置234上的氨基酸L包括以下各种置换：234A、234C、234D、234E、234F、234G、234H、234I、234K、234M、234N、234Q、234R、234S、234T、234V、234W、234P和
234Y。即，通过这种方式，等同于命名234X，其中X指示除了原始氨基酸之外的任何氨基酸。
这些置换也可称为L234A,L234C等，或L234A,C等，或L234A/C/等。所述命名类似地适用于本文提及的各个和全部位置，本文特别包括这样的置换中的任一个。
234Y。即，通过这种方式，等同于命名234X，其中X指示除了原始氨基酸之外的任何氨基酸。
这些置换也可称为L234A,L234C等，或L234A,C等，或L234A/C/等。所述命名类似地适用于本文提及的各个和全部位置，本文特别包括这样的置换中的任一个。
[0678] 本发明的抗体还可包含氨基酸残基的缺失。这样的缺失可表示为“del”，和包括例如书写为L234del。因此，在这样的实施方案中，位置234上的亮氨酸从氨基酸序列中缺失。
[0679] 术语“氨基酸”和“氨基酸残基”在本文可互换使用。
[0680] 在本发明的一个实施方案中，抗体包含含有重链可变(VH)区的结合区，其中所述VH区包含具有选自下组之一的三个CDR序列的CDR1、CDR2和CDR3区：
[0681] a)SEQ ID NO:54,2,3[T31M]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0682] b)SEQ ID NO:58,2,3[T31P]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0683] c)SEQ ID NO:1,106,3[N57E]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0684] d)SEQ ID NO:1,2,176[H101G]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0685] e)SEQ ID NO:1,2,184[H101N]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0686] f)SEQ ID NO:1,2,220[G105P]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0687] g)SEQ ID NO:1,2,236[S110A]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0688] h)SEQ ID NO:1,2,244[S110G]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0689] i)SEQ ID NO:1,2,284[Y114M]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0690] j)SEQ ID NO:1,2,292[Y114R]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0691] k)SEQ ID NO:1,2,298[Y114V]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；和
[0692] l)a)至k)中所述的CDR1、CDR2和CDR3序列，其在三个CDR序列中总共具有至多5个另外的突变或置换，至多4个另外的突变或置换，至多3个另外的突变或置换，至多2个另外的突变或置换，或至多1个另外的突变或置换，并且所述突变或置换优选不改变对人CD3的结合亲和力。
[0693] 在本发明的一个实施方案中，另外的突变或置换是保守的，物理的或功能性的氨基酸。
[0694] 在一些实施方案中，与CD3的结合可以与全长CD3例如存在于T细胞上的CD3结合。在其它实施方案中，与CD3结合可以结合CD3肽例如SEQ ID NO:402所示的。与CD3肽结合以及是否有任何另外的突变可以修饰与CD3的结合可以通过如实施例7中公开的生物层干涉测量法来确定。
[0695] 在一个实施方案中，抗体包含含有第一和第二免疫球蛋白重链的Fc区。
[0696] 本文使用的术语“C1q结合”是指当抗体结合至其抗原时C1q与所述抗体结合。本文使用的术语“结合至其抗原”是指抗体与其抗原在体内和体外的结合。
[0697] 本文使用的术语“减少的”当涉及C1q结合时，是指当与C1q与野生型抗体的结合相比，本发明的抗体减少、最小化或甚至完全抑制C1q与抗体结合的能力。
[0698] 本文使用的术语“减少的”或“减少性”或其任何变体在与结合人CD3的抗体的结合亲和力相关使用时涉及与参考结合亲和力相比较低的结合亲和力。在这种情况下，参考结合亲和力可以是当与SEQ ID NO:402的CD3肽结合时由VH序列SEQ ID NO:4和VL序列SEQ ID NO:8指定的参考抗体的结合亲和力，并且由如实施例7中所述的生物层干涉测量法测定。
[0699] 本文使用的术语“结合亲和力”涉及抗体与预定抗原或靶的结合，所述结合通常对应于KD的亲和力。本文使用的术语“KD”(M)是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。
[0700] 本文使用的术语“野生型抗体”涉及在本发明的抗体的比较测定法中使用时，是指除了并非无活性之外与待测试的抗体相同的抗体。在该背景下，术语“无活性”是指修饰的Fc区具有减少或无C1q结合，即在C1q结合通过ELISA测定时，在基于PBMC的功能测定法中测定(即T-细胞增殖在基于外周血单核细胞(PBMC)的功能测定法中测量)的减少或无Fc-介导的T-细胞增殖；和/或在基于PBMC的功能测定法中测定的减少或无Fc-介导的CD69表达。因此，野生型抗体包含在免疫球蛋白重链中天然存在的氨基酸，即不包含任何氨基酸修饰的抗体，所述修饰可改变或减少抗体与例如C1q、Fc受体等相互作用的能力。因此，这样的野生型抗体将保持为能够结合例如C1q的活化抗体。野生型抗体和本发明的抗体可包含并非影响抗体诱导效应器功能的能力的那些的氨基酸修饰，以将抗体制备成双特异性抗体等。
[0701] 本文使用的术语“ELISA”是指酶联免疫吸附测定法，其为使用抗体和颜色变化来鉴定物质的试验。第一特异性抗体连接至平板表面。藉此加入来自样品的蛋白，其中测试与所述第一特异性抗体的结合。加入结合来自样品的抗体的第二抗体。第二抗体与酶连接，并且在最终步骤中加入包含酶的底物的物质。随后的反应产生可检测信号，最常见的是底物的颜色变化。ELISA方法的概念是本领域众所周知的，和进行ELISA的各种方式被视为评价本发明的抗体的方法的一部分。特别是，本发明的抗体结合C1q的能力可通过ELISA测定，包括以下步骤：(i)包被所述抗体到96-孔板上，(ii)加入3％血清，(iii)加入抗-人C1q抗体，(iv)将板显色，和(v)测量OD405nm。因此，在一个实施方案中，抗体包含已被修饰的Fc区，使得C1q与所述抗体的结合与野生型抗体相比减少至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或100％，其中C1q结合通过ELISA测定，包括以下步骤：(i)包被所述抗体到96-孔板上，(ii)加入3％血清，(iii)加入抗-人C1q，(iv)将板显色，和(v)测量OD405nm。
[0702] 本文使用的术语“Fc受体”或“FcR”是指存在于某些细胞的表面上的蛋白质。FcR结合抗体的Fc区。存在数种不同类型的FcR，其根据它们识别的抗体的类型分类。例如Fcγ(gamma)受体结合IgG类型的抗体。
[0703] 本文使用的术语“Fcγ受体”、“Fc gamma受体”或“FcγR”是指属于免疫球蛋白超家族的一组Fc受体，和对于诱导调理(包覆)微生物的吞噬作用是最重要的Fc受体。该家族包括几个成员，FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32a)、FcγRIIb(CD32b)、FcγRIIIa(CD16a)、FcγRIIIb(CD16b)，它们由于不同的分子结构而在抗体亲和力上不同。
[0704] Fc-介导的效应器功能形成人免疫球蛋白G(IgG)分子的生物活性的一部分。这样的效应器功能的实例包括例如抗体依赖性细胞-介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)，其通过各种效应分子与Fc区结合而触发。在本发明的背景下，“Fc结合”、“Fc受体结合”、“FcR结合”和“抗体Fc区与FcR结合”是指Fc区与Fc受体(FcR)或效应分子结合。术语“FcγR结合”和“FcγRI结合”是指分别结合至或以Fc区结合至Fc gamma受体和Fc gamma受体I。当CD3抗体结合T细胞时，CD3抗体的野生型Fc区结合至其它细胞(例如单核细胞)上存在的FcR，这导致非特异性的Fc-介导的T细胞活化。这样的非特异性的Fc-介导的T细胞活化可能是不需要的。T细胞也可被靶向的或靶标特异性的T细胞活化激活。对于许多适应症例如癌症的治疗，这样的靶向的T细胞活化可为高度需要的。本文使用的术语“靶向的T细胞活化”是指通过使用双特异性抗体指导T细胞至特定细胞例如肿瘤细胞，所述双特异性抗体包含结合特定靶标例如肿瘤细胞上的肿瘤靶标的第一结合区，和结合T细胞特异性靶标例如CD3的第二结合区。因此，T细胞靶向至特定细胞例如肿瘤细胞，可通过使用双特异性抗体而促进，其中结合区之一结合T细胞上存在的CD3和另一结合区结合靶标特异性抗原，例如肿瘤细胞上的靶标特异性抗原。尽管如此，非特异性的Fc-介导的T细胞活化可能仍然存在，和因此通过Fc-介导的交联的这样的不需要的非特异性的Fc-介导的T细胞活化应该被避免，和可通过制备对这样的活性而言是无活性的Fc区而失活。因此，所述无活性Fc区与存在的Fc受体之间的相互作用被阻止。
[0705] 本发明的抗体可包含Fc区的修饰。当抗体包含这样的修饰时，其可变成无活性或非-激活的抗体。本文使用的术语“无活性”、“无活性的”或“非-激活的”是指至少不能结合任何Fcγ受体、通过FcR诱导Fc-介导的交联或通过Fc区诱导FcR-介导的靶抗原交联，或不能结合C1q的Fc区。人源化或嵌合CD3抗体的Fc区的无活性合适地使用单特异性形式的抗体测试，但是如此鉴定的无活性Fc区可以双特异性或其它人源化或嵌合多特异性CD3抗体使用。
[0706] 可构建几种变体以制备对与Fc gamma受体和C1q的相互作用无活性的抗体的Fc区，用于治疗性抗体开发。这样的变体的实例在本文描述。
[0707] 因此，在一个实施方案中，抗体包含已被修饰的Fc区，使得与野生型抗体相比，所述抗体介导减少的Fc-介导的T-细胞增殖，减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少99％或100％，其中所述T-细胞增殖在基于外周血单核细胞(PBMC)的功能测定法中测量。
[0708] 术语“减少”当涉及T-细胞增殖时，是指当与通过野生型抗体结合的T细胞增殖相比，本发明的抗体减少、最小化或甚至完全抑制T细胞增殖的能力。抗体减少T-细胞增殖的能力可通过基于PBMC的功能测定法评价。在一个实施方案中，用人PBMC进行测定法。在另一实施方案中，用食蟹猴PBMC进行测定法。在又一实施方案中，用恒河猴PBMC进行测定法。由于本发明的抗体有交叉反应性，本文所述的基于PBMC的测定法可用任何物种的PBMC进行以显示T-细胞增殖的减少，只要使用的物种的PBMC在抗体的交叉反应性谱内，例如人、食蟹猴或恒河猴。
[0709] 本文使用的术语“基于外周血单核细胞(PBMC)的功能测定法”是指用于评价本发明的抗体的功能特征，例如所述抗体影响T-细胞增殖或CD69表达的能力的测定法，其中存在的唯一细胞是外周血单核细胞。因此，在一个实施方案中，T-细胞增殖通过包括以下步骤的方法测量：用范围1-1000ng/mL的抗体在37℃在5％(vol/vol)CO2潮湿孵育器中孵育PBMC三天；加入化合物，例如BrdU，其掺入至增殖的细胞的DNA；孵育5小时，沉淀细胞，干燥细胞，任选地在4℃贮存细胞，包被细胞到ELISA板，在室温下用抗-BrdU-过氧化物酶孵育90分钟，用1mg/mL 2,2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)显色约30分钟，加入100μL 2％草酸终止反应，和在合适的微板阅读器中测量405nm的吸光度。
[0710] 本文使用的术语“增殖”是指在细胞分裂的背景下的细胞生长。
[0711] 本文使用的术语“BrdU”是指5-溴-2’-脱氧尿苷，其是胸苷的同系物。当BrdU加入细胞培养物中一段有限的时间(例如4小时)时，其将掺入增殖的细胞的DNA中。在固定细胞后，可在ELISA中使用抗-BrdU-过氧化物酶进行掺入的BrdU检测。BrdU掺入因此是增殖的度量。
[0712] 在一个实施方案中，抗体包含已被修饰的Fc区，使得与野生型抗体相比，所述抗体减少Fc-介导的CD69表达至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少99％或100％，其中所述Fc-介导的CD69表达在基于PBMC的功能测定法中测定。
[0713] 具体而言，术语“减少”当涉及T细胞活化标记物CD69的表达水平时，是指与当T细胞被结合CD3并与Fc受体相互作用的野生型抗体结合时CD69的表达水平相比，CD69的表达水平减少。抗体减少CD69表达的能力可通过基于PBMC的功能测定法评价。因此，在一个实施方案中，CD69的表达通过包括以下步骤的方法测量：用范围1-1000ng/mL的抗体在37℃在5％(vol/vol)CO2潮湿孵育器中孵育PBMC 16-24小时，洗涤细胞，在4℃用小鼠抗-人CD28-PE和小鼠-抗-人CD69-APC抗体染色细胞，和通过流式细胞术测定CD28阳性细胞上的CD69表达。
[0714] 本文使用的术语“CD69”是指分化簇69，其是由CD69基因编码的人跨膜C-型凝集素蛋白质。T淋巴细胞和天然杀伤(NK)细胞在体内和体外的活化，诱导CD69的表达。CD69用作参与细胞活化事件包括增殖的信号传递受体，用作在淋巴细胞包括天然杀伤细胞和血小板中的信号传递受体，和诱导特定基因。
[0715] 本文使用的术语“基于外周血单核细胞(PBMC)的功能测定法”是指用于评价本发明的抗体的功能特征，例如所述抗体影响T-细胞增殖或CD69表达的能力的测定法，其中存在的唯一细胞是外周血单核细胞。基于PBMC的功能测定法包括以下步骤：(i)用抗体在37℃在5％(vol/vol)CO2潮湿孵育器中孵育PBMC约16-24小时，(ii)洗涤细胞，(iii)在4℃用小鼠抗-人CD28-PE和小鼠-抗-人CD69-APC抗体染色细胞，和(iv)当评价CD69表达时，通过流式细胞术测定CD28阳性细胞上的CD69表达。
[0716] Fc区中在与C1q和Fc Gamma受体的相互作用中起主要作用的氨基酸可被修饰。可被修饰的氨基酸位置的实例包括位置L234、L235和P331。其组合，例如L234F/L235E/P331S，可引起与人CD64、CD32A、CD16和C1q结合的显著降低。
[0717] 因此，在一个实施方案中，对应于L234、L235和P331的至少一个位置上的氨基酸可以分别是A、A和S([1]、[28])。此外，L234F和L235E氨基酸置换可产生具有与Fc Gamma受体和C1q的相互作用废除的Fc区([29]-[30])。因此，在一个实施方案中，对应于L234和L235的位置上的氨基酸可以分别是F和E。D265A氨基酸置换可降低与所有Fc gamma受体的结合和防止ADCC([31])。因此，在一个实施方案中，对应于D265的位置上的氨基酸可以是A。与C1q的结合可通过突变位置D270、K322、P329和P331而废除。突变这些位置成D270A或K322A或P329A或P331A任一个可使抗体缺乏CDC活性([32])。因此，在一个实施方案中，对应于D270、K322、P329和P331的至少一个位置上的氨基酸可以分别是A、A、A和A。
[0718] 使Fc区与Fc gamma受体和C1q相互作用最小化的备选方法为通过除去抗体的糖基化位点。突变位置N297为例如Q、A和E除去对于IgG-Fc gamma受体相互作用是关键的糖基化位点。因此，在一个实施方案中，对应于N297的位置上的氨基酸可以是G、Q、A或E([33])。使Fc区与Fc gamma受体的相互作用最小化的另一备选方法可以通过以下突变获得：P238A、A327Q、P329A或E233P/L234V/L235A/G236del([31])。
[0719] 或者，尽管人IgG2和IgG4亚类被认为天然在它们与C1q和Fc gamma受体的相互作用中不足，但是仍有人报道了与Fcγ受体(Fc gamma受体)的相互作用([34]-[35])。废除这些残留相互作用的突变可在这两个同种型中进行，导致与FcR结合有关的不需要的副作用减少。对于IgG2，这些包括L234A和G237A，和对于IgG4，包括L235E。因此，在一个实施方案中，人IgG2重链中对应于L234和G237的位置上的氨基酸可以分别是A和A。在一个实施方案中，人IgG4重链中对应于L235的位置上的氨基酸可以是E。
[0720] 在IgG2抗体中进一步使与Fc gamma受体和C1q相互作用最小化的其它方法包括描述于[36]和[37]中的那些。
[0721] 关于与Fc gamma受体和补体的相互作用，抗体的铰链区也可能是重要的([38]-[39])。因此，铰链区的突变或缺失可影响抗体的效应器功能。
[0722] 本文使用的术语“交联”是指通过带有FcR的细胞结合抗体Fc区的结合靶抗原的抗体Fab臂(单价或二价)的间接桥连。因此，在带有靶抗原的细胞上结合其靶抗原的抗体可与表达FcR的另一细胞交联。
[0723] 本文使用的术语“非特异性杀死”是指通过T细胞或其它效应细胞的细胞毒性功能，经过所述细胞的肿瘤靶抗原-非依赖性活化杀死细胞。因此，非特异性杀死意思是带有肿瘤靶标的细胞可通过例如细胞毒性T细胞杀死，而不是通过结合肿瘤靶标的抗体通过例如诱导CDC而杀死。
[0724] 非激活的Fc区可通过修饰Fc区的至少五个特定氨基酸位置中的一个或多个而获得。
[0725] 在一个实施方案中，抗体包含含有第一和第二免疫球蛋白重链的Fc区。
[0726] 因此，在一个实施方案中，抗体包含第一和第二免疫球蛋白重链，其中在所述第一和第二免疫球蛋白重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置L234、L235、D265、N297和P331的位置上的一个或多个氨基酸分别不是L、L、D、N和P。
[0727] 在一个实施方案中，在第一和第二重链两者中，对应于人IgG1重链的位置L234、L235、D265、N297和P331的位置上的一个或多个氨基酸分别不是L、L、D、N和P。
[0728] 在另一个实施方案中，在第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置L234、L235和D265的位置上的一个或多个氨基酸分别不是L、L和D，和对应于人IgG1重链的N297和P331的位置上的氨基酸分别是N和P。
[0729] 本文使用的术语“对应于位置的氨基酸”是指人IgG1重链的氨基酸位置编号。除非另外说明或上下文矛盾，恒定区序列的氨基酸在本文中根据Eu编号索引(描述于[27])编号。因此，一个序列中“对应于”另一个序列中的氨基酸或区段的氨基酸或区段是使用标准序列比对程序例如ALIGN、ClustalW或类似程序，通常以默认设置与其它氨基酸或区段比对，并与人IgG1重链具有至少50％、至少80％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸或区段。本领域众所周知的是，如何比对序列或序列中的区段和从而确定序列中与本发明的氨基酸位置相应的位置。
[0730] 在本发明的背景下，氨基酸可如上文所述定义。
[0731] 术语“氨基酸不是”或类似用语当涉及重链中的氨基酸时，应理解为意思是氨基酸是并非提及的特定氨基酸的任何其它氨基酸。例如，对应于人IgG1重链的L234的位置上的氨基酸不是L，意思是氨基酸可以是除了L之外的任何其它天然或非天然存在的氨基酸。
[0732] 在一个实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置D265的位置上的氨基酸不是D。
[0733] 在一个实施方案中，在第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的D265的位置上的氨基酸不是D，和对应于人IgG1重链的位置N297和P331的位置上的氨基酸分别是N和P。
[0734] 在一个实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置D265的位置上的氨基酸是疏水的或极性的氨基酸。
[0735] 本文使用的关于氨基酸残基的术语“疏水的”是指选自A、C、F、G、H、I、L、M、R、T、V、W和Y的氨基酸残基。因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置D265的位置上的氨基酸选自由A、C、F、G、H、I、L、M、R、T、V、W和Y组成的氨基酸。
[0736] 本文使用的关于氨基酸残基的术语“极性的”是指选自C、D、E、H、K、N、Q、R、S和T的任何氨基酸残基。因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人重链的位置D265的位置上的氨基酸选自C、E、H、K、N、Q、R、S和T。
[0737] 在另一个实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置D265的位置上的氨基酸是脂族不带电荷、芳族或酸性氨基酸。
[0738] 本文使用的关于氨基酸残基的术语“脂族不带电荷”是指选自A、G、I、L和V的任何氨基酸残基。因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置D265的位置上的氨基酸选自A、G、I、L和V。
[0739] 本文使用的关于氨基酸残基的术语“芳族”是指选自F、T和W的任何氨基酸残基。因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置D265的位置上的氨基酸选自F、T和W。
[0740] 本文使用的关于氨基酸残基的术语“酸性”是指选自D和E的任何氨基酸残基。因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置D265的位置上的氨基酸选自D和E。
[0741] 在具体的实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置D265的位置上的氨基酸选自A、E、F、G、I、L、T、V和W。
[0742] 在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于人IgG1重链的位置D265的位置上的氨基酸不是D。
[0743] 在一个实施方案中，在第一和第二重链两者中，对应于人IgG1重链的D265的位置上的氨基酸不是D，和对应于人IgG1重链的位置N297和P331的位置上的氨基酸分别是N和P。
[0744] 在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于人IgG1重链的位置D265的位置上的氨基酸是疏水的或极性的氨基酸。
[0745] 本文使用的关于氨基酸残基的术语“疏水的”是指选自A、C、F、G、H、I、L、M、R、T、V、W和Y的氨基酸残基。因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于人IgG1重链的位置D265的位置上的氨基酸选自由A、C、F、G、H、I、L、M、R、T、V、W和Y组成的氨基酸。
[0746] 本文使用的关于氨基酸残基的术语“极性的”是指选自C、D、E、H、K、N、Q、R、S和T的任何氨基酸残基。因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于人重链的位置D265的位置上的氨基酸选自C、E、H、K、N、Q、R、S和T。在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于人IgG1重链的位置D265的位置上的氨基酸选自由A、C、F、G、H、I、L、M、R、T、V、W和Y组成的氨基酸。
[0747] 在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于人重链的位置D265的位置上的氨基酸选自C、E、H、K、N、Q、R、S和T。
[0748] 在另一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于人IgG1重链的位置D265的位置上的氨基酸是脂族不带电荷、芳族或酸性氨基酸。
[0749] 本文使用的关于氨基酸残基的术语“脂族不带电荷”是指选自A、G、I、L和V的任何氨基酸残基。因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于人IgG1重链的位置D265的位置上的氨基酸选自A、G、I、L和V。
[0750] 本文使用的关于氨基酸残基的术语“芳族”是指选自F、T和W的任何氨基酸残基。因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于人IgG1重链的位置D265的位置上的氨基酸选自F、T和W。
[0751] 本文使用的关于氨基酸残基的术语“酸性”是指选自D和E的任何氨基酸残基。因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于人IgG1重链的位置D265的位置上的氨基酸选自D和E。
[0752] 在具体的实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于人IgG1重链的位置D265的位置上的氨基酸选自A、E、F、G、I、L、T、V和W。
[0753] 在进一步的实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置N297的位置上的氨基酸不是N。
[0754] 在一个实施方案中，在第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的N297的位置上的氨基酸不是N，和对应于人IgG1重链的位置P331的位置上的氨基酸是P。
[0755] 在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于人IgG1重链的位置N297的位置上的氨基酸不是N。
[0756] 在一个实施方案中，在第一和第二重链两者中，对应于人IgG1重链的N297的位置上的氨基酸不是N，和对应于人IgG1重链的位置P331的位置上的氨基酸是P。
[0757] 在进一步的实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置L234和L235的位置上的氨基酸分别不是L和L。
[0758] 在一个实施方案中，在第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的L234和L235的位置上的氨基酸分别不是L和L，和对应于人IgG1重链的位置N297和P331的位置上的氨基酸分别是N和P。
[0759] 在一个实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置L234和L235的氨基酸选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、Y、V。
[0760] 在一个实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置L234和L235的位置上的氨基酸是疏水的或极性的氨基酸。
[0761] 本文使用的关于氨基酸残基的术语“疏水的”是指选自A、C、F、G、H、I、L、M、R、T、V、W和Y的氨基酸残基。因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置L234和L235的位置上的氨基酸各自选自A、C、F、G、H、I、M、R、T、V、W和Y。
[0762] 本文使用的关于氨基酸残基的术语“极性”是指选自C、D、E、H、K、N、Q、R、S和T的任何氨基酸残基。因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置L234和L235的位置上的氨基酸各自选自由C、D、E、H、K、N、Q、R、S和T组成的氨基酸。
[0763] 在具体的实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置L234和L235的位置上的氨基酸各自选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y。
[0764] 在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于人IgG1重链的位置L234和L235的位置上的氨基酸分别不是L和L。
[0765] 在一个实施方案中，在第一和第二重链两者中，对应于人IgG1重链的L234和L235的位置上的氨基酸分别不是L和L，和对应于人IgG1重链的位置N297和P331的位置上的氨基酸分别是N和P。
[0766] 在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于人IgG1重链的L234和L235的位置上的氨基酸是疏水的或极性的氨基酸。
[0767] 在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于人IgG1重链的位置L234和L235的位置上的氨基酸各自选自A、C、F、G、H、I、M、R、T、V、W和Y。
[0768] 在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于人IgG1重链的位置L234和L235的位置上的氨基酸各自选自由C、D、E、H、K、N、Q、R、S和T组成的氨基酸。
[0769] 在具体的实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于人IgG1重链的位置L234和L235的位置上的氨基酸各自选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y。
[0770] 在另一个实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置L234和L235的位置上的氨基酸是脂族不带电荷、芳族或酸性氨基酸。
[0771] 本文使用的关于氨基酸残基的术语“脂族不带电荷”是指选自A、G、I、L和V的任何氨基酸残基。因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置L234和L235的位置上的氨基酸各自选自A、G、I和V。
[0772] 本文使用的关于氨基酸残基的术语“芳族”是指选自F、T和W的任何氨基酸残基。因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置L234和L235的位置上的氨基酸各自选自F、T和W。
[0773] 本文使用的关于氨基酸残基的术语“酸性”是指选自D和E的任何氨基酸残基。因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置L234和L235的位置上的氨基酸各自选自D和E。
[0774] 在具体的实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于L234和L235的位置上的氨基酸各自选自A、D、E、F、G、I、T、V和W。
[0775] 在一个实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置L234和L235的位置上的氨基酸分别是F和E；或A和A。
[0776] 在一个实施方案中，在第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的L234和L235的位置上的氨基酸分别是F和E；或A和A，和对应于人IgG1重链的位置N297和P331的位置上的氨基酸分别是N和P。
[0777] 在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于人IgG1重链的位置L234和L235的位置上的氨基酸分别是F和E；或A和A。
[0778] 在一个实施方案中，在第一和第二重链两者中，对应于人IgG1重链的L234和L235的位置上的氨基酸分别是F和E；或A和A，和对应于人IgG1重链的位置N297和P331的位置上的氨基酸分别是N和P。
[0779] 在具体的实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置L234和L235的位置上的氨基酸分别是F和E。
[0780] 在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于人IgG1重链的位置L234和L235的位置上的氨基酸分别是F和E。
[0781] 在一个实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，至少对应于人IgG1重链的位置L234和L235的位置上的氨基酸分别是A和A。
[0782] 在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，至少对应于人IgG1重链的位置L234和L235的位置上的氨基酸分别是A和A。
[0783] 在一个实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分别不是L、L和D。
[0784] 在一个实施方案中，在第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的L234、L235和D265的位置上的氨基酸分别不是L、L和D，和对应于人IgG1重链的位置N297和P331的位置上的氨基酸分别是N和P。
[0785] 在一个实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置L234和L235的氨基酸选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、Y、V和W，和对应于位置D265的氨基酸选自A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、Y、V和W。
[0786] 在一个实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸是疏水的或极性的氨基酸。
[0787] 本文使用的关于氨基酸残基的术语“疏水的”是指选自A、C、F、G、H、I、L、M、R、T、V、W和Y的氨基酸残基。因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置D265的位置上的氨基酸选自A、C、F、G、H、I、L、M、R、T、V、W和Y，和对应于人IgG1重链的位置L234和L235的位置上的氨基酸各自选自A、C、F、G、H、I、M、R、T、V、W和Y。
[0788] 本文使用的关于氨基酸残基的术语“极性”是指选自C、D、E、H、K、N、Q、R、S和T的任何氨基酸残基。因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置L234和L235的位置上的氨基酸各自选自C、D、E、H、K、N、Q、R、S和T，对应于人重链的位置D265的位置上的氨基酸选自C、E、H、K、N、Q、R、S和T。
[0789] 在具体的实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置L234和L235的位置上的氨基酸各自选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y，和对应于人IgG1重链的位置D265的位置上的氨基酸选自A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y。
[0790] 在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于人IgG1重链的L234、L235和D265的位置上的氨基酸是疏水的或极性的氨基酸。
[0791] 在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于人IgG1重链的位置D265的位置上的氨基酸选自A、C、F、G、H、I、L、M、R、T、V、W和Y，和对应于人IgG1重链的位置L234和L235的位置上的氨基酸各自选自A、C、F、G、H、I、M、R、T、V、W和Y。
[0792] 在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于人IgG1重链的位置L234和L235的位置上的氨基酸各自选自C、D、E、H、K、N、Q、R、S和T，对应于人重链的位置D265的位置上的氨基酸选自C、E、H、K、N、Q、R、S和T。
[0793] 在具体的实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于人IgG1重链的位置L234和L235的位置上的氨基酸各自选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y，和对应于人IgG1重链的位置D265的位置上的氨基酸选自A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y。
[0794] 在另一个实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸是脂族不带电荷、芳族或酸性氨基酸。
[0795] 本文使用的关于氨基酸残基的术语“脂族不带电荷”是指选自A、G、I、L和V的任何氨基酸残基。因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置D265的位置上的氨基酸选自A、G、I、L和V，和对应于人IgG1重链的位置L234和L235的位置上的氨基酸各自选自A、G、I和V。
[0796] 本文使用的关于氨基酸残基的术语“芳族”是指选自F、T和W的任何氨基酸残基。因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸各自选自F、T和W。
[0797] 本文使用的关于氨基酸残基的术语“酸性”是指选自D和E的任何氨基酸残基。因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸各自选自D和E。
[0798] 在具体的实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置D265的位置上的氨基酸选自A、E、F、G、I、L、T、V和W，和对应于L234和L235的位置上的氨基酸各自选自A、D、E、F、G、I、T、V和W。
[0799] 在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于人IgG1重链的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分别不是L、L和D。
[0800] 在一个实施方案中，在第一和第二重链两者中，对应于人IgG1重链的L234、L235和D265的位置上的氨基酸分别不是L、L和D，和对应于人IgG1重链的位置N297和P331的位置上的氨基酸分别是N和P。
[0801] 在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于人IgG1重链的L234、L235和D265的位置上的氨基酸是脂族不带电荷、芳族或酸性氨基酸。
[0802] 在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于人IgG1重链的位置D265的位置上的氨基酸选自A、G、I、L和V，和对应于人IgG1重链的位置L234和L235的位置上的氨基酸各自选自A、G、I和V。
[0803] 在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于人IgG1重链的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸各自选自D和E。
[0804] 在具体的实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于人IgG1重链的位置D265的位置上的氨基酸选自A、E、F、G、I、L、T、V和W，和对应于L234和L235的位置上的氨基酸各自选自A、D、E、F、G、I、T、V和W。
[0805] 在一个实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分别是F、E和A；或A、A和A。
[0806] 在一个实施方案中，在第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的L234、L235和D265的位置上的氨基酸分别是F、E和A；或A、A和A，和对应于人IgG1重链的位置N297和P331的位置上的氨基酸分别是N和P。
[0807] 在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于人IgG1重链的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分别是F、E和A；或A、A和A。
[0808] 在一个实施方案中，在第一和第二重链两者中，对应于人IgG1重链的L234、L235和D265的位置上的氨基酸分别是F、E和A；或A、A和A，和对应于人IgG1重链的位置N297和P331的位置上的氨基酸分别是N和P。
[0809] 在具体的实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分别是F、E和A。
[0810] 在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于人IgG1重链的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分别是F、E和A。
[0811] 在一个实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分别是A、A和A。
[0812] 在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于人IgG1重链的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分别是A、A和A。
[0813] 在另一个实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链的位置L234、L235、D265、N297和P331的位置上的氨基酸分别是F、E、A、Q和S。
[0814] 在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于人IgG1重链的位置L234、L235、D265、N297和P331的位置上的氨基酸分别是F、E、A、Q和S。
[0815] 在一个实施方案中，根据本发明的抗体包含SEQ ID NOs:107；59；245；299；285；55；185；179；237；177和293的任一序列中所示的VH序列；SEQ ID NO:8所示的VL序列，并且在至少一个或两个重链中，与人IgG1重链中的位置L234、L235和D265相对应的位置中的氨基酸，分别是F、E和A。由此提供了与包含SEQ ID NO:4和8中所示的VH和VL序列的参考抗体相比对人CD3ε具有降低的亲和力的抗CD3抗体的实施方案，并且其中抗体还包含非活化Fc区。
[0816] 在一个具体的实施方案中，根据本发明的抗体包含SEQ ID NOs:107；59；245；299；285；55；185；179；237；177和293所示任一序列中所示的VH序列，SEQ ID NO:10所示的VL序列，并且在至少一个或两个重链中，与人IgG1重链中的位置L234、L235和D265相对应的位置中的氨基酸，分别是F、E和A。由此提供了与包含SEQ ID NO:4和8中所示的VH和VL序列的参考抗体相比对人CD3ε具有降低的亲和力的抗CD3抗体的实施方案，并且其中抗体还包含非活化Fc区和允许增强生产的VL区。
[0817] 在另一个实施方案中，根据本发明的抗体包含如SEQ ID NO:221所示的VH序列，如SEQ ID NO:8或10所示的VL序列，并且在至少一个或两个重链中对应于人IgG1重链中L234、L235和D265位置的氨基酸分别为F，E和A。
[0818] 在本发明的一个实施方案中，人IgG1重链具有如SEQ ID NO:407所示的IgG1m(f)序列。在另一个实施方案中，对应于如SEQ ID NO:407所示的人IgG1m(f)中的位置L234、L235和D265的位置中的氨基酸分别是F，E和A。
[0819] 在本发明的一个实施方案中，人IgG1重链具有如SEQ ID NO:409所示的IgG1m(f)序列。
[0820] 在一个方面，根据本发明的抗体包含SEQ ID NO:408的人IgLC2/IgLC3恒定结构域λ轻链。
[0821] 在一个方面，本发明的抗体可在轻链(LC)和/或重链(HC)中被修饰以增加表达水平和/或生产收率。在一个实施方案中，本发明的抗体可在轻链(LC)中被修饰。这样的修饰是本领域已知的，和可按照描述于例如Zheng,L.,Goddard,J.-P.,Baumann,U.,&Reymond,J.-L.(2004)Expression improvement and mechanistic study of the retro-Diels-Alderase catalytic antibody 10F11 by site-directed mutagenesis.Journal of Molecular Biology,341(3),807–14.doi:10.1016/j.jmb.2004.06.014的方法进行。
[0822] 在一个方面，可以在VH区和/或VL区中修饰根据本发明的抗体以修饰抗体的亲和力，例如减少或增加抗体抗体的亲和力。在某些情况下这可能是有利的，和导致功效增加。具体而言，低亲和力的CD3臂可能对循环中和肿瘤位点的T细胞的活动力具有影响，从而导致肿瘤细胞更好地与T细胞的接合(engagement)，参见 等,Molecular Immunology
44(2007)。具体而言，这可用于双特异性形式，其中CD3抗体用作结合臂之一。导致抗体亲和力降低的修饰是本领域已知的，参见例如Webster等IntJ Cancer Suppl.1988；3:13-6。
44(2007)。具体而言，这可用于双特异性形式，其中CD3抗体用作结合臂之一。导致抗体亲和力降低的修饰是本领域已知的，参见例如Webster等IntJ Cancer Suppl.1988；3:13-6。
[0823] 因此，在一个实施方案中，本发明的抗体包含含有具有如SEQ ID NO:6，GTN，7所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变(VL)区，和重链可变(VH)区，其中所述VH区包含具有选自由以下组之一的CDR序列的CDR1、CDR2和CDR3；
[0824] a)SEQ ID NO:54,2,3[T31M]所示的CDR序列；
[0825] b)SEQ ID NO:58,2,3[T31P]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0826] c)SEQ ID NO:1,106,3[N57E]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0827] d)SEQ ID NO:1,2,176[H101G]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0828] e)SEQ ID NO:1,2,184[H101N]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0829] f)SEQ ID NO:1,2,220[G105P]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0830] g)SEQ ID NO:1,2,236[S110A]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0831] h)SEQ ID NO:1,2,244[S110G]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0832] i)SEQ ID NO:1,2,284[Y114M]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0833] j)SEQ ID NO:1,2,292[Y114R]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；和
[0834] k)SEQ ID NO:1,2,298[Y114V]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列。
[0835] 另一方面，本发明提供了结合人CD3的抗体，其包含结合区，所述结合区包含具有SEQ ID NO 10所示序列的轻链可变(VL)区和重链可变(VH)区，所述VH区的CDR1、CDR2和CDR3具有选自以下组之一的序列：
[0836] a)SEQ ID NO:54,2,3[T31M]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0837] b)SEQ ID NO:58,2,3[T31P]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0838] c)SEQ ID NO:1,106,3[N57E]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0839] d)SEQ ID NO:1,2,176[H101G]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0840] e)SEQ ID NO:1,2,184[H101N]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0841] f)SEQ ID NO:1,2,220[G105P]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0842] g)SEQ ID NO:1,2,236[S110A]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0843] h)SEQ ID NO:1,2,244[S110G]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0844] i)SEQ ID NO:1,2,284[Y114M]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0845] j)SEQ ID NO:1,2,292[Y114R]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；和
[0846] k)SEQ ID NO:1,2,298[Y114V]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列。
[0847] 由此提供了包含如SEQ ID NO:10所示的VL区中的T41K突变的实施方案，由此允许所述抗体的产生增加。
[0848] 在一个方面，本发明涉及多特异性抗体，其至少包含本文所述的任何方面或实施方案的抗体的第一结合区，和与第一结合区结合一个或多个不同的靶标的一个或多个结合区。这样的多特异性抗体可以是双特异性抗体。
[0849] 因此，在一个方面，本发明涉及双特异性抗体，其包含本文所述的任何方面或实施方案的抗体的第一结合区，和与第一结合区结合不同的靶标的第二结合区。
[0850] 术语“多特异性抗体”是指对至少两个不同的例如至少三个、通常不重叠的表位具有特异性的抗体。这样的表位可在相同或不同的靶标上。如果表位在不同的靶标上，这样的靶标可在相同的细胞或不同的细胞或细胞类型上。
[0851] 术语“双特异性抗体”是指对至少两个不同的、通常不重叠的表位具有特异性的抗体。这样的表位可在相同的或不同的靶标上。如果表位在不同的靶标上，这样的靶标可在相同的细胞或不同的细胞或细胞类型上。
[0852] 在一个实施方案中，双特异性抗体包含第一和第二重链。
[0853] 涉及Fc区的修饰的实施方案和涉及特定氨基酸置换的实施方案预期是本发明的任何双特异性抗体的一部分。因此，在一个实施方案中，第一和第二重链中的至少一个包含按本文所述任何实施方案(例如关于提供无活性Fc区而描述的那些)定义进行修饰的一个或多个氨基酸。在一个实施方案中，所述第一和第二重链两者包含按本文所述任何实施方案(例如关于提供无活性Fc区而描述的那些)定义进行修饰的一个或多个氨基酸。因此，双特异性抗体包含按照本文所述的任何方面或实施方案进行修饰的Fc区；或所述第一和第二重链中的至少一个包含按本文所述的任何方面或实施方案定义进行修饰的一个或多个氨基酸。
[0854] 可用于本发明的双特异性抗体分子的实例包括(i)具有包含不同的抗原结合区的两个臂的单一抗体，(ii)对两个不同的表位具有特异性的单链抗体，例如经过由额外的肽接头串联的两个scFv；(iii)双重可变结构域抗体(DVD-IgTM)，其中各轻链和重链包含通过短的肽连键串联的两个可变结构域([40])；(iv)化学连接的双特异性(Fab’)2片段；(v)其是两个单链双抗体的融合物，产生四价双特异性抗体，其对每个靶抗原具有两个结合位点；(vi)柔韧抗体(flexibody)，其是scFv与双抗体的组合，产生多价分子；
(vii)所谓的“停靠和锁闭”分子(Dock-and- )，根据蛋白质激酶A中的“二聚化和对
接结构域”，当应用于Fab时，其可产生三价双特异性结合蛋白，其由与不同的Fab片段连接的两个相同的Fab片段组成；(viii)所谓的Scorpion分子，其包含例如与人Fab臂的两个末端融合的两个scFv；和(ix)双抗体。
(vii)所谓的“停靠和锁闭”分子(Dock-and- )，根据蛋白质激酶A中的“二聚化和对
接结构域”，当应用于Fab时，其可产生三价双特异性结合蛋白，其由与不同的Fab片段连接的两个相同的Fab片段组成；(viii)所谓的Scorpion分子，其包含例如与人Fab臂的两个末端融合的两个scFv；和(ix)双抗体。
[0855] 在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体是双抗体、杂合体(cross-body)或经过受控的Fab臂交换获得的双特异性抗体，例如 (例如描述于[41])，如本发明中描述的那些。
[0856] 不同类型的双特异性抗体的实例包括但不限于(i)IgG-样分子，具有互补CH3结构域以强迫异源二聚化；(ii)重组的IgG-样双重靶向分子，其中分子的两侧各自包含至少两种不同的抗体的Fab片段或Fab片段的一部分；(iii)IgG融合分子，其中全长IgG抗体与额外的Fab片段或Fab片段的一部分融合；(iv)Fc融合分子，其中单链Fv分子或稳定的双抗体与重链恒定结构域、Fc-区或其一部分融合；(v)Fab融合分子，其中不同的Fab-片段融合在一起，与重链恒定结构域、Fc-区或其一部分融合；和(vi)基于ScFv和双抗体的和重链抗体(例如，结构域抗体、 )，其中不同的单链Fv分子或不同的双抗体或不同的重链抗体(例如结构域抗体, )彼此融合，或与融合至重链恒定结构域、Fc-区或其一
部分的另一蛋白质或载体分子融合。
部分的另一蛋白质或载体分子融合。
[0857] 具有互补的CH3结构域分子的IgG-样分子的实例包括但不限于 (Trion Pharma/Fresenius Biotech,[42])、Knobs-into-Holes(Genentech,[43])、CrossMAbs(Roche,[44])和静电配对(Amgen,[45]-[46]；Chugai,[47]；Oncomed,[48])、LUZ-Y
(Genentech,Wranik等.J.Biol.Chem.2012,287(52):43331-9,doi:10.1074/
jbc.M112.397869.Epub 2012 Nov 1)、DIG体和PIG体(Pharmabcine,WO2010134666,
WO2014081202)、链交换改造结构域体(SEED体)(EMD Serono,[49])、Biclonics(Merus,WO2013157953)、FcΔAdp(Regeneron,[50])、双特异性IgG1和IgG2(Pfizer/Rinat,[51])、Azymetric支架(Zymeworks/Merck,[52])、mAb-Fv(Xencor,[53])、二价双特异性抗体
(Roche,WO2009080254)和 分子(Genmab A/S,[41])。
(Genentech,Wranik等.J.Biol.Chem.2012,287(52):43331-9,doi:10.1074/
jbc.M112.397869.Epub 2012 Nov 1)、DIG体和PIG体(Pharmabcine,WO2010134666,
WO2014081202)、链交换改造结构域体(SEED体)(EMD Serono,[49])、Biclonics(Merus,WO2013157953)、FcΔAdp(Regeneron,[50])、双特异性IgG1和IgG2(Pfizer/Rinat,[51])、Azymetric支架(Zymeworks/Merck,[52])、mAb-Fv(Xencor,[53])、二价双特异性抗体
(Roche,WO2009080254)和 分子(Genmab A/S,[41])。
[0858] 重组IgG-样双重靶向分子的实例包括但不限于双重靶向(DT)-Ig(GSK/Domantis,WO2009058383)、二合一抗体(Genentech,Bostrom等2009.Science 323,1610–1614)、交联Mab(Karmanos Cancer Center)、mAb2(F-Star,[54])、ZybodiesTM(Zyngenia,LaFleur et al.MAbs.2013Mar-Apr；5(2):208-18)、用共有轻链的方法(Crucell/Merus,[55])、κλBodies(NovImmune,WO2012023053)和CovX (CovX/Pfizer,Doppalapudi,V.R.,et al 2007.Bioorg.Med.Chem.Lett.17,501–506)。
[0859] IgG融合分子的实例包括但不限于双重可变结构域(DVD)-IgTM(Abbott,[56])、双重结构域双头抗体(Unilever；Sanofi Aventis,[57])、IgG-样双特异性(ImClone/Eli Lilly,Lewis etal.Nat Biotechnol.2014 Feb；32(2):191-8)、Ts2Ab(MedImmune/AZ,Dimasi et al.J Mol Biol.2009Oct 30；393(3):672-92)和BsAb(Zymogenetics,WO2010111625)、HERCULES(Biogen Idec,[58])、scFv融合物(Novartis)、scFv融合物(ChangzhouAdamBiotech Inc,[59])和TvAb(Roche,[59],[60])。
[0860] Fc融合分子的实例包括但不限于ScFv/Fc融合物(Academic Institution,Pearce et al Biochem Mol Biol Int.1997Sep；42(6):1179-88.)、SCORPION(Emergent BioSolutions/Trubion,Blankenship JW,et al.AACR 100 th Annual meeting 2009
(Abstract#5465)；Zymogenetics/BMS,WO2010111625)、双重亲和力再导向技术(Fc-DARTTM)(MacroGenics,[62],[63])和双重(ScFv)2-Fab(National Research Center forAntibody Medicine–China)。
(Abstract#5465)；Zymogenetics/BMS,WO2010111625)、双重亲和力再导向技术(Fc-DARTTM)(MacroGenics,[62],[63])和双重(ScFv)2-Fab(National Research Center forAntibody Medicine–China)。
[0861] Fab融合双特异性抗体的实例包括但不限于F(ab)2(Medarex/AMGEN)、双重作用或Bis-Fab(Genentech)、Dock-and- (DNL)(ImmunoMedics)、二价双特异性(Biotecnol)和Fab-Fv(UCB-Celltech)。
[0862] 基于ScFv-、双抗体-的抗体和结构域抗体的实例包括但不限于双特异性T细胞衔接物 (Micromet,Tandem Diabody(Tandab)(Affimed)、双重亲和力再导向技术(DARTTM)(MacroGenics)、单链双抗体(Academic,Lawrence FEBS Lett.1998Apr 3；425(3):
479-84)、TCR-样抗体(AIT,ReceptorLogics)、人血清白蛋白ScFv融合物(Merrimack,
WO2010059315)和COMBODY分子(Epigen Biotech,Zhu et al.Immunol Cell Biol.2010 Aug；88(6):667-75)、双重靶向 (Ablynx,Hmila et al.,FASEB J.2010)、双
重靶向仅重链结构域抗体。
479-84)、TCR-样抗体(AIT,ReceptorLogics)、人血清白蛋白ScFv融合物(Merrimack,
WO2010059315)和COMBODY分子(Epigen Biotech,Zhu et al.Immunol Cell Biol.2010 Aug；88(6):667-75)、双重靶向 (Ablynx,Hmila et al.,FASEB J.2010)、双
重靶向仅重链结构域抗体。
[0863] 还预期，满足本文所述的测定条件的任何单特异性抗体可形成双特异性抗体的基础。即，其中结合区之一结合CD3的双特异性抗体可源自在功能测定法中测试并满足本文所述要求的任何单特异性CD3抗体。这样的双特异性抗体可通过描述于[41]的方法提供，其通过引用结合到本文中。
[0864] 在一个方面，本发明的双特异性抗体包含含有第一CH3区的第一Fc区和含有第二CH3区的第二Fc区，其中第一和第二CH3区的序列不同，并且使得所述第一和第二CH3区之间的异二聚相互作用比所述第一和第二CH3区的每个同二聚相互作用更强。在WO2011131746和WO2013060867(Genmab)中提供了关于这些相互作用以及它们如何实现的更多细节，其通过引用并入本文。
[0865] 因此，在具体的实施方案中，所述第一和第二重链各自至少包含铰链区、CH2和CH3区，其中在所述第一重链中对应于选自人IgG1重链的T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409的位置的位置上的至少一个氨基酸被置换，和在所述第二重链中对应于选自人IgG1重链的T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409的位置的位置上的至少一个氨基酸被置换，和其中所述第一和所述第二重链未在相同的位置上被置换。在该情况下，术语“置换”是指特定氨基酸位置上的氨基酸被另一天然或非天然存在的氨基酸置换。因此，在对应于人IgG1重链中的位置的位置上“置换的”氨基酸意指在特定位置上的氨基酸不同于IgG1重链中天然存在的氨基酸。
[0866] 在一个实施方案中，在所述第一重链中对应于人IgG1重链的K409的位置上的氨基酸不是K、L或M，和任选地对应于人IgG1重链的F405的位置上的氨基酸是F，和在所述第二重链中对应于人IgG1重链中选自T366、L368、K370、D399、F405和Y407的位置的至少一个位置上的氨基酸被置换。
[0867] 在一个实施方案中，在所述第一重链中对应于人IgG1重链的K409的位置上的氨基酸不是K、L或M，和在所述第二重链中对应于人IgG1重链的F405的位置上的氨基酸不是F和任选地对应于人IgG1重链的K409的位置上的氨基酸是K。
[0868] 在一个实施方案中，在所述第一重链中对应于人IgG1重链的F405的位置上的氨基酸不是F、R和G，和在所述第二重链中对应于人IgG1重链的选自T366、L368、K370、D399、Y407和K409的位置的位置上的氨基酸被置换。
[0869] 在一个实施方案中，在所述第一重链中对应于人IgG1重链的K409的位置上的氨基酸不是K、L或M，和对应于人IgG1重链的F405的位置上的氨基酸不是F。
[0870] 在进一步的实施方案中，在所述第一重链中对应于人IgG1重链的F405的位置上的氨基酸是L，和在所述第二重链中对应于人IgG1重链的K409的位置上的氨基酸是R，或反之亦然。
[0871] 因此，在一个实施方案中，在第一重链中对应于人IgG1重链的K409的位置上的氨基酸是R，和在第二重链中对应于人IgG1重链的F405的位置上的氨基酸是L。
[0872] 在进一步的实施方案中，本发明的人源化或嵌合CD3抗体在第一和第二重链的至少一个中包含上述实施方案中任一个所公开的一个或多个无活性置换，例如L234F、L235E和D265A；和对应于F405的位置上的氨基酸不是F。在一个实施方案中，本发明的人源化或嵌合CD3抗体在第一和第二重链的至少一个中包含上述实施方案中任一个所公开的一个或多个无活性置换，例如L234F、L235E和D265A；和K409位置上的另外的置换，例如K409R。具体而言，在一个实施方案中，本发明的人源化或嵌合CD3抗体在第一和第二重链两者中包含上述实施方案中任一个所公开的一个或多个无活性置换，例如L234F、L235E和D265A；和F405位置上的置换，例如F405L。在一个实施方案中，本发明的人源化或嵌合CD3抗体在第一和第二重链两者中包含上述实施方案中任一个所公开的一个或多个无活性置换，例如L234F、L235E和D265A；和K409位置上的另外的置换，例如K409R。这样的抗体可用于产生双特异性抗体。
[0873] 因此，在进一步的实施方案中，在第一和第二重链的至少一个中对应于人IgG1重链的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分别是F、E和A，在第一重链中对应于人IgG1重链的F405的位置上的氨基酸是L，和在第二重链中对应于人IgG1重链的K409的位置上的氨基酸是R。
[0874] 在一个实施方案中，在第一和第二重链的至少一个中对应于人IgG1重链的L234、L235、D265、N297和P331的位置上的氨基酸分别是F、E、A、N和P，在第一重链中对应于人IgG1重链的F405的位置上的氨基酸是L，和在第二重链中对应于人IgG1重链的K409的位置上的氨基酸是R。
[0875] 在备选的实施方案中，在第一和第二重链的至少一个中对应于人IgG1重链的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分别是F、E和A，在第一重链中对应于人IgG1重链的K409的位置上的氨基酸是R，和在第二重链中对应于人IgG1重链的F405的位置上的氨基酸是L。
[0876] 在一个实施方案中，在第一和第二重链的至少一个中对应于人IgG1重链的L234、L235、D265、N297和P331的位置上的氨基酸分别是F、E、A、N和P，在第一重链中对应于人IgG1重链的K409的位置上的氨基酸是R，和在第二重链中对应于人IgG1重链的F405的位置上的氨基酸是L。
[0877] 在另一个实施方案中，在第一和第二重链两者中对应于人IgG1重链的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分别是F、E和A，在第一重链中对应于人IgG1重链的F405的位置上的氨基酸是L，和在第二重链中对应于人IgG1重链的K409的位置上的氨基酸是R。
[0878] 在一个实施方案中，在第一和第二重链两者中对应于人IgG1重链的L234、L235、D265、N297和P331的位置上的氨基酸分别是F、E、A、N和P，在第一重链中对应于人IgG1重链的F405的位置上的氨基酸是L，和在第二重链中对应于人IgG1重链的K409的位置上的氨基酸是R。
[0879] 在备选的实施方案中，在第一和第二重链两者中对应于人IgG1重链的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分别是F、E和A，在第一重链中对应于人IgG1重链的K409的位置上的氨基酸是R，和在第二重链中对应于人IgG1重链的F405的位置上的氨基酸是L。
[0880] 在一个实施方案中，在第一和第二重链两者中对应于人IgG1重链的L234、L235、D265、N297和P331的位置上的氨基酸分别是F、E、A、N和P，在第一重链中对应于人IgG1重链的K409的位置上的氨基酸是R，和在第二重链中对应于人IgG1重链的F405的位置上的氨基酸是L。
[0881] 如本文所述，T细胞募集至特定靶细胞，例如癌症或肿瘤细胞，提供杀死靶细胞的方法。T细胞介导的杀死可通过第一结合区靶向CD3和第二结合区靶向另一靶标的双特异性抗体获得。因此，在一个实施方案中，第一结合区按照本文所述的对于人源化或嵌合CD3抗体的任何实施方案，和第二结合区与第一结合区结合不同的靶标。应理解，当抗体是双特异性抗体时，抗体的至少一半，即抗体的重链和轻链对之一，是本文所述的人源化或嵌合抗体。因此，双特异性抗体的一半是根据本发明的结合CD3的人源化或嵌合抗体和另一半可以是结合第二靶标的人源化、嵌合、完全非人或完全人抗体。因此，在一个实施方案中，抗体包含第一和第二重链、第一和第二轻链，其中所述第一重链和所述第一轻链是人源化或嵌合的，和通过二硫桥连接，形成第一结合区；和所述第二重链和轻链是完全人的，和通过二硫桥连接，形成第二结合区，其中所述第一结合区按照本文所述的任何方面或实施方案，和所述第二结合区结合不同靶标。在一个实施方案中，抗体包含第一和第二重链、第一和第二轻链，其中所述第一重链和所述第一轻链是人源化或嵌合的，和通过二硫桥连接，形成第一结合区；和所述第二重链和轻链是人源化或嵌合的，和通过二硫桥连接，形成第二结合区，其中所述第一结合区根据本文所述的方面或实施方案，和所述第二结合区与所述第一结合区结合不同的CD3表位。
[0882] 本文使用的术语“二硫桥”是指两个半胱氨酸残基之间的共价键，即所述相互作用也可称为Cys-Cys相互作用。
[0883] 本文使用的术语“靶标”是指本发明的抗体的结合区结合的分子。当用于抗体结合的背景下时，该术语包括产生的抗体所针对的任何抗原。
[0884] 在一个具体的实施方案中，第一重链和第一轻链是人源化或嵌合的，和通过二硫桥连接，形成第一结合区；和第二重链和轻链是全人的和通过二硫桥连接，形成第二结合区，其中第一结合区按照本文所述的任何方面或实施方案，和第二结合区结合不同的靶标；和其中在第一和第二重链的至少一个中对应于人IgG1重链的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分别是F、E和A。
[0885] 在一个具体的实施方案中，第一重链和第一轻链是人源化或嵌合的和通过二硫桥连接，形成第一结合区；和第二重链和轻链是全人的和通过二硫桥连接，形成第二结合区，其中第一结合区按照本文所述的任何方面或实施方案，和第二结合区与第一结合区结合不同的CD3表位；和其中在第一和第二重链的至少一个中对应于人IgG1重链的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分别是F、E和A。
[0886] 在一个具体的实施方案中，第一重链和第一轻链是人源化或嵌合的和通过二硫桥连接，形成第一结合区；和第二重链和轻链是全人的和通过二硫桥连接，形成第二结合区，其中第一结合区按照本文所述的任何方面或实施方案，和第二结合区结合不同的靶标；和其中在第一和第二重链两者中对应于人IgG1重链的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分别是F、E和A。
[0887] 在一个具体的实施方案中，第一重链和第一轻链是人源化或嵌合的和通过二硫桥连接，形成第一结合区；和第二重链和轻链是全人的和通过二硫桥连接，形成第二结合区，其中第一结合区按照本文所述的任何方面或实施方案，和第二结合区与第一结合区结合不同的CD3表位；和其中在第一和第二重链两者中对应于人IgG1重链的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分别是F、E和A。
[0888] 在另一方面，本发明涉及涉及与包含重链可变(VH)区的参考抗体相比降低结合人CD3的抗体的结合亲和力的方法，其中所述VH区包含SEQ ID NO:1、2、3所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，该方法包括所述参考抗体的三个CDR序列之一中引入突变，所述突变选自以下位置之一的突变，所述位置选自T31M、T31P、N57、H101、S110和Y114，其中所述位置根据SEQ ID NO:4的参考序列进行编号。
[0889] VH区中的氨基酸的编号和待突变的位置根据SEQ ID NO:4中的氨基酸进行编号。编号是根据从N端到C端方向上从第一个氨基酸到数字125的直接数字编号方案。图2中示出了对应于SEQ ID NO:4的位置的数字编号。此外，根据IMGT定义已经注释了CDR区。
[0890] 在本发明的一个实施方案中，所述方法包括引入T31M或T31P突变。位置T31根据SEQ ID NO:4。
[0891] 在本发明的一个实施方案中，所述方法包括在位置N57引入突变。位置N57根据SEQ ID NO:4。在一个实施方案中，所述突变是N57E。
[0892] 在本发明的一个实施方案中，所述方法包括在位置H101引入突变。位置H101根据SEQ ID NO:4。在一个实施方案中，突变是H101G或H101N。
[0893] 在本发明的一个实施方案中，所述方法包括在位置Y114引入突变。位置Y114根据SEQ ID NO:4。在一个实施方案中，突变是Y114、Y114R或Y114V。
[0894] 在本发明的一个实施方案中，所述方法包括在对应于选自H101、S110和Y114的位置的VH CDR3区中的突变中引入突变。
[0895] 在本发明的一个实施方案中，所述方法包括将突变引入VHCDR3区，选自H101G、H101N、S110A、S110G、Y114M、Y114R和Y114V。
[0896] 在本发明的一个实施方案中，所述方法包括引入突变，其中抗体对具有SEQ ID -8 -8 -7 -7NO:402的人CD3ε肽的结合亲和力对应于1.6x10 M至9.9x10 M或1.0x10 至9.9x10 M的KD值，如通过生物层干涉测量法测定的。
[0897] 在本发明的一个实施方案中，所述方法包括引入突变，其中抗体对具有SEQ ID NO:402的人CD3ε肽的结合亲和力对应于1.4x10-8M至1.0x10-8M或9.9x10-9至1x10-9的KD值，如通过生物层干涉测量法测定的。
[0898] 在本发明的一个实施方案中，抗体对具有SEQ ID NO:402的人CD3ε肽的结合亲和力对应于1.6x10-8M至9.9x10-8M或1.0x10-7至9.9x10-7M的KD值，如通过生物层干涉测量法测定的。
[0899] 另一方面，本发明涉及与包含重链可变区(VH)区的参考抗体相比增加结合人CD3的抗体的结合亲和力的方法，其中所述VH区包含SEQ ID NO:1、2、3所示的CDR1、CDR2和CDR3，所述方法包括在对应于位置G105的VH CDR3中引入突变，其中所述位置根据SEQ ID NO:4的参考序列进行编号。
[0900] 在一个实施方案中，所述方法包括在位置G105引入突变。位置G105根据SEQ ID NO:4。在一个实施方案中，突变是G105P。
[0901] 在本发明的一个实施方案中，所述方法包括将至多5个另外的突变，至多4个另外的突变，至多3个另外的突变，至多2个另外的突变或至多1个另外的突变引入SEQ ID NO:1、2、3所示的参考抗体的VH区的CDR中。
[0902] 在本发明的一个实施方案中，增加或降低结合亲和力的方法包括包含含有重链可变区(VH)的结合区，其中所述VH区包含选自以下的CDR1、CDR2和CDR3序列：
[0903] a)SEQ ID NO:54,2,3[T31M]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0904] b)SEQ ID NO:58,2,3[T31P]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0905] c)SEQ ID NO:1,106,3[N57E]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0906] d)SEQ ID NO:1,2,176[H101G]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0907] e)SEQ ID NO:1,2,184[H101N]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0908] f)SEQ ID NO:1,2,220[G105P]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0909] g)SEQ ID NO:1,2,236[S110A]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0910] h)SEQ ID NO:1,2,244[S110G]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0911] i)SEQ ID NO:1,2,284[Y114M]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；
[0912] j)SEQ ID NO:1,2,292[Y114R]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列；和
[0913] k)SEQ ID NO:1,2,298[Y114V]所示的CDR1,CDR2和CDR3序列。
[0914] 在本发明的另一个实施方案中，所述方法包括在对应于N57E的VH区CDR2区中引入突变。在本发明的另一个实施方案中，所述方法包括在对应于H101G、H101N、G105P、S110A、S110G、Y114M、Y114R或Y114V的VH区CDR3区中引入突变。另一方面，本发明涉及降低或增加抗体对CD3的结合亲和力的方法，其中所述抗体包含含有重链可变(VH)区的结合区，其中所述VH区在CDR1SEQ ID：1，CDR2SEQ ID：2和CDR3SEQ ID：3所示的参考抗体的三个CDR序列之一中包含突变，其中所述抗体在选自以下位置之一中包含突变：T31M、T31P、N57、H101、G105、S110和Y114，其中所述位置对应于SEQ ID NO:4的参考序列。
[0915] 在本发明的一个实施方案中，所述方法包括在对应于T31M或T31P的VH区CDR1区序列中引入突变。在本发明的另一个实施方案中，所述方法包括在对应于N57E的VH区CDR2区中引入突变。在本发明的另一个实施方案中，所述方法包括在对应于H101G、H101N、G105P、S110A、S110G、Y114M、Y114R或Y114V的VH区CDR3区中引入突变。
[0916] 另一方面，本发明涉及与包含重链可变(VH)区的参考抗体相比降低结合CD3的抗体的结合亲和力的方法，其中所述VH区包含具有SEQ ID NO:1、2和3所示的CDR序列的CDR1、CDR2和CDR3，所述方法包括在SEQ ID NO:1、2或3所示的VH区CDR1、CDR2或CDR3序列之一中引入突变。
[0917] 在本发明的一个实施方案中，所述方法包括在对应于以下位置之一的VH区的三个CDR区之一中引入突变：T31、N57、H101、S110或Y114、其中所述位置对应于SEQ ID NO:4的参考序列。
[0918] 在本发明的一个实施方案中，所述方法包括在对应于位置T31的VH区CDR1序列中引入突变，其中所述CDR1序列如SEQ ID NO1所示。当所述突变由X表示时，所得的CDR1序列可以呈现为GFTFNXYA。在一个实施方案中，VH区的三个CDR序列可以具有以下序列CDR1 GFTFNXYA,CDR2 IRSKYNNYAT和CDR3 VRHGNFGNSYVSWFAY。在一个实施方案中，VH区CDR1中位置T31的突变是T31M或T31P突变。
[0919] 在本发明的一个实施方案中，所述方法包括在对应于位置N57的VH区CDR2序列中引入突变，其中CDR2序列为如SEQ ID NO 2所示。当突变由X表示时，所得的CDR2序列可以呈现为IRSKYNXYAT。在一个实施方案中，VH区的三个CDR序列可具有以下序列CDR1 GFTFNTYA,CDR2 IRSKYNXYAT和CDR3 VRHGNFGNSYVSWFAY。在一个实施方案中，VH区CDR2中位置N57的突变是N57E突变。
[0920] 在本发明的一个实施方案中，所述方法包括在对应于位置H101的VH区CDR3序列中引入突变，其中CDR3序列如SEQ ID NO 3所示。当突变由X表示时，所得的CDR3序列可以呈现为VRXGNFGNSYVSWFAY。在一个实施方案中，VH区的三个CDR序列可具有以下序列：CDR1 GFTFNTYA,CDR2 IRSKYNNYAT和CDR3 VRXGNFGNSYVSWFAY。在一个实施方案中，VH区CDR3中H101位的突变是H101G或H101N突变。
[0921] 在本发明的一个实施方案中，所述方法包括在对应于位置S110的VH区CDR3序列中引入突变，其中CDR3序列为如SEQ ID NO 3所示。当突变由X表示时，所得的CDR3序列可以呈现为VRHGNFGNSYVXWFAY。在一个实施方案中，VH区的三个CDR序列可具有以下序列：CDR1 GFTFNTYA,CDR2 IRSKYNNYAT和CDR3 VRHGNFGNSYVXWFAY。在一个实施方案中，VH区CDR3中位置H101的突变是S110A或S110G突变。
[0922] 在本发明的一个实施方案中，所述方法包括在对应于位置Y114的VH区CDR3序列中引入突变，其中CDR3序列为如SEQ ID NO 3所示。当突变由X表示时，所得的CDR3序列可以呈现为VRHGNFGNSYVSWFAX。在一个实施方案中，VH区的三个CDR序列可以具有以下序列：CDR1 GFTFNTYA,CDR2 IRSKYNNYAT和CDR3 VRHGNFGNSYVSWFAX。在一个实施方案中，VH区CDR3中位置Y114的突变是Y114M、Y114R或Y114V突变。
[0923] 在本发明的一个实施方案中，所述方法包括将至多3个突变，至多2个突变或至多1个突变引入SEQ ID NO:1、2、3中所示的参考抗体的VH区的三个CDR的一个或更多。
[0924] 在本发明的一个实施方案中，所述方法包括将至多10个突变，至多9个突变，至多8个突变，至多7个突变，至多6个突变，至多5个突变，至多4个突变，至多3个突变，至多2个突变或至多1个突变引入抗体的可变重链框架区，其中与没有突变的相同抗体相比，所述突变优选不改变抗体与CD3的结合。
[0925] 在本发明的一个实施方案中，所述方法包括将选自T31M或T31P的突变的引入VH区CDR1序列。在本发明的另一个实施方案中，所述方法包括在N57E的VH区CDR2序列中引入突变。在本发明的另一个实施方案中，所述方法包括在选自H101G、H101N、S110A、S110G、Y114M、Y114R和Y114V的VH区CDR3序列中引入突变。
[0926] 另一方面，本发明涉及与包含重链可变(VH)区的参考抗体相比增加结合CD3的抗体的结合亲和力的方法，其中所述VH区包含具有SEQ ID NO:1、2和3所示CDR1、CDR2和CDR3的CDR序列，所述方法包括在SEQ ID NO:1、2或3所示的VH区CDR1、CDR2或CDR3序列之一中引入突变。
[0927] 在本发明的一个实施方案中，所述方法包括在对应于位置G105的VH区CDR3序列中引入突变，其中CDR3序列如SEQ ID NO 3所示。当突变由X表示时，所得CDR3序列可以呈现为VRHGNFXNSYVSWFAY。在一个实施方案中，VH区的三个CDR序列可具有以下序列：CDR1 GFTFNTYA,CDR2 IRSKYNNYAT和CDR3 VRXGNFGNSYVSWFAY。在一个实施方案中，VH区CDR3中位置G105的突变是G105P突变。
[0928] 核酸构建体、表达载体和宿主细胞
[0929] 在一个方面，本发明涉及编码表1所示的一个或多个序列的核酸构建体。因此，本发明涉及编码SEQ ID NO:107；221；59；245；299；285；55；185；179；237；177和293所示的任何一个序列的核酸构建体。
[0930] 在进一步的方面，本发明涉及编码本发明的人源化或嵌合CD3抗体的序列的核酸构建体、包含本发明的核酸构建体的表达载体、包含所述表达载体的宿主细胞、和通过在产生和任选地收回所述抗体的合适的条件下培养所述宿主细胞产生所述抗体的方法。人源化CD3抗体亦称为“huCD3”。
[0931] 在一个实施方案中，本发明提供表达载体，其包含(i)编码本发明的人源化或嵌合抗体的重链序列的核酸序列，(ii)编码本发明的人源化或嵌合抗体的轻链序列的核酸序列，或(iii)(i)和(ii)两者。因此，表达载体包含本文所述的任何方面或实施方案的一个或多个核酸构建体或核酸序列。
[0932] 在一个实施方案中，本发明的表达载体包含编码重链和轻链CDR序列中的一个或多个的核酸序列，其中VH CDR序列选自:SEQ ID NO.:12,2,3；14,2,3；16,2,3；18,2,3；20,2,3；22,2,3；24,2,3；26,2,3；28,2,3；30,2,3；32,2,3；34,2,3；36,2,3；38,2,3；:40,2,3；
42,2,3；44,2,3；:46,2,3；48,2,3；50,2,3；52,2,3；54,2,3；56,2,3；58,2,3；60,2,3；62,2,
3；64,2,3；66,2,3；68,2,3；70,2,3；72,2,3；74,2,3；76,2,3；78,2,3；80,2,3；82,2,3；84,2,
3；86,2,3；88,2,3；90,2,3；92,2,3；94,2,3；96,2,3；98,2,3；1,100,3；1,102,3；1,104,3；1,
106,3；1,108,3；1,110,3；1,112,3；1,114,3；1,116,3；1,118,3；1,120,3；1,122,3；1,124,
3；1,126,3；1,128,3；1,130,3；1,132,3；1,134,3；1,136,3；1,138,3；；1,140,3；1,142,3；1,
144,3；1,146,3；1,148,3；1,150,3；1,152,3；1,154,3；1,156,3；1,158,3；1:1,2,176；1,2,
178；1,2,180；1,2,182；1,2,184；1,2,186；1,2,188；1,2,190；:1,2,192；1,2,194；1,2,196；
1,2,198；1,2,200；1,2,202；1,2,204；1,2,206；:1,2,208；1,2,210；1,2,212；1,2,214；1,2,
216；1,2,218；1,2,220；:1,2,222；1,2,224；1,2,226；1,2,228；1,2,230；1,2,232；1,2,234；
1,2,236；1,2,238；1,2,240；1,2,242；1,2,244；1,2,246；1,2,248；1,2,250；1,2,252；1,2,
254；1,2,256；1,2,258；1,2,260；1,2,262；1,2,264；1,2,266；1,2,268；1,2,270；1,2,272；
1,2,274；1,2,276；1,2,278；:1,2,280；1,2,282；1,2,284；1,2,286；:1,2,288；1,2,290；1,
2,292；1,2,294；1,2,296；1,2,298和1,2,300。和其中VL CDR序列选自SEQ ID NO:6,GTN,7；
302,GTN,7；304,GTN,7；306,GTN,7；308,GTN,7；:310,GTN,7；312,GTN,7；314,GTN,7；316,GTN,7；318,GTN,7；320,GTN,7；322,GTN,7；324,GTN,7；326,GTN,7；328,GTN,7；330,GTN,7；:
6,GTN,332；6,GTN,334；6,GTN,336；6,GTN,338；6,GTN,340；6,GTN,342；6,GTN,344；6,GTN,
346；6,GTN,348；6,GTN,350；6,GTN,352；6,GTN,354；6,GTN,356；6,GTN,358；6,GTN,360；6,GTN,362；6,GTN,364；6,GTN,366；6,GTN,368；6,GTN,370；6,GTN,372；6,GTN,374；6,GTN,
376；6,GTN,378；6,GTN,380；6,GTN,382；6,GTN,384；GTN,386；:6,GTN,388；6,GTN,390；,GTN,392；和6,GTN,394所示的CDR序列。
42,2,3；44,2,3；:46,2,3；48,2,3；50,2,3；52,2,3；54,2,3；56,2,3；58,2,3；60,2,3；62,2,
3；64,2,3；66,2,3；68,2,3；70,2,3；72,2,3；74,2,3；76,2,3；78,2,3；80,2,3；82,2,3；84,2,
3；86,2,3；88,2,3；90,2,3；92,2,3；94,2,3；96,2,3；98,2,3；1,100,3；1,102,3；1,104,3；1,
106,3；1,108,3；1,110,3；1,112,3；1,114,3；1,116,3；1,118,3；1,120,3；1,122,3；1,124,
3；1,126,3；1,128,3；1,130,3；1,132,3；1,134,3；1,136,3；1,138,3；；1,140,3；1,142,3；1,
144,3；1,146,3；1,148,3；1,150,3；1,152,3；1,154,3；1,156,3；1,158,3；1:1,2,176；1,2,
178；1,2,180；1,2,182；1,2,184；1,2,186；1,2,188；1,2,190；:1,2,192；1,2,194；1,2,196；
1,2,198；1,2,200；1,2,202；1,2,204；1,2,206；:1,2,208；1,2,210；1,2,212；1,2,214；1,2,
216；1,2,218；1,2,220；:1,2,222；1,2,224；1,2,226；1,2,228；1,2,230；1,2,232；1,2,234；
1,2,236；1,2,238；1,2,240；1,2,242；1,2,244；1,2,246；1,2,248；1,2,250；1,2,252；1,2,
254；1,2,256；1,2,258；1,2,260；1,2,262；1,2,264；1,2,266；1,2,268；1,2,270；1,2,272；
1,2,274；1,2,276；1,2,278；:1,2,280；1,2,282；1,2,284；1,2,286；:1,2,288；1,2,290；1,
2,292；1,2,294；1,2,296；1,2,298和1,2,300。和其中VL CDR序列选自SEQ ID NO:6,GTN,7；
302,GTN,7；304,GTN,7；306,GTN,7；308,GTN,7；:310,GTN,7；312,GTN,7；314,GTN,7；316,GTN,7；318,GTN,7；320,GTN,7；322,GTN,7；324,GTN,7；326,GTN,7；328,GTN,7；330,GTN,7；:
6,GTN,332；6,GTN,334；6,GTN,336；6,GTN,338；6,GTN,340；6,GTN,342；6,GTN,344；6,GTN,
346；6,GTN,348；6,GTN,350；6,GTN,352；6,GTN,354；6,GTN,356；6,GTN,358；6,GTN,360；6,GTN,362；6,GTN,364；6,GTN,366；6,GTN,368；6,GTN,370；6,GTN,372；6,GTN,374；6,GTN,
376；6,GTN,378；6,GTN,380；6,GTN,382；6,GTN,384；GTN,386；:6,GTN,388；6,GTN,390；,GTN,392；和6,GTN,394所示的CDR序列。
[0933] 在一个实施方案中，本发明的表达载体包含编码重链和轻链CDR序列中的一个或多个的核酸序列，其中VL区CDR1,CDR2,CDR3区CDR序列包含SEQ ID NO:6,GTN,7所示的CDR序列和VH区CDR1,CDR2,CDR3区CDR序列选自:SEQ ID NOs.:54,2,3所示的CDR1,CDR2,CDR3；SEQ ID NO:58,2,3所示的CDR1,CDR2,CDR3；SEQ ID NO:1,106,3所示的CDR1,CDR2,CDR3；
SEQ ID NO:1,2,176所示的CDR1,CDR2,CDR3；SEQ ID NO:1,2,184所示的CDR1,CDR2,CDR3；
SEQ ID NO 1,2,220所示的CDR1,CDR2,CDR3；SEQ ID NO 1,2,236所示的CDR1,CDR2,CDR3；
SEQ ID NO 1,2,244所示的CDR1,CDR2,CDR3；SEQ ID NO 1,2,284所示的CDR1,CDR2,CDR3；
SEQ ID NO 1,2,292所示的CDR1,CDR2,CDR3和SEQ ID NO1,2,298所示的CDR1,CDR2,CDR3。
SEQ ID NO:1,2,176所示的CDR1,CDR2,CDR3；SEQ ID NO:1,2,184所示的CDR1,CDR2,CDR3；
SEQ ID NO 1,2,220所示的CDR1,CDR2,CDR3；SEQ ID NO 1,2,236所示的CDR1,CDR2,CDR3；
SEQ ID NO 1,2,244所示的CDR1,CDR2,CDR3；SEQ ID NO 1,2,284所示的CDR1,CDR2,CDR3；
SEQ ID NO 1,2,292所示的CDR1,CDR2,CDR3和SEQ ID NO1,2,298所示的CDR1,CDR2,CDR3。
[0934] 在具体的实施方案中，表达载体包含编码一个或多个上述氨基酸序列的变体的核酸序列，所述变体具有至多25个氨基酸修饰，例如至多20个，例如至多15、14、13、12或11个氨基酸修饰，例如10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸修饰，例如缺失或插入，优选置换，例如保守或非保守置换，或与任何所述序列具有至少80％同一性，例如与任何上述氨基酸序列具有至少85％同一性或90％同一性或95％同一性，例如96％同一性或97％同一性或98％同一性或99％同一性。本发明还涉及不同于上述核酸序列但由于遗传密码的差异而编码与本发明的抗体相同的氨基酸序列的核酸序列。例如，核酸序列可不同，但产生与本文所述的任何氨基酸序列相同的氨基酸序列。如何基于遗传密码鉴定这样的另外的核酸序列是技术人员众所周知的。
[0935] 在进一步的实施方案中，表达载体进一步包含编码抗体(例如人抗体)的轻链、重链或轻链和重链两者的恒定区的核酸序列。
[0936] 上文所述的这样的表达载体可用于重组产生本发明的抗体。
[0937] 在本发明的背景下，表达载体可以是任何合适的载体，包括染色体、非染色体和合成的核酸载体(包含一组合适的表达控制元件的核酸序列)。这样的载体的实例包括SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、源自质粒和噬菌体DNA的组合的载体，和病毒核酸(RNA或DNA)载体。在一个实施方案中，人源化或嵌合CD3抗体-编码核酸包含在裸DNA或RNA载体中，包括例如线性表达元件(如描述于例如[64])、致密核酸载体(如描述于例如[65]和/或[66])、质粒载体例如pBR322、pUC 19/18或pUC 118/119、"midge"最低大小的核酸载体(如描述于例如[67])，或作为沉淀的核酸载体构建体，例如CaPO4--沉淀的构建体(如描述于例如[68]、[69]、[70]和[71])。这样的核酸载体和其用途是本领域众所周知的(见例如[72]和[73])。
[0938] 在一个实施方案中，所述载体适合于在细菌细胞中表达人源化或嵌合CD3抗体。这样的载体的实例包括表达载体，例如BlueScript(Stratagene)、pIN载体([74])、pET载体(Novagen,Madison WI)等。
[0939] 表达载体可另外或备选地是适合于在酵母系统中表达的载体。可使用适合于在酵母系统中表达的任何载体。合适的载体包括，例如包含组成型或诱导型启动子，例如α因子、醇氧化酶和PGH的载体(综述于[75]和[76])。
[0940] 核酸构建体和/或载体可还包含编码分泌/定位序列的核酸序列，其可将多肽(例如新生的多肽链)靶向胞质空间或细胞培养基中。这样的序列是本领域已知的，和包括分泌前导序列或信号肽、细胞器靶向序列(例如核定位序列、ER保留信号、线粒体运输序列、叶绿体运输序列)、膜定位/锚序列(例如终止转移序列、GPI锚序列)等，其是本领域众所周知的。
[0941] 在本发明的表达载体中，人源化或嵌合CD3抗体-编码核酸可包含或与任何合适的启动子、增强子和其它表达促进元件缔合。这样的元件的实例包括强表达启动子(例如人CMV IE启动子/增强子以及RSV、SV40、SL3-3、MMTV和HIV LTR启动子)、有效的多聚(A)终止序列、大肠杆菌中质粒产物的复制起点、作为选择性标记的抗生素抗性基因和/或合适的克隆位点(例如，聚合接头)。核酸构建体和/或载体还可包含与组成型启动子相对的诱导型启动子，例如CMV IE(技术人员将知道，这些术语实际上是在某些条件下基因表达程度的描述符)。
[0942] 在一个实施方案中，人源化或嵌合CD3抗体-编码表达载体位于宿主细胞或宿主动物中，和/或通过病毒载体递送至宿主细胞或宿主动物。
[0943] 这样的表达载体可用于重组产生人源化或嵌合CD3抗体。
[0944] 在一个方面，本发明提供包含本发明的表达载体的宿主细胞。
[0945] 在一个方面，本文所述的任何方面或实施方案的人源化或嵌合CD3抗体通过使用产生抗体的重组真核、重组原核或重组微生物宿主细胞提供。因此，本发明提供重组真核、重组原核或重组微生物宿主细胞，其产生本文定义的人源化或嵌合CD3抗体或免疫球蛋白。宿主细胞的实例包括酵母、细菌和哺乳动物细胞，例如CHO或HEK-293细胞。例如，在一个实施方案中，宿主细胞包含稳定整合至细胞基因组的核酸序列，其包含编码本文所述的人源化或嵌合CD3抗体的表达的序列。在另一个实施方案中，宿主细胞包含非整合的核酸序列，例如质粒、粘粒、噬菌粒或线性表达元件，其包含编码本文所述的人源化或嵌合CD3抗体的表达的序列。
[0946] 本文使用的术语"重组宿主细胞"(或简称"宿主细胞")意指表达载体或核酸构建体或序列所引入的细胞。应理解，该术语不仅意指具体的受试细胞，而且指所述细胞的子代。因为在传代时由突变或环境影响导致可存在某些修饰，所述子代事实上可能与亲代细胞不同，但仍包括在本文使用的术语"宿主细胞"的范围内。重组宿主细胞包括例如：真核宿主细胞，例如CHO细胞、HEK-293细胞、PER.C6、NS0细胞和淋巴细胞；和原核细胞，例如大肠杆菌；和其它真核宿主，例如植物细胞和真菌。
[0947] 在进一步的方面，本发明涉及用于产生本发明的人源化或嵌合CD3抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
[0948] a)培养上文所述的本发明的宿主细胞，和
[0949] b)从培养基回收和/或纯化本发明的抗体。
[0950] 在进一步的方面，编码人源化或嵌合CD3抗体的序列的核苷酸序列进一步编码第二部分，例如治疗多肽。示例性的治疗多肽在本文另外描述。在一个实施方案中，本发明涉及用于产生人源化或嵌合CD3抗体融合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
[0951] a)培养宿主细胞，所述宿主细胞包含包含所述核苷酸序列的表达载体，和
[0952] b)从培养基回收和/或纯化人源化或嵌合CD3抗体融合蛋白。
[0953] 组合物
[0954] 在一个方面，本发明提供包含本文所述的任何方面和实施方案的抗体或双特异性抗体的组合物。
[0955] 在一个方面，本发明提供包含本文所述的任何一个方面和实施方案定义的抗体或双特异性抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。
[0956] 药物组合物可按照常规技术，例如描述于[77]中的技术，用药学上可接受的载体或稀释剂以及任何其它已知的助剂和赋形剂配制。
[0957] 药学上可接受的载体或稀释剂以及任何其它已知的助剂和赋形剂应适合于本发明的人源化或嵌合抗体和选择的给药方式。药物组合物的载体和其它组分的适合性根据不存在对选择的本发明的化合物或药物组合物对抗原结合所需要的生物性质的显著的负面影响来确定(例如，小于实质的影响(10％或更小的相对抑制、5％或更小的相对抑制等))。
[0958] 本发明的药物组合物还可包括稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、去垢剂(例如非离子去垢剂，例如Tween-20或Tween-80)、稳定剂(例如糖或无蛋白质氨基酸)、防腐剂、组织固定剂、增溶剂和/或适合于包括在药物组合物中的其它材料。
[0959] 本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可改变，以获得对具体患者、组合物和给药方式有效实现需要的治疗反应并对患者无毒的量的活性成分。选择的剂量水平将取决于医学领域众所周知的各种药代动力学因素，包括使用的本发明的特定组合物或其酰胺的活性、给药途径、给药次数、使用的特定化合物的排泄速率、治疗持续时间；与使用的特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料；治疗的患者的年龄、性别、体重、病况、一般健康和之前的病史等因素。
[0960] 药物组合物可通过任何合适的途径和方式给予。体内和体外给予本发明的人源化或嵌合抗体的合适途径是本领域众所周知的，和可由本领域普通技术人员选择。
[0961] 在一个实施方案中，本发明的药物组合物经胃肠外给予。
[0962] 本文使用的短语"胃肠外给予"和"经胃肠外给予"意指肠内和局部给药以外的给药方式，通常通过注射，和包括表皮、静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、腱内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、颅内、胸内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
[0963] 在一个实施方案中，药物组合物通过静脉内或皮下注射或输注给予。
[0964] 在优选的实施方案中，药物组合物经皮下给予。
[0965] 药学上可接受的载体包括任何和所有合适的溶剂、分散介质、包衣料、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂、抗氧化剂和吸收延迟剂等，其在生理上与本发明的人源化或嵌合抗体相容。
[0966] 可用于本发明的药物组合物的合适的水性和非水性载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇、葡萄糖、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，和其合适的混合物；植物油例如橄榄油、玉米油、花生油、棉籽油和芝麻油；羧甲基纤维素胶体溶液、黄蓍胶和可注射的有机酯例如油酸乙酯，和/或各种缓冲液。其它载体是制药领域众所周知的。
[0967] 药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉剂。对于药学活性物质，这样的介质和试剂的使用是本领域已知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，预期其在本发明的药物组合物中使用。当涉及“活性化合物”时，预期也涉及本发明的人源化或嵌合抗体。
[0968] 适当的流动性可例如，通过使用包衣材料，例如卵磷脂，在分散剂的情况下通过保持所需的粒度，和通过使用表面活性剂来保持。
[0969] 本发明的药物组合物还可包含药学上可接受的抗氧化剂，例如(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟基茴香醚(BHA)、丁羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
[0970] 本发明的药物组合物还可在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇，例如甘露醇、山梨醇、甘油或氯化钠。
[0971] 本发明的药物组合物还可包含适合于选择的给药途径的一种或多种助剂，例如防腐剂、湿润剂、乳化剂、分散剂、防腐剂或缓冲剂，其可提高药物组合物的半寿期或功效。本发明的人源化或嵌合抗体可与保护化合物免于快速释放的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微囊化递送系统。这样的载体可包括明胶、单硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、生物可降解的生物相容性聚合物例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和单独或与蜡一起的聚乳酸，或本领域众所周知的其它材料。用于制备这样的制剂的方法是本领域技术人员通常已知的(参见例如[78])。
[0972] 在一个实施方案中，本发明的人源化或嵌合抗体可经配制以确保适当的体内分布。用于胃肠外给予的药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉剂。对于药学活性物质，这样的介质和试剂的使用是本领域已知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，预期其在本发明的药物组合物中使用。其它活性或治疗化合物也可掺入组合物中。
[0973] 注射用的药物组合物在制备和贮存条件下通常必须是无菌的和稳定的。组合物可配制为溶液、微乳剂、脂质体或适合于高药物浓度的其它有序结构。载体可以是水性或非水性溶剂或分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，和其合适的混合物；植物油例如橄榄油，和可注射有机酯，例如油酸乙酯。合适的流动性可例如，通过使用包衣料例如卵磷脂，在分散剂的情况下通过保持所需的粒度和通过使用表面活性剂来保持。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇例如甘油、甘露醇、山梨醇或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶来产生。无菌注射溶液可通过将需要量的活性化合物与按需要例如上文列举的一种成分或成分的组合一起掺入合适溶剂中，接着无菌微量过滤来制备。一般而言，分散液通过将活性化合物掺入包含基础分散基质和需要的其它成分例如上文列举的那些的无菌溶媒来制备。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉剂的情况下，制备方法的实例是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其得到来自其之前无菌过滤溶液的活性成分加任何其它需要的成分的粉末。
[0974] 无菌注射溶液可通过将需要量的活性化合物与按需要上文列举的一种成分或成分的组合一起掺入合适的溶剂中，接着无菌微量过滤来制备。一般而言，分散液通过将活性化合物掺入包含基础分散介质和来自上文列举的那些的需要的其它成分的无菌溶媒中来制备。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉剂的情况下，制备方法的实例是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其得到来自其之前无菌过滤溶液的活性成分加任何其它需要的成分的粉末。
[0975] 治疗应用
[0976] 在另一方面，本发明涉及本文所述的任何方面或实施方案定义的本发明的人源化或嵌合抗体或药物组合物，其用作药物。
[0977] 在另一方面，本发明涉及本文所述的任何方面或实施方案定义的本发明的人源化或嵌合抗体或药物组合物，其用于治疗疾病。
[0978] 在本发明的一个实施方案中，双特异性抗体、组合物、药物组合物用于治疗疾病。
[0979] 在本发明的一个实施方案中，双特异性抗体、组合物、药物组合物用于治疗疾病，其中所述疾病是癌症、感染性疾病或自身免疫性疾病。
[0980] 本发明的人源化或嵌合抗体或药物组合物可用于治疗其中需要细胞毒性T细胞的效应器机制的任何癌症。例如，人源化或嵌合抗体可给予至例如体外或离体培养的细胞，或例如体内给予至人受试者，以治疗或预防病症例如癌症、炎性或自身免疫性病症。本文使用的术语“受试者”通常是对人源化或嵌合抗体或药物组合物有反应的人。受试者可例如包括具有病症的人患者，所述病症可通过调节靶功能或通过直接或间接导致杀死细胞来纠正或改善。
[0981] 在另一方面，本发明提供用于治疗或预防病症例如癌症的方法，其中T细胞的募集将有助于治疗或预防，所述方法包括给予治疗有效量的本发明的人源化或嵌合抗体或药物组合物至有需要的受试者。该方法通常包括给予受试者有效治疗或预防所述病症的量的人源化或嵌合抗体。
[0982] 在一个具体的方面，本发明涉及治疗癌症的方法，包括给予本文所述的任何方面和实施方案中定义的本发明的人源化或嵌合抗体或药物组合物至有需要的受试者。
[0983] 在另一方面，本发明涉及本文所述的任何方面或实施方案中定义的用途或方法，其中人源化或嵌合抗体是特异性结合CD3和癌症-特异性靶标或在癌症中过量表达或与癌症有关的靶标两者的双特异性抗体，所述靶标例如HER2、CD19、EpCAM、EGFR、CD66e(或CEA、CEACAM5)、CD33、EphA2或MCSP(或HMW-MAA)、CD20和其中疾病是癌症，例如乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、卵巢癌、胃癌、结肠直肠癌、食管癌和头和颈的鳞状细胞癌、宫颈癌、胰腺癌、睾丸癌、恶性黑素瘤、软组织癌症(例如滑膜肉瘤)、无痛或侵袭形式的B-细胞淋巴瘤、慢性淋巴性白血病或急性淋巴性白血病。
[0984] 人源化或嵌合抗体的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或病况，和可由本领域技术人员确定。
[0985] 本领域具有普通技能的医生可容易地确定和处方需要的有效量的药物组合物。例如，医生可以低于为实现理想的治疗效果而需要的水平开始药物组合物中使用的人源化或嵌合抗体的剂量，和逐渐增加剂量，直到实现理想的效果。一般而言，本发明的组合物的合适的剂量为根据特定的剂量方案有效产生治疗效果的最低剂量的人源化或嵌合抗体的量。这样的有效剂量一般取决于上文所述的因素。
[0986] 例如，治疗用途的"有效量"可通过其稳定疾病进展的能力来测量。化合物抑制癌症的能力可例如在预测在人肿瘤中的功效的动物模型系统中评价。或者，组合物的这种性质可通过技术人员已知的体外测定法检查人源化或嵌合抗体抑制细胞生长或诱导细胞毒性的能力来评价。治疗有效量的治疗化合物，即本发明的治疗人源化或嵌合抗体或药物组合物，可减少肿瘤大小，或以其它方式改善受试者的症状。本领域普通技术人员将能够根据例如受试者的大小、受试者的症状的严重性和特定组合物或选择的给药途径等因素确定这样的量。
[0987] 本发明的人源化或嵌合抗体的治疗有效量的示例性的非限制性范围是约0.001-30mg/kg，例如约0.001-20mg/kg，例如约0.001-10mg/kg，例如约0.001-5mg/kg，例如约
0.001-2mg/kg，例如约0.001-1mg/kg，例如约0.001,约0.01,约0.1,约1,约5,约8,约10,约
12,约15,约18mg/kg。
0.001-2mg/kg，例如约0.001-1mg/kg，例如约0.001,约0.01,约0.1,约1,约5,约8,约10,约
12,约15,约18mg/kg。
[0988] 给药可例如是静脉内、肌内、腹膜内或皮下的，和例如给予至靶标位点附近。
[0989] 上述治疗方法和用途中的剂量方案经调整以提供最佳需要的反应(例如，治疗反应)。例如，可给予单次推注，可随时间给予数次分开的剂量，或按治疗情况的紧急性所指示的，可按比例减少或增加剂量。
[0990] 在一个实施方案中，在治疗期间，例如在预定的时间点，监测治疗功效。
[0991] 如果需要，药物组合物的有效日剂量可在全天中以合适的时间间隔作为单独给予的两次、三次、四次、五次、六次或更多次的子剂量，任选地以单位剂量形式给予。在另一个实施方案中，人源化或嵌合抗体或药物组合物经长时间例如超过24小时通过缓慢连续输注给予，以使不需要的副作用最小化。
[0992] 尽管有可能单独给予本发明的人源化或嵌合抗体，但优选作为上文所述的药物组合物给予人源化或嵌合抗体。
[0993] 有效剂量的本发明的人源化或嵌合抗体也可使用一周一次、两周一次或三周一次的给药期给予。给药期可限制为例如，8周、12周或直到确定临床进展。或者，有效剂量的本发明的人源化或嵌合抗体可每隔一周、两周或三周给予。
[0994] 在一个实施方案中，人源化或嵌合抗体可通过输注，以通过mg/m2计算的每周一次剂量给予。这样的剂量可例如基于上文提供的mg/kg剂量，根据以下得到：剂量(mg/kg)x 70:1.8。这样的给药可重复例如1-8次，例如3-5次。给药可通过连续输注进行2-24小时的一段时间，例如2-12小时。在一个实施方案中，人源化或嵌合抗体可通过缓慢连续输注给予一段长的时间，例如超过24小时，以减少毒性副作用。
[0995] 在一个实施方案中，当一周一次给予时，人源化或嵌合抗体可以作为固定剂量计算的每周一次剂量给予至多8次，例如4-6次。这样的方案可按需要重复一次或多次，例如在6个月或12个月后。这样的固定剂量可例如基于上文提供的mg/kg剂量，体重估计为70kg。剂量可通过在给予后通过例如获取生物样品和使用靶向本发明的人源化或嵌合抗体的结合区的抗个体基因型抗体，测量在血液中本发明的人源化或嵌合抗体的量来确定或调整。
[0996] 在一个实施方案中，人源化或嵌合抗体可通过维持疗法给予，例如一周一次持续6个月或更多的一段时间。
[0997] 人源化或嵌合抗体也可预防性给予以减少发生癌症的风险，延迟癌症进展中的事件发生的开始，和/或当癌症减轻时减少复发风险。
[0998] 为容易给予和剂量的均匀性，胃肠外组合物可配制为剂量单位形式。本文使用的剂量单位形式是指适合作为待治疗的受试者的单一剂量的物理离散单位；每个单位包含经计算产生需要的治疗效果的预定量的活性化合物和需要的药用载体。本发明的剂量单位形式的规格通过以下方面来指示和直接取决于以下方面：(a)活性化合物的独特特征和欲实现的特定治疗效果，和(b)本领域中调配这样的活性化合物用于治疗个体的敏感性而固有的局限性。
[0999] 人源化或嵌合抗体也可预防性给予以减少发生癌症的风险，延迟癌症进展中的事件发生的开始，和/或当癌症缓解时减少复发风险。在其中难以定位由于其它生物因素而已知存在的肿瘤的患者中，这可能是特别有用的。
[1000] 诊断应用
[1001] 使用包含本文所述的人源化或嵌合抗体的组合物，本发明的人源化或嵌合抗体还可用于诊断目的。因此，本发明提供使用本文所述的人源化或嵌合抗体的诊断方法和组合物。这样的方法和组合物可用于纯粹的诊断目的，例如检测或鉴定疾病，以及用于监测治疗性治疗的进展，监测疾病进展，评价治疗后的状态，监测疾病的复发，评价发生疾病的风险等。
[1002] 在一个方面，本发明涉及诊断特征为涉及或积聚CD3-表达细胞的疾病的方法，包括给予本发明的人源化或嵌合抗体，本发明的组合物，或本发明的药物组合物至受试者，任选地其中所述人源化或嵌合抗体用可检测试剂标记。
[1003] 在一个方面，本发明的人源化或嵌合抗体离体使用，例如用于通过在获自患者的样品中检测靶标的水平或在其细胞表面上表达目的靶标的细胞的水平，诊断其中表达特定目的靶标且被人源化或嵌合抗体结合的细胞指示疾病或涉及发病机理的疾病。这可例如通过使测试的样品，任选地与对照样品一起，在允许抗体与靶标结合的条件下接触本发明的人源化或嵌合抗体来实现。然后可检测复合物形成(例如使用ELISA)。当使用对照样品连同测试样品时，在两种样品中分析人源化或嵌合抗体或抗体-靶标复合物的水平，和测试样品中统计学显著的更高水平的人源化或嵌合抗体或抗体-靶标复合物指示与对照样品相比，测试样品中更高水平的靶标。
[1004] 其中可使用本发明的人源化或嵌合抗体的常规免疫测定的实例包括而不限于ELISA、RIA、FACS分析、等离子体共振分析、色谱分析、组织免疫组织化学、蛋白质印迹和/或免疫沉淀。
[1005] 因此，在一个实施方案中，本发明涉及诊断特征为涉及或积聚CD3-表达细胞的疾病的方法，包括给予本文所述的任何方面或实施方案的抗体、双特异性抗体、组合物或药物组合物至受试者，任选地其中抗体用可检测标记进行标记。
[1006] 在一个实施方案中，本发明涉及用于检测样品中靶标或表达靶标的细胞的存在情况的方法，包括：
[1007] -使样品与本发明的人源化或嵌合抗体在允许人源化或嵌合抗体与样品中的靶标结合的条件下接触；和
[1008] -分析是否形成复合物。通常，样品是生物学样品。
[1009] 在一个实施方案中，样品是已知或疑似包含特定靶标和/或表达靶标的细胞的组织样品。例如，原位检测靶标表达可通过从患者移出组织学样本，和提供本发明的人源化或嵌合抗体至这样的样本来实现。人源化或嵌合抗体可通过施加或涂覆人源化或嵌合抗体至样本来提供，然后使用合适的工具对其进行检测。然后可能不仅检测靶标或表达靶标的细胞的存在情况，而且检测靶标或表达靶标的细胞在受检组织中的分布(例如，在评价癌细胞的扩散的情况下)。使用本发明，普通技术人员容易地理解，各种组织学方法中的任一种(例如染色程序)可被改良，以实现这样的原位检测。
[1010] 在上述测定法中，人源化或嵌合抗体可用可检测物质进行标记，以允许结合的抗体被检测。或者，结合的(第一)特异性人源化或嵌合抗体可通过用可检测物质进行标记和结合第一特异性人源化或嵌合抗体的抗体检测。此外，在上述测定法中，可使用包含本文所述的任何方面或实施方案的抗体或双特异性抗体的诊断组合物。因此，在一个方面，本发明涉及包含本文所述的任何方面或实施方案的抗体或双特异性抗体的诊断组合物。
[1011] 样品中的靶标水平还可使用用可检测物质标记的靶标标准物和未标记的靶标特异性的人源化或嵌合抗体，通过竞争免疫测定法进行评价。在该类型的测定法中，将生物样品、标记的靶标标准物和靶标特异性人源化或嵌合抗体组合，和测定与未标记的靶标特异性人源化或嵌合抗体结合的标记的靶标标准物的量。生物样品中靶标的量与结合至靶标特异性人源化或嵌合抗体的标记的靶标标准物的量成反比。
[1012] 用于体外诊断技术的靶标特异性人源化或嵌合抗体、第二抗体和/或靶标标准物的合适的标记包括而不限于各种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉抗生物素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹酰氯和藻红蛋白；发光材料的实例125 131 35 3
包括鲁米诺；和合适放射性材料的实例包括 I、 I、S和H。
包括鲁米诺；和合适放射性材料的实例包括 I、 I、S和H。
[1013] 在一个方面，本发明的靶标特异性人源化或嵌合抗体用于表达靶标的组织例如肿瘤的体内成像。对于体内方法，抗体片段例如(Fab’)2、Fab和Fab’片段，因为其快速分布动力学而是特别有利的。
[1014] 体内成像可通过任何合适的技术进行。例如，用99Tc、131I、111In或其它发射γ射线的同位素标记的靶标特异性人源化或嵌合抗体(例如抗体或片段)可用于在表达靶标的组织例如肿瘤中，用γ闪烁照相机(例如Elscint Apex 409ECT设备)，通常使用低能高分辨率准直仪或低能通用准直仪成像靶标特异性抗体积聚或分布。或者，用89Zr、76Br、18F或其它发射正电子的放射性核素标记可在肿瘤中使用正电子发射断层照相术(PET)，用于成像靶标特异性人源化或嵌合抗体或抗体片段分布。通过使用这样的技术获得的图像可用于评价在患者、哺乳动物或组织中的靶标的生物分布，例如在使用靶标作为癌症/肿瘤细胞的存在情况的生物标记物的情况下。该技术的变化可包括使用磁共振成像(MRI)以改进经γ照相机技术的成像。常规的免疫闪烁成像方法和原理描述于例如[79]、[80]和[81]。此外，这样的图像也可或备选地用作除去肿瘤的手术技术的基础。此外，这样的体内成像技术可在其中患者被鉴定为具有肿瘤(由于存在其它生物标记物、转移等)但肿瘤不能通过传统分析技术鉴定的情况下，允许鉴定和定位肿瘤。所有这些方法是本发明的特征。
[1015] 本发明提供的体内成像和其它诊断方法可特别用于检测人患者(例如，之前未诊断患有癌症的患者或处于癌症恢复/缓解期的患者)中的微小转移。
[1016] 在一个实施方案中，本发明提供体内成像方法，其中本发明的靶标特异性人源化或嵌合抗体与促进检测的不透射线的试剂缀合，缀合的人源化或嵌合抗体给予至宿主，例如通过注射至血流，和分析标记的人源化或嵌合抗体在宿主中的存在情况和位置。通过本文提供的该技术和任何其它诊断方法，本发明提供用于筛选在人患者或获自人患者的生物样品中疾病相关细胞的存在情况的方法和/或用于在靶标特异性ADC疗法之前评价靶标特异性人源化或嵌合抗体的分布的方法。
[1017] 对于诊断成像，放射性同位素可与靶标特异性人源化或嵌合抗体直接或通过使用中间官能团间接结合。有用的中间官能团包括螯合剂，例如乙二胺四乙酸和二亚乙基三胺五乙酸(参见例如[82])。
[1018] 除了放射性同位素和不透射线的试剂之外，诊断方法可使用与染料(例如与生物素-链霉抗生物素复合物)、造影剂、荧光化合物或分子和用于磁共振成像(MRI)的增强剂(例如顺磁离子)缀合的靶标特异性抗体进行(参见例如[83]，其描述了MRI技术和与MRI增强剂缀合的抗体的制备)。这样的诊断/检测试剂可选自用于MRI的试剂和荧光化合物。为了用放射性金属或顺磁离子加载靶标特异性人源化或嵌合抗体，可能有必要将其与具有长尾的试剂反应，多倍螯合基团与所述长尾连接以结合离子。这样的尾可以是聚合物例如聚赖氨酸、聚糖或具有侧挂基团的另一衍生化或衍生的链，螯合基团可与所述侧挂基团结合，例如已知用于该目的的卟啉、聚胺、冠醚、双硫代半卡巴腙、聚肟等基团。螯合剂可使用标准化学与靶标特异性人源化或嵌合抗体偶联。
[1019] 因此，本发明提供诊断性靶标特异性人源化或嵌合抗体，其中靶标特异性人源化或嵌合抗体与造影剂(例如用于磁共振成像、计算机断层照相术或超声对比增强剂)或放射性核素(其可以是例如γ-、β-、α-、Auger电子-或正电子-发射型同位素)缀合。
[1020] 在一个方面，本发明涉及包含本发明的抗体或双特异性抗体的诊断组合物。
[1021] 在进一步的方面，本发明涉及用于检测样品中靶标抗原或表达靶标的细胞的存在情况的试剂盒，包含：
[1022] -本发明的靶标特异性人源化或嵌合抗体；和
[1023] -试剂盒的使用说明书。
[1024] 因此，在一个方面，本发明提供用于检测样品中CD3抗原或表达CD3的细胞的存在情况的试剂盒，包括以下步骤：
[1025] a)使样品与本发明的抗体或双特异性抗体在允许在抗体或双特异性抗体和CD3之间形成复合物的条件下接触；和
[1026] b)分析是否形成复合物。
[1027] 在一个实施方案中，本发明提供用于诊断癌症的试剂盒，其包含包含靶标特异性人源化或嵌合抗体的容器，和用于检测靶标特异性人源化或嵌合抗体与靶标结合的一种或多种试剂。试剂可包括例如荧光标签、酶标签或其它可检测标签。试剂还可包括第二或第三抗体或用于酶反应的试剂，其中酶反应产生可被显现的产物。在一个实施方案中，本发明提供诊断试剂盒，其包含在合适的容器中的呈标记或未标记形式的本发明的一种或多种靶标特异性人源化或嵌合抗体、用于间接测定法孵育的试剂，和用于在这样的测定法中检测的底物或衍生试剂(取决于标签的性质)。还可包括对照试剂和使用说明书。
[1028] 还可提供与靶标特异性人源化或嵌合抗体、例如标记的靶标特异性抗体使用的诊断试剂盒，用于检测组织样品或宿主中靶标的存在情况。在这样的诊断试剂盒中以及在本文他处描述的治疗用途的试剂盒中，靶标特异性人源化或嵌合抗体通常可以冻干形式在容器中单独或与对靶细胞或肽有特异性的另外的抗体结合提供。通常，还可包括药学上可接受的载体(例如，惰性稀释剂)和/或其组分，例如Tris、磷酸盐或碳酸盐缓冲液、稳定剂、防腐剂、杀生物剂、惰性蛋白例如血清白蛋白等(通常在分开的容器中用于混合)和另外的试剂(也通常在分开的容器中)。在某些试剂盒中，还包括能够结合靶标特异性人源化或嵌合抗体的第二抗体，其通常存在于单独的容器中。第二抗体通常与标签缀合和以类似于本发明的靶标特异性人源化或嵌合抗体的方式配制。使用上文和本文他处描述的方法，靶标特异性人源化或嵌合抗体可用于定义癌症/肿瘤细胞的子集和表征这样的细胞和相关肿瘤组织。
[1029] 抗个体基因型抗体
[1030] 在进一步的方面，本发明涉及抗个体基因型抗体，其结合本文所述的本发明的人源化或嵌合抗体。
[1032] 抗个体基因型(Id)抗体是识别通常与抗体的抗原结合位点关联的独特的决定簇的抗体。抗-Id抗体可通过用对其制备了抗-Id的单克隆抗体免疫与CD3单克隆抗体的来源相同的物种和基因型的动物制备。免疫的动物通常可通过产生对这些个体基因型决定簇的抗体(抗-Id抗体)而识别和响应免疫抗体的个体基因型决定簇。这样的抗体描述于例如US 4,699,880。这样的抗体是本发明的另外特征。
[1033] 抗-Id抗体也可用作"免疫原"以在又一动物中诱导免疫反应，产生所谓的抗-抗-Id抗体。抗-抗-Id抗体可在表位上与诱导抗-Id抗体的原始单克隆抗体相同。因此，通过使用针对单克隆抗体的个体基因型决定簇的抗体，有可能鉴定表达相同特异性的抗体的其它克隆。通过任何合适的技术，例如本文他处关于本发明的CD3-特异性抗体描述的那些技术，抗-Id抗体可以改变(从而产生抗-Id抗体变体)和/或衍生。例如，单克隆抗-Id抗体可与载体例如匙孔 血蓝蛋白(KLH)偶联和用于免疫BALB/c小鼠。来自这些小鼠的血清通常包含抗-抗-Id抗体，其具有类似于(如果不相同)原始/亲代CD3抗体的结合性质。
[1034] 序列
[1035] 表1
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[1073]
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[1075]
[1076]
[1077]
[1078] CDR区根据IMGT定义注释。实施例
[1079] 实施例1–人源化CD3抗体和非-激活的抗体变体的产生
[1080] CD3抗体的人源化
[1081] 鼠CD3抗体(US 8,236,308，本文描述为IgG1-CD3)的人源化通过Antitope(Cambridge,UK)使用其改进形式的种系人源化(CDR-移植)技术(EP 0629240)进行。使用该技术，设计1个不同的VH链(SEQ ID NO:4)和2个不同的VL链(SEQ ID NO:8、10)。通过组合这些1个VH与2个VL链，产生2种不同的抗体。人源化变体在本文描述为huCD3。因此，本发明的包含VH和VL的人源化变体被描述为例如，IgG1-huCD3-H1L1，其意指所述特定变体具有IgG1同种型，是人源化CD3和包含称为“H1”和根据SEQ ID NO:4定义的VH氨基酸序列和称为“L1”和根据SEQ ID NO:8定义的VL氨基酸序列。因此，H1是指可变重链区VH1，L1是指可变轻链区VL1，等等。
[1082] 具体而言，变体IgG1-huCD3-H1L1(包含SEQ ID NO:4所示的VH1序列和SEQ ID NO:8所示的VL1序列的人源化CD3)、IgG1-huCD3-L1-T41K(包含SEQ ID NO:4所示的VH1序列和SEQ ID NO:10所示的VL序列的人源化CD3)。
[1083] b12抗体
[1084] 在一些实施例中，抗体b12，一种HIV-1gp120特异性抗体(Barbas,CF.J Mol Biol.1993Apr 5；230(3):812-23.)用作阴性对照，和被称为“IgG1-b12”。
[1085] 表达
[1086] 抗体作为IgG1,κ或IgG1,λ表达，带有或没有下文描述的非-激活的突变和具有CH3结构域中的突变，其通过下文描述的方法能够产生双特异性抗体。基本上按制造商所述，使用293fectin(Invitrogen,US)，将编码抗体的重链和轻链两者的质粒DNA混合物瞬时转染至Freestyle HEK293F细胞(Invitrogen,US)。
[1087] 抗体的纯化
[1088] 培养上清液通过加载到5mLMabSelect SuRe柱(GE Health Care)的0.2μm空端过滤器过滤和用0.1M柠檬酸钠-NaOH,pH 3洗脱。洗脱液立即用2M Tris-HCl,pH 9中和，和过夜透析至12.6mMNaH2PO4,140mM NaCl,pH 7.4(B.Braun)。或者，纯化后，将洗脱液加载至HiPrep脱盐柱和将抗体交换至12.6mM NaH2PO4,140mM NaCl,pH 7.4(B.Braun)缓冲液。在透析或缓冲液交换后，将样品经0.2μm空端过滤器无菌过滤。通过SDS-PAGE测定纯度，和通过280nm的吸光度测量浓度。纯化的抗体在2-8℃下贮存。
[1089] 实施例2：突变体文库的产生
[1090] 使用Quickchange诱变试剂盒(Stratagene，根据制造商的说明书)和HC(p33HGTE-huCD3-H1)和LC(p33L-huCD3-L1-T41K)表达质粒作为模板进行随机诱变产生点突变。HC质粒编码如WO2011110642中所述的单价UniBody-TE形式。每个选择的位置通过使用在所选位置含有NNS密码子的引物随机化(N＝G，A，T或C和S＝G或C)。突变体文库根据制造商的说明书转化至OneShotDH5α(Invitrogen)。
[1091] 集落挑选和LEE PCR
[1092] 对于每个突变位置，将96个克隆分别挑入50μL LEE(线性表达元件)PCR缓冲液(5μL 10x AccuPrime PCR缓冲液1,44.6μL水(B.Braun),0.1μL CMV P f(MAR5)和0.1μL TkpA r(MAR1)引物(100μM储液),0.2μL Accuprime Taq(Invitrogen)以从表达质粒扩增表达盒(启动子至多聚A)。LEE PCR通过将混合物孵育2’94℃,[30”94℃,30”55℃,5’68℃]35x,10’72℃进行，并储存在4℃直至进一步使用。
[1093] 使用Sanger测序(Beckman Coulter Genomics,UK)对96个集落的每个文库(12)进行测序。
[1094] 表2：用于LEE PCR的引物序列
[1095]
[1096] 实施例3：突变体文库的表达和IgG定量
[1097] 在每个突变体(总共12×96)中，1.11μL HC和1.11μL LC LEE PCR产物在2.78μL水中稀释。使用5μL DNA稀释液转染96孔板中的单个孔。
[1098] 每孔将0.4μL ExpiFectamineTM 293(Invitrogen,US)和4.6μLOpti-MEM(Gibco,US)混合并在室温下孵育5分钟。接下来，将Fectin/Opti-MEM混合物加入到5μL DNA稀释液中并在室温下孵育30分钟。最后，将8.3μL的Fectin/Opti-MEM/DNA混合物加入到117.5μL的Expi293FTM细胞中。在所有程序中，振荡装有Expi293FTM细胞的平板以保持细胞悬浮。转染后，将细胞在37℃/8％CO2下孵育5天。
[1099] 转染后5天，收集上清液。使用OctetRED(ForteBio,US)通过生物层干涉测量法测量上清液中的抗体浓度。
[1100] 实施例4：CD3/TCR-LC13筛选文库的产生
[1101] 用编码TCR的人α和β链(分别为SEQ ID NO:396和SEQ ID NO:397),人CD3δ(SEQ ID NO:398),人CD3ε(SEQ ID NO:399),人CD3γ(SEQ ID NO:400)和人CD3ζ(SEQ ID NO:401)的表达构建体共转染Freestyle 293-F细胞(Invitrogen,US)。这些序列中排除了信号肽序列。根据制造商的说明书(Invitrogen,US)进行转染。转染后一天，将细胞冷冻直至进一步使用。
[1102] 实施例5：亲和突变体的筛选
[1103] 均质测定(剂量反应)
[1104] 基于序列数据，选择突变体，其中序列痕迹显示高PHRED得分，表明不存在多重突变。对于每个突变，可用时选择多个冗余克隆。
[1105] 通过使用Fluorometric Micro volume Assay Technology(FMAT；Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)的均质抗原特异性结合测定来确定重组产生的UniBody分子在细胞培养物上清液中的结合。在测定试验中，在剂量反应中分析设计样品中的抗体或单价抗体分子与CD3/TCR-LC13(Freestyle 293-F细胞瞬时表达人CD3和人T细胞受体
(TCR)，如上所述产生)和Freestyle 293-F野生型细胞(不表达人TCR的阴性对照)的结合。
使用Octet仪器(Fortebio,Menlo Park,USA)测量剂量反应结合前样品标准化的IgG水平。
(TCR)，如上所述产生)和Freestyle 293-F野生型细胞(不表达人TCR的阴性对照)的结合。
使用Octet仪器(Fortebio,Menlo Park,USA)测量剂量反应结合前样品标准化的IgG水平。
[1106] 将稀释系列样品加入细胞中以允许与CD3结合。随后，使用荧光缀合物(山羊抗人IgG Fcγ-Alexa647；Jackson ImmunoResearch)检测单价抗体分子的结合。使用CD3特异性人源化小鼠抗体IgG1-HuM291-F405L(在Freestyle 293-F细胞中产生)和单价抗体UniTE-huCD3-H1L1-LT41K作为阳性对照，使用ChromPure HumanIgG全分子(Jackson ImmunoResearch)作为阴性对照。使用Applied Biosystems 8200细胞检测系统(8200CDS)扫描样品，并使用样品浓度范围内的总荧光作为读出。当计数高于50时，样品呈阳性，计数x荧光(总荧光)至少为阴性对照的3倍。
[1107] 热图
[1108] 从均质剂量反应筛选中，使用4参数S形模型拟合结合曲线。从拟合中，确定每个突变体的最大结合。对于每个突变体，计算平均最大结合，并描绘为如图1所示的平均最大值与wt结合之间的比率。
[1109] 比对
[1110] 将这些文库中产生的选择HC突变体进行比对并在图2中描绘。CDR区已经根据IMGT定义注释。序列的编号根据直接编号方案注释。
[1111] 实施例6：通过2-MEA诱导的Fab臂交换产生双特异性抗体
[1112] 根据本发明的双特异性抗体可以通过使用WO2011131746和WO2013060867(Genmab)中公开的方法产生。
[1113] 举例来说，可将位置F405L中的突变引入IgG1同种型的一个亲本抗体中，并且可将位置K409R中的突变引入IgG1同种型的另一亲本抗体中。
[1114] 可以在还原条件下在总体积为100μL Tris-EDTA(TE)中，将各自终浓度为0.5mg/mL(等摩尔浓度)的这两种亲本抗体与25mM 2-巯基乙胺-HCl(2-MEA)在37℃下孵育90分钟。根据制造商的方案，当通过使用离心柱(Microcon离心过滤器，30k，Millipore)除去还原剂
2-MEA时，停止还原反应。
2-MEA时，停止还原反应。
[1115] 双特异性抗体可以在0.2μm死端过滤器上过滤，可以测量双特异性抗体在280nm的吸光度(A280)以确定其最终浓度。
[1116] 实施例7：结合数据
[1117] 对于以下的所有结合测定，以不同形式测试了huCD3-H1L1的重链变体的选定组：
[1118] 表3：单价抗体-TE形式的huCD3-H1L1的选择的亲和变体
[1119]
[1120]
[1121] 以单价抗体-TE形式的CD3亲和突变体的Octet结合亲和力测定
[1122] 选定组的亲和VH变体(表3)的亲和力使用生物层干涉测量法在ForteBio Octet HTX上测定。向抗人Fc捕获(AHC)生物传感器(ForteBio，Portsmouth，UK；目录号18-5060)加载以单价抗体-TE形式(2μg/mL)的CD3亲和突变体600s，旨在加载响应为0.4nm。UniBody-TE形式的抗体用于特异性测量CD3亲和突变体和CD3ε27-GSKα配体之间的单价相互作用亲和力。基线(150s)后，测定CD3ε27-GSKα(100和1000nM)的结合(1000s)和解离(1000s)。CD3ε27-GSKα蛋白由融合到κLC(SEQ ID NO:402)的N端的人CD3ε肽(aa1-27)组成。为了计算，使用基于氨基酸序列的CD3ε27-GSKα的理论分子量，即27.1kDa。在1000rpm和30℃下摇动，同时进行实验。
[1123] 用ForteBio数据分析软件v8.1分析数据，使用1：1模型和全局完全拟合，结合时间为1000s，解离时间为200s。通过减去参考曲线(没有CD3ε27-GSKα的CD3亲和突变体)校正数据轨迹，将Y轴与基线的最后5s对齐，并且应用步间校正以及Savitzky-Golay滤波。
[1124] 表4：所选变体的平衡解离常数(KD)
[1125]
[1126]
[1127] nd＝未测定
[1128] 流式细胞术(FACS)中人源化CD3(UniTE-huCD3-H1L1-LT41K)的亲和变体的T细胞结合
[1129] 使用荧光激活细胞分选在FACSCanto 752(BD Biosciences)上测定人源化CD3(IgG1-huCD3-H1L1)抗体的纯化VH亲和变体的T细胞结合。从抗凝人供体血液样品的血沉棕黄层级分分离T细胞，并以1.8×10E6个细胞/mL重悬浮于PBS/0.1％BSA/0.02％叠氮化物中。将50μL T细胞悬液和50μL抗体稀释液在96孔板中在冰上合并，在4℃孵育30min并用PBS/0.1％BSA/0.02％叠氮化物洗涤两次。接下来，将50μL在PBS/0.1％BSA/0.02％叠氮化物中1/200稀释的二抗R-藻红蛋白(PE)缀合的山羊抗人IgG F(ab')2(109-116-098，
Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.，West Grove，PA)加入用于染色，将混合物在4℃孵育30分钟，随后用PBS/0.1％BSA/0.02％叠氮化物洗涤两次。将细胞重悬于120μL PBS/0.1％BSA/0.02％叠氮化物中，测量PE几何平均荧光强度。使用GraphPad Prism V5.04软件(GraphPad Software，San Diego，CA，USA)使用非线性回归(具有可变斜率的S形剂量-反应)分析结合曲线，并且从半最大结合的浓度推导出表观亲和力(KD)。图4显示了人源化CD3(UniTE-huCD3-H1L1-LT41K)的亲和变体的结合曲线，图5显示了人源化CD3(UniTE-
huCD3-H1L1-LT41K)的低亲和变体的结合曲线。
Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.，West Grove，PA)加入用于染色，将混合物在4℃孵育30分钟，随后用PBS/0.1％BSA/0.02％叠氮化物洗涤两次。将细胞重悬于120μL PBS/0.1％BSA/0.02％叠氮化物中，测量PE几何平均荧光强度。使用GraphPad Prism V5.04软件(GraphPad Software，San Diego，CA，USA)使用非线性回归(具有可变斜率的S形剂量-反应)分析结合曲线，并且从半最大结合的浓度推导出表观亲和力(KD)。图4显示了人源化CD3(UniTE-huCD3-H1L1-LT41K)的亲和变体的结合曲线，图5显示了人源化CD3(UniTE-
huCD3-H1L1-LT41K)的低亲和变体的结合曲线。
[1130] 表5：单价抗体-TE形式的CD3亲和突变体的结合数据的总结
[1131]
[1132]
[1133] 对于以下所有结合测定，测试了选定组的优选重链变体(参见表5)。
[1134] IgG1-huCD3-H1L1-FEAL亲和突变体的Octet结合亲和力测定IgG1-huCD3-H1L1-FEAL形式的选择的CD3亲和变体的亲和力在ForteBio Octet HTX(ForteBio，UK)上使用生物层干涉测量法测定(表6)。使用hIgG(1μg/mL)加载抗人Fc捕获生物传感器(cat：18-5060，ForteBio，UK)600s。在基线(200s)后，使用27.11μg/mL-0.04μg/mL(1000nM-1.4nM)的CD3E27-GSKa浓度范围和三倍稀释步骤(样品稀释剂，cat：18-5028，ForteBio，UK)，测定CD3E27-GSKa的缔合(1000s)和解离(2000s)。为了计算，使用基于氨基酸序列的CD3E27-GSKα的理论分子量，即27.11kDa。在1000rpm和30℃下摇动的同时进行实验。在至少两个独立实验中对每种抗体进行测试(表6)。
[1135] 使用1：1模型和全局完全拟合，1000s结合时间和100s解离时间，使用ForteBio数据分析软件v8.1分析数据。通过减去参考曲线(没有CD3E27-GSKα的抗体)校正数据轨迹，将Y轴与基线的最后10s对齐，并且应用步间校正以及Savitzky-Golay滤波。从分析中排除具有响应<0.05nm的数据迹线。
[1136] 表6
[1137]平均 SDEV SEM CV SDEV SEM CV SDEV SEM CV pKD n
(nM)
IgG1-huCD3-G105P-FEAL 5 2 1 45 4.7E+05 9.7E+04 5.6E+04 21 2.5E-03 1.0E-03 5.8E-04 40 8.3 3IgG1-huCD3-FEAL 15 6 3 37 2.7E+05 5.1E+04 2.9E+04 19 4.0E-03 1.6E-03 9.1E-04 39 7.8 3IgG1-huCD3-Y114V-FEAL 29 8 4 26 2.2E+05 3.3E+04 1.9E+04 15 6.3E-03 9.7E-04 5.6E-04 15 7.5 3IgG1-huCD3-T31P-FEAL 42 9 4 21 1.9E+05 3.8E+04 1.6E+04 20 7.8E-03 1.3E-03 5.3E-04 17 7.4 6IgG1-huCD3-Y114M-FEAL 42 14 8 33 2.6E+05 6.2E+04 3.6E+04 24 1.0E-02 1.5E-03 8.7E-04 15 7.4 3IgG1-huCD3-H101N-FEAL 45 13 7 29 4.8E+05 2.2E+05 1.2E+05 45 2.0E-02 3.1E-03 1.8E-03 16 7.3 3IgG1-huCD3-Y114R-FEAL 46 10 6 22 1.5E+05 4.1E+04 2.4E+04 27 6.8E-03 4.1E-04 2.4E-04 6 7.3 3IgG1-huCD3-S110A-FEAL 72 15 6 21 1.8E+05 2.5E+04 1.0E+04 14 1.3E-02 1.6E-03 6.4E-04 12 7.1 6IgG1-huCD3-N57E-FEAL 91 30 17 33 2.1E+05 2.8E+04 1.6E+04 13 1.9E-02 4.0E-03 2.3E-03 21 7.0 3IgG1-huCD3-T31M-FEAL 99 23 13 23 1.9E+05 2.5E+04 1.5E+04 14 1.8E-02 2.6E-03 1.5E-03 14 7.0 3IgG1-huCD3-Y32A-FEAL 105 31 22 29 2.2E+05 1.1E+05 7.5E+04 48 2.2E-02 4.4E-03 3.1E-03 20 7.0 2IgG1-huCD3-H101L-FEAL 107 39 23 37 2.7E+05 4.3E+04 2.5E+04 16 2.8E-02 7.5E-03 4.4E-03 27 7.0 3IgG1-huCD3-H101K-FEAL 120 94 55 79 2.2E+05 1.9E+05 1.1E+05 84 1.7E-02 9.8E-03 5.7E-03 58 6.9 3IgG1-huCD3-S110G-FEAL 153 120 70 79 3.8E+05 4.2E+05 2.4E+05 112 2.6E-02 8.3E-03 4.8E-03 32 6.8 3IgG1-huCD3-H101G-FEAL 683 169 97 25 3.0E+04 9.2E+03 5.3E+03 30 2.0E-02 8.5E-04 4.9E-04 4 6.2 3IgG1-huCD3-H101I-FEAL nd 0
IgG1-huCD3-H101F-FEAL nd 0
(nM)
IgG1-huCD3-G105P-FEAL 5 2 1 45 4.7E+05 9.7E+04 5.6E+04 21 2.5E-03 1.0E-03 5.8E-04 40 8.3 3IgG1-huCD3-FEAL 15 6 3 37 2.7E+05 5.1E+04 2.9E+04 19 4.0E-03 1.6E-03 9.1E-04 39 7.8 3IgG1-huCD3-Y114V-FEAL 29 8 4 26 2.2E+05 3.3E+04 1.9E+04 15 6.3E-03 9.7E-04 5.6E-04 15 7.5 3IgG1-huCD3-T31P-FEAL 42 9 4 21 1.9E+05 3.8E+04 1.6E+04 20 7.8E-03 1.3E-03 5.3E-04 17 7.4 6IgG1-huCD3-Y114M-FEAL 42 14 8 33 2.6E+05 6.2E+04 3.6E+04 24 1.0E-02 1.5E-03 8.7E-04 15 7.4 3IgG1-huCD3-H101N-FEAL 45 13 7 29 4.8E+05 2.2E+05 1.2E+05 45 2.0E-02 3.1E-03 1.8E-03 16 7.3 3IgG1-huCD3-Y114R-FEAL 46 10 6 22 1.5E+05 4.1E+04 2.4E+04 27 6.8E-03 4.1E-04 2.4E-04 6 7.3 3IgG1-huCD3-S110A-FEAL 72 15 6 21 1.8E+05 2.5E+04 1.0E+04 14 1.3E-02 1.6E-03 6.4E-04 12 7.1 6IgG1-huCD3-N57E-FEAL 91 30 17 33 2.1E+05 2.8E+04 1.6E+04 13 1.9E-02 4.0E-03 2.3E-03 21 7.0 3IgG1-huCD3-T31M-FEAL 99 23 13 23 1.9E+05 2.5E+04 1.5E+04 14 1.8E-02 2.6E-03 1.5E-03 14 7.0 3IgG1-huCD3-Y32A-FEAL 105 31 22 29 2.2E+05 1.1E+05 7.5E+04 48 2.2E-02 4.4E-03 3.1E-03 20 7.0 2IgG1-huCD3-H101L-FEAL 107 39 23 37 2.7E+05 4.3E+04 2.5E+04 16 2.8E-02 7.5E-03 4.4E-03 27 7.0 3IgG1-huCD3-H101K-FEAL 120 94 55 79 2.2E+05 1.9E+05 1.1E+05 84 1.7E-02 9.8E-03 5.7E-03 58 6.9 3IgG1-huCD3-S110G-FEAL 153 120 70 79 3.8E+05 4.2E+05 2.4E+05 112 2.6E-02 8.3E-03 4.8E-03 32 6.8 3IgG1-huCD3-H101G-FEAL 683 169 97 25 3.0E+04 9.2E+03 5.3E+03 30 2.0E-02 8.5E-04 4.9E-04 4 6.2 3IgG1-huCD3-H101I-FEAL nd 0
IgG1-huCD3-H101F-FEAL nd 0
[1138] IgG1-huCD3-H1L1-FEAL亲和突变体的T细胞结合亲和力测定
[1139] 通过使用RosetteSep人T细胞富集混合物(Cat：15021C.1，Stemcell Technologies，France)根据制造商的说明书分离来自供体血沉棕黄层(Sanquin，
Amsterdam，The Netherlands)的T细胞。简而言之，将50μL的T细胞分离混合物加入到1mL的血沉棕黄层中并在室温孵育20分钟。接下来，用PBS(cat：3623140，B.Braun，Germany)稀释血沉棕黄层(1∶3，v/v)并轻轻转移到装有15mL淋巴细胞分离培养基(cat：17-829E，Lonza，Switzerland)的50mL falcon管(cat：227261，Greinerbio-one，The Netherlands)中。不加制动，将管在室温在1200xg下离心20分钟。从密度培养基中收集T细胞，并用PBS洗涤两次。
Amsterdam，The Netherlands)的T细胞。简而言之，将50μL的T细胞分离混合物加入到1mL的血沉棕黄层中并在室温孵育20分钟。接下来，用PBS(cat：3623140，B.Braun，Germany)稀释血沉棕黄层(1∶3，v/v)并轻轻转移到装有15mL淋巴细胞分离培养基(cat：17-829E，Lonza，Switzerland)的50mL falcon管(cat：227261，Greinerbio-one，The Netherlands)中。不加制动，将管在室温在1200xg下离心20分钟。从密度培养基中收集T细胞，并用PBS洗涤两次。
[1140] 将2×10E6个T细胞/mL重悬于FACS缓冲液中并将50μL转移至圆底96孔板(cat：650101，Greinerbio-one，The Netherlands)。以5μg/mL开始，添加50μL以5倍稀释的抗体溶液，并在4℃孵育30min。将96孔板在4℃以300xg离心5分钟，弃去上清液。将细胞用冰冷的FACS缓冲液在冰上洗涤两次，并将1∶200稀释的二抗(抗IgGFcγ-PE(fab)＇2，cat：109-116-
098，Jackson Immuno Research，UK)加至100μL/孔并孵育30分钟并用FACS缓冲液洗涤两次。在FACS Canto上测量荧光强度，并通过FlowJo V10软件计算几何平均值。图由GraphPad(V6.04)制作。参见图5。
098，Jackson Immuno Research，UK)加至100μL/孔并孵育30分钟并用FACS缓冲液洗涤两次。在FACS Canto上测量荧光强度，并通过FlowJo V10软件计算几何平均值。图由GraphPad(V6.04)制作。参见图5。
[1141] 实施例9：CD3亲和突变体的体外细胞毒性筛选
[1142] CD3亲和突变体对实体肿瘤细胞系的细胞毒性(阿尔玛蓝测定法)
[1143] 通过使用RosetteSep人T细胞富集混合物(Cat：15021C.1，Stemcell Technologies，France)根据制造商的说明书分离来自供体血沉棕黄层(Sanquin，
Amsterdam，The Netherlands)的T细胞。将NCI-N87(25.000个细胞/孔)(图6A)，SKOV3(16.000个细胞/孔)(图6B)和MDA-MB-231(16.000个细胞/孔)(图6C)细胞接种到平底96孔板(cat：655180，Greiner-bio-one，The Netherlands)并在37℃下粘附3-5小时。以下列比例将T细胞添加到肿瘤细胞中：NCI-N87细胞：T细胞，1：3；SKOV3细胞：T细胞，1：4；MDA-MB-
231细胞：T细胞，1：8。随后以10倍稀释加入抗体溶液，并将平板在37℃下孵育2天。接下来，弃去上清液并用PBS将粘附的细胞洗涤两次。在含10％供体牛血清和铁(cat:10371-029,Life Technologies,The Netherlands)的RPMI-1640(cat:BE12-115F,Lonza,
Switzerland)培养基中制备的150μL 10％阿尔玛蓝(cat:DAL1100,Life Technologies,The Netherlands)溶液加入到孔中并在37℃孵育3-5小时。用Envision多标记板阅读器(PerkinElmer,US)测量吸光度。将星孢菌素(cat:S6942,Sigma-Aldrich,US)处理的细胞设定为100％杀死，将未处理的细胞设定为0％杀死。通过从所有组中减去星孢菌素处理的细胞计算活细胞，并将百分比对未处理组作图。图由GraphPad(V6.04)制作。参见图6。
Amsterdam，The Netherlands)的T细胞。将NCI-N87(25.000个细胞/孔)(图6A)，SKOV3(16.000个细胞/孔)(图6B)和MDA-MB-231(16.000个细胞/孔)(图6C)细胞接种到平底96孔板(cat：655180，Greiner-bio-one，The Netherlands)并在37℃下粘附3-5小时。以下列比例将T细胞添加到肿瘤细胞中：NCI-N87细胞：T细胞，1：3；SKOV3细胞：T细胞，1：4；MDA-MB-
231细胞：T细胞，1：8。随后以10倍稀释加入抗体溶液，并将平板在37℃下孵育2天。接下来，弃去上清液并用PBS将粘附的细胞洗涤两次。在含10％供体牛血清和铁(cat:10371-029,Life Technologies,The Netherlands)的RPMI-1640(cat:BE12-115F,Lonza,
Switzerland)培养基中制备的150μL 10％阿尔玛蓝(cat:DAL1100,Life Technologies,The Netherlands)溶液加入到孔中并在37℃孵育3-5小时。用Envision多标记板阅读器(PerkinElmer,US)测量吸光度。将星孢菌素(cat:S6942,Sigma-Aldrich,US)处理的细胞设定为100％杀死，将未处理的细胞设定为0％杀死。通过从所有组中减去星孢菌素处理的细胞计算活细胞，并将百分比对未处理组作图。图由GraphPad(V6.04)制作。参见图6。
[1144] CD3亲和突变体对血液细胞系的细胞毒性(铬释放测定)
[1145] 在37℃的振荡条件下，将5x10E6个Daudi细胞/mL在具有100μCi铬的完全培养基中孵育1h。接下来，将细胞在PBS中洗涤两次并重悬于5mL完全细胞培养基(含10％供体牛血清和铁的RPMI1640)。将5.000个Daudi细胞接种到圆底96孔板中。根据制造商的说明书，通过使用RosetteSep人T细胞富集混合物(Cat:15021C.1,Stemcell Technologies,France)分离来自供体血沉棕黄层(购自Sanquin,Amsterdam,The Netherlands)的T细胞。将T细胞以(肿瘤细胞：T细胞)1:10比率加入Daudi细胞中，接着加入两倍稀释的抗体溶液。将板在37℃孵育24h。24h后，将板以300xg离心3分钟，收集上清液并测量放射性。参见图7。
[1146] 表7
[1147]
[1148] 实施例10：在NOD-SCID小鼠的(人PBMC+NCI-N87细胞)共移植模型中CD3xHER2双特异性抗体的肿瘤效力
[1149] 几种CD3xHER2双特异性抗体的体内抗肿瘤功效在皮下NCI-N87共移植模型中评价(图8)。作为双特异性抗体的CD3臂，使用人源化WT CD3(huCD3-FEAL)和4种不同的CD3亲和变体(N57E，H101K，S110A，Y114M)。在所有情况下HER2-靶向臂是相同的(赫赛汀FEAR)[1150] BisG1-huCD3-FEALx1014-赫赛汀-FEAR
[1151] BisG1-huCD3-N57E-FEALx1014-赫赛汀-FEAR
[1152] BisG1-huCD3-H101K-FEALx1014-赫赛汀-FEAR
[1153] BisG1-huCD3-S110A-FEALx1014-赫赛汀-FEAR
[1154] BisG1-huCD3-Y114M-FEALx1014-赫赛汀-FEAR
[1155] 在此模型中，HLA-A-匹配的人未刺激PBMC，作为人T细胞的来源，与NCI-N87肿瘤细胞在两种不同的剂量水平(0.5和0.05mg/kg)下共接种。
[1156] 将小鼠分选到治疗组(每一治疗组n＝4)。在第0天，将在200μLPBS/0.1％BSA中含有HLA-A匹配的hPBMC(5x10E6，Sanquin)和NCI-N87(5x10E6)细胞的混合物皮下(s.c.)接种到每只雌性NOD-SCID小鼠(NOD.CB-17-Prkdcscid/J)，6-11周龄(Charles-River))的右腹侧。直接在肿瘤细胞注射之后，对于所有双特异性抗体，以两种不同浓度(0.5和0.05mg/kg)将5种不同CD3xHER2抗体进行单次静脉内给药(150μL)。每周至少测定两次肿瘤体积。根据卡尺(PLEXX)测量将肿瘤体积(mm3)计算为：0.52×(长度)×(宽度)2。
[1157] 将NCI-N87细胞(ATCC#CRL-5822,源自胃的胃癌)解冻，在补充有10％供体牛血清与铁(Gibco,目录号10371-029),青霉素/链霉素和0.45％葡萄糖(Sigma,G8769)、丙酮酸钠(Cambrex,BE13-115E)和0.075％碳酸氢钠(Cambrex,BE17-613E)的RPMI 1640(Lonza,BE12-115F)中培养。使细胞在CellSTACK培养室中生长并以对数期收获并通过台盼蓝排除计数。
[1158] 对于每项研究，从对于NCI-N87(HLA-A-01,23)的人HLA-A匹配的供体中，通过Ficoll密度离心从血沉棕黄层(Sanquin)分离hPBMC。分离的细胞在氮中冷冻并在使用前解冻。将所有细胞在PBS/0.1％BSA中洗涤，通过细胞过滤器过滤并重悬浮至PBS/0.1％BSA中
50 x 10E6个细胞/mL的浓度。
50 x 10E6个细胞/mL的浓度。
[1159] 结果显示在图8中。图6A-B显示治疗后随时间的平均肿瘤体积。图6C-D显示了在第44天的平均NCI-N87肿瘤体积的点图表示。在第44天(所有组仍保持完整的最后一天)对肿瘤体积的统计分析(Mann-Whitney)显示在0.05mg/kg剂量下，与对照(PBMC)相比，BisG1-huCD3-FEALx1014-赫赛汀-FEAR、BisG1-huCD3-S110A-FEALx1014-赫赛汀-FEAR和BisG1-huCD3-Y114M-FEALx1014-赫赛汀-FEAR的显著肿瘤生长抑制(p<0.05)，而BisG1-huCD3-N57E-FEALx1014-赫赛汀-FEAR和BisG1-huCD3-H101K-FEALx1014-赫赛汀-FEAR并非如此。
在0.5mg/kg剂量下，与PBS(PBMC)对照组相比，BisG1-huCD3-FEALx1014-赫赛汀-FEAR和所有CD3-臂亲和变体显示显著的肿瘤生长(p<0.05)抑制，BisG1-huCD3-H101K-FEALx1014-赫赛汀-FEAR除外。
在0.5mg/kg剂量下，与PBS(PBMC)对照组相比，BisG1-huCD3-FEALx1014-赫赛汀-FEAR和所有CD3-臂亲和变体显示显著的肿瘤生长(p<0.05)抑制，BisG1-huCD3-H101K-FEALx1014-赫赛汀-FEAR除外。
[1160] 在0.05和0.5mg/kg剂量下，BisG1-huCD3-FEALx1014-赫赛汀-FEAR、BisG1-huCD3-S110A-FEALx1014-赫赛汀-FEAR和BisG1-huCD3-Y114M-FEALx1014-赫赛汀-FEAR显著(p<0.05)降低NCI-N87肿瘤体积。BisG1-huCD3-N57E-FEALx1014-赫赛汀-FEAR仅在0.5mg/kg剂量下显著降低(p<0.05)NCI-N87肿瘤体积。在两种测试剂量下，BisG1-huCD3-H101K-
FEALx1014-赫赛汀-FEAR不影响NCI-N87肿瘤生长。
FEALx1014-赫赛汀-FEAR不影响NCI-N87肿瘤生长。
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