血管抑素受体β亚基人源化嵌合及人抗体、其制备及应用
阅读：1026发布：2020-05-21
专利汇可以提供血管抑素受体β亚基人源化嵌合及人抗体、其制备及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种血管抑素受体β亚基人源化 嵌合 抗体 ，为鼠抗人血管抑素受体β亚基单克隆抗体的 信号 肽区和可变区与人IgG1的恒定区嵌合获得。本发明还具体公开了该人源化嵌合抗体的制备方法及其在抗 肿瘤 上的应用。本发明的人源化嵌合抗体与鼠源的血管抑素受体β亚基单克隆抗体相比，免疫原性低， 副作用 小，在保持其抗血管抑素受体β亚基活性的同时，更适于体内应用。，下面是血管抑素受体β亚基人源化嵌合及人抗体、其制备及应用专利的具体信息内容。
1.一种血管抑素受体β亚基人源化嵌合抗体，其重链为鼠抗人血管抑素受体β亚基单克隆抗体的重链信号肽区、鼠抗人血管抑素受体β亚基单克隆抗体的重链可变区与人IgG1的重链恒定区嵌合获得，其轻链为鼠抗人血管抑素受体β亚基单克隆抗体的轻链信号肽区、鼠抗人血管抑素受体β亚基单克隆抗体的轻链可变区与人IgG1的轻链恒定区嵌合获得，所述人源化嵌合抗体的重链氨基酸序列为SEQ ID NO：7，轻链氨基酸序列为SEQ ID NO：9。
2.一种编码权利要求1所述血管抑素受体β亚基人源化嵌合抗体的多核苷酸序列，其同时含有编码权利要求1所述血管抑素受体β亚基人源化嵌合抗体的重链和编码权利要求1所述血管抑素受体β亚基人源化嵌合抗体的轻链的多核苷酸序列。
3.如权利要求2所述多核苷酸序列，其特征在于，所述编码血管抑素受体β亚基人源化嵌合抗体的重链和编码上述血管抑素受体β亚基人源化嵌合抗体的轻链的多核苷酸序列串联。
4.一种表达载体，其含有权利要求2或3所述多核苷酸序列。
5.一种宿主细胞，其被权利要求4所述载体转化。
6.权利要求1所述血管抑素受体β亚基人源化嵌合抗体的制备方法，包括下列步骤：
1)在适合表达血管抑素受体β亚基人源化嵌合抗体的条件下，培养如权利要求5所述宿主细胞；
2)从培养物中分离出具有血管抑素受体β亚基抗体活性的多肽。
7.权利要求1所述血管抑素受体β亚基人源化嵌合抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。
血管抑素受体β亚基人源化嵌合及人抗体、其制备及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及抗体，具体涉及血管抑素受体β亚基人源化嵌合及人抗体、其制备及应用。
背景技术
[0002] 血管抑素受体(Angiostatin Receptor F1FO-ATP合成酶)对肿瘤细胞中ATP合成起重要作用。在正常人体组织中，血管抑素受体主要在线粒体内膜上定位，但也有少量存在于内皮细胞的细胞膜上。相对而言，很多肿瘤细胞超量表达血管抑素受体，并大量定位于细胞膜上。因而肿瘤细胞膜上的血管抑素受体是一个潜在的抗肿瘤药物靶标。
[0003] 传统认为，血管抑素受体(ATP synthase)是仅存在于真核细胞线粒体内膜上的多亚单位复合酶分子，在氧化磷酸化的过程中，利用电子传递链酶复合体建立的质子动势合成ATP，是一个将ATP合成与水解(由F1亚单位介导)同质子转运装置的旋转(由F0亚单位介导)耦联的机械化学酶。该酶由脂溶性的、镶于线粒体内膜中的定位复合体F0和水溶性的、基质侧的合成复合体F1构成。F0由a、b、c、d、e、f、g、A6L、OSCP及偶联因子6等亚基构成，其中a、b、c为主要构成亚基。F1由亚基α、β、γ、δ、ε构成，其比例为3:3:1:1:1，其中α、β亚基成对存在，该酶的催化位点就位于β亚基。F0是质子通道，F1的正常功能是合成ATP，在缺乏质子梯度时F1具有水解ATP的非正常生理功能。F0的a亚基含有两个局部通道，质子若要跨膜，需经其中一个通道进入a亚基的中心，结合众多c亚基中的一个，并经c亚基的旋转被转移到a亚基的另一个通道。c亚基锚定于F1的γ亚基(转子的构成部分)，而a亚基通过b亚基(定子)锚定于α3β3六聚体。因此，F0上c亚基相对于a亚基的转动将带动F1上γ亚基相对于α3β3六聚体的转动，合成ATP。IF1(inhibitor of F1)是F1的内源性抑制因子，抑制其ATP水解活性。
[0004] 近年发现，ATP合成酶不仅存在于线粒体内膜，在内皮细胞和肿瘤细胞质膜表面也有表达。1995年，Mozer和Pizzo对血管抑素(环饼域1-3)在内皮细胞表面的结合位点进行了鉴定。通过对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)膜组分进行配体杂交，成功分离了与血管抑素结合的，大小约55kD的蛋白。通过对蛋白进行氨基末端测序、肽指纹图谱及免疫学分析表明，抗肿瘤血管新生药血管抑素在该细胞表面的受体为人血管抑素受体的α/β亚基(基因名分别为ATP5A1和ATP5B)。这一受体在细胞表面的存在通过流式细胞术和免疫荧光分析得到了证实。另外，血管抑素能与重组ATP5A1结合，抗ATP5A1的抗体能将血管抑素的抗细胞增殖效果抑制掉90％。综上所述，细胞表面的ATP5A1/ATP5B是血管抑素在内皮细胞表面的受体，血管抑素可能通过与ATP5A1/ATP5B亚基的结合，抑制内皮细胞的增殖和迁移，从而抑制血管新生。
[0005] 在Mozer的研究公开前，关于血管抑素受体在细胞膜表面定位的报道仅有一例，是定位于肿瘤细胞系A549的表面。在Mozer的研究公开后，血管抑素与细胞表面ATP合成酶的结合，又被其它的研究团体在不同的肿瘤细胞类型证实。在除内皮细胞外的许多其它类型细胞，包括肿瘤细胞、上皮细胞、成纤维细胞、肝细胞都发现了定位于细胞膜表面的血管抑素受体，这些类型的细胞都具有较强的增殖力，而在红细胞中未发现。这提示膜表达的人血管抑素受体可能具有促增殖作用，不仅是肿瘤的标志，还可能是癌变的促因，这对肿瘤的早期诊断和预后具有重大的意义。如果能成功验证膜表达的人血管抑素受体对肿瘤的促进作用，将使其肿瘤靶标的地位进一步巩固，并可针对其促增殖功能设计相应的药物进行抑制，以期特异高效地治疗肿瘤。
[0006] Chi等用纯化的E.coli F1-ATP合成酶免疫小鼠，得到21株单克隆抗体(mAb)，其中只有一株mAb是针对催化亚基ATP5B的，其余20株均是针对非催化亚基ATP5A1的，而只有针对β亚基的那株mAb具有抑制F1-ATP合成酶活性的作用。但是该mAb为鼠源性，在人体中极易产生人抗鼠抗体(HAMA)反应，使mAb用于治疗的研究受到限制。
[0007] 嵌合抗体是通过基因工程将鼠源单抗可变区和人抗体恒定区拼接的抗体，相对于其它人源化抗体的优点在于其技术路线简单；抗体完整性好，体内潴留期长。利妥昔单抗(rituximab)于1997年获得FDA批准，是全球第一个上市的抗肿瘤mAb药物，用于治疗CD20阳性的B淋巴细胞性非霍奇金淋巴瘤，该抗体就是一个嵌合抗体。第一个用于临床的嵌合抗体是阿来组单抗(alemtuzumab)，用于治疗非何杰金氏淋巴瘤和类风湿性关节炎。曲妥珠单抗(trastuzumab)于1998年获批，是一种可以抑制HER-2/neu阳性乳腺癌的mAb药物，该抗体是一个人源化抗体。吉妥单抗(gemtuzumab ozogamicin)于2000年获批，用于治疗CD33阳性的急性复发性髓性白血病，该抗体也是一个人源化抗体。近年来，先后获批用于治疗肿瘤的抗体药物还有90Y-ibritumomab、131I-tositumomab、cetuximab和bevacizumab等，其中嵌合或人源化的抗体所占的比例逐年提升，全人抗体已成为治疗类抗体在抗体类型上必然趋势。目前已有超过20种嵌合抗体已进入临床试验阶段，还有为数众多的嵌合或人源化抗体处于临床前研究中。
发明内容
[0008] 本发明的目的是提供血管抑素受体β亚基人源化嵌合抗体，其制备及应用。
[0009] 本发明一方面提供了一种血管抑素受体β亚基人源化嵌合抗体，其重链为鼠抗人血管抑素受体β亚基单克隆抗体的重链信号肽区、鼠抗人血管抑素受体β亚基单克隆抗体的重链可变区与人IgG1的重链恒定区嵌合获得，其轻链为鼠抗人血管抑素受体β亚基单克隆抗体的轻链信号肽区、鼠抗人血管抑素受体β亚基单克隆抗体的轻链可变区与人IgG1的轻链恒定区嵌合获得。
[0010] 上述鼠抗人血管抑素受体β亚基单克隆抗体的重链信号肽区的氨基酸序列为SEQ IDNO：4，鼠抗人血管抑素受体β亚基单克隆抗体的轻链信号肽区的氨基酸序列为SEQ IDNO：3。
[0011] 上述鼠抗人血管抑素受体β亚基单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO：1，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
[0012] 上述人IgG1的重链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO：5，轻链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO：6。
[0013] 较佳的，上述人源化嵌合抗体的重链氨基酸序列为SEQ ID NO：7，轻链氨基酸序列为SEQ ID NO：9。
[0014] 本发明第二方面，提供了一种多核苷酸序列，其编码上述血管抑素受体β亚基人源化嵌合抗体的轻链。
[0015] 较佳的，编码血管抑素受体β亚基人源化嵌合抗体的轻链的多核苷酸序列为SEQ IDNO：10。
[0016] 本发明第三方面，提供了一种表达载体，其含有编码上述血管抑素受体β亚基人源化嵌合抗体的轻链的多核苷酸序列。
[0017] 本发明第四方面，提供了一种宿主细胞，其被上述载体转化。
[0018] 本发明第五方面，提供了一种多核苷酸序列，其编码血管抑素受体β亚基人源化嵌合抗体的重链。较佳的，上述编码血管抑素受体β亚基人源化嵌合抗体的重链的多核苷酸序列为SEQ ID NO：8。
[0019] 本发明第六方面，提供了一种表达载体，其含有编码上述血管抑素受体β亚基人源化嵌合抗体的重链的多核苷酸序列。
[0020] 本发明第七方面，提供了一种宿主细胞，其被上述载体转化。
[0021] 本发明第八方面，提供了一种多核苷酸序列，其同时含有编码上述血管抑素受体β亚基人源化嵌合抗体的重链和编码上述血管抑素受体β亚基人源化嵌合抗体的轻链的多核苷酸序列。较佳的，上述编码血管抑素受体β亚基人源化嵌合抗体的重链和编码上述血管抑素受体β亚基人源化嵌合抗体的轻链的多核苷酸序列串联。较佳的，上述多核苷酸的序列为SEQ ID NO：11。
[0022] 本发明第九方面，提供了一种表达载体，其同时含有编码上述血管抑素受体β亚基人源化嵌合抗体的重链和编码上述血管抑素受体β亚基人源化嵌合抗体的轻链的多核苷酸序列。
[0023] 本发明第十方面，提供了一种宿主细胞，其被上述载体转化。
[0024] 本发明第十一方面，提供了血管抑素受体β亚基人源化嵌合抗体的制备方法，包括下列步骤：
[0025] 1.在适合表达血管抑素受体β亚基人源化嵌合抗体的条件下，培养上述宿主细胞；
[0026] 2.从培养物中分离出具有血管抑素受体β亚基抗体活性的多肽。
[0027] 本发明第十二方面，提供了血管抑素受体β亚基人源化嵌合抗体在制备治疗肿瘤药物中的应用。
[0029] 本发明中的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO，或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
[0030] 本发明通过选择β亚基构建表达克隆，表达纯化了β亚基蛋白，并以此为抗原获得了抗人血管抑素受体β亚基的单克隆抗体杂交瘤。在此基础上，采用嵌合抗体构建方法对其进行人源化基因工程改造，并在CHO-DG44细胞中实现人鼠嵌合抗体的表达。筛选后获得持续分泌抗人β亚基人鼠嵌合抗体的稳定转染细胞株，为靶向人β亚基的肿瘤免疫治疗提供了必要的前期物质基础。本发明的嵌合抗体亲和力高，且与鼠源的单克隆抗体相比具有更低的免疫原性。附图说明
[0031] 图1 ATP5B的克隆
[0032] 1-2：RT-PCR结果，1：β-actin，2：ATP5B；3-7：PCR检测ATP5B插入，4，5，7：包含插入片段的阳性克隆；8-11：酶切鉴定阳性克隆8：酶切前的质粒，9：SacI酶切，10：HindIII酶切，11：SacI和HindIII酶切，证实读框正确；12：DNA marker.
[0033] 图2 重组人ATP5B的表达，纯化及复性
[0034] 1：PageRulerTM预先染色的蛋白梯(prestained protein ladder)，2：未诱导的细胞裂解液，3：诱导后的细胞裂解液，4：细胞裂解液上清，5：包涵体，6：变性的包涵体，7：亲和纯化的rhATP5B，8：纯化并复性的rhATP5B.
[0035] 图3 Western blot鉴定表达的rhATP5B蛋白
[0036] 1：PageRulerTM预染色的蛋白梯(prestained protein ladder)，2：BL21(DE3)裂解液，3：诱导前的裂解液，4：诱导后的裂解液，5：包涵体；6：纯化的rhATP5B.[0037] 图4 mAb 7A8的Western blot分析
[0038] 1：HUVE细胞的总蛋白与制得的鼠mAb7A8反应；2：纯化的rhATP5B与商业化的鼠ATP5B mAb抗体反应作为阳性对照；3：HUVE细胞总蛋白与二抗直接反应，不加7A8作为阴性对照.
[0039] 图5 7A8的免疫荧光鉴定
[0040] A：HUVE细胞与DAPI反应，B：HUVE细胞与制得的鼠7A8 mAb及DAPI反应图6 mAb7A8的IHC分析
[0042] 图7 m10G Fab区的扩增
[0043] 1：DNA Marker，2：m7A8 IgG1重链的Fab区扩增带，3：用针对IgG2a设计的引物从m7A8 cDNA中扩增，4：用针对IgG3设计的引物从m7A8 cDNA中扩增，5：m7A8 IgG1 k链的Fab区扩增带.注意，此处针对IgG2a或IgG3的无扩增带
[0044] 图8 m7A8重、轻链可变区序列分析
[0045] A：重链可变区，B：轻链可变区，CDR用红线表示
[0046] 图9 m7A8前导肽区和人IgG1恒定区的扩增
[0047] 1：DNA Marker，2：人k链恒定区扩增带，3：人IgG1重链恒定区扩增带4：m7A8 k链前导序列扩增带，5：m7A8 IgG1重链前导序列扩增带
[0048] 图10 SOE-PCR拼接的c7A8嵌合重、轻链
[0049] 1：拼接的m7A8 kappa L-V区；2，4，9：DNA Marker；3：拼接的整条嵌合k链；5：m7A8IgG1重链前导序列；6：m7A8 IgG1重链可变区；7：m7A8 IgG1重链恒定区；8：拼接的整条嵌合IgG1重链
[0050] 图11 嵌合重、轻链的测序验证
[0051] A：c7A8嵌合重链，B：c7A8嵌合轻链，鼠可变区和人恒定区已标记
[0052] 图12：构建pCI-dhfr-LH-c7A8-L，
[0053] 图13：构建pSEC-c7A8-H，
[0054] 图14：构建pCI-dhfr-LH-c7A8.
具体实施方式
[0055] ATP5B是ATP合成酶的催化亚基，具有ATP的合成与水解活性。Chi等制备的一株识别ATP5B催化活性位点的单克隆抗体(mAb)3D5AB1，其内皮细胞血管分化抑制活性比血管抑素更强，故ATP5B可作抑制肿瘤血管新生的靶标。本发明用RT-PCR方法获得了ATP5B成熟肽的编码序列，将其克隆入携带His-tag的原核表达载体pET28a(+)中，并在E.coli BL21(DE3)中表达。在此基础上，对其表达产物进行纯化及复性。
[0056] 嵌合抗体可变区基因的克隆，参考Kabat数据库中的抗体序列，针对抗体可变区的保守区域设计若干套通用引物，采用RT-PCR法从杂交瘤细胞株的mRNA扩增可变区基因，5’端通用引物设计在第一骨架区或前导肽区；3’端通用引物设计在恒定区或J链区。
[0057] 嵌合抗体恒定区由抗体亚型决定，不同的亚型具有不同的免疫效应，故可根据需要的免疫效应选择不同的亚型恒定区进行扩增。IgG1适于介导抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)和补体依赖的细胞毒作用(CDC)，而IgG2和IgG4则适于激活或阻断某一受体。抗体的恒定区不仅能提供效应功能，还能通过于组织细胞表面的IgGFc受体FcγRn结合，免受蛋白酶类降解，在体内保持较长半衰期(20多天)。
[0058] 嵌合抗体的重轻链表达单位可串联于一个表达载体上，也可分别构建于两个载体上共转染，有文献报道，串联表达载体的转化子中产生抗体的克隆的比例，显著高于共转染表达载体。目前用于增加目的基因扩增的筛选标志主要有二氢叶酸还原酶(DHFR)和谷氨酰胺合成酶(GS)两种。而用于临床治疗用抗体表达的系统主要是CHO细胞系统，该系统能为嵌合抗体的恒定区提供有效的糖基化。
[0059] 下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：试验手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。
[0060] 实施例1 血管抑素受体β亚基人源化嵌合抗体的制备及检验
[0061] 1 材料
[0062] 1.1 质粒载体
[0063] 表1 实验中所用的质粒载体
[0064]
[0065] 1.2 宿主菌
[0066] 表2 实验中所用的宿主菌
[0067]
[0068] 1.3 细胞株
[0069] 表3 实验中所用的细胞株
[0070]
[0071]
[0072] 1.4 实验动物
[0073] 表4 实验动物
[0074]
[0075] 1.5 引物
[0076] 表5 实验中所用引物(上海捷瑞公司合成)
[0077]
[0078]
[0079] 1.6 主要试剂
[0080] 1)DNA标准分子量DGL2000(北京鼎国公司)
[0081] 2)凝胶回收纯化试剂盒(上海华舜公司)
[0082] 3)限制性内切酶，T4连接酶(NEB公司)
[0083] 4)去内毒素质粒小抽试剂盒(北京博大泰克公司)
[0084] 5)LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，固体培养基另加琼脂粉15g/L。
[0085] 6)Lipofectamine2000(Invitrogen公司)
[0086] 7)胎牛血清(Gibco BRL公司)
[0087] 8)10×磷酸盐缓冲液(PBS)：NaCl 40g/L，KCl1g/L，Na2HPO4 5.75g/L，KH2PO4 1g/L，调pH至7.4，ddH2O定容，121℃高压蒸汽灭菌20min备用。
[0088] 9)胰酶—EDTA消化液：胰酶2.5g/L，EDTA 0.2g/L，1×PBS定容，过滤除菌。
[0089] 10)RPMI-1640，F12，EX-CELL 302等细胞培养基，过滤除菌。
[0090] 11)TRIzol试剂(Invitrogen公司)
[0091] 12)SuperscriptIII反转录试剂盒(Invitrogen公司)
[0092] 13)Chelating Sepharose Fast Flow型填料(GE公司)
[0093] 14)10K MWCO型透析袋(Pierce公司)
[0094] 15)鼠抗人ATP5B mAb(BD Biosciences公司)
[0095] 16)HRP-羊抗鼠IgG，HRP-羊抗兔IgG(北京鼎国公司)
[0096] 17)荧光素-羊抗兔IgG(Invitrogen公司)
[0097] 18)SDS-PAGE胶配方：
[0098]
[0099] 19)5×Tris-Gly电泳缓冲液：Tris-Base 15.1g/L，Gly 94g/L，10％ SDS 50ml/L，ddH2O定容。
[0100] 20)2×SDS-PAGE上样缓冲液：0.5 M Tris-HCl 2.0ml，甘油2.0ml，20％(W/V)SDS2.0ml，0.1％(W/V)溴酚蓝0.5ml，β-巯基乙醇1.0ml，ddH2O定容至10ml。
[0102] 22)SDS-PAGE脱色液：甲醇45ml，冰乙酸10ml，ddH2O定容至100ml。
[0103] 23)超声缓冲液：Triton X-100 10g/L，PMSF 1mmol/L，pH 8.5，PBS定容。
[0104] 24)包涵体洗涤液：尿素2mol/L，ddH2O定容。
[0105] 25)包涵体溶解液：尿素8mol/L，ddH2O定容。
[0106] 26)rhATP5B复性缓冲液：100ml/L glycerol，pH 7.5，PBS定容。
[0107] 27)Western blot转膜缓冲液：Tris-Base 3g/L，Gly 14.4g/L，甲醇100ml/L，ddH2O定容。
[0108] 28)PBST洗涤缓冲液：Tween-20 0.5ml/L，PBS定容。
[0109] 29)脱脂牛奶封闭缓冲液：脱脂奶粉5g，Western blot洗涤缓冲液定容至100ml。
[0110] 1.7 实验仪器
[0111] 1)iCycler型PCR循环扩增仪器(Bio-Rad公司)
[0112] 2)5417R型台式高速冷冻离心机(Eppendorf公司)
[0113] 3)EPS-100型核酸电泳仪(上海天能公司)
[0114] 4)JS380-A型凝胶成像系统(上海培清公司)
[0115] 5)HZ-C型台式恒温振荡器(江苏太仓科教仪器厂)
[0116] 6)微量加样器：1000μl/200μl/20μl(Eppendorf公司)
[0117] 7)7700型实时荧光定量PCR仪器(ABI公司)
[0118] 8)HERAcell 150型CO2培养箱(Heraeus公司)
[0119] 9)CX41-32RFL型荧光显微镜(Olympus公司)
[0120] 10)VE-186型转移电泳槽(上海天能公司)
[0122] 1)NBCI：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blastN，blastP，blastX
[0123] 2)ExPASY：http://www.expasy.org
[0124] 3)ORF Finder：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/
[0125] 4)SMART：http://smart.embl-heidelberg.de/
[0126] 5)PSORT II：http://psort.nibb.ac.jp/psortII/
[0127] 6)VECTOR NTI Version10.0，DNAssist Version1.0等序列分析软件[0128] 7)Photoshop Version 6.0等图象处理软件
[0129] 1.9 缩略词
[0130]
[0131]
[0132] 2. ATP5B基因的原核表达、纯化与复性
[0133] 2.1 RT-PCR扩增ATP5B成熟肽编码序列
[0134] 分离人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)，分离方法见文献(刘秋英，张美英，罗新，etc.人脐静脉血管内皮细胞的体外培养及rhNDPK-A对其增殖的作用[J].中国卫生检验杂志，2005，(03)：257-261.)。
[0135] HUVEC的cDNA制备：
[0136] 用TRIzol试剂抽提细胞株MCF 7、MCF 7/Adr、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MCF 10F7
的总RNA，操作按TRIzol试剂说明书，简要的步骤如下：收集1×10 细胞，10000g离心
1min，吸弃上清。加入1ml TRIzol充分溶解细胞，室温静置5min后12000g离心10min，取上清。加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，室温静置3min，4℃下12000g离心15min，转移上清至新离心管中。加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min，4℃下12000g离心10min，弃上清，75％乙醇洗涤两次，空气干燥，加入50μl DEPC处理水溶解沉淀。
的总RNA，操作按TRIzol试剂说明书，简要的步骤如下：收集1×10 细胞，10000g离心
1min，吸弃上清。加入1ml TRIzol充分溶解细胞，室温静置5min后12000g离心10min，取上清。加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，室温静置3min，4℃下12000g离心15min，转移上清至新离心管中。加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min，4℃下12000g离心10min，弃上清，75％乙醇洗涤两次，空气干燥，加入50μl DEPC处理水溶解沉淀。
[0137] 对抽得RNA反转录，得这5株细胞的cDNA，操作按SuperscriptIII反转录试剂盒操作。
[0138] RT扩增体系如下：
[0139]
[0140] RT扩增条件为：50℃/1h→85℃/5min，所得产物cDNA冻于—20℃备用。
[0141] ATP5B成熟肽编码序列的PCR扩增体系与扩增条件：
[0142] PCR扩增体系如下：
[0143]
[0144]
[0145] PCR扩增条件为：94℃/2min→94℃/30sec→58℃/30sec→72℃/2min for 30 cycles→72℃/10min。
[0146] 将PCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶中电泳，凝胶回收试剂盒回收之，并与pMD19-T载体连接。
[0147] 连接体系如下：
[0148]
[0149] 连接条件：16℃连接过夜。
[0150] CaCl2法制备大肠杆菌E.coli Top10感受态细胞，简要的步骤如下：挑取E.coli Top10单菌落，接种于1ml LB培养基中，225rpm、37℃培养过夜。次日以1/100转接于5ml LB培养基，培养至OD600在0.4～0.6之间。以1mL/管分装于1.5mL离心管中，置于冰浴10min后，于4℃以4000g离心10min，弃上清。以500μl/管加入100mmol/L CaCl2重悬，冰浴30min。4℃以4000g离心10min，弃上清。加入100μl/管100mmol/L CaCl2重悬，冰浴备用，此感受态细菌即可用于转化。
[0151] 用连接产物转化之，简要的步骤如下：取适量连接产物DNA加入100μlTop10感受态细菌中，旋转混匀，冰浴30min后进行热休克。42℃水浴90s，冰浴2min，再加入0.8mlLB培养基，100rpm、37℃振荡培养45min。取适量菌液涂布于含100mg/L Amp的LB琼脂平板上37℃倒置培养过夜。
[0152] 用菌落PCR扩增法筛选阳性克隆，扩增β-actin作为阳性对照，测序。HUVEC细胞抽提RNA后电泳鉴定其抽提完整性，28s、18s和5s rRNA清晰可见，证明抽提的RNA完整性良好。以抽得RNA进行RT-PCR，扩增ATP5B序列，以扩增β-actin作为阳性对照。扩得ATP5B片段长1600bp，同预期大小相符；将该片段的测序结果与hATP5B的GenBank序列比较，所得序列正确无误。
[0153] 2.2 重组表达载体pET28a(+)-ATP5B的构建
[0154] 将载体pMD19-T-ATP5B和pET28a(+)用SacI/HindTII双切，胶回收目的片段，T4连接酶连接，所进行的是粘端定向克隆。
[0155] 定向克隆连接体系如下：
[0156]
[0157] 连接条件：16℃连接过夜。
[0158] 转化E.coli Top10，CaCl2法制备大肠杆菌E.coli Top10感受态细胞，具体步骤同上。
[0159] 用菌落PCR扩增法筛选阳性克隆，送测序。用DNAssist1.0软件对克隆的cDNA序列、依据开放阅读框(open reading frame，ORF)推测氨基酸序列。
[0160] 用含50mg/L Kan的LB琼脂平板过夜培养。菌落PCR及酶切鉴定转化子，阳性克隆并送上海英骏公司测序。测序正确的克隆抽提质粒并转化表达菌株大肠杆菌E.coli BL21(λDE3)感受态细菌。
[0161] 对克隆进行菌落PCR和酶切鉴定(图1)。测序结果显示，序列正确且插入载体后读码框未改变。
[0162] 2.3 rhATP5B亚基在BL21(λ DE3)中的诱导表达
[0163] 随机挑取若干转有重组质粒pET28a(+)-ATP5B的单个E.coli BL21(λ DE3)菌落，接种于2ml含50mg/L Kan的LB培养基中，225rpm、37℃振荡培养过夜。取1ml过夜培养物接种于100ml含50mg/L Kan的LB培养基中，225rpm、37℃振荡培养至OD600约0.8。加入IPTG至终浓度1mM，225rpm、37℃振荡培养4h。4℃下4000rpm离心10min，弃上清，收获细菌备用。
[0164] 2.4 包涵体的制备、纯化与复性
[0165] 向原菌液中加入1/2体积的超声缓冲液重悬菌体，按300W功率、间歇超声共15min的超声条件在冰浴下破碎细菌。超声后菌液在4℃下10000g离心15min，弃上清，加入包涵体洗涤液充分重悬包涵体，室温下洗涤2h，4℃下10000g离心15min，弃上清。洗涤后的包涵体沉淀可放置于—20℃备用。
[0166] 加入包涵体溶解液过夜，4℃下15000g离心30min，收上清。按GE公司说明书，用镍柱亲和层析法纯化rhATP5，取样SDS-PAGE。调整洗脱液浓度至300mg/L，装入透析袋，用20倍体积的复性缓冲液透析，4℃过夜，用镍柱浓缩后取样SDS-PAGE。灰度扫描上述SDS-PAGE凝胶，分析rhATP5B占菌体总蛋白的百分率及纯化、复性后的纯度。复性产物用Bradford法测定蛋白终浓度。
[0167] 用pET28a(+)-ATP5B转化感受态E.coli BL21(DE3)，诱导后在Mr约55 000处出现1浓染带，同预期大小相符(图2，泳道3)。灰度扫描显示，rhATP5B的表达量占菌体蛋白总量的36.8％，实现了高效表达。菌体裂解后上清与沉淀分别电泳，发现目的蛋白主要分布在裂解沉淀中，说明表达的rhATP5B蛋白主要以包涵体形式存在。包涵体蛋白经纯化，纯度达98.3％(图2，泳道7)。纯化蛋白经复性，纯度达99.2％(图2，泳道8)；Bradford法测其浓度为1.2g/L。rhATP5B经粗提、纯化、复性后的得率为19.5％(见表6)，说明此方法能够用于纯化、复性目的蛋白。
[0168] 表6 rhATP5B的纯化和复性
[0169]
[0170] rhATP5B蛋白的Western blot鉴定
[0171] 用鼠抗人ATP5B的mAb进行Western blot分析，鉴定rhATP5B蛋白。结果显示，诱导4h的pET28a(+)-ATP5B转化菌、超声裂解沉淀、纯化后的蛋白样品，在Mr约55000处均有一条带(图3，泳道4-6)，而在空菌E.coli BL21(λ DE3)和诱导前的pET28a(+)-ATP5B转化菌中没有条带出现(图3，泳道2、3)，这说明已成功表达和纯化了rhATP5B蛋白，纯化蛋白仍保持其免疫结合活性。
[0172] 2.5 抗ATP5B鼠单抗的制备与鉴定
[0173] 抗ATP5B杂交瘤的制备按常规方法进行，简要步骤如下：取小鼠免疫，初次免疫时将50μg rhATP5B抗原与等体积弗氏完全佐剂充分混合，背部皮下多点注射。每2周加强免疫1次，采用30μg rhATP5B抗原与等体积的弗氏不完全佐剂充分混合，皮下多点注射。每次加强免疫7天后尾静脉取血，用rhATP5B包被的间接ELISA测定血清抗体效价。待效
5
价达1：10 以上后，采用尾静脉直接注射30μg rhATP5B抗原的方式进行加强免疫，3天后取脾。
5
价达1：10 以上后，采用尾静脉直接注射30μg rhATP5B抗原的方式进行加强免疫，3天后取脾。
[0174] 将剪去脂肪、筋膜组织的脾通过200目的不锈钢网，收集细胞于试管中，静置2-3分钟，吸取上层分离良好的细胞于50ml离心管中并计数，按脾细胞数目1/10的量加入对数生长期的SP2/0细胞混匀，1000rpm离心5min，弃上清。于1min内加入1ml经37℃预温的50％ PEG4000。加完后搅拌30s，静置30s。再于2min内加入4.5ml无血清RPMI-1640培养液，1000rpm离心5min，弃上清。用含HAT的PPMI-1640完全培养液重悬细胞，稀释至6
2×10 细胞/ml，按0.1ml/孔接种于已铺有饲养细胞的96孔板中。
2×10 细胞/ml，按0.1ml/孔接种于已铺有饲养细胞的96孔板中。
[0175] 用rhATP5B包被的间接ELISA检测上清中的特异性抗体：
[0176] 将rhATP5B抗原以ELISA包被缓冲液稀释至10μg/ml，以100μl/孔的量在4℃下包被酶标板过夜。脱脂牛奶封闭缓冲液37℃封闭2h后拍干，加免疫血清作一抗，血清稀释度为1:1 000～1:1 000 000，以免疫前兔血清为阴性对照，反应1.5h后，用PBST洗涤缓冲液液洗5次，再加用PBST以1：5000稀释的羊抗兔IgG(H+L)-HRP酶标二抗孵育30min，PBST洗6次。加入100μl/孔的TMB底物，37℃显色30min，加100μl/孔的2M H2SO4终止反应，OD450读值，以试验孔比阴性对照孔OD450值≥2.1为阳性判定标准。
[0177] 阳性孔以3-4个细胞/孔的密度亚克隆，3-5轮亚克隆后所有孔的抗体效价相近时，扩大培养、冻存并制备腹水，腹水制备的简要步骤如下：BALB/c小鼠腹腔注射0.5ml无6
菌石蜡油，7天后注射4×10 细胞/ml的杂交瘤细胞0.5ml，观察腹水生长情况并抽取腹水。
腹水用Protein G亲和层析柱纯化。
菌石蜡油，7天后注射4×10 细胞/ml的杂交瘤细胞0.5ml，观察腹水生长情况并抽取腹水。
腹水用Protein G亲和层析柱纯化。
[0178] 分泌鼠抗的杂交瘤细胞即为5B mAb 7A8，所得鼠抗用Western blot，HUVEC免疫荧光染色和IHC鉴定均符合预期。
[0179] 1)Western blot：HUVEC裂解后进行SDS-PAGE，以纯化rhATP5B为阳性对照。湿法转移至PVDF膜上，转移后的PVDF膜于封闭液中封闭过夜，以制备单抗为一抗(1:1 000)，以HRP-羊抗兔IgG为二抗(1:5 000)进行孵育，DAB显色后观察结果。
[0180] 2)HUVEC间接免疫荧光染色：HUVEC用20g/L多聚甲醛固定，5g/L Triton X-100处理，10g/L BSA封闭。以制备单抗为一抗(含10g/L BSA的PBS稀释，1:100)，室温避光1h，含10g/L BSA的PBS洗3次，加荧光素-羊抗兔IgG为二抗，室温避光20min，含10g/L BSA的PBS洗3次。DAPI染核，封片，荧光显微镜观察、拍照。
[0181] 3)IHC鉴定：取出石蜡包埋的肝癌、肺癌病理组织切片，脱蜡至水，并灭活内源性过氧化酶，浸入0.01mol/L，pH6.0的柠檬酸溶液于98℃加热20min以热修复抗原，加10％正常山羊血清封闭20min，加制备单抗(1:100)37℃孵育1h，PBS洗片后加HRP-羊抗兔IgG(1:250)37℃孵育30min，PBS洗片后进行DAB显色，0.01mol/L PBS终止反应后，苏木精复染，脱水，封片，透明，镜检，拍照。
[0182] 鼠抗ATP5B mAb 7A8的鉴定结果：
[0183] Western blot显示，mAb 7A8在Mr约55000处与HUVEC中hATP5B有特异性反应(图4，泳道1)，同纯化rhATP5B的条带位置一致(图4，泳道2)。该单抗与HUVEC中其他蛋白无交叉反应(图4，泳道1)，表明单抗具有高特异性。mAb 7A8的HUVEC免疫荧光分析表明，单抗能识别HUVEC中的ATP5B(图5)，因此具有天然抗原的结合活性。免疫组化实验证明，mAb 7A8可与肺癌组织细胞胞膜和胞质中的ATP5B蛋白结合(图6)。
[0184] 2.6 抗ATP5B人鼠人源化嵌合抗体的构建及真核表达
[0185] 2.6.1 mAb 7A8可变区的扩增
[0186] mAb 7A8杂交瘤细胞株cDNA的制备，制备方法同2.1。抗体Fab区的PCR扩增体系同2.1。扩增引物为4组，分别为mouse IgG-5’/mouse IgG1-3’，mouse IgG-5’/mouseIgG2a-3’，mouse IgG-5’/mouse IgG3-3’，(LC1+LC2+LC3+LC4+LC5+LC6+LC7)/mousekappa-3’，延伸时间1min。PCR产物电泳回收，并克隆至载体pMD19-T测序。根据Fab区测序结果设计引物，扩增可变区，并克隆至载体pMD19-T测序。
[0187] mAb 7A8重链可变区氨基酸序列：(SEQ ID NO：1)
[0188] EVQLLESGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDAYMYWVRQRPEQGLEWIGRIDPANDNTKYDPKFQGRATITADT
[0189] SSNTAYLQLSSLTSEDTAVHYCARFYSVYAMDYWGQGTSVTVSS(118aa)
[0190] mAb 7A8轻链可变区氨基酸序列：(SEQ ID NO：2)
[0191] TQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVSYMHWFQQQPGTSPKLWVYTTSNLAFGVPARFSGSGPGTSYSLTISRME
[0192] AEDAATYYCQQRSSYPLTFGAGTKLEL(101aa)
[0193] 从m7A8杂交瘤细胞株中提取总RNA，采用0.8％琼脂糖凝胶电泳分析，18S RNA和28 SRNA大小正确，亮度比约1:2，条带清晰，说明所提总RNA比较完整。以Oligo d(T)18为引物合成cDNA第一链，并以此cDNA为模板，采用重链引物mouse IgG-5’/mouse IgG1-3’进行PCR，扩增出700bp左右大小的重链Fab区基因片段，采用轻链引物(LC1+LC2+LC3+LC4+LC5+LC6+LC7)/mouse kappa-3’进行PCR，扩增出700bp左右大小的轻链Fab区基因片段，与Fab基因片段的理论推导值一致(图7，泳道2，5)。引物对mouseIgG-5’/mouse IgG2a-3’，mouse IgG-5’/mouse IgG3-3’无扩增带，这在分子水平上验证了杂交瘤细胞株m7A8是分泌抗体亚型为IgG1的单克隆细胞株。
[0194] 2.6.2 mAb 7A8杂交瘤细胞信号肽区扩增
[0195] 根据对重、轻链Fab区序列分析结果设计引物，应用cRACE法扩增mAb 7A8杂交瘤细胞的信号肽区。PCR产物电泳回收，并克隆至载体pMD19-T测序，PCR产物经测序证实符合相应抗体编码基因特征。
[0196] mAb 7A8轻链信号肽氨基酸序列：(SEQ ID NO：3)
[0197] MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC(22aa)
[0198] mAb 7A8重链信号肽氨基酸序列：(SEQ ID NO：4)
[0199] MEFGLSWLFLVAILKGVQC(19aa)
[0200] 2.6.3 人IgG1重、轻链恒定区扩增
[0201] 人脾脏细胞的cDNA制备同2.1，人IgG1重、轻链恒定区基因进行PCR扩增，并克隆至载体pMD19-T测序。
[0202] 抽提人脾细胞总RNA，并对mRNA进行RT-PCR扩增人IgG1恒定区基因(图9)。PCR产物经测序证实符合相应抗体编码基因特征。
[0203] 人IgG1重链恒定区氨基酸序列：(SEQ ID NO：5)
[0204] ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS
[0205] SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE
[0206] DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ
[0207] VYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC
[0208] SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.(330aa)
[0209] 人IgG1轻链恒定区氨基酸序列：(SEQ ID NO：6)
[0210] TRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(108aa)
[0211] 2.6.4 拼接构建嵌合重链和嵌合轻链基因
[0212] 使用拼接PCR(SOE-PCR)将mAb7A8的信号肽区、可变区、人IgG1的重、轻链恒定区进行拼接获得嵌合重链和嵌合轻链基因。将两者的PCR产物电泳回收，并克隆至载体pMD19-T测序。
[0213] 根据基因测序结果，设计特异性引物，用SOE-PCR将m7A8的前导肽、可变区同人IgG1的恒定区进行拼接，得到嵌合重链和嵌合轻链基因。琼脂糖凝胶电泳显示，SOE-PCR能成功拼接嵌合基因，所得的嵌合重链和嵌合轻链基因大小分别约为1500bp和750bp(图10)，并测序验证正确(图11)。
[0214] 人源化嵌合抗体重链氨基酸序列为：(SEQ ID NO：7)
[0215] 氨基酸(467aa)
[0216] MEFGLSWLFLVAILKGVQCEVQLLESGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDAYMYWVRQRPEQGLEWIGRIDPANDNTK
[0217] YDPKFQGRATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVHYCARFYSVYAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS
[0218] GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKR
[0219] VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR
[0220] EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVK
[0221] GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
[0222] 人源化嵌合抗体重链多核苷酸序列为：(SEQ ID NO：8)
[0223] ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAGGTCCAACTGCTCGAGTCT
[0224] GGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACGCCTAT
[0225] ATGTACTGGGTGAGACAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGTAGGATTGATCCTGCGAATGATAATACTAAA
[0226] TATGACCCGAAGTTCCAGGGCAGGGCCACTATAACAGCTGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGC
[0227] CTGACATCTGAGGACACTGCCGTCCATTACTGTGCTAGGTTTTACTCCGTCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGA
[0228] ACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCT
[0229] GGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCC
[0230] CTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTG
[0231] CCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGA
[0232] GTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTC
[0233] TTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTG
[0234] AGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGG
[0235] GAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAG
[0236] TACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGA
[0237] GAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAA
[0238] GGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC
[0239] GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTC
[0240] TTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATG(
[0241] 1403bp)
[0242] 人源化嵌合抗体轻链氨基酸序列为：(SEQ ID NO：9)
[0243] MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVSYMHWFQQQPGTSPKLWVYTTSNLAFGVPAR
[0244] FSGSGPGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPLTFGAGTKLELTRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF
[0245] YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.
[0246] (231aa)
[0247] 人源化嵌合抗体轻链多核苷酸序列为：(SEQ ID NO：10)
[0248] ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTACTCTGGCTCCGAGGTGCCAGATGTACCCAGTCTCCA
[0249] GCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATAACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGCACTGG
[0250] TTCCAGCAGCAGCCAGGCACTTCTCCCAAACTCTGGGTTTATACCACATCCAACCTGGCTTTTGGAGTCCCTGCTCGC
[0251] TTCAGTGGCAGTGGACCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCCGAATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTAC
[0252] TGCCAGCAAAGGAGTAGTTACCCGCTCACTTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGACCCGTACGGTGGCTGCACCA
[0253] TCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTC
[0254] TATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAG
[0255] CAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTC
[0256] TACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
[0257] (696bp)
[0258] 2.6.5 人源化嵌合抗体的真核表达载体pCI-dhfr-LH-c7A8的构建
[0259] 用NheI和NotI分别酶切嵌合轻链的PCR纯化产物及表达载体pCI-dhfr-LH，电泳回收后，T4连接酶16℃连接2h。连接产物转化TOP10感受态细菌。重组质粒经PCR和酶切鉴定后，筛选出阳性克隆pCI-dhfr-LH-c7A8-L。
[0260] 用EcoRI和NotI分别酶切嵌合重链的PCR纯化产物及中间载体pSEC，电泳回收后，T4连接酶16℃连接2h。连接产物转化TOP10感受态细菌。重组质粒经PCR和酶切鉴定后，筛选出阳性克隆pSEC-c7A8-H。
[0261] 用MluI和NotI酶切pSEC-c7A8-H和pCI-dhfr-LH-c7A8-L，将携带重链和轻链的酶切片段用T4连接酶16℃连接6h。连接产物转化TOP10感受态细菌。重组质粒经PCR和酶切鉴定后，筛选出阳性克隆pCI-dhfr-LH-c7A8。
[0262] 将 嵌 合 轻 链 基 因 克 隆 入 真 核 表 达 载 体 pCI-dhfr-LH中 构 建pCI-dhfr-LH-c7A8-L(图12)，将 嵌合 重链基 因克 隆入中 间载 体pSEC中构 建pSEC-c7A8-H(图13)，从pSEC-c7A8-H酶切由SV40pA、Pcmv、c7A8-H构成的片段，插入轻链表达载体pCI-dhfr-LH-c7A8-L，构建成重、轻链表达单位串联的嵌合抗体真核表达载体pCI-dhfr-LH-c7A8(图14)。利用特异性引物进行PCR可分别从重组质粒中扩增出嵌合重、轻链基因，测序结果显示重组载体构建正确。以上结果表明，已成功构建了含人—鼠嵌合重、轻链基因的真核共表达载体pCI-dhfr-LH-c7A8。
[0263] 重、轻链表达单位串联的多核苷酸序列：(SEQ ID NO：11)
[0264] CGCGTTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATGCTTCGAGCAGACATGATAAGATACATTGATG[0265] AGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTG
[0266] TGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAA[0267] TTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGT[0268] AAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATCCGATAAGG
[0269] TCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCTATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCATATGACCGCCATGTTGGCATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTGCGATCGCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGAAGCTTTATTGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGCTGCAGTGACTCTCTTAAGGTAGCCTTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGTTCAATTACAGCTCTTAAGGCTAGAGTACTTAATACGACTCACTATAGGCTAGCCTCGAGAATTCACGCGTGGTACCTCTAGAGTCGAGCCCGGCGGCCGC(1406bp)[0270] 2.6.6 CHO-DG44细胞培养、转染与加压筛选
[0271] CHO-DG44细胞采用含10％ FBS、0.03mmol/L次黄嘌呤(H)、0.003mmol/L胸腺嘧啶脱氧核苷(T)、0.1mmol/L脯氨酸(Pro)、0.1mmol/L甘氨酸(Gly)、2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青链霉素的F12完全培养基在37℃、5％CO2培养，常规按1：4传代。
[0272] c7A8嵌合表达质粒的转染：
[0273] 1)质粒抽提。
[0274] 2)细胞瞬时转染：细胞转染按LipofectamineTM2000操作说明书进行，以6孔5
板中的1孔为例，简要步骤如下：向该孔接种4×10 细胞，37℃、5％CO2培养18h后换液
1次，12h后开始转染，贴壁细胞在转染时的理想汇合度为90-95％。将4μg质粒DNA和TM
10μlLipofectamine 2000分别用无抗生物、无血清的培养基稀释至250μl，温和混匀，室温静置15min形成脂质体复合物。用PBS洗涤细胞一次，并加入2mlF12作培养基，再滴入脂质体复合物，将板前后振荡，温和混匀。37℃、5％ CO2培养6h后更换5ml含10％FBS的F12完全培养基培养48-72h，之后用不含H、T、Gly的无血清培养基EX-CELL 302培养以筛+
选dhfr 表型的细胞克隆。
板中的1孔为例，简要步骤如下：向该孔接种4×10 细胞，37℃、5％CO2培养18h后换液
1次，12h后开始转染，贴壁细胞在转染时的理想汇合度为90-95％。将4μg质粒DNA和TM
10μlLipofectamine 2000分别用无抗生物、无血清的培养基稀释至250μl，温和混匀，室温静置15min形成脂质体复合物。用PBS洗涤细胞一次，并加入2mlF12作培养基，再滴入脂质体复合物，将板前后振荡，温和混匀。37℃、5％ CO2培养6h后更换5ml含10％FBS的F12完全培养基培养48-72h，之后用不含H、T、Gly的无血清培养基EX-CELL 302培养以筛+
选dhfr 表型的细胞克隆。
[0275] 将在EX-CELL 302中培养的细胞消化，计数，按1.5个细胞/孔接种于96孔培养板中进行亚克隆，采用羊抗人IgG(H+L)多抗包被的夹心ELISA筛选嵌合抗体高表达的克隆。挑选嵌合抗体表达最高的细胞克隆，按1:5传代后换含30nmol/L氨甲喋呤(MTX)的EX-CELL302选择培养基进行培养。待细胞适应了30nmol/L MTX后，如前所述继续进行亚克隆，筛选嵌合抗体表达最高的细胞克隆，按同样方法相继换含100nmol/L MTX、1μmol/L MTX的EX-CELL 302选择培养基进行培养，进行亚克隆，待96孔板细胞基本长满后，换液继续培养2d，取上清测定其嵌合抗体含量，以此法筛选嵌合抗体表达最高的细胞克隆。将细胞2
克隆移至25cm 培养瓶中扩大培养，待细胞长满后，换液继续培养4天，取上清测定其嵌合抗体含量，并以此次测得的抗体含量值为准，挑选嵌合抗体表达最高的细胞克隆。
克隆移至25cm 培养瓶中扩大培养，待细胞长满后，换液继续培养4天，取上清测定其嵌合抗体含量，并以此次测得的抗体含量值为准，挑选嵌合抗体表达最高的细胞克隆。
[0276] 本发明构建了抗ATP5B人鼠嵌合抗体基因c7A8，并在CHO-DG44细胞成功表达。表达产物保持了亲本鼠抗的抗原结合性，同时在恒定区以人源代替了鼠源，在分泌克隆上清中表达量为40ng/ml。
[0277] 2.6.7 ELISA检测c7A8的表达
[0278] 1)间接ELISA检测c7A8的抗原结合性和人源性，具体方法同2.5，每个样品都用羊抗人IgG(H+L)-HRP酶标二抗和羊抗鼠IgG(H+L)-HRP分别进行检测。
[0279] 2)双抗体夹心ELISA，方法同2.5，但以10μg/ml的羊抗人IgG(H+L)多抗包被酶标板过夜，以羊抗人IgG(H+L)-HRP酶标二抗。
[0280] 以rhATP5B包被酶标板进行间接ELISA实验，用羊抗人IgG(H+L)-HRP为二抗时，转染细胞克隆E1培养上清中的c7A8既可结合包被的rhATP5B，也可被羊抗人IgG(H+L)识别，呈现阳性反应。用羊抗鼠IgG(H+L)-HRP为二抗时，亲本m7A8呈阳性反应，而嵌合抗体c7A8呈阴性反应(结果见表7)。这证明c7A8含有人抗体的恒定区片段，并与m7A8一样可以结合rhATP5B。
[0281] 表7 间接ELISA检测转染细胞株嵌合抗体c7A8的抗原结合性和人源性A：羊抗人IgG(H+L)-HRP为二抗，B：羊抗鼠IgG(H+L)-HRP为二抗
[0282]
[0283] 采用双抗体夹心ELISA，以羊抗人IgG(H+L)多抗包被酶标板，用羊抗人IgG(H+L)-HRP为二抗，人IgG1作标准曲线，测得克隆E1培养上清中c7A8表达量为40.05ng/ml(结果见表8)。
[0284] 表8 双抗体夹心ELISA检测嵌合抗体c7A8的表达
[0285]
[0286]
[0288] <110>苏州工业园区晨健抗体组药物开发有限公司
[0289] <120>血管抑素受体β亚基人源化嵌合及人抗体、其制备及应用
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[0292] <170>PatentIn version3.1
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[0382] <223>重、轻链表达单位串联的多核苷酸序列
[0383] <400>11
[0384]
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