淋巴细胞系肿瘤的治疗剂
阅读：1023发布：2020-09-01
专利汇可以提供淋巴细胞系肿瘤的治疗剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且能与具有序列号1所示 氨 基酸序列的 蛋白质 特异结合的，而且具有细胞杀伤活性的 抗体 为有效成分的淋巴细胞系 肿瘤 (骨髓瘤除外) 治疗 剂。，下面是淋巴细胞系肿瘤的治疗剂专利的具体信息内容。
1.一种治疗剂作为制备除骨髓瘤外的淋巴细胞系肿瘤药的应用，所述治 疗剂含有以能与具有序列号1所示氨基酸序列的蛋白质特异结合的，而 且具有细胞杀伤活性的抗体为有效成分。
2.权利要求1记载的应用，其中淋巴细胞系肿瘤是T细胞肿瘤。
3.权利要求1记载的应用，其中淋巴细胞系肿瘤是除骨髓瘤外的B细胞 肿瘤。
4.权利要求1记载的应用，其中的抗体是单克隆抗体。
5.权利要求1记载的应用，其中的细胞杀伤活性是ADCC活性。
6.权利要求1记载的应用，其中的细胞杀伤活性是CDC活性。
7.权利要求4记载的应用，其中的抗体具有人抗体恒定区Cγ。
8.权利要求7记载的应用，其中的人抗体恒定区Cγ是Cγ1或Cγ3。
9.权利要求4记载的应用，其中的抗体是抗HM1.24抗体。
10.权利要求4记载的应用，其中的抗体是嵌合抗体或类人化抗体。
11.权利要求9记载的应用，其中的抗体是嵌合抗HM1.24抗体。
12.权利要求9记载的应用，其中的抗体是类人化抗HM1.24抗体。
13.权利要求1记载的应用，其中的抗体是与抗HM1.24抗体识别的抗原 决定部位特异结合的抗体。
技术领域
本发明涉及以能特异结合自淋巴细胞系肿瘤显示出的蛋白质的抗体 为有效成分的淋巴细胞系肿瘤(骨髓瘤除外)治疗剂。本发明还涉及T 细胞肿瘤或B细胞肿瘤(骨髓瘤除外)治疗剂。另外本发明也涉及能特 异结合淋巴细胞系肿瘤显示出的蛋白质，具有细胞杀伤活性的抗体。
背景技术
淋巴细胞系细胞是生物体内主要担当免疫任务的细胞。淋巴细胞系细 胞都来自同一血液干细胞，在骨髓中或其它器官中受到各种各样的分化 诱导因子或增殖因子的作用反复分化后，释放到外周血液。根据分化的 不同，淋巴细胞系细胞又大致分为T细胞和B细胞。一般认为B细胞具 有产生抗体的能力，而T细胞具有抗原提示能力、细胞杀伤能力以及其 它各种各样的能力。但在分化阶段中由于某些原因使得细胞肿瘤化，在 骨髓中、淋巴组织中、外周血液等部位已经异常增殖的细胞就是淋巴细 胞系肿瘤。
由于近年来新技术的引入，特别是随着利用对细胞表面的分化抗原的 单克隆抗体技术的进步，淋巴细胞系细胞的由来以及分化阶段的鉴定都 成为可能。随之而来，有关淋巴细胞系肿瘤其肿瘤细胞的由来不只是T 细胞、B细胞的由来，甚至连成熟度的鉴定也成为可能。
淋巴细胞系肿瘤根据其肿瘤细胞的起源或成熟度大致分为B细胞肿瘤 和T细胞肿瘤。B细胞肿瘤按照肿瘤细胞成熟度又分为急性B淋巴性白血 病(B-ALL)、慢性B淋巴白血病(B-CLL)、pre-B淋巴肿瘤、Burkitt 淋巴肿瘤、滤胞性淋巴肿瘤、滤胞外套淋巴肿瘤、弥漫性淋巴肿瘤等。 而T细胞肿瘤根据其肿瘤细胞成熟度的不同分为急性T淋巴性白血病(T -ALL)、慢性T淋巴白血病(T-CLL)、成人T细胞白血病(ATL)、非ATL 外周性T淋巴肿瘤(PNTL)等(《图解临床[癌]系列》No.17白血病·淋 巴肿瘤、杉村隆等、MEDICAL VIEW社、1987，《B细胞肿瘤》、高月清、 西村书店、1991)。
尽管近年来的医疗技术有了进步，然而不得不说有关淋巴细胞系肿瘤 的治疗还不充分。例如，急性淋巴白血病(ALL)的治愈率在20％以下。 而淋巴肿瘤治疗，如B淋巴瘤治疗虽说是由于多剂并用疗法的进步，治 愈率比较高，但进行期中的治愈率是50％左右。T淋巴瘤是更难治的肿 瘤，治愈率大约为30％，至于成人T细胞白血病(ATL)治愈率还不到 10％，这就是目前治疗的现状。
Goto，T.等人报告(《血液》(Blood)(1994)84，1922-1930)，将人 骨髓瘤细胞免疫小鼠获得了单克隆抗体(抗HM1.24抗体)。如果给予移 植了人骨髓瘤细胞小鼠抗HM1.24抗体，该抗体特异地聚集在肿瘤组织(小 阪昌明等、《日本临床》(1995)(53，627-635)，因此，这表明抗HM1.24 抗体应用于通过放射性同位素诊断肿瘤部位以及放射免疫疗法等导弹疗 法是有可能的。然而还不清楚抗HM1.24抗体对于其它淋巴细胞系肿瘤的 治疗是否有用。
由于近年来新技术的引入，特别是随着利用对细胞表面的分化抗原的 单克隆抗体技术的进步，淋巴细胞系细胞的由来以及分化阶段的鉴定都 成为可能。随之而来，有关淋巴细胞系肿瘤其肿瘤细胞的由来不只是T 细胞、B细胞的由来，甚至连成熟度的鉴定也成为可能。
淋巴细胞系肿瘤根据其肿瘤细胞的起源或成熟度大致分为B细胞肿瘤 和T细胞肿瘤。B细胞肿瘤按照肿瘤细胞成熟度又分为急性B淋巴性白血 病(B-ALL)、慢性B淋巴白血病(B-CLL)、pre-B淋巴肿瘤、Burkitt 淋巴肿瘤、滤胞性淋巴肿瘤、滤胞外套淋巴肿瘤、弥漫性淋巴肿瘤等。 而T细胞肿瘤根据其肿瘤细胞成熟度的不同分为急性T淋巴性白血病(T -ALL)、慢性T淋巴白血病(T-CLL)、成人T细胞白血病(ATL)、非ATL 外周性T淋巴肿瘤(PNTL)等(《图解临床[癌]系列》No.17白血病·淋 巴肿瘤、杉村隆等、MEDICAL VIEW社、1987，《B细胞肿瘤》、高月清、 西村书店、1991)。
尽管近年来的医疗技术有了进步，然而不得不说有关淋巴细胞系肿瘤 的治疗还不充分。例如，急性淋巴白血病(ALL)的治愈率在20％以下。 而淋巴肿瘤治疗，如B淋巴瘤治疗虽说是由于多剂并用疗法的进步，治 愈率比较高，但进行期中的治愈率是50％左右。T淋巴瘤是更难治的肿 瘤，治愈率大约为30％，至于成人T细胞白血病(ATL)治愈率还不到 10％，这就是目前治疗的现状。
Goto，T.等人报告(《血液》(Blood)(1994)84，1922-1930)，将人 骨髓瘤细胞免疫小鼠获得了单克隆抗体(抗HM1.24抗体)。如果给予移 植了人骨髓瘤细胞小鼠抗HM1.24抗体，该抗体特异地聚集在肿瘤组织(小 阪昌明等、《日本临床》(1995)(53，627-635)，因此，这表明抗HM1.24 抗体应用于通过放射性同位素诊断肿瘤部位以及放射免疫疗法等导弹疗 法是有可能的。然而还不清楚抗HM1.24抗体对于其它淋巴细胞系肿瘤的 治疗是否有用。
发明内容
现在进行的淋巴细胞系肿瘤的治疗中有各种化学疗法、X射线疗法、 骨髓移植等，上述疗法中的任何一种疗法都还不完全，所以期待着能使 淋巴细胞系肿瘤缓解、使患者生存期间延长的划时代的治疗剂或治疗方 法。
因此本发明的目的在于提供对淋巴细胞系肿瘤(骨髓瘤除外)的新的 治疗剂。
本发明人为了提供这样的治疗剂，反复使用抗HM1.24抗体(Goto，T. 等人《血》(Blood)(1994)84，1922-1930)，进行FCM(流式细胞测量 法)解析、ADCC活性、CDC活性那样的细胞杀伤活性的测定等体外研究， 以及体内的抗肿瘤效果的研究，还进一步进行了抗HM1.24抗体特异结合 的抗原蛋白质分离的研究，通过这些结果发现抗HM1.24抗体识别的抗原 蛋白质出现在淋巴细胞系肿瘤上，以及抗HM1.24抗体对淋巴细胞系肿瘤 具有抗肿瘤效果，从而完成本发明。
即，本发明提供含有能与具有序列号1所示氨基酸序列的蛋白质特异 结合，而且具有细胞杀伤活性的抗体为有效成分的淋巴细胞系肿瘤(骨 髓瘤除外)治疗剂。
本发明提供含有能与具有序列号1所示氨基酸序列的蛋白质特异结 合，而且具有细胞杀伤活性的抗体为有效成分的T细胞肿瘤治疗剂，或B 细胞肿瘤(骨髓瘤除外)治疗剂。
本发明提供含有能与具有序列号1所示氨基酸序列的蛋白质特异结 合，而且具有细胞杀伤活性的单克隆抗体为有效成分的T细胞肿瘤治疗 剂，以及B细胞肿瘤(骨髓瘤除外)治疗剂。
本发明提供含有能与具有序列号1所示氨基酸序列的蛋白质特异结 合，而且具有作为细胞杀伤活性的ADCC活性或CDC活性的抗体为有效成 分的T细胞肿瘤治疗剂，以及B细胞肿瘤(骨髓瘤除外)治疗剂。
本发明提供含有能与具有序列号1所示氨基酸序列的蛋白质特异结 合，而且具有细胞杀伤活性，作为恒定区域的人抗体的Cγ抗体为有效成 分的T细胞肿瘤治疗剂，以及B细胞肿瘤(骨髓瘤除外)治疗剂。
本发明提供含有能与具有序列号1所示氨基酸序列的蛋白质特异结 合，而且具有细胞杀伤活性的嵌合体抗体或类人化抗体为有效成分的T 细胞肿瘤治疗剂，以及B细胞肿瘤(骨髓瘤除外)治疗剂。
本发明提供以与抗HM1.24抗体识别的抗原决定部位特异结合的抗体为 有效成分的T细胞肿瘤治疗剂，以及B细胞肿瘤(骨髓瘤除外)治疗剂。
本发明提供以抗HM1.24抗体作为有效成分的T细胞肿瘤治疗剂，以及 B细胞肿瘤(骨髓瘤除外)治疗剂。
另外本发明还涉及能特异结合淋巴细胞系肿瘤表达的蛋白质的，具有 细胞杀伤活性的抗体。
附图的简单说明
图1表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图2表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图3表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图4表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图5表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图6表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图7表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图8表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图9表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图10表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的T细胞株进行FCM解析时的直方图。
图11表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的T细胞株进行FCM解析时的直方图。
图12表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的T细胞株进行FCM解析时的直方图。
图13表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的T细胞株进行FCM解析时的直方图。
图14表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的T细胞株进行FCM解析时的直方图。
图15表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的T细胞株进行FCM解析时的直方图。
图16表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的T细胞株进行FCM解析时的直方图。
图17表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的T细胞株进行FCM解析时的直方图。
图18表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的T细胞株进行FCM解析时的直方图。
图19表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的T细胞株进行FCM解析时的直方图。
图20表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的非T非B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图21表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的非T非B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图22表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的非T非B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图23表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的非T非B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图24是表示抗HM1.24抗体对作为T细胞肿瘤株的CCRF-CEM，CCRF -HSB-2以及HPB-MLT，引起的细胞杀伤与抗体浓度依赖性关系图。
图25是表示抗HM1.24抗体对作为B细胞肿瘤株的EB-3，MC116以 及CCRF-SB，引起的细胞杀伤与抗体浓度依赖性关系图。
图26是表示人淋巴细胞系肿瘤移植小鼠中，抗HM1.24抗体给予群与 对照小鼠IgG2a给予群相比，其肿瘤体积的增加被抑制的图。
图27是表示人淋巴细胞系肿瘤移植小鼠中，抗HM1.24抗体给予群与 对照小鼠IgG2a给予群相比，其生存期间延长的图。
因此本发明的目的在于提供对淋巴细胞系肿瘤(骨髓瘤除外)的新的 治疗剂。
本发明人为了提供这样的治疗剂，反复使用抗HM1.24抗体(Goto，T. 等人《血》(Blood)(1994)84，1922-1930)，进行FCM(流式细胞测量 法)解析、ADCC活性、CDC活性那样的细胞杀伤活性的测定等体外研究， 以及体内的抗肿瘤效果的研究，还进一步进行了抗HM1.24抗体特异结合 的抗原蛋白质分离的研究，通过这些结果发现抗HM1.24抗体识别的抗原 蛋白质出现在淋巴细胞系肿瘤上，以及抗HM1.24抗体对淋巴细胞系肿瘤 具有抗肿瘤效果，从而完成本发明。
即，本发明提供含有能与具有序列号1所示氨基酸序列的蛋白质特异 结合，而且具有细胞杀伤活性的抗体为有效成分的淋巴细胞系肿瘤(骨 髓瘤除外)治疗剂。
本发明提供含有能与具有序列号1所示氨基酸序列的蛋白质特异结 合，而且具有细胞杀伤活性的抗体为有效成分的T细胞肿瘤治疗剂，或B 细胞肿瘤(骨髓瘤除外)治疗剂。
本发明提供含有能与具有序列号1所示氨基酸序列的蛋白质特异结 合，而且具有细胞杀伤活性的单克隆抗体为有效成分的T细胞肿瘤治疗 剂，以及B细胞肿瘤(骨髓瘤除外)治疗剂。
本发明提供含有能与具有序列号1所示氨基酸序列的蛋白质特异结 合，而且具有作为细胞杀伤活性的ADCC活性或CDC活性的抗体为有效成 分的T细胞肿瘤治疗剂，以及B细胞肿瘤(骨髓瘤除外)治疗剂。
本发明提供含有能与具有序列号1所示氨基酸序列的蛋白质特异结 合，而且具有细胞杀伤活性，作为恒定区域的人抗体的Cγ抗体为有效成 分的T细胞肿瘤治疗剂，以及B细胞肿瘤(骨髓瘤除外)治疗剂。
本发明提供含有能与具有序列号1所示氨基酸序列的蛋白质特异结 合，而且具有细胞杀伤活性的嵌合体抗体或类人化抗体为有效成分的T 细胞肿瘤治疗剂，以及B细胞肿瘤(骨髓瘤除外)治疗剂。
本发明提供以与抗HM1.24抗体识别的抗原决定部位特异结合的抗体为 有效成分的T细胞肿瘤治疗剂，以及B细胞肿瘤(骨髓瘤除外)治疗剂。
本发明提供以抗HM1.24抗体作为有效成分的T细胞肿瘤治疗剂，以及 B细胞肿瘤(骨髓瘤除外)治疗剂。
另外本发明还涉及能特异结合淋巴细胞系肿瘤表达的蛋白质的，具有 细胞杀伤活性的抗体。
附图的简单说明
图1表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图2表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图3表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图4表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图5表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图6表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图7表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图8表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图9表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图10表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的T细胞株进行FCM解析时的直方图。
图11表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的T细胞株进行FCM解析时的直方图。
图12表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的T细胞株进行FCM解析时的直方图。
图13表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的T细胞株进行FCM解析时的直方图。
图14表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的T细胞株进行FCM解析时的直方图。
图15表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的T细胞株进行FCM解析时的直方图。
图16表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的T细胞株进行FCM解析时的直方图。
图17表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的T细胞株进行FCM解析时的直方图。
图18表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的T细胞株进行FCM解析时的直方图。
图19表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的T细胞株进行FCM解析时的直方图。
图20表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的非T非B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图21表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的非T非B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图22表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的非T非B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图23表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示 的非T非B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图24是表示抗HM1.24抗体对作为T细胞肿瘤株的CCRF-CEM，CCRF -HSB-2以及HPB-MLT，引起的细胞杀伤与抗体浓度依赖性关系图。
图25是表示抗HM1.24抗体对作为B细胞肿瘤株的EB-3，MC116以 及CCRF-SB，引起的细胞杀伤与抗体浓度依赖性关系图。
图26是表示人淋巴细胞系肿瘤移植小鼠中，抗HM1.24抗体给予群与 对照小鼠IgG2a给予群相比，其肿瘤体积的增加被抑制的图。
图27是表示人淋巴细胞系肿瘤移植小鼠中，抗HM1.24抗体给予群与 对照小鼠IgG2a给予群相比，其生存期间延长的图。
具体实施方式
1.抗体的制备
1-1.杂交瘤的制备
产生本发明中使用的产生抗体的杂交瘤基本上是利用众所周知的技 术，可以按以下方法制备。即，使用显示出HM1.24抗原蛋白质或HM1.24 抗原的细胞作为致敏抗原，按照通常的免疫方法进行免疫，使用通常的 细胞融合方法将得到的免疫细胞与众所周知的亲本细胞融合，利用通常 的筛选方法筛选产生单克隆抗体的细胞，就可以制备杂交瘤。
具体来说，为了制备单克隆抗体可以按如下方法进行。例如，作为能 获得抗体的致敏抗原的HM1.24抗原显示细胞可以使用人多发性骨髓瘤细 胞株KPMM2(特开平7-236475)或KPC-32(Goto，T.等，《日本临床血 液学杂志》(Jpn.J.Clin.Hematol.(1991)32，1400)。作为致敏抗原还 可以使用具有序列号1所示氨基酸序列的蛋白质，或含有抗HM1.24抗体 识别的抗原决定部位的肽或多肽。
另外，作为致敏抗原使用的，具有序列号1所示的氨基酸序列的蛋白 质的cDNA被插入到pUC19载体的Xbal切点之间，制备成质粒pRS38- pUC19。含有这个pRS38-pUC19质粒的大肠杆菌(E.coli)于平成5年 (1993年)10月5日以Escherichia coli DH5α(pRS38-pUC19)保藏 号为FERM BP-4434，按照布达佩斯条约保藏于工业技术院生命工学工业 技术研究所(参照特开平7-196694)。利用包含在pRS38-pUC19质粒中 的cDNA片段通过基因工程手法可以制备含有抗HM1.24抗体识别抗原决 定部位的肽或多肽。
作为可用致敏抗原免疫的哺乳动物虽然没有特别地限定，但最好是在 考虑与细胞融合使用的亲本细胞的适合性后，进行选择。一般来说是使 用啮齿类动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠等。
在用致敏抗原免疫动物时，按照众所周知的方法进行。例如，作为一 般的方法是将致敏抗原注射到哺乳动物的腹腔内或皮下。具体来说，将 致敏抗原用PBS(磷酸盐缓冲盐水Phosphate-Buffered Saline)或生理 盐水适当地稀释，根据需要将悬浊的上述稀释液与常用的佐剂，例如弗 罗因德完全佐剂进行适量混合，乳化后，最好是每隔4-21天对哺乳动 物进行免疫数次。致敏抗原免疫时可以使用适当的载体。
在进行这样免疫，确认血清中所需要的抗体水平上升后，从哺乳动物 中取得免疫细胞，进行细胞融合。用于细胞融合的免疫细胞最好是脾细 胞。
作为与上述免疫细胞融合的另外的亲本细胞的哺乳动物的骨髓瘤细胞 已经知道的各种各样的细胞株都适用，例如，P3X63Ag8.653(《免疫学杂 志》(J.Immnol.)(1979)123：1548-1550)，P3X63Ag8U.1(《当代微生 物学和免疫学论题》(Current Topics in Microbiology and Immunology) (1978)81：1-7)，NS-1(Kohler.G.和Milstein，C.《欧洲免疫学杂 志》(Eur.J.Immunol.)(1976)6：511-519)，MPC-11(Margulies.D.H. 等，《细胞》(Cell)(1976)8：405-415)，SP2/0(Shulman，M.等，《自 然》(Nature)(1978)276：269-270)，FO(de St.Groth，S.F.等，《免 疫学方法杂志》(J.Immunol.Methods)(1980)35：1-21)，S194 (Trowbridge，I.S.《实验医学杂志》J.Exp.Med.(1978)148：313-323)， R210(Galfre，G.等，自然(Nature)(1979)277：131-133)。
上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的融合基本上是按照众所周知的方法进 行，例如可以按照Milstein等人的方法(Kohler.G.和Milstein，C.，《酶 学方法》(Methods Enzymol.)(1981)73：3-46)进行。
更具体来说，上述细胞融合，例如可以在细胞融合促进剂存在下于常 用的营养培养液中实施。作为融合促进剂，例如可以使用聚乙二醇(PEG)、 仙台病毒(HVJ)等，根据需要为了提高融合效率也可以添加二甲基亚砜 等辅助试剂。
免疫细胞与骨髓瘤的使用比例，例如，免疫细胞最好是骨髓瘤细胞的 1-10倍。作为上述细胞融合使用的培养液，例如可以使用适合于上述骨 髓瘤细胞株增殖的RPMI1640培养液、MEM培养液、此外可以使用该种细 胞培养中使用的常用培养液，也可以与胎牛血清(FCS)等血清补液并用。
细胞融合是将上述免疫细胞与骨髓瘤细胞于上述培养液中充分混合， 然后添加事先升温到37℃左右的PEG溶液，例如平均分子量1000-6000 左右的PEG溶液，通常浓度为30-60％(W/V)，通过混合就可形成所需 要的融合细胞(杂交瘤)。然后，通过反复进行逐次添加适当的培养液， 离心除去上清的操作可以除去对杂交瘤的增殖不利的细胞融合剂。
该杂交瘤通过在常用的选择培养液，例如HAT培养液(含有次黄嘌呤、 氨基蝶呤和胸腺嘧啶脱氧核苷的培养液)中培养进行选择。当在HAT培 养液中培养时，为了使除了目的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死掉 的充分时间通常是持续数日～数周。然后实施极限稀释法，进行产生目 的抗体的杂交瘤的筛选和单克隆化。
另外除了用抗原免疫人以外的动物得到上述杂交瘤以外，也可以在体 外用HM1.24抗原或HM1.24抗原显示细胞使人淋巴细胞致敏，致敏的淋 巴细胞再与人骨髓瘤细胞，例如U266融合，也可以得到具有与HM1.24 抗原或HM1.24抗原显示细胞结合活性的所希望的人抗体(参照特公平1 -59878)。另外将成为抗原的HM1.24抗原或HM1.24抗原显示细胞注入 具有人抗体基因全部指令的转基因动物，按照上述方法获得所希望的抗 体也是可以的(国际专利申请公开号WO 93/12227，WO 93/03918，WO 94/02602，WO 94/25585，WO 96/34096，WO 96/33735)。
这样制备的产生单克隆抗体的杂交瘤可以在常用的培养液中进行继代 培养，也可以在液氮中长期保存。
要从该杂交瘤中获得单克隆抗体，可以采用对该杂交瘤按通常的方法 进行培养，获取其培养上清的方法，或采用将杂交瘤注入适合杂交瘤增 殖的哺乳动物中使其增殖，获得其腹水的方法。前者方法适合于获得高 纯度的抗体，后者适用于抗体的大量生产。
具体来说，产生抗HM1.24抗体的杂交瘤的制备可以按照Goto，T.等人 的方法(《血液》(Blood)(1994)84，1922-1930)进行。可以采用平 成7年9月14日以FERM BP-5233按照布达佩斯条约保藏于工业技术院 生命工学工业技术研究所的产生抗HM1.24抗体的杂交瘤注入BALB/c小 鼠(日本クレア制)的腹腔内，得到腹水，从该腹水可以纯化抗HM1.24 抗体的方法，或者是利用将该杂交瘤在适当的培养基，例如含有10％胎 牛血清、5％BM-Condimed H1(Boehringer Mannheim制)的RPMI 1640 培养基、杂交瘤SFM培养基(GIBCO-BRL制)、PFHM-II培养基(GIBCO -BRL制)等培养，从培养上清中纯化抗HM1.24抗体的方法。
1-2.重组型抗体
在本发明中作为单克隆抗体可以从杂交瘤中克隆抗体基因，然后重组 到适当的载体中，再导入宿主，利用基因重组技术生产的重组型抗体。(例 如，参见Carl，A.K.Borrebaeck，James，W.Larrick，《治疗单克隆抗 体》(THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES)，MACMILLAN PUBLISHERS LTD 出版，英国1990)。
具体来说，从产生目的抗体的杂交瘤中分离编码抗体可变区(V)的 mRNA。mRNA的分离可以按照众所周知的方法，例如梯度超离心法 (Chirgwin，J.M.等人，《生物化学》(Biochemistry)(1979)18，5294 -5299)、AGPC法(Chomczynski，P.等人，《分析生物化学》(Analytical Biochemistry)，(1987)162，156-159)，制备总mRNA，使用mRNA纯 化试剂盒(Pharmacia制)等制备mRNA。另外通过使用QuickPrep mRNA 纯化试剂盒(Pharmacia制)可直接制备mRNA。
使用逆转录酶由得到的mRNA合成抗体V区的cDNA。用AMV逆转录酶 第一链cDNA合成试剂盒也可以进行cDNA的合成。而为了进行cDNA的合 成和扩增，可以使用5′-Ampli Finder Race试剂盒(Clontech制)和 PCR的5′-RACE法(Frohman，M.A.等人，《美国国家科学院院报》(Proc. Natl.Acad.Sci.USA)(1988)85，8998-9002；Belyavsky，A等人《核 酸研究》Nucleic Acids Res.(1989)17，2919-2932)。从得到的PCR 产物纯化目的DNA片断，与载体连接。然后作成重组的载体，导入大肠 杆菌，选择茵落制备所希望的重组载体。利用众所周知的方法，例如脱 氧法，确认目的DNA。
如果得到编码目的抗体V区的DNA，将它与编码所希望的抗体的恒定 区(C区)连接，重组入表达载体。而也可以将编码抗体V区的DNA重组 入含有抗体C区DNA的表达载体。
为了制备本发明中使用的抗体，可以象后面叙述的那样，将抗体基因 重组入在表达调控区，例如增强子、启动子的控制下能表达的那样表达 载体中，然后用该表达载体转化宿主细胞，可以使抗体表达。
1-3改变抗体
在本发明中，以使对人的异种抗原性降低等为目的，可以使用人为改 变了的基因重组型抗体，例如嵌合(Chimeric)抗体，类人化(Humanized) 抗体等。这些改型抗体可以用已知的方法进行制造。
嵌合抗体可以通过将上述得到的编码抗体V区的DNA与编码人抗体C 区的DNA连接，然后重组入表达载体，导入宿主使其表达得到(参照欧 洲专利申请公开号EP 125023，国际专利申请公开号WO 96/02576)。使 用这个已知的方法可以得到本发明中有用的嵌合抗体。
例如，含有编码嵌合抗体抗HM1.24抗体的L链V区和H链V区的DNA 质粒的大肠杆菌分别以Escherichia coli DH5α(pUC19-1.24L-gκ) 和Escherichia coli DH5α(pUC19-1.24H-gγ1)的名称于平成8年 8月29日，按照布达佩斯条约于工业技术院生命工学工业技术研究所(茨 域县筑波市东1丁目1番3号)进行国际保藏，保藏号分别为FERM BP- 5646，FERM BP-5644(参见特愿平9-271536)。
类人化抗体也称之改造的(reshaped)人抗体，是将人以外的哺乳动 物，例如小鼠抗体的互补性决定区(CDR：complementarity determining region)移植入人抗体的互补性决定区后形成的抗体，其常用的基因重 组手法也已了解(参照欧洲专利申请公开号EP 125023，国际专利申请公 开号WO 96/02576)。
具体来说，通过PCR法由末端部位含有重叠部分而制成的数个的寡核 苷酸合成一个设计的DNA序列，使小鼠抗体的CDR和人抗体的框架区 (framework region；FR)连接。得到的DNA与编码人抗体C区的DNA 连接，然后重组入表达载体，再将该载体导入宿主使其产生抗体(参照 欧洲专利申请公开号EP 239400，国际专利申请公开号WO 96/02576)。
通过CDR连接的人抗体的FR选择的是互补性决定区形成良好抗原结合 部位的区。根据需要为了使改造的人抗体的互补性决定区形成合适的抗 原结合部位，也可以替换抗体可变区框架区的氨基酸(Sato，K.等，《癌 症研究》Cancer Res.(1993)53，851-856)。
例如，含有编码类人化抗HM1.24抗体的L链V区a区(序列号：2) 以及H链V区r区(序列号：3)的DNA的质粒的大肠杆菌分别以Escherichia coli DH5α(pUC19-RVLa-AHM-gκ)和Escherichia coli DH5α(pUC19 -RVHr-AHM-gγ1)的名称于平成8年8月29日，按照布达佩斯条约 于工业技术院生命工学工业技术研究所(茨域县筑波市东1丁目1番3 号)进行国际保藏，保藏号分别为FERM BP-5645，FERM BP-5643(参 见特愿平9-271536)。另外含有编码类人化抗HM1.24抗体的H链V区s 区(序列号：4)DNA质粒的大肠杆菌以Escherichia coli DH5α(pUC19 -RVHs-AHM-gγ1)的名称的名称于平成8年8月29日，按照布达佩 斯条约于工业技术院生命工学工业技术研究所(茨域县筑波市东1丁目1 番3号)进行国际保藏，保藏号分别为FERM BP-6127(参见特愿平9- 271536)。
在嵌合抗体和类人化抗体中使用了人抗体C区，作为表现出细胞杀伤 活性的人抗体C区，可以使用人Cγ，例如Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4。 其中，特别是含有Cγ1、Cγ3的抗体具有很强的细胞杀伤活性，即具有 ADCC活性、CDC活性，最适用于本发明。
嵌合抗体是由来自人以外的哺乳动物抗体的可变区和来自人抗体的C 区构成的，类人化抗体是由来自人以外的哺乳动物抗体的互补性决定区 以及来自人抗体的框架区(framework region；FR)和C区构成的，为 了使人体内的抗原性降低，作为本发明的治疗剂的有效成分是很有用 的。
作为本发明中使用的类人化抗体的优选具体例子有类人化抗HM1.24抗 体(参见特愿平9-271536)。类人化抗HM1.24抗体的L链V区的优选具 体例子有由序列号2所示碱基序列编码的氨基酸序列。类人化抗HM1.24 抗体的H链V区优选具体例子有由序列号3和4所示碱基序列编码的氨 基酸序列。
1-4.表达和生产
上述构建的抗体基因可以通过众所周知的方法使其表达来获得。若是 哺乳类细胞，抗体基因可以通过含有从功能上使常用的启动子、被表达 的抗体基因、其3′侧下游聚A信号功能性结合的DNA或含有该DNA的载 体使其表达。例如，作为启动子/增强子如人巨细胞病毒前期启动子/增 强子(human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)。
此外，作为本发明使用的抗体的表达中用的启动子/增强子只要使用逆 病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿病毒40(SV40)等病毒启动子/增强子或 来自人延伸因子1α(HEF1α)等哺乳类细胞的启动子/增强子就可以。
例如，使用SV40启动子/增强子时，按照Mulligan等人的方法(《自 然》Nature(1979)277，108)、使用HEF1α启动子/增强子时，按照 Mizushima等人的方法(《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)(1990)18， 5322)可以很容易实施。
若是大肠杆菌，可以从功能上使常用的启动子、抗体分泌用的信号序 列、被表达的抗体基因功能性结合，使其表达。例如作为启动子有1acz 启动子、araB启动子。使用1acz启动子时，按照Ward等人的方法(《自 然》Nature(1980)343，544-546；FASEB J.(1992)6，2422-2427) 进行，使用araB启动子时，可以按照Better等人的方法(《科学》Sciense (1988)240，1041-1043)实施。
作为抗体分泌用的信号序列，使抗体在周质中产生时，只要使用pelB 信号序列(Lei，S.P.等，《细茵学杂志》J.Bacteriol.(1987)169，4379) 就可以。产生在周质的抗体分离后，对抗体的结构进行适当的再折叠后 就可以使用了(例如，参照WO 96/30394)。
作为复制起源可以使用来自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头状瘤 病毒(BPV)等的起源，另外为了在宿主细胞系中扩增基因拷贝数，表达 载体作为选择标记可以含有氨基糖苷转移酶(APH)基因、胸腺嘧啶核苷 激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基 因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等。
为了制造本发明中使用的抗体可以使用任意的产生体系。抗体制造用 产生体系有体外(体外(in vitro))和体内(体内(in vivo))产生体系。 作为体外产生体系可以举出使用真核细胞的产生体系和使用原核细胞的 产生体系的例子。
使用真核细胞时，有使用动物细胞、植物细胞和真菌细胞的产生体系。 作为动物细胞已知有(1)哺乳类细胞，例如CHO，COS，骨髓瘤、BHK(乳 仓鼠肾baby hamster kidney)，Hela，Vero，(2)两栖类细胞，例如非洲 蛙卵母细胞、或(3)昆虫细胞，例如sf9，sf21，Tn5等。作为植物细 胞已知有来自烟草属(Nicotiana)，例如烟草Nicotiana tabacum的细 胞，只要进行愈伤组织培养就可以。作为真菌细胞已知有酵母，例如酵 母(Saccharomyces)属，例如酿酒酵母(Saccharomyces serevisiae)， 霉菌，例如曲霉属(Aspergillus)，例如黑曲霉(Aspergillus niger) 等。
使用原核细胞时，有使用细菌细胞的产生体系。作为细菌细胞已知有 大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌。
这些细胞通过转化将作为目的基因的抗体基因导入，经过在体外对转 化的细胞进行培养就可得到抗体。培养按照众所周知的方法进行。例如， 作为培养液可以使用DMEM、MEM、RPMI 1640、IMDM，也可以同时使用胎 牛血清(FCS)等血清补液。另外通过将已导入抗体基因的细胞移入动物 的腹腔，也可以在体内(in vivo)产生抗体。
另外作为体内(in vivo)的产生体系，可以举出使用动物的产生体系和 使用植物的产生体系。使用动物时，有使用哺乳类动物、昆虫的产生体 系。
作为哺乳类动物可以使用山羊、猪、绵羊、小鼠、牛等(Vicki Glaser， 光谱生物技术应用(SPECTRUM Biotechnology Application)，1993)。 另外作为昆虫可以使用蚕。
使用植物时，可以用烟草。
将抗体基因导入这些动物或植物，使动物或植物体内产生抗体，然后 再回收。例如，将抗体基因插入编码如山羊β-酪蛋白之类的乳汁中固有 产生的蛋白质的基因中，制备融合基因。然后将含有插入了抗体基因的 融合基因的DNA片段注入山羊的胚内，将该胚导入雌性山羊。从接受了 胚的山羊产下的转基因山羊或其后代产生的乳汁中可以获得所希望的抗 体。为了使从转基因山羊产生的含有所希望的抗体的乳汁量增加，可以 对转基因山羊使用适当的激素(Ebert，K.M.等，生物/技术 (Bio/Technology)(1994)12，699-702)。
当使用蚕时，用插入了目的抗体基因的杆状病毒感染蚕，然后从感染 的蚕的体液获得所希望的抗体(Susumu，M.等，《自然》Nature(1985)315， 592-594)。在使用烟草时，将目的抗体基因插入植物表达用载体，例如 pMON530，然后将该载体导入根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumeraciens) 一类的细菌中。使该细菌感染烟草，例如烟草(Nicotiana tabacum)， 从该烟草的叶子中提取所希望的抗体(Julian，K.-c，Ma等《欧洲免疫学 杂志》(Eur.J.Immunol.)(1994)24，131-138)。
象上述那样利用体外(in vitro)或体内(in vivo)的产生体系产生抗 体时，可以将编码抗体重链(H链)或轻链(L链)的DNA分别重组入表 达载体中，同时转化宿主，或者将编码H链和L链的DNA重组入单一的 一个表达载体后，转化宿主也可以(参照国际专利申请公开号WO 94- 11523)。
使象上述那样得到的抗体与聚乙二醇(PEG)等各种分子结合，也可以 作为抗体修饰物使用。本专利申请权利要求的范围中，所谓“抗体”也 包括这些抗体修饰物。为了得到这样的抗体修饰物，通过对得到的抗体 进行化学修饰就可实现。这些方法在该领域已经确立。
2.抗体的分离、纯化
2-1.抗体的分离、纯化
象上述那样产生、表达的抗体可以从细胞内外、宿主中分离纯化至均 一。本发明中使用的抗体的分离、纯化可以利用亲和层析进行。作为亲 和层析所用的柱子，例如有蛋白A柱、蛋白G柱。蛋白A柱中用的载体， 例如有Hyper D，POROS，Sepharose F.F.等。
此外，只要使用通常蛋白质中使用的分离、纯化方法就可以，并没有 什么限定。例如通过适当选择、或联合使用除了上述亲和层析以外的层 析、过滤、超滤、盐析、透析等方法，就可以分离、纯化本发明中使用 的抗体。作为层析，例如有离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤等。这 些层析也适用于HPLC。另外也可以使用反相HPLC。
2-2.抗体浓度的测定
2-1中得到的抗体的浓度测定可以通过吸光度测定或ELISA进行。即， 通过吸光度测定时，将本发明中使用的抗体或含有抗体的样品用PBS(-) 适当稀释后，测定280nm的吸光度，以1mg/ml作为1.350D就可以算出 浓度。而利用ELISA测定时可以按以下方法测定。即，将用0.1M重碳酸 缓冲液(pH9.6)稀释成1μg/ml的山羊抗人IgG(BIO SOURCE制)100 μl加到96孔板(Nunc制)，于4℃下温育过夜，使抗体固相化。
封闭后，添加适当稀释的本发明中使用的抗体或含抗体的样品，以及 作为标准样品的人IgG(CAPPEL制)100μl，于室温保温1小时。洗净 后，添加5000倍稀释的碱性磷酸酶标记的抗IgG(BIOSOURCE制)100μ l，于室温保温1小时。洗净后，加入底物溶液，温育后，使用MICROPLATE READER Model 3550(Bio-Rad制)测定405nm的吸光度，可以算出目的 抗体的浓度。
3.FCM解析
淋巴细胞系肿瘤与本发明中使用的抗体的反应性可以通过FCM(流式 细胞计)解析进行。作为细胞可以用树立细胞株或新分离细胞。例如作 为树立细胞株可以使用作为T细胞的RPMI 8402(ATCC CRL-1994)、来 自急性成淋巴细胞白血病的CCRF-CEM(ATCC CCL-119)、来自急性淋巴 性白血病的HPB-ALL(FCCH1018)、来自T淋巴肿瘤的HPB-MLT (FCCH1019)、来自急性淋巴性白血病的JM(FCCH1023)、来自急性成淋 巴细胞白血病的MOLT-4(ATCC CRL-1582)、来自急性淋巴性白血病的 Jurkat(FCCH1024)、来自急性成淋巴细胞白血病的CCRF-HSB-2(ATCC CRL -120.1)、来自成人T细胞白血病的MT-1(FCCH1043)、来自レンネル ト淋巴肿瘤的KT-3(Shimizu，S.等，《血液》Blood(1988)71，196-203) 等，作为B细胞株可以使用EB病毒转化细胞CESS(ATCC TIB-190)、EB 病毒阳性B细胞SKW6.4(ATCC TIB-215)、来自B淋巴肿瘤的MC116(ATCC CRL-1649)、来自急性成淋巴细胞白血病的CCRF-SB(ATCC CCL-120)、 来自急性骨髓性白血病患者的B细胞RPMI 6410(FCCH6047)、来自Burkitt 淋巴肿瘤的Daudi(ATCC CCL-213)、来自Burkitt淋巴肿瘤的EB-3(ATCC CCL-85)、来自Burkitt淋巴肿瘤的Jijoye(ATCC CCL-87)、来自Burkitt 淋巴肿瘤的Raji(ATCC CCL-86)等，也可以使用作为非T非B细胞株 的来自骨髓性白血病HL-60(ATCC CCL-240)、来自急性单核细胞白血 病的THP-1(ATCC TIB-202)、来自组织细胞性白血病的U-937(ATCC CRL -1593)、来自慢性骨髓性白血病的K-562(ATCC CCL-243)、等细胞。
用PBS(-)洗净上述细胞后，加入用FACS缓冲液(含有2％胎牛血 清、0.1％叠氮钠的PBS(-))稀释到25μg/ml的抗体或对照抗体100 μl，冰中放置30分钟。用FACS缓冲液洗净后，加入25μg/ml的FITC 标记的山羊抗小鼠抗体(GAM，Becton Dickinson制)的抗体100μl，冰 中放置30分钟。用FACS缓冲液洗净后，悬浮于600μl或1ml的FACS 缓冲液中，用FACScan(Becton Dickinson制)测定各个细胞的荧光强 度。
从各个细胞的荧光强度的测定值可以知道本发明中使用的抗体和各个 细胞的反应性。就是说，从各个细胞的荧光强度的测定值就可以知道各 个细胞中HM1.24抗原是否显示出来(阳性或阴性)以及显示的强度。有 关淋巴细胞系肿瘤中HM1.24抗原的显示有无以及显示强度记载于下面的 实施例2.2.FCM解析中。
成为本发明治疗对象的淋巴细胞系肿瘤的肿瘤细胞显示出HM1.24抗 原。更详细地说，理想的淋巴细胞系肿瘤的肿瘤细胞是HM1.24抗原阳性 的百分数不小于5％的肿瘤细胞。更详细地说，理想的淋巴细胞系肿瘤的 肿瘤细胞是HM1.24抗原阳性的百分数在20％以上的肿瘤细胞。再详细地 说，理想的淋巴细胞系肿瘤的肿瘤细胞是HM1.24抗原阳性的百分数在50 ％以上的肿瘤细胞。再详细地说，理想的淋巴细胞系肿瘤的肿瘤细胞是 HM1.24抗原阳性的百分数在80％以上的肿瘤细胞。
4.细胞杀伤活性
4-1.CDC活性的测定
本发明使用的抗体是具有作为细胞杀伤活性的抗体，例如CDC活性的 抗体。
本发明的淋巴细胞系肿瘤治疗剂对淋巴细胞系肿瘤的CDC活性可以按 以下方法测定。首先将用适当的培养基，例如含有10％胎牛血清(GIBCO -BRL制)的RPMI 1640培养基(GIBCO-BRL制)将靶细胞调整至4×105 个/ml。作为靶细胞可以用CCRF-CEM(ATCC CCL-119)、CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1)、HPB-MLT(FCCH1019)、EB-3(ATCC CCL-85)、 MC116(ATCC CRL-1649)、CCRF-SB(ATCC CCL-120)、K-562(ATCC CCL -243)等。将这些细胞50μl加入到96孔平底板(FALCON制)中。于 37℃、CO2条件下在培养箱中培养过夜。
然后，加入测定CDC活性的抗体，温育60分钟后，加入适当稀释的补 体，例如乳兔补体(Baby Rabbit Complement)(CEDARLANE制)，温育2 小时。然后向各个孔中加入Alamar Bule(BIO SOURCE制)10μl，温育 4小时后，用荧光测定系统CytoFluor 2350(MILLIPORE制)测定各孔的 荧光强度(激发波长530nm，检测波长590nm)。细胞杀伤活性(％)可 以用(A-C)/(B-C)×100计算。其中，A是抗体存在下温育后的荧 光强度，B是不含抗体只是培养液温育后的荧光强度，C是不含细胞的孔 的荧光强度。
4-2.ADCC活性测定
本发明使用的抗体是具有作为细胞杀伤活性的抗体，例如ADCC活性的 抗体。
本发明的淋巴细胞系肿瘤治疗剂对淋巴细胞系肿瘤的ADCC活性可以按 以下方法测定。首先，用比重离心法从人的外周血液中分离出单核细胞， 制备成效应细胞。而作为靶细胞通过用51Cr标记CCRF-CEM(ATCC CCL- 119)、CCRF-HSB-2(ATCC CCL-120.1)、HPB-MLT(FCCH1019)、EB- 3(ATCC CCL-85)、MC116(ATCC CRL-1649)、CCRF-SB(ATCC CCL-120)、 K-562(ATCC CCL-243)等，制备成靶细胞。接下来，向标记的靶细胞 加入测定ADCC活性的抗体，温育，然后加入对靶细胞恰当比例的效应细 胞，温育。
取温育后的上清，用γ计数器测定放射活性。此时，在最大游离放射 能测定中可以使用1％的NP-40。细胞杀伤活性(％)可以用(A-C)/ (B-C)×100计算。其中，A是抗体存在下游离的放射活性(％)，B是 通过NP-40游离出的放射活性(cpm)，C是不含抗体只含培养液而游离 出的放射活性(cpm)。
4-3.细胞杀伤活性的增强
为了发挥象ADCC活性和CDC活性那样的细胞杀伤活性，对于人最好使 用作为抗体恒定区(C区)的Cγ、特别是Cγ1、Cγ3。另外通过对抗体 C区的氨基酸进行部分增加、改变、修饰，可以诱导更强的ADCC活性或 CDC活性。
例如，通过氨基酸转换的IgG象IgM那样的聚合化(Smith， R.I.F.&Morrison，S.L.《生物/fsy》BIO/TECHNOLOGY(1994)12，683 -688)，通过附加氨基酸的IgG象IgM那样的聚合化(Smith，R.I.F.等， 《免疫学杂志》(J.Immunology)(1995)154，2226-2236)，通过编码L 链的基因的串联的表达(Shuford，W.等，《科学》Science(1991)252， 724-727)，通过氨基酸转换引起的IgG的二聚体化(Caron，P.C.等，《实 验医学杂志》J.Exp.Med.(1992)176，1191-1195，Shopes，B.，《免疫 学杂志》J.Immunology(1992)148，2918-2922)，通过化学修饰引起IgG 的二聚体化(Wolff，E.A.等，《癌症研究》Cancer Res.(1993)53，2560 -2565)，以及通过抗体铰链区氨基酸的改变引起的效应功能的导入 (Norderhaug，L.等，《欧洲免疫学杂志》(Eur.J.Immunol.)(1991)21， 2379-2384)。这些变化通过利用引物的寡聚物部位特异的变异导入法， 利用限制酶切部位的碱基序列的添加，以及使用可以引起共价结合的化 学修饰剂都可实现。
5.治疗效果的确认
为了确认本发明的淋巴细胞系肿瘤治疗剂的治疗效果，可以将本发明 中使用的抗体注入移植了淋巴细胞系肿瘤细胞的动物，通过评价抗肿瘤 效果得出。
作为向动物移植的淋巴细胞型肿瘤细胞，可以使用树立细胞株或新分 离的细胞。例如作为树立细胞可以用作为T细胞的CCRF-CEM(ATCC CCL -119)、HPB-MLT(FCCH1019)、MOLT-4(ATCC CRL-1582)、CCRF-HSB -2(ATCC CCL-120.1)等，作为B细胞的CESS(ATCC TIB-190)、SKW6.4 (ATCC TIB-215)、CCRF-SB(ATCC CCL-120)、RPMI 6410(FCCH6047)、 EB-3(ATCC CCL-85)等。
作为被移植的动物，用免疫功能低下或欠缺的动物最好，例如可以用 裸小鼠、SCID小鼠、本色小鼠、裸大鼠等。进行评价的抗肿瘤效果的确 认可以利用肿瘤体积和重量的测定以及动物的生存期间等进行。
就象下述的实施例所给出的那样，通过将抗HM1.24抗体注入人淋巴细 胞系肿瘤移植鼠，确认肿瘤体积的增加的抑制、肿瘤移植鼠的生存期间 进一步延长。这些现象表明抗HM1.24抗体对淋巴细胞系肿瘤有抗肿瘤效 果。
6.给药途径和制剂
本发明的淋巴细胞系肿瘤治疗剂可以非口服的全身或局部给药。例如， 可以选择点滴等静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射，可以根据 患者的年龄、症状选择合适的给药方式。有效的给药量每一次每1kg体 重在0.01mg至100mg的范围内选择，或者每个患者选择1-100mg，最好 是5-50mg给药量。
本发明的淋巴细胞系肿瘤治疗剂即使是同时含有由给药途径决定，医 药上容许的载体和添加物也可以。作为这样的载体和添加物的例子有水、 医药上容许的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯 聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧 甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、呫吨胶(xanthan gum) 阿拉伯树胶、酪蛋白、明胶、琼脂、一缩二甘油、丙(撑)二醇、聚乙 二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HAS)、甘露糖 醇、山梨糖醇、乳糖、作为医药添加物容许的表面活性剂等。使用的添 加物根据剂型，可以从上述的化合物中选择合适的或组合使用，这些并 没有特别限定。
作为本发明的治疗对象疾病，是作为靶细胞的肿瘤细胞上存在结合本 发明中使用的抗体的抗原的，除骨髓瘤之外的淋巴细胞系肿瘤。具体来 说，有急性B淋巴性白血病(B-ALL)、慢性B淋巴白血病(B-CLL)、pre -B淋巴肿瘤、Burkitt淋巴肿瘤、滤胞性淋巴肿瘤、滤胞外套淋巴肿瘤、 弥漫性淋巴肿瘤、急性T淋巴性白血病(T-ALL)、慢性T淋巴白血病(T -CLL)、成人T细胞白血病(ATL)、非ATL外周性T淋巴肿瘤(PNTL) 等。本发明的治疗剂作为这些淋巴细胞系肿瘤的治疗剂是有用的。
实施例
下面，通过实施例进一步具体地说明本发明，但本发明并不限定于这 些实施例。
实施例1.抗HM1.24抗体的制备
1.含抗HM1.24抗体的小鼠腹水的制备
根据Goto，T.等人的方法(《血液》(Blood)(1994)84，1922-1930) 得到产生抗HM1.24抗体的杂交瘤。
首先向于3日前已将2，6，10，14-四甲基十五烷(和光纯药工业制)各 500μl注入了腹腔内的小鼠(日本クレア制)，再注入该杂交瘤5×106 个。从杂交瘤注入第十天开始，用19口径的留置针ハツピ-キヤス(メ デイキツト制)取小鼠腹腔中的腹水。采得的腹水用低速离心机RLX-131 (トミ-精工制)离心两次，转数分别为1000，3000rpm，除去杂交瘤、 血细胞等杂物。
2.从小鼠腹水中纯化抗HM1.24抗体
从上述小鼠腹水中纯化抗HM1.24抗体可以按以下方法进行。向小鼠腹 水中加入等量的PBS(-)后，使用中空纤维フイルタ-メデイアフレツプ (MILLIPORE制)进行过滤，用高速抗体纯化装置Consep LC100(MILLIPORE 制)和Hyper D Protein A柱(柱体积20ml、日本ガイシ制)按照附带的 说明书，作为吸附缓冲液使用PBS(-)，作为洗脱液使用0.1M柠檬酸钠 缓冲液(pH4)，进行亲和纯化。洗脱级分在洗脱出来之后马上添加1M Tris-HCl(pH8.0)，然后将pH调整到pH7.4附近，然后使用离心超滤浓 缩器Centriprep 10进行浓缩和将缓冲液置换为PBS(-)，用孔径0.22 μm的膜过滤器MILLEX-GV(MILLIPORE制)过滤灭菌，得到纯化的抗 HM1.24抗体。
3.抗体浓度的测定
纯化抗体浓度的测定是通过吸光度的测定进行的。即纯化抗体用PBS (-)适当稀释后，测定280nm的吸光度，以1mg/ml作为1.350D就可以 算出浓度。
实施例2.抗HM1.24抗体对淋巴细胞系肿瘤细胞反应性的研究
1.对照小鼠IgG2a的纯化
对照小鼠IgG2a的纯化按照以下方法进行。市售的mouse IgG2a(KAPPA)(UPC 10)ascites(CAPPEL制)用精制水和PBS(-)溶解。 然后用孔径0.2μm的膜过滤器Acrodisc(Gelman Sciences制)过滤后， 用高速抗体纯化装置Consep LC100(MILLIPORE制)和Hyper D Protein A 柱(柱体积20ml、日本ガイシ制)按照附带的说明书，作为吸附缓冲液 使用PBS(-)，作为洗脱液使用0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH4)，进行亲和 纯化。洗脱级分在洗脱出来之后马上添加1Mtris-HCl(pH8.0)后，将pH 调整到pH7.4附近，然后使用离心超滤浓缩器Centriprep 10进行浓缩 和将缓冲液置换为PBS(-)，用孔径0.22μm的膜过滤器MILLEX- GV(MILLIPORE制)过滤灭菌，得到纯化的对照小鼠IgG2a。
纯化的对照小鼠IgG2a的浓度测定按照上述3的抗体浓度测定进行。
2.FCM解析
抗HM1.24抗体对淋巴细胞系肿瘤细胞反应性的研究可以通过FCM(流 式细胞计)解析进行。可以使用作为T细胞的RPMI 8402(ATCC CRL-1994)、 来自急性淋巴性白血病的CCRF-CEM(ATCC CCL-119)、来自急性成淋巴 细胞白血病的HPB-ALL(FCCH1018)、来自T淋巴肿瘤的HPB-MLT (FCCH1019)、来自急性淋巴性白血病的JM(FCCH1023)、来自急性淋巴 细胞性白血病的MOLT-4(ATCC CRL-1582)、来自急性成淋巴细胞白血 病的Jurkat(FCCH1024)、来自急性成淋巴细胞白血病的CCRF-HSB-2 (ATCC CRL-120.1)、来自成人T细胞白血病的MT-1(FCCH1043)、来 自レンネルト淋巴肿瘤的KT-3(Shimizu，S.等，《血液》Blood(1988) 71，196-203)等，可以使用作为B细胞株的EB病毒转化细胞CESS(ATCC TIB-190)、EB病毒阳性B细胞SKW6.4(ATCC TIB-215)、来自B淋巴 肿瘤的MC116(ATCC CRL-1649)、来自急性成淋巴细胞白血病的CCRF- SB(ATCC CCL-120)、来自急性骨髓性白血病患者的B细胞RPMI 6410 (FCCH6047)、来自Burkitt淋巴肿瘤的Daudi(ATCC CCL-213)、来自 Burkitt淋巴肿瘤的EB-3(ATCC CCL-85)、来自Burkitt淋巴肿瘤的 Jijoye(ATCC CCL-87)、来自Burkitt淋巴肿瘤的Raji(ATCC CCL-86) 等，也可以使用作为非T非B细胞株的来自骨髓性白血病HL-60(ATCC CCL -240)、来自急性单核细胞白血病的THP-1(ATCC TIB-202)、来自组 织细胞性白血病的U-937(ATCC CRL-1593)、来自慢性骨髓性白血病的 K-562(ATCC CCL-243)、等细胞。用PBS(-)洗净上述细胞后，加入 用FACS缓冲液(含有2％胎牛血清、0.1％叠氮钠的PBS(-))稀释到25 μg/ml的抗HM1.24抗体或对照小鼠IgG2a100μl，冰中放置30分钟。
用FACS缓冲液洗净后，加入25μg/ml的FITC标记的山羊抗小鼠抗 体(GAM)100μl，冰中放置30分钟。用FACS缓冲液洗净后，悬浮于600 μl或1ml的FACS缓冲液中，用FACScan(Becton Dickinson制)测定 各个细胞的荧光强度。测定结果如图1～23所示，确认若是用T细胞则 是全部例子，而若是用B细胞，除Daudi，Raji 2类没有反应外，其它例 子都可与抗HM1.24抗体反应，表现出高HM1.24抗原性。另外非T非B 细胞株全部例子都不能与抗HM1.24抗体反应，也不能检测出抗原显示。
在图1～23的各个细胞的直方图中，使用对照小鼠IgG2a的染色，使 阴性细胞为98％，阳性细胞为2％那样设定直方图标示，按照该直方图 标示，可以算出使用抗HM1.24抗体时的HM1.24抗原阳性细胞的百分数， 结果如表1所示。从HM1.24抗原阳性细胞的百分数可以将HM1.24抗原 显示率分为-、+/-、+、++、+++5个区段，结果表明与图1～23 一样，T细胞株全部例子、而B细胞株除去Daudi，Raji其它都显示为+ +或+++的非常高的HM1.24抗原性。而非T非B细胞株全部例子中， HM1.24抗原阳性细胞不到5％，这表明没有抗原的显示，或是非常少。
表1
细胞名 显现率
B细胞株 CESS +++ 94.5
SKW6.4 +++ 92.8
MC116 ++ 65.0
CCRF-SB +++ 98.4
RPMI6410 +++ 94.5
EB-3 +++ 88.3
Jijoye +++ 92.3
Daudi - 2.8
Raji - 2.0
T细胞株
RPMI8402 +++ 94.0
CCRF-CEM +++ 97.8
HPB-ALL ++ 63.8
HPB-MLT +++ 94.6
JM +++ 99.6
MOLT-4 +++ 84.1
Jurkat ++ 70.9
CCRF-HSB-2 +++ 100.0
MT-1 +++ 95.9
KT-3 +++ 96.0
非T非B细胞株
HL-60 - 2.9
THP-1 - 1.5
U-937 - 1.1
K-562 - 3.9
实施例3.CDC活性的测定
抗HM1.24抗体对淋巴细胞类肿瘤细胞的CDC活性按以下方法测定。
1.靶细胞的制备
用含有10％胎牛血清(GIBCO-BRL制)的RPMI 1640培养基(GIBCO -BRL制)将作为靶细胞的来自急性淋巴性白血病的CCRF-CEM(ATCC CCL -119)、来自急性成淋巴细胞白血病的CCRF-HSB-2(ATCC CRL-120.1)、 来自T淋巴肿瘤的HPB-MLT(FCCH1019)、来自Burkitt淋巴肿瘤的EB -3(ATCC CCL-85)、来自B淋巴肿瘤的116(ATCC CRL-1649)、来自 急性淋巴性白血病的CCRF-SB(ATCC CCL-120)、来自骨髓性白血病K562 (ATCC CCL-243)调整至4×105个/ml。将这些细胞悬浊液50μl加入 到96孔平底板(FALCON制)中，于37℃、CO2条件下在培养箱中(TABAI 制)培养过夜。
2.抗HM1.24抗体的制备
用含有10％胎牛血清(GIBCO-BRL制)的RPMI 1640培养基(GIBCO -BRL制)将上述实施例1中得到的纯化抗HM1.24抗体调整为0，0.2， 2，20μg/ml，然后向上述1中制作的96孔平板的各孔中各加入50μl。 于37℃、5％CO2条件下在高湿培养箱中(TABAI制)培养60分钟后，用 低速离心机05PR-22(日立制)，1000rpm，离心5分钟，除去上清50μ l。
3.补体的制备
每1小玻璃瓶1ml的精制水溶解“乳鼠补体”(Baby Rabbit Complement)(CEDARLANE制)，再用不含FCS的RPMI1640培养基(GIBCO -BRL制)5ml稀释。然后加入到上述2的96孔平板的各孔中，每孔50 μl，于37℃、5％CO2条件下在高湿培养箱中(TABAI制)培养2小时。
4.CDC活性的测定
培养后，向上述3的96孔平板各孔中各加入Alamar Bule(BIO SOURCE 制)10μl，于37℃、5％CO2条件下在高湿培养箱中(TABAI制)温育4 小时后，用荧光测定系统CytoFluor 2350(MILLIPORE制)测定各孔的 荧光强度(激发波长530nm，检测波长590nm)。细胞杀伤活性(％)可 以用(A-C)/(B-C)×100计算。其中，A是抗体存在下温育后的荧 光强度，B是不含抗体只是培养液温育后的荧光强度，C是不含细胞的孔 的荧光强度。
测定结果就象图24和25给出的那样。在FCM解析中没有与抗HM1.24 抗体反应的K562即使添加抗HM1.24抗体也不引起细胞杀伤，与此相反， 与抗HM1.24抗体反应的CCRF-CEM，CCRF-HSB-2，HPB-MLT，EB-3， MC116和CCRF-SB可以看到细胞杀伤依赖于抗HM1.24抗体的浓度。这一 现象表明抗HM1.24抗体对细胞表面存在抗HM1.24抗体特异结合的抗原 蛋白的淋巴细胞系肿瘤显示出CDC活性。
实施例4.抗HM1.24抗体对人淋巴细胞系肿瘤移植小鼠的抗肿瘤效果
1.实验用抗体的制备
1-1.抗HM1.24抗体的制备
上述实施例1中得到的纯化抗HM1.24抗体用过滤灭茵的PBS(-)调 整为1mg/ml，200μg/ml，用于以下实验。
1-2.对照小鼠IgG2a的制备
上述实施例2中得到的纯化抗HM1.24抗体用过滤灭菌的PBS(-)调 整为1mg/ml，用于以下实验。
2.抗HM1.24抗体对人淋巴细胞系肿瘤移植小鼠的抗肿瘤效果
2-1.人淋巴细胞系肿瘤移植鼠的制备
人淋巴细胞系肿瘤移植鼠可以象以下那样制备。用含有10％胎牛血清 (GIBCO-BRL制)的RPMI1640培养基将使用SCID小鼠(日本クレア) 体内(in vivo)传代的来自急性成淋巴细胞系白血病CCRF-HSB-2细胞 (ATCC CRL-120.1)调整为1×108个/ml。将上述制备的细胞悬浊液注 入于前一天腹腔注入了抗唾液酸基缺乏GM1(和光纯药工业制)100μl 的SCID小鼠(雄性、6周龄)(日本クレア)的腹部皮下。
2-2.抗体注入
肿瘤移植后第7天，用卡尺测量急性淋巴细胞肿瘤移植小鼠CCRF-HSB -2移植部位的肿瘤直径，算出肿瘤体积后，使各组的肿瘤体积的平均值 大致相等那样进行分组(各组都是8只，共3组)。从同日开始，将上述 1制备的1mg/ml或200μg/ml的抗HM1.24抗体，以及对照小鼠IgG2a各 100μl注入各群鼠腹腔中。每周注入2次，同样注入总计进行19次。注 入期间，每周两次用卡尺测量肿瘤直径，算出肿瘤体积。
2-3.抗HM1.24抗体对人淋巴细胞系肿瘤移植鼠抗肿瘤效果的评价
关于抗HM1.24抗体抗肿瘤效果是用肿瘤体积的变化和小鼠的生存期 间评价的。结果如图26所示的那样，抗HM1.24抗体注入组与对照鼠IgG2a 注入组相比，其肿瘤体积的增加被抑制了。又如图27所示，抗HM1.24 抗体注入组与对照鼠IgG2a注入组相比，可以看到其生存期间延长了。 以上现象表明抗HM1.24抗体对人淋巴细胞系肿瘤移植鼠具有抗肿瘤效 果。
参考例1.产生小鼠抗HM1.24抗体杂交瘤的制备
按照Goto，T.等，《血液》(Blood)(1994)84，1922-1930记载的 方法制备产生鼠抗HM1.24抗体杂交瘤。
将取自人多发性骨髓瘤患者骨髓的浆细胞株KPC-32(1×107个) (Goto，T.等，《日本临床血液学杂志》Jpn.J.Clin.Hematol.(1991) 32，1400)相隔6周向BALB/C小鼠(チヤ-ルスリバ-制)的腹腔内注 入两次。
为了使小鼠的抗体效价进一步提高，在处死小鼠之前3天再向小鼠的 脾脏内注入1.5×106个KPC-32(Goto，T.等，《德岛实验医学杂志》 Tokushima J.Exp.Med.(1990)37，89)。在将小鼠处死后，摘出脾脏， 按照Groth，de St.&Schreidegger的方法(《癌症研究》Cancer Research (1981)41，3465)，使摘出的脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。
通过使用KPC-32的Cell ELISA(Posner，M.R.等，《免疫学方法杂 志》(J.Immunol.Methods)(1982)48，23)进行杂交瘤培养上清中的抗 体的筛选。将5×104个的KPC-32悬浮于50ml的PBS中，分别注入96 孔板(U型，Corning，Iwaki制)，于37℃风干过夜。用含有1％血清白 蛋白(BSA)封闭后，加入杂交瘤培养上清，于4℃培养2小时。然后使 其与过氧化物酶标记的抗小鼠IgG山羊抗体(Zymed制)反应，洗净后， 于室温与间苯二胺底物溶液(Sumitomo Bakelite制)反应30分钟。
用2N硫酸中止反应，用ELISA reader(Bio-Rad制)测定492nm处 的吸光度。为了除去产生抗人免疫球蛋白抗体的杂交瘤，首先使阳性杂 交瘤培养上清吸附于人血清，通过ELISA筛选对其它细胞株的反应性。 选择阳性的杂交瘤，用流式细胞测量法研究对各种细胞的反应性。对最 后选择的杂交瘤克隆进行2次克隆，再将它注入进行了降植烷处理的 BALB/C小鼠的腹腔，取得腹水。
单克隆抗体可以通过硫酸铵沉淀和蛋白A亲和层析试剂盒(Ampure PA、 Amersham)从小鼠的腹水中纯化。纯化抗体通过使用Quick Tag FITC结 合试剂盒(Boehringer Mannheim制)进行FITC标记。
结果30个杂交瘤克隆产生的单克隆抗体可以与KPC-32和RPMI8226 反应。克隆后，考查这些杂交瘤的培养上清与其它细胞株或外周血液单 核细胞的反应性。
其中有3个克隆是对浆细胞特异反应的单克隆抗体。这3个克隆中， 在流式细胞测量法中最有用的，而且选择对RPMI8226具有CDC活性的 杂交瘤克隆，取名HM1.24。这个杂交瘤产生的单克隆抗体的亚类是通过 使用了亚类特异的抗小鼠兔抗体(Zymed制)的ELISA确定的。抗HM1.24 抗体具有IgG2aκ亚类。产生抗HM1.24抗体的杂交瘤HM1.24于平成7年 9月14日，以FERM BP-5233的名称，按照布达佩斯条约于工业技术院 生命工学工业技术研究所(茨城县筑波市东1丁目3号)进行国际保藏。
参考例2.类人化抗HM1.24抗体的制备
类人化抗HM1.24抗体通过下述方法得到。
从参考例1中制备的杂交瘤HM1.24中利用常规方法制备总RNA。通过 聚合酶链式反应(PCR)法和5′-RACE法由总RNA合成、扩增编码小鼠 抗体V区的cDNA，得到含有编码小鼠抗体V区基因的DNA片段，将这些 DNA片段分别连接于各个质粒pUC系克隆载体中，导入大肠杆菌感受态细 胞，得到大肠杆菌转化体。从该转化体可以得到上述质粒，通过常规方 法可以确定质粒中的cDNA编码区的碱基序列，进而确定各个V区的互补 决定区(CDR)。
为了制备表达嵌合抗HM1.24抗体的载体，将分别编码小鼠抗HM1.24 抗体L链和H链V区的cDNA插入HEF载体。而为了制备类人化抗HM1.24 抗体，利用CDR移植法将小鼠抗HM1.24抗体的V区CDR向人抗体移植。 作为人抗体的L链用人抗体REI的L链，而关于作为人抗体H链的框架 区(FR)1-3，使用人抗体HG3的FR1-3，对于FR4使用人抗体JH6的 FR4。为了使移植了CDR的抗体形成恰当的抗原结合部位进行了H链V区 的FR的氨基酸置换。
为了使这样制备的类人化抗HM1.24抗体的L链和H链的基因能在哺乳 动物细胞中表达，将各个基因分别导入HEF载体，制备表达类人化抗HM1.24 抗体的L链或H链的载体。
通过将这两个表达载体同时导入CHO细胞，建立了产生类人化抗HM1.24 抗体的细胞株。通过Cell ELISA研究培养上述细胞株得到的类人化抗 HM1.24抗体对来自人羊膜的细胞株WISH的抗原结合活性和结合抑制活 性。结果类人化抗HM1.24抗体具有与嵌合抗体同等的抗原结合活性，即 便就使用了生物素化小鼠抗HM1.24抗体的结合抑制活性来说，也具有与 嵌合抗体或鼠抗体同等的活性。
另外，含有编码嵌合抗HM1.24抗体的L链V区和H链V区的DNA质 粒的大肠杆菌分别以Escherichia coli DH5α(pUC19-1.24L-gκ)和 Escherichia coli DH5α(pUC19-1.24H-gγ1)的名称于平成8年8 月29日，按照布达佩斯条约于工业技术院生命工学工业技术研究所(茨 城县筑波市东1丁目1号)进行国际保藏，保藏号分别为FERM BP-5246， FERM BP-5644。含有编码类人化抗HM1.24抗体的L链V区a区(序列 号：2)以及H链V区r区(序列号：3)的DNA的质粒大肠杆菌分别作 为Escherichia coli DH5α(pUC19-RVLa-AHM-gκ)和Escherichia coli DH5α(pUC19-RVHr-AHM-gγ1)于平成8年8月29日，按照布 达佩斯条约保藏于工业技术院生命工学工业技术研究所(茨城县筑波市 东1丁目1号)，保藏号分别为FERM BP-5645，FERM BP-5643。另外含 有编码类人化抗HM1.24抗体的L链V区s区(序列号：4)DNA质粒的 大肠杆菌作为Escherichia coli DH5α(pUC19-RVHs-AHM-gγ1)于 平成9年(1997年)9月29日，按照布达佩斯条约保藏于工业技术院生 命工学工业技术研究所(茨城县筑波市东1丁目1号)，保藏号为FERM BP -6127。
参考例3.HM1.24抗原蛋白质cDNA的克隆
对编码抗HM1.24抗体特异识别的HM1.24抗原蛋白质进行克隆。
1.cDNA文库的制备
1)总RNA的制备
根据Chirgwin等人(生物化学(Biochemistry)，18，5294(1979)) 的方法从人多发性骨髓瘤细胞株提取总RNA。即将2.2×108个KPMM2于 20ml的4M的胍基硫氰酸盐(ナカライテスク制)中使其充分匀浆。
将匀浆液加到离心管中的5.3M氯化铯溶液上，然后在Beckman SW40 转子中用31,000rpm于20℃离心24小时，使RNA沉淀。用70％乙醇洗 RNA沉淀物，然后溶解于含有1mM EDTA和0.5％SDS的10mM Tris-HCl(pH7.4)300μl中，然后加入最后浓度达到0.5mg/ml的链霉蛋白酶 (Boehringer制)，于37℃温育30分钟。混合物用苯酚和三氯甲烷萃取， 用乙醇使RNA沉淀。RNA沉淀物溶解于含有1mM EDTA的10mM Tris-HCl(pH7.4)200μl中。
2)poly(A)+RNA的制备
以上述那样制备的总RNA中的大约500μg作为材料，使用Fast Track 2.0 mRNA Isolation Kit(Invitrogen制)，按照试剂盒附带的处方纯化 poly(A)+RNA。
3)cDNA文库的构建
以上述poly(A)+RNA 10μg作为材料用cDNA合成试剂盒TimeSaver cDNA Synthesis Kit(Pharmacia制)，按照试剂盒附带的处方合成双链 cDNA，再用Directional Cloning Toolbox(Pharmcia)，用试剂盒附带 的EcoRI结合体按照试剂盒附带的处方连接。EcoRI连接体的カイネ-シ ョン以及限制酶NotI处理都是按照试剂盒附带的处方进行。另外用1.5 ％低熔点的琼脂糖凝胶(Sigma制)分离、纯化大约500bp以上的大的带 有连接体的双链cDNA，得到带有连接体的双链cDNA约40μl。
象上面那样制备的带有连接体的双链cDNA用事先经限制酶EcoRI和 NotI及碱性磷酸酶(宝酒造制)处理的pCOSI载体(特愿平8-255196) 和T4DNA连接酶(GIBCO-BRL制)连接，构建cDNA文库。构建的cDNA 文库转入大肠杆菌细胞株DH5α(GIBCO-BRL制)，据推测总转化数大约 是2.5×106个独立的克隆。
2.通过直接表达法进行克隆
1)转染COS-7细胞
上述转化的大约2.5×105克隆大肠杆菌通过在含有50μg/ml的氨苄 青霉素的2-YT培养基(《分子克隆实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Mannual.)Sambrook等人、冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))，进行cDNA扩增，利用碱法(《分子 克隆实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Mannual.)Sambrook 等人、冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))从大肠杆菌中回收质粒DNA。得到的质粒DNA用Gene Pulser 装置(Bio-Rad制)通过电穿孔法转染COS-7细胞。
即，将纯化的质粒DNA 10μg加到悬浮于PBS中的COS-7细胞液0.8ml (1×107细胞/ml)，以1500V，25μFD容量加脉冲。于室温下经10分钟 恢复期间后，经电穿孔处理的细胞于含有10％胎牛血清(GIBCO-BRL制) 的DMEM培养液(GIBCO-BRL制)中，在37℃，5％CO2的条件下培养3 天。
2)淘选盘(パンニングデイツシュ)的制备
根据B.Seed等人(美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)， 84，3365-3369(1987))的方法制备铺了小鼠抗HM1.24抗体的淘选盘。 即，将鼠抗HM1.24抗体加到50mM Tris-HCl(pH9.5)中，溶液中抗体最 后浓度为10μg/ml。将这样制备的抗体溶液3ml加到直径60mm的细胞培 养皿中，于室温培养2小时。用0.15M NaCl溶液洗3次后，加入含有5 ％胎牛血清、1mM EDTA、0.02％NaN3的PBS，封闭后，用于下面的克隆。
3)cDNA文库的克隆
象上述那样转染的COS-7细胞通过含有5mM EDTA的PBS剥离，用含 有5％胎牛血清的PBS洗一次后悬浮于含有5％胎牛血清和0.02％NaN3的 PBS中，使细胞的密度变为1×106细胞/ml，然后加到上述那样制备的淘 选盘中，于室温培养2小时。用含有5％胎牛血清和0.02％NaN3的PBS 温和地洗三次后，然后用含有0.6％SDS和10mM EDTA的溶液从结合于淘 选盘上的细胞进行质粒DNA的回收。
回收的质粒DNA再转化导入大肠杆菌DH5α，象上述那样使质粒DNA 扩增后，用碱法回收。回收的质粒DNA通过电穿孔法转染COS-7细胞， 与上述一样从结合的细胞回收质粒DNA。同样的操作再重复一次，回收的 质粒DNA用限制酶EcoRI和NotI消化，结果可以确认大约0.9kbp大小 的插入片段被浓缩。将转化导入了回收的质粒DNA的一部分的大肠杆菌 接种于含有50μg/ml的氨苄青霉素的2-YT琼脂板，培养过夜后，从单 一的菌落回收质粒DNA。用限制酶EcoRI和NotI消化，得到显示插入片 段的大小大约为0.9kbp的克隆p3.19。
就本克隆用PRISM，Dye Terminater Cycle Sequencing试剂盒(Perkin Elmer制)，根据试剂盒附带的处方进行反应，通过ABI 373A DNA测序 仪(Perkin Elmer制)确定碱基序列。该碱基序列和对应的氨基酸序列 表示在序列号1中。
FCM解析的结果表明，抗HM1.24抗体可以与来自几乎所有的人淋巴细 胞系肿瘤的细胞进行强烈的反应。这表示在许多淋巴细胞系肿瘤中，强 烈地显示出具有抗HM1.24抗体识别的抗原决定部位的多肽。另外，在移 植了与抗HM1.24抗体反应的人淋巴细胞系肿瘤移植鼠实验中，确认通过 抗HM1.24抗体的注入抑制了肿瘤体积的增加，而且生存期间延长。从这 些现象表明抗HM1.24抗体或识别具有抗HM1.24抗体识别的抗原决定部 位的多肽的抗体对很多淋巴细胞系肿瘤表现出细胞杀伤活性，其结果对 淋巴细胞系肿瘤患者的治疗非常有用。
根据《专利合作条约》细则13条之二的微生物的保藏以及保藏机构、 保藏机构 名称：工业技术院生命工学工业技术研究所
地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1-3 微生物(1) 名称：Escherichia coli DH5α(pRS38-pUC19)
保藏号：FERM BP-4434
保藏日：1993年10月5日
(2) 名称：杂交瘤HM1.24
保藏号：FERM BP-5233
保藏日：1995年9月14日
(3) 名称：Escherichia coli DH5α(pUC19-RVHr-AHM-gγ1)
保藏号：FERM BP-5643
保藏日：1996年8月29日
(4) 名称：Escherichia coli DH5α(pUC19-1.24H-gγ1)
保藏号：FERM BP-5644
保藏日：1996年8月29日
(5) 名称：Escherichia coli DH5α(pUC19-RVLa-AHN-gκ)
保藏号：FERM BP-5645
保藏日：1996年8月29日
(6) 名称：Escherichia coli DH5α(pUC19-1.24L-gκ)
保藏号：FERM BP-5646
保藏日：1996年8月29日
(7) 名称：Escherichia coli DH5α(pUC19-RVHs-AHM-gγ1)
保藏号：FERM BP-6127
保藏日：1997年9月29日
序列表
序列号：1
序列长度：1013
序列类型：核酸
链数：一条链
拓扑学：直链型
序列种类：cDNA
GAATTCGGCA CGAGGGATCT GG ATG GCA TCT ACT TCG TAT GAC TAT TGC 49
Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys
1 5
AGA GTG CCC ATG GAA GAC GGG GAT AAG CGC TGT AAG CTT CTG CTG GGG 97
Arg Val Pro Met Glu Asp Gly Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly
10 15 20 25
ATA GGA ATT CTG GTG CTC CTG ATC ATC GTG ATT CTG GGG GTG CCC TTG 145
Ile Gly Ile Leu Val Leu Leu Ile Ile Val Ile Leu Gly Val Pro Leu
30 35 40
ATT ATC TTC ACC ATC AAG GCC AAC AGC GAG GCC TGC CGG GAC GGC CTT 193
Ile Ile Phe Thr Ile Lys Ala Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu
45 50 55
CGG GCA GTG ATG GAG TGT CGC AAT GTC ACC CAT CTC CTG CAA CAA GAG 241
Arg Ala Val Met Glu Cys Arg Asn Val Thr His Leu Leu Gln Gln Glu
60 65 70
CTG ACC GAG GCC CAG AAG GGC TTT CAG GAT GTG GAG GCC CAG GCC GCC 289
Leu Thr Glu Ala Gln Lys Gly Phe Gln Asp Val Glu Ala Gln Ala Ala
75 80 85
ACC TGC AAC CAC ACT GTG ATG GCC CTA ATG GCT TCC CTG GAT GCA GAG 337
Thr Cys Asn His Thr Val Met Ala Leu Met Ala Ser Leu Asp Ala Glu
90 95 100 105
AAG GCC CAA GGA CAA AAG AAA GTG GAG GAG CTT GAG GGA GAG ATC ACT 385
Lys Ala Gln Gly Gln Lys Lys Val Glu Glu Leu Glu Gly Glu Ile Thr
110 115 120
ACA TTA AAC CAT AAG CTT CAG GAC GCG TCT GCA GAG GTG GAG CGA CTG 433
Thr Leu Asn His Lys Leu Gln Asp Ala Ser Ala Glu Val Glu Arg Leu
125 130 135
AGA AGA GAA AAC CAG GTC TTA AGC GTG AGA ATC GCG GAC AAG AAG TAC 481
Arg Arg Glu Asn Gln Val Leu Ser Val Arg Ile Ala Asp Lys Lys Tyr
140 145 150
TAC CCC AGC TCC CAG GAC TCC AGC TCC GCT GCG GCG CCC CAG CTG CTG 529
Tyr Pro Ser Ser Gln Asp Ser Ser Ser Ala Ala Ala Pro Gln Leu Leu
155 160 165
ATT GTG CTG CTG GGC CTC AGC GCT CTG CTG CAG TGA GATCCCAGGA 575
Ile Val Leu Leu Gly Leu Ser Ala Leu Leu Gln ***
170 175 180
AGCTGGCACA TCTTGGAAGG TCCGTCCTGC TCGGCTTTTC GCTTGAACAT TCCCTTGATC 635
TCATCAGTTC TGAGCGGGTC ATGGGGCAAC ACGGTTAGCG GGGAGAGCAC GGGGTAGCCG 695
GAGAAGGGCC TCTGGAGCAG GTCTGGAGGG GCCATGGGGC AGTCCTGGGT GTGGGGACAC 755
AGTCGGGTTG ACCCAGGGCT GTCTCCCTCC AGAGCCTCCC TCCGGACAAT GAGTCCCCCC 815
TCTTGTCTCC CACCCTGAGA TTGGGCATGG GGTGCGGTGT GGGGGGCATG TGCTGCCTGT 875
TGTTATGGGT TTTTTTTGCG GGGGGGGTTG CTTTTTTCTG GGGTCTTTGA GCTCCAAAAA 935
AATAAACACT TCCTTTGAGG GAGAGCACAC CTTAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 995
AAAATTCGGG CGGCCGCC 1013
序列号：2
序列长度：379
序列类型：核酸
拓扑学：直链型
序列种类：cDNA
ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT 48
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
-15 -10 -5
GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG AGC GCC 96
Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
-1 1 5 10
AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT AAG GCT AGT CAG GAT GTG 144
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val
15 20 25
AAT ACT GCT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA AAG GCT CCA AAG 192
Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
30 35 40 45
CTG CTG ATC TAC TCG GCA TCC AAC CGG TAC ACT GGT GTG CCA AGC AGA 240
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg
50 55 60
TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC ACC TTC ACC ATC AGC AGC 288
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser
65 70 75
CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCT ACC TAC TAC TGC CAG CAA CAT TAT AGT 336
Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser
80 85 90
ACT CCA TTC ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379
Thr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
95 100 105
序列号：3
序列长度：418
序列类型：核酸
拓扑学：直链型
序列种类：cDNA
ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA GGT 48
Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly
-15 -10 -5
GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96
Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
-1 1 5 10
CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC 144
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
15 20 25
ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT 192
Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
30 35 40 45
GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240
Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser
50 55 60
CAG AAG TTC AAG GGC AGA GTC ACC ATG ACC GCA GAC AAG TCC ACG AGC 288
Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser
65 70 75
ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
80 85 90
TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
95 100 105
TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
110 115 120
序列号：4
序列长度：418
序列类型：核酸
拓扑学：直链型
序列种类：cDNA
ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA GGT 48
Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly
-15 -10 -5
GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96
Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
-1 1 5 10
CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC 144
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
15 20 25
ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT 192
Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
30 35 40 45
GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240
Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser
50 55 60
CAG AAG TTC AAG GGC AGA GTC ACC ATC ACC GCA GAC AAG TCC ACG AGC 288
Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser
65 70 75
ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
80 85 90
TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
95 100 105
TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
110 115 120
1-1.杂交瘤的制备
产生本发明中使用的产生抗体的杂交瘤基本上是利用众所周知的技 术，可以按以下方法制备。即，使用显示出HM1.24抗原蛋白质或HM1.24 抗原的细胞作为致敏抗原，按照通常的免疫方法进行免疫，使用通常的 细胞融合方法将得到的免疫细胞与众所周知的亲本细胞融合，利用通常 的筛选方法筛选产生单克隆抗体的细胞，就可以制备杂交瘤。
具体来说，为了制备单克隆抗体可以按如下方法进行。例如，作为能 获得抗体的致敏抗原的HM1.24抗原显示细胞可以使用人多发性骨髓瘤细 胞株KPMM2(特开平7-236475)或KPC-32(Goto，T.等，《日本临床血 液学杂志》(Jpn.J.Clin.Hematol.(1991)32，1400)。作为致敏抗原还 可以使用具有序列号1所示氨基酸序列的蛋白质，或含有抗HM1.24抗体 识别的抗原决定部位的肽或多肽。
另外，作为致敏抗原使用的，具有序列号1所示的氨基酸序列的蛋白 质的cDNA被插入到pUC19载体的Xbal切点之间，制备成质粒pRS38- pUC19。含有这个pRS38-pUC19质粒的大肠杆菌(E.coli)于平成5年 (1993年)10月5日以Escherichia coli DH5α(pRS38-pUC19)保藏 号为FERM BP-4434，按照布达佩斯条约保藏于工业技术院生命工学工业 技术研究所(参照特开平7-196694)。利用包含在pRS38-pUC19质粒中 的cDNA片段通过基因工程手法可以制备含有抗HM1.24抗体识别抗原决 定部位的肽或多肽。
作为可用致敏抗原免疫的哺乳动物虽然没有特别地限定，但最好是在 考虑与细胞融合使用的亲本细胞的适合性后，进行选择。一般来说是使 用啮齿类动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠等。
在用致敏抗原免疫动物时，按照众所周知的方法进行。例如，作为一 般的方法是将致敏抗原注射到哺乳动物的腹腔内或皮下。具体来说，将 致敏抗原用PBS(磷酸盐缓冲盐水Phosphate-Buffered Saline)或生理 盐水适当地稀释，根据需要将悬浊的上述稀释液与常用的佐剂，例如弗 罗因德完全佐剂进行适量混合，乳化后，最好是每隔4-21天对哺乳动 物进行免疫数次。致敏抗原免疫时可以使用适当的载体。
在进行这样免疫，确认血清中所需要的抗体水平上升后，从哺乳动物 中取得免疫细胞，进行细胞融合。用于细胞融合的免疫细胞最好是脾细 胞。
作为与上述免疫细胞融合的另外的亲本细胞的哺乳动物的骨髓瘤细胞 已经知道的各种各样的细胞株都适用，例如，P3X63Ag8.653(《免疫学杂 志》(J.Immnol.)(1979)123：1548-1550)，P3X63Ag8U.1(《当代微生 物学和免疫学论题》(Current Topics in Microbiology and Immunology) (1978)81：1-7)，NS-1(Kohler.G.和Milstein，C.《欧洲免疫学杂 志》(Eur.J.Immunol.)(1976)6：511-519)，MPC-11(Margulies.D.H. 等，《细胞》(Cell)(1976)8：405-415)，SP2/0(Shulman，M.等，《自 然》(Nature)(1978)276：269-270)，FO(de St.Groth，S.F.等，《免 疫学方法杂志》(J.Immunol.Methods)(1980)35：1-21)，S194 (Trowbridge，I.S.《实验医学杂志》J.Exp.Med.(1978)148：313-323)， R210(Galfre，G.等，自然(Nature)(1979)277：131-133)。
上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的融合基本上是按照众所周知的方法进 行，例如可以按照Milstein等人的方法(Kohler.G.和Milstein，C.，《酶 学方法》(Methods Enzymol.)(1981)73：3-46)进行。
更具体来说，上述细胞融合，例如可以在细胞融合促进剂存在下于常 用的营养培养液中实施。作为融合促进剂，例如可以使用聚乙二醇(PEG)、 仙台病毒(HVJ)等，根据需要为了提高融合效率也可以添加二甲基亚砜 等辅助试剂。
免疫细胞与骨髓瘤的使用比例，例如，免疫细胞最好是骨髓瘤细胞的 1-10倍。作为上述细胞融合使用的培养液，例如可以使用适合于上述骨 髓瘤细胞株增殖的RPMI1640培养液、MEM培养液、此外可以使用该种细 胞培养中使用的常用培养液，也可以与胎牛血清(FCS)等血清补液并用。
细胞融合是将上述免疫细胞与骨髓瘤细胞于上述培养液中充分混合， 然后添加事先升温到37℃左右的PEG溶液，例如平均分子量1000-6000 左右的PEG溶液，通常浓度为30-60％(W/V)，通过混合就可形成所需 要的融合细胞(杂交瘤)。然后，通过反复进行逐次添加适当的培养液， 离心除去上清的操作可以除去对杂交瘤的增殖不利的细胞融合剂。
该杂交瘤通过在常用的选择培养液，例如HAT培养液(含有次黄嘌呤、 氨基蝶呤和胸腺嘧啶脱氧核苷的培养液)中培养进行选择。当在HAT培 养液中培养时，为了使除了目的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死掉 的充分时间通常是持续数日～数周。然后实施极限稀释法，进行产生目 的抗体的杂交瘤的筛选和单克隆化。
另外除了用抗原免疫人以外的动物得到上述杂交瘤以外，也可以在体 外用HM1.24抗原或HM1.24抗原显示细胞使人淋巴细胞致敏，致敏的淋 巴细胞再与人骨髓瘤细胞，例如U266融合，也可以得到具有与HM1.24 抗原或HM1.24抗原显示细胞结合活性的所希望的人抗体(参照特公平1 -59878)。另外将成为抗原的HM1.24抗原或HM1.24抗原显示细胞注入 具有人抗体基因全部指令的转基因动物，按照上述方法获得所希望的抗 体也是可以的(国际专利申请公开号WO 93/12227，WO 93/03918，WO 94/02602，WO 94/25585，WO 96/34096，WO 96/33735)。
这样制备的产生单克隆抗体的杂交瘤可以在常用的培养液中进行继代 培养，也可以在液氮中长期保存。
要从该杂交瘤中获得单克隆抗体，可以采用对该杂交瘤按通常的方法 进行培养，获取其培养上清的方法，或采用将杂交瘤注入适合杂交瘤增 殖的哺乳动物中使其增殖，获得其腹水的方法。前者方法适合于获得高 纯度的抗体，后者适用于抗体的大量生产。
具体来说，产生抗HM1.24抗体的杂交瘤的制备可以按照Goto，T.等人 的方法(《血液》(Blood)(1994)84，1922-1930)进行。可以采用平 成7年9月14日以FERM BP-5233按照布达佩斯条约保藏于工业技术院 生命工学工业技术研究所的产生抗HM1.24抗体的杂交瘤注入BALB/c小 鼠(日本クレア制)的腹腔内，得到腹水，从该腹水可以纯化抗HM1.24 抗体的方法，或者是利用将该杂交瘤在适当的培养基，例如含有10％胎 牛血清、5％BM-Condimed H1(Boehringer Mannheim制)的RPMI 1640 培养基、杂交瘤SFM培养基(GIBCO-BRL制)、PFHM-II培养基(GIBCO -BRL制)等培养，从培养上清中纯化抗HM1.24抗体的方法。
1-2.重组型抗体
在本发明中作为单克隆抗体可以从杂交瘤中克隆抗体基因，然后重组 到适当的载体中，再导入宿主，利用基因重组技术生产的重组型抗体。(例 如，参见Carl，A.K.Borrebaeck，James，W.Larrick，《治疗单克隆抗 体》(THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES)，MACMILLAN PUBLISHERS LTD 出版，英国1990)。
具体来说，从产生目的抗体的杂交瘤中分离编码抗体可变区(V)的 mRNA。mRNA的分离可以按照众所周知的方法，例如梯度超离心法 (Chirgwin，J.M.等人，《生物化学》(Biochemistry)(1979)18，5294 -5299)、AGPC法(Chomczynski，P.等人，《分析生物化学》(Analytical Biochemistry)，(1987)162，156-159)，制备总mRNA，使用mRNA纯 化试剂盒(Pharmacia制)等制备mRNA。另外通过使用QuickPrep mRNA 纯化试剂盒(Pharmacia制)可直接制备mRNA。
使用逆转录酶由得到的mRNA合成抗体V区的cDNA。用AMV逆转录酶 第一链cDNA合成试剂盒也可以进行cDNA的合成。而为了进行cDNA的合 成和扩增，可以使用5′-Ampli Finder Race试剂盒(Clontech制)和 PCR的5′-RACE法(Frohman，M.A.等人，《美国国家科学院院报》(Proc. Natl.Acad.Sci.USA)(1988)85，8998-9002；Belyavsky，A等人《核 酸研究》Nucleic Acids Res.(1989)17，2919-2932)。从得到的PCR 产物纯化目的DNA片断，与载体连接。然后作成重组的载体，导入大肠 杆菌，选择茵落制备所希望的重组载体。利用众所周知的方法，例如脱 氧法，确认目的DNA。
如果得到编码目的抗体V区的DNA，将它与编码所希望的抗体的恒定 区(C区)连接，重组入表达载体。而也可以将编码抗体V区的DNA重组 入含有抗体C区DNA的表达载体。
为了制备本发明中使用的抗体，可以象后面叙述的那样，将抗体基因 重组入在表达调控区，例如增强子、启动子的控制下能表达的那样表达 载体中，然后用该表达载体转化宿主细胞，可以使抗体表达。
1-3改变抗体
在本发明中，以使对人的异种抗原性降低等为目的，可以使用人为改 变了的基因重组型抗体，例如嵌合(Chimeric)抗体，类人化(Humanized) 抗体等。这些改型抗体可以用已知的方法进行制造。
嵌合抗体可以通过将上述得到的编码抗体V区的DNA与编码人抗体C 区的DNA连接，然后重组入表达载体，导入宿主使其表达得到(参照欧 洲专利申请公开号EP 125023，国际专利申请公开号WO 96/02576)。使 用这个已知的方法可以得到本发明中有用的嵌合抗体。
例如，含有编码嵌合抗体抗HM1.24抗体的L链V区和H链V区的DNA 质粒的大肠杆菌分别以Escherichia coli DH5α(pUC19-1.24L-gκ) 和Escherichia coli DH5α(pUC19-1.24H-gγ1)的名称于平成8年 8月29日，按照布达佩斯条约于工业技术院生命工学工业技术研究所(茨 域县筑波市东1丁目1番3号)进行国际保藏，保藏号分别为FERM BP- 5646，FERM BP-5644(参见特愿平9-271536)。
类人化抗体也称之改造的(reshaped)人抗体，是将人以外的哺乳动 物，例如小鼠抗体的互补性决定区(CDR：complementarity determining region)移植入人抗体的互补性决定区后形成的抗体，其常用的基因重 组手法也已了解(参照欧洲专利申请公开号EP 125023，国际专利申请公 开号WO 96/02576)。
具体来说，通过PCR法由末端部位含有重叠部分而制成的数个的寡核 苷酸合成一个设计的DNA序列，使小鼠抗体的CDR和人抗体的框架区 (framework region；FR)连接。得到的DNA与编码人抗体C区的DNA 连接，然后重组入表达载体，再将该载体导入宿主使其产生抗体(参照 欧洲专利申请公开号EP 239400，国际专利申请公开号WO 96/02576)。
通过CDR连接的人抗体的FR选择的是互补性决定区形成良好抗原结合 部位的区。根据需要为了使改造的人抗体的互补性决定区形成合适的抗 原结合部位，也可以替换抗体可变区框架区的氨基酸(Sato，K.等，《癌 症研究》Cancer Res.(1993)53，851-856)。
例如，含有编码类人化抗HM1.24抗体的L链V区a区(序列号：2) 以及H链V区r区(序列号：3)的DNA的质粒的大肠杆菌分别以Escherichia coli DH5α(pUC19-RVLa-AHM-gκ)和Escherichia coli DH5α(pUC19 -RVHr-AHM-gγ1)的名称于平成8年8月29日，按照布达佩斯条约 于工业技术院生命工学工业技术研究所(茨域县筑波市东1丁目1番3 号)进行国际保藏，保藏号分别为FERM BP-5645，FERM BP-5643(参 见特愿平9-271536)。另外含有编码类人化抗HM1.24抗体的H链V区s 区(序列号：4)DNA质粒的大肠杆菌以Escherichia coli DH5α(pUC19 -RVHs-AHM-gγ1)的名称的名称于平成8年8月29日，按照布达佩 斯条约于工业技术院生命工学工业技术研究所(茨域县筑波市东1丁目1 番3号)进行国际保藏，保藏号分别为FERM BP-6127(参见特愿平9- 271536)。
在嵌合抗体和类人化抗体中使用了人抗体C区，作为表现出细胞杀伤 活性的人抗体C区，可以使用人Cγ，例如Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4。 其中，特别是含有Cγ1、Cγ3的抗体具有很强的细胞杀伤活性，即具有 ADCC活性、CDC活性，最适用于本发明。
嵌合抗体是由来自人以外的哺乳动物抗体的可变区和来自人抗体的C 区构成的，类人化抗体是由来自人以外的哺乳动物抗体的互补性决定区 以及来自人抗体的框架区(framework region；FR)和C区构成的，为 了使人体内的抗原性降低，作为本发明的治疗剂的有效成分是很有用 的。
作为本发明中使用的类人化抗体的优选具体例子有类人化抗HM1.24抗 体(参见特愿平9-271536)。类人化抗HM1.24抗体的L链V区的优选具 体例子有由序列号2所示碱基序列编码的氨基酸序列。类人化抗HM1.24 抗体的H链V区优选具体例子有由序列号3和4所示碱基序列编码的氨 基酸序列。
1-4.表达和生产
上述构建的抗体基因可以通过众所周知的方法使其表达来获得。若是 哺乳类细胞，抗体基因可以通过含有从功能上使常用的启动子、被表达 的抗体基因、其3′侧下游聚A信号功能性结合的DNA或含有该DNA的载 体使其表达。例如，作为启动子/增强子如人巨细胞病毒前期启动子/增 强子(human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)。
此外，作为本发明使用的抗体的表达中用的启动子/增强子只要使用逆 病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿病毒40(SV40)等病毒启动子/增强子或 来自人延伸因子1α(HEF1α)等哺乳类细胞的启动子/增强子就可以。
例如，使用SV40启动子/增强子时，按照Mulligan等人的方法(《自 然》Nature(1979)277，108)、使用HEF1α启动子/增强子时，按照 Mizushima等人的方法(《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)(1990)18， 5322)可以很容易实施。
若是大肠杆菌，可以从功能上使常用的启动子、抗体分泌用的信号序 列、被表达的抗体基因功能性结合，使其表达。例如作为启动子有1acz 启动子、araB启动子。使用1acz启动子时，按照Ward等人的方法(《自 然》Nature(1980)343，544-546；FASEB J.(1992)6，2422-2427) 进行，使用araB启动子时，可以按照Better等人的方法(《科学》Sciense (1988)240，1041-1043)实施。
作为抗体分泌用的信号序列，使抗体在周质中产生时，只要使用pelB 信号序列(Lei，S.P.等，《细茵学杂志》J.Bacteriol.(1987)169，4379) 就可以。产生在周质的抗体分离后，对抗体的结构进行适当的再折叠后 就可以使用了(例如，参照WO 96/30394)。
作为复制起源可以使用来自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头状瘤 病毒(BPV)等的起源，另外为了在宿主细胞系中扩增基因拷贝数，表达 载体作为选择标记可以含有氨基糖苷转移酶(APH)基因、胸腺嘧啶核苷 激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基 因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等。
为了制造本发明中使用的抗体可以使用任意的产生体系。抗体制造用 产生体系有体外(体外(in vitro))和体内(体内(in vivo))产生体系。 作为体外产生体系可以举出使用真核细胞的产生体系和使用原核细胞的 产生体系的例子。
使用真核细胞时，有使用动物细胞、植物细胞和真菌细胞的产生体系。 作为动物细胞已知有(1)哺乳类细胞，例如CHO，COS，骨髓瘤、BHK(乳 仓鼠肾baby hamster kidney)，Hela，Vero，(2)两栖类细胞，例如非洲 蛙卵母细胞、或(3)昆虫细胞，例如sf9，sf21，Tn5等。作为植物细 胞已知有来自烟草属(Nicotiana)，例如烟草Nicotiana tabacum的细 胞，只要进行愈伤组织培养就可以。作为真菌细胞已知有酵母，例如酵 母(Saccharomyces)属，例如酿酒酵母(Saccharomyces serevisiae)， 霉菌，例如曲霉属(Aspergillus)，例如黑曲霉(Aspergillus niger) 等。
使用原核细胞时，有使用细菌细胞的产生体系。作为细菌细胞已知有 大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌。
这些细胞通过转化将作为目的基因的抗体基因导入，经过在体外对转 化的细胞进行培养就可得到抗体。培养按照众所周知的方法进行。例如， 作为培养液可以使用DMEM、MEM、RPMI 1640、IMDM，也可以同时使用胎 牛血清(FCS)等血清补液。另外通过将已导入抗体基因的细胞移入动物 的腹腔，也可以在体内(in vivo)产生抗体。
另外作为体内(in vivo)的产生体系，可以举出使用动物的产生体系和 使用植物的产生体系。使用动物时，有使用哺乳类动物、昆虫的产生体 系。
作为哺乳类动物可以使用山羊、猪、绵羊、小鼠、牛等(Vicki Glaser， 光谱生物技术应用(SPECTRUM Biotechnology Application)，1993)。 另外作为昆虫可以使用蚕。
使用植物时，可以用烟草。
将抗体基因导入这些动物或植物，使动物或植物体内产生抗体，然后 再回收。例如，将抗体基因插入编码如山羊β-酪蛋白之类的乳汁中固有 产生的蛋白质的基因中，制备融合基因。然后将含有插入了抗体基因的 融合基因的DNA片段注入山羊的胚内，将该胚导入雌性山羊。从接受了 胚的山羊产下的转基因山羊或其后代产生的乳汁中可以获得所希望的抗 体。为了使从转基因山羊产生的含有所希望的抗体的乳汁量增加，可以 对转基因山羊使用适当的激素(Ebert，K.M.等，生物/技术 (Bio/Technology)(1994)12，699-702)。
当使用蚕时，用插入了目的抗体基因的杆状病毒感染蚕，然后从感染 的蚕的体液获得所希望的抗体(Susumu，M.等，《自然》Nature(1985)315， 592-594)。在使用烟草时，将目的抗体基因插入植物表达用载体，例如 pMON530，然后将该载体导入根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumeraciens) 一类的细菌中。使该细菌感染烟草，例如烟草(Nicotiana tabacum)， 从该烟草的叶子中提取所希望的抗体(Julian，K.-c，Ma等《欧洲免疫学 杂志》(Eur.J.Immunol.)(1994)24，131-138)。
象上述那样利用体外(in vitro)或体内(in vivo)的产生体系产生抗 体时，可以将编码抗体重链(H链)或轻链(L链)的DNA分别重组入表 达载体中，同时转化宿主，或者将编码H链和L链的DNA重组入单一的 一个表达载体后，转化宿主也可以(参照国际专利申请公开号WO 94- 11523)。
使象上述那样得到的抗体与聚乙二醇(PEG)等各种分子结合，也可以 作为抗体修饰物使用。本专利申请权利要求的范围中，所谓“抗体”也 包括这些抗体修饰物。为了得到这样的抗体修饰物，通过对得到的抗体 进行化学修饰就可实现。这些方法在该领域已经确立。
2.抗体的分离、纯化
2-1.抗体的分离、纯化
象上述那样产生、表达的抗体可以从细胞内外、宿主中分离纯化至均 一。本发明中使用的抗体的分离、纯化可以利用亲和层析进行。作为亲 和层析所用的柱子，例如有蛋白A柱、蛋白G柱。蛋白A柱中用的载体， 例如有Hyper D，POROS，Sepharose F.F.等。
此外，只要使用通常蛋白质中使用的分离、纯化方法就可以，并没有 什么限定。例如通过适当选择、或联合使用除了上述亲和层析以外的层 析、过滤、超滤、盐析、透析等方法，就可以分离、纯化本发明中使用 的抗体。作为层析，例如有离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤等。这 些层析也适用于HPLC。另外也可以使用反相HPLC。
2-2.抗体浓度的测定
2-1中得到的抗体的浓度测定可以通过吸光度测定或ELISA进行。即， 通过吸光度测定时，将本发明中使用的抗体或含有抗体的样品用PBS(-) 适当稀释后，测定280nm的吸光度，以1mg/ml作为1.350D就可以算出 浓度。而利用ELISA测定时可以按以下方法测定。即，将用0.1M重碳酸 缓冲液(pH9.6)稀释成1μg/ml的山羊抗人IgG(BIO SOURCE制)100 μl加到96孔板(Nunc制)，于4℃下温育过夜，使抗体固相化。
封闭后，添加适当稀释的本发明中使用的抗体或含抗体的样品，以及 作为标准样品的人IgG(CAPPEL制)100μl，于室温保温1小时。洗净 后，添加5000倍稀释的碱性磷酸酶标记的抗IgG(BIOSOURCE制)100μ l，于室温保温1小时。洗净后，加入底物溶液，温育后，使用MICROPLATE READER Model 3550(Bio-Rad制)测定405nm的吸光度，可以算出目的 抗体的浓度。
3.FCM解析
淋巴细胞系肿瘤与本发明中使用的抗体的反应性可以通过FCM(流式 细胞计)解析进行。作为细胞可以用树立细胞株或新分离细胞。例如作 为树立细胞株可以使用作为T细胞的RPMI 8402(ATCC CRL-1994)、来 自急性成淋巴细胞白血病的CCRF-CEM(ATCC CCL-119)、来自急性淋巴 性白血病的HPB-ALL(FCCH1018)、来自T淋巴肿瘤的HPB-MLT (FCCH1019)、来自急性淋巴性白血病的JM(FCCH1023)、来自急性成淋 巴细胞白血病的MOLT-4(ATCC CRL-1582)、来自急性淋巴性白血病的 Jurkat(FCCH1024)、来自急性成淋巴细胞白血病的CCRF-HSB-2(ATCC CRL -120.1)、来自成人T细胞白血病的MT-1(FCCH1043)、来自レンネル ト淋巴肿瘤的KT-3(Shimizu，S.等，《血液》Blood(1988)71，196-203) 等，作为B细胞株可以使用EB病毒转化细胞CESS(ATCC TIB-190)、EB 病毒阳性B细胞SKW6.4(ATCC TIB-215)、来自B淋巴肿瘤的MC116(ATCC CRL-1649)、来自急性成淋巴细胞白血病的CCRF-SB(ATCC CCL-120)、 来自急性骨髓性白血病患者的B细胞RPMI 6410(FCCH6047)、来自Burkitt 淋巴肿瘤的Daudi(ATCC CCL-213)、来自Burkitt淋巴肿瘤的EB-3(ATCC CCL-85)、来自Burkitt淋巴肿瘤的Jijoye(ATCC CCL-87)、来自Burkitt 淋巴肿瘤的Raji(ATCC CCL-86)等，也可以使用作为非T非B细胞株 的来自骨髓性白血病HL-60(ATCC CCL-240)、来自急性单核细胞白血 病的THP-1(ATCC TIB-202)、来自组织细胞性白血病的U-937(ATCC CRL -1593)、来自慢性骨髓性白血病的K-562(ATCC CCL-243)、等细胞。
用PBS(-)洗净上述细胞后，加入用FACS缓冲液(含有2％胎牛血 清、0.1％叠氮钠的PBS(-))稀释到25μg/ml的抗体或对照抗体100 μl，冰中放置30分钟。用FACS缓冲液洗净后，加入25μg/ml的FITC 标记的山羊抗小鼠抗体(GAM，Becton Dickinson制)的抗体100μl，冰 中放置30分钟。用FACS缓冲液洗净后，悬浮于600μl或1ml的FACS 缓冲液中，用FACScan(Becton Dickinson制)测定各个细胞的荧光强 度。
从各个细胞的荧光强度的测定值可以知道本发明中使用的抗体和各个 细胞的反应性。就是说，从各个细胞的荧光强度的测定值就可以知道各 个细胞中HM1.24抗原是否显示出来(阳性或阴性)以及显示的强度。有 关淋巴细胞系肿瘤中HM1.24抗原的显示有无以及显示强度记载于下面的 实施例2.2.FCM解析中。
成为本发明治疗对象的淋巴细胞系肿瘤的肿瘤细胞显示出HM1.24抗 原。更详细地说，理想的淋巴细胞系肿瘤的肿瘤细胞是HM1.24抗原阳性 的百分数不小于5％的肿瘤细胞。更详细地说，理想的淋巴细胞系肿瘤的 肿瘤细胞是HM1.24抗原阳性的百分数在20％以上的肿瘤细胞。再详细地 说，理想的淋巴细胞系肿瘤的肿瘤细胞是HM1.24抗原阳性的百分数在50 ％以上的肿瘤细胞。再详细地说，理想的淋巴细胞系肿瘤的肿瘤细胞是 HM1.24抗原阳性的百分数在80％以上的肿瘤细胞。
4.细胞杀伤活性
4-1.CDC活性的测定
本发明使用的抗体是具有作为细胞杀伤活性的抗体，例如CDC活性的 抗体。
本发明的淋巴细胞系肿瘤治疗剂对淋巴细胞系肿瘤的CDC活性可以按 以下方法测定。首先将用适当的培养基，例如含有10％胎牛血清(GIBCO -BRL制)的RPMI 1640培养基(GIBCO-BRL制)将靶细胞调整至4×105 个/ml。作为靶细胞可以用CCRF-CEM(ATCC CCL-119)、CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1)、HPB-MLT(FCCH1019)、EB-3(ATCC CCL-85)、 MC116(ATCC CRL-1649)、CCRF-SB(ATCC CCL-120)、K-562(ATCC CCL -243)等。将这些细胞50μl加入到96孔平底板(FALCON制)中。于 37℃、CO2条件下在培养箱中培养过夜。
然后，加入测定CDC活性的抗体，温育60分钟后，加入适当稀释的补 体，例如乳兔补体(Baby Rabbit Complement)(CEDARLANE制)，温育2 小时。然后向各个孔中加入Alamar Bule(BIO SOURCE制)10μl，温育 4小时后，用荧光测定系统CytoFluor 2350(MILLIPORE制)测定各孔的 荧光强度(激发波长530nm，检测波长590nm)。细胞杀伤活性(％)可 以用(A-C)/(B-C)×100计算。其中，A是抗体存在下温育后的荧 光强度，B是不含抗体只是培养液温育后的荧光强度，C是不含细胞的孔 的荧光强度。
4-2.ADCC活性测定
本发明使用的抗体是具有作为细胞杀伤活性的抗体，例如ADCC活性的 抗体。
本发明的淋巴细胞系肿瘤治疗剂对淋巴细胞系肿瘤的ADCC活性可以按 以下方法测定。首先，用比重离心法从人的外周血液中分离出单核细胞， 制备成效应细胞。而作为靶细胞通过用51Cr标记CCRF-CEM(ATCC CCL- 119)、CCRF-HSB-2(ATCC CCL-120.1)、HPB-MLT(FCCH1019)、EB- 3(ATCC CCL-85)、MC116(ATCC CRL-1649)、CCRF-SB(ATCC CCL-120)、 K-562(ATCC CCL-243)等，制备成靶细胞。接下来，向标记的靶细胞 加入测定ADCC活性的抗体，温育，然后加入对靶细胞恰当比例的效应细 胞，温育。
取温育后的上清，用γ计数器测定放射活性。此时，在最大游离放射 能测定中可以使用1％的NP-40。细胞杀伤活性(％)可以用(A-C)/ (B-C)×100计算。其中，A是抗体存在下游离的放射活性(％)，B是 通过NP-40游离出的放射活性(cpm)，C是不含抗体只含培养液而游离 出的放射活性(cpm)。
4-3.细胞杀伤活性的增强
为了发挥象ADCC活性和CDC活性那样的细胞杀伤活性，对于人最好使 用作为抗体恒定区(C区)的Cγ、特别是Cγ1、Cγ3。另外通过对抗体 C区的氨基酸进行部分增加、改变、修饰，可以诱导更强的ADCC活性或 CDC活性。
例如，通过氨基酸转换的IgG象IgM那样的聚合化(Smith， R.I.F.&Morrison，S.L.《生物/fsy》BIO/TECHNOLOGY(1994)12，683 -688)，通过附加氨基酸的IgG象IgM那样的聚合化(Smith，R.I.F.等， 《免疫学杂志》(J.Immunology)(1995)154，2226-2236)，通过编码L 链的基因的串联的表达(Shuford，W.等，《科学》Science(1991)252， 724-727)，通过氨基酸转换引起的IgG的二聚体化(Caron，P.C.等，《实 验医学杂志》J.Exp.Med.(1992)176，1191-1195，Shopes，B.，《免疫 学杂志》J.Immunology(1992)148，2918-2922)，通过化学修饰引起IgG 的二聚体化(Wolff，E.A.等，《癌症研究》Cancer Res.(1993)53，2560 -2565)，以及通过抗体铰链区氨基酸的改变引起的效应功能的导入 (Norderhaug，L.等，《欧洲免疫学杂志》(Eur.J.Immunol.)(1991)21， 2379-2384)。这些变化通过利用引物的寡聚物部位特异的变异导入法， 利用限制酶切部位的碱基序列的添加，以及使用可以引起共价结合的化 学修饰剂都可实现。
5.治疗效果的确认
为了确认本发明的淋巴细胞系肿瘤治疗剂的治疗效果，可以将本发明 中使用的抗体注入移植了淋巴细胞系肿瘤细胞的动物，通过评价抗肿瘤 效果得出。
作为向动物移植的淋巴细胞型肿瘤细胞，可以使用树立细胞株或新分 离的细胞。例如作为树立细胞可以用作为T细胞的CCRF-CEM(ATCC CCL -119)、HPB-MLT(FCCH1019)、MOLT-4(ATCC CRL-1582)、CCRF-HSB -2(ATCC CCL-120.1)等，作为B细胞的CESS(ATCC TIB-190)、SKW6.4 (ATCC TIB-215)、CCRF-SB(ATCC CCL-120)、RPMI 6410(FCCH6047)、 EB-3(ATCC CCL-85)等。
作为被移植的动物，用免疫功能低下或欠缺的动物最好，例如可以用 裸小鼠、SCID小鼠、本色小鼠、裸大鼠等。进行评价的抗肿瘤效果的确 认可以利用肿瘤体积和重量的测定以及动物的生存期间等进行。
就象下述的实施例所给出的那样，通过将抗HM1.24抗体注入人淋巴细 胞系肿瘤移植鼠，确认肿瘤体积的增加的抑制、肿瘤移植鼠的生存期间 进一步延长。这些现象表明抗HM1.24抗体对淋巴细胞系肿瘤有抗肿瘤效 果。
6.给药途径和制剂
本发明的淋巴细胞系肿瘤治疗剂可以非口服的全身或局部给药。例如， 可以选择点滴等静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射，可以根据 患者的年龄、症状选择合适的给药方式。有效的给药量每一次每1kg体 重在0.01mg至100mg的范围内选择，或者每个患者选择1-100mg，最好 是5-50mg给药量。
本发明的淋巴细胞系肿瘤治疗剂即使是同时含有由给药途径决定，医 药上容许的载体和添加物也可以。作为这样的载体和添加物的例子有水、 医药上容许的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯 聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧 甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、呫吨胶(xanthan gum) 阿拉伯树胶、酪蛋白、明胶、琼脂、一缩二甘油、丙(撑)二醇、聚乙 二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HAS)、甘露糖 醇、山梨糖醇、乳糖、作为医药添加物容许的表面活性剂等。使用的添 加物根据剂型，可以从上述的化合物中选择合适的或组合使用，这些并 没有特别限定。
作为本发明的治疗对象疾病，是作为靶细胞的肿瘤细胞上存在结合本 发明中使用的抗体的抗原的，除骨髓瘤之外的淋巴细胞系肿瘤。具体来 说，有急性B淋巴性白血病(B-ALL)、慢性B淋巴白血病(B-CLL)、pre -B淋巴肿瘤、Burkitt淋巴肿瘤、滤胞性淋巴肿瘤、滤胞外套淋巴肿瘤、 弥漫性淋巴肿瘤、急性T淋巴性白血病(T-ALL)、慢性T淋巴白血病(T -CLL)、成人T细胞白血病(ATL)、非ATL外周性T淋巴肿瘤(PNTL) 等。本发明的治疗剂作为这些淋巴细胞系肿瘤的治疗剂是有用的。
实施例
下面，通过实施例进一步具体地说明本发明，但本发明并不限定于这 些实施例。
实施例1.抗HM1.24抗体的制备
1.含抗HM1.24抗体的小鼠腹水的制备
根据Goto，T.等人的方法(《血液》(Blood)(1994)84，1922-1930) 得到产生抗HM1.24抗体的杂交瘤。
首先向于3日前已将2，6，10，14-四甲基十五烷(和光纯药工业制)各 500μl注入了腹腔内的小鼠(日本クレア制)，再注入该杂交瘤5×106 个。从杂交瘤注入第十天开始，用19口径的留置针ハツピ-キヤス(メ デイキツト制)取小鼠腹腔中的腹水。采得的腹水用低速离心机RLX-131 (トミ-精工制)离心两次，转数分别为1000，3000rpm，除去杂交瘤、 血细胞等杂物。
2.从小鼠腹水中纯化抗HM1.24抗体
从上述小鼠腹水中纯化抗HM1.24抗体可以按以下方法进行。向小鼠腹 水中加入等量的PBS(-)后，使用中空纤维フイルタ-メデイアフレツプ (MILLIPORE制)进行过滤，用高速抗体纯化装置Consep LC100(MILLIPORE 制)和Hyper D Protein A柱(柱体积20ml、日本ガイシ制)按照附带的 说明书，作为吸附缓冲液使用PBS(-)，作为洗脱液使用0.1M柠檬酸钠 缓冲液(pH4)，进行亲和纯化。洗脱级分在洗脱出来之后马上添加1M Tris-HCl(pH8.0)，然后将pH调整到pH7.4附近，然后使用离心超滤浓 缩器Centriprep 10进行浓缩和将缓冲液置换为PBS(-)，用孔径0.22 μm的膜过滤器MILLEX-GV(MILLIPORE制)过滤灭菌，得到纯化的抗 HM1.24抗体。
3.抗体浓度的测定
纯化抗体浓度的测定是通过吸光度的测定进行的。即纯化抗体用PBS (-)适当稀释后，测定280nm的吸光度，以1mg/ml作为1.350D就可以 算出浓度。
实施例2.抗HM1.24抗体对淋巴细胞系肿瘤细胞反应性的研究
1.对照小鼠IgG2a的纯化
对照小鼠IgG2a的纯化按照以下方法进行。市售的mouse IgG2a(KAPPA)(UPC 10)ascites(CAPPEL制)用精制水和PBS(-)溶解。 然后用孔径0.2μm的膜过滤器Acrodisc(Gelman Sciences制)过滤后， 用高速抗体纯化装置Consep LC100(MILLIPORE制)和Hyper D Protein A 柱(柱体积20ml、日本ガイシ制)按照附带的说明书，作为吸附缓冲液 使用PBS(-)，作为洗脱液使用0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH4)，进行亲和 纯化。洗脱级分在洗脱出来之后马上添加1Mtris-HCl(pH8.0)后，将pH 调整到pH7.4附近，然后使用离心超滤浓缩器Centriprep 10进行浓缩 和将缓冲液置换为PBS(-)，用孔径0.22μm的膜过滤器MILLEX- GV(MILLIPORE制)过滤灭菌，得到纯化的对照小鼠IgG2a。
纯化的对照小鼠IgG2a的浓度测定按照上述3的抗体浓度测定进行。
2.FCM解析
抗HM1.24抗体对淋巴细胞系肿瘤细胞反应性的研究可以通过FCM(流 式细胞计)解析进行。可以使用作为T细胞的RPMI 8402(ATCC CRL-1994)、 来自急性淋巴性白血病的CCRF-CEM(ATCC CCL-119)、来自急性成淋巴 细胞白血病的HPB-ALL(FCCH1018)、来自T淋巴肿瘤的HPB-MLT (FCCH1019)、来自急性淋巴性白血病的JM(FCCH1023)、来自急性淋巴 细胞性白血病的MOLT-4(ATCC CRL-1582)、来自急性成淋巴细胞白血 病的Jurkat(FCCH1024)、来自急性成淋巴细胞白血病的CCRF-HSB-2 (ATCC CRL-120.1)、来自成人T细胞白血病的MT-1(FCCH1043)、来 自レンネルト淋巴肿瘤的KT-3(Shimizu，S.等，《血液》Blood(1988) 71，196-203)等，可以使用作为B细胞株的EB病毒转化细胞CESS(ATCC TIB-190)、EB病毒阳性B细胞SKW6.4(ATCC TIB-215)、来自B淋巴 肿瘤的MC116(ATCC CRL-1649)、来自急性成淋巴细胞白血病的CCRF- SB(ATCC CCL-120)、来自急性骨髓性白血病患者的B细胞RPMI 6410 (FCCH6047)、来自Burkitt淋巴肿瘤的Daudi(ATCC CCL-213)、来自 Burkitt淋巴肿瘤的EB-3(ATCC CCL-85)、来自Burkitt淋巴肿瘤的 Jijoye(ATCC CCL-87)、来自Burkitt淋巴肿瘤的Raji(ATCC CCL-86) 等，也可以使用作为非T非B细胞株的来自骨髓性白血病HL-60(ATCC CCL -240)、来自急性单核细胞白血病的THP-1(ATCC TIB-202)、来自组 织细胞性白血病的U-937(ATCC CRL-1593)、来自慢性骨髓性白血病的 K-562(ATCC CCL-243)、等细胞。用PBS(-)洗净上述细胞后，加入 用FACS缓冲液(含有2％胎牛血清、0.1％叠氮钠的PBS(-))稀释到25 μg/ml的抗HM1.24抗体或对照小鼠IgG2a100μl，冰中放置30分钟。
用FACS缓冲液洗净后，加入25μg/ml的FITC标记的山羊抗小鼠抗 体(GAM)100μl，冰中放置30分钟。用FACS缓冲液洗净后，悬浮于600 μl或1ml的FACS缓冲液中，用FACScan(Becton Dickinson制)测定 各个细胞的荧光强度。测定结果如图1～23所示，确认若是用T细胞则 是全部例子，而若是用B细胞，除Daudi，Raji 2类没有反应外，其它例 子都可与抗HM1.24抗体反应，表现出高HM1.24抗原性。另外非T非B 细胞株全部例子都不能与抗HM1.24抗体反应，也不能检测出抗原显示。
在图1～23的各个细胞的直方图中，使用对照小鼠IgG2a的染色，使 阴性细胞为98％，阳性细胞为2％那样设定直方图标示，按照该直方图 标示，可以算出使用抗HM1.24抗体时的HM1.24抗原阳性细胞的百分数， 结果如表1所示。从HM1.24抗原阳性细胞的百分数可以将HM1.24抗原 显示率分为-、+/-、+、++、+++5个区段，结果表明与图1～23 一样，T细胞株全部例子、而B细胞株除去Daudi，Raji其它都显示为+ +或+++的非常高的HM1.24抗原性。而非T非B细胞株全部例子中， HM1.24抗原阳性细胞不到5％，这表明没有抗原的显示，或是非常少。
表1
细胞名 显现率
B细胞株 CESS +++ 94.5
SKW6.4 +++ 92.8
MC116 ++ 65.0
CCRF-SB +++ 98.4
RPMI6410 +++ 94.5
EB-3 +++ 88.3
Jijoye +++ 92.3
Daudi - 2.8
Raji - 2.0
T细胞株
RPMI8402 +++ 94.0
CCRF-CEM +++ 97.8
HPB-ALL ++ 63.8
HPB-MLT +++ 94.6
JM +++ 99.6
MOLT-4 +++ 84.1
Jurkat ++ 70.9
CCRF-HSB-2 +++ 100.0
MT-1 +++ 95.9
KT-3 +++ 96.0
非T非B细胞株
HL-60 - 2.9
THP-1 - 1.5
U-937 - 1.1
K-562 - 3.9
实施例3.CDC活性的测定
抗HM1.24抗体对淋巴细胞类肿瘤细胞的CDC活性按以下方法测定。
1.靶细胞的制备
用含有10％胎牛血清(GIBCO-BRL制)的RPMI 1640培养基(GIBCO -BRL制)将作为靶细胞的来自急性淋巴性白血病的CCRF-CEM(ATCC CCL -119)、来自急性成淋巴细胞白血病的CCRF-HSB-2(ATCC CRL-120.1)、 来自T淋巴肿瘤的HPB-MLT(FCCH1019)、来自Burkitt淋巴肿瘤的EB -3(ATCC CCL-85)、来自B淋巴肿瘤的116(ATCC CRL-1649)、来自 急性淋巴性白血病的CCRF-SB(ATCC CCL-120)、来自骨髓性白血病K562 (ATCC CCL-243)调整至4×105个/ml。将这些细胞悬浊液50μl加入 到96孔平底板(FALCON制)中，于37℃、CO2条件下在培养箱中(TABAI 制)培养过夜。
2.抗HM1.24抗体的制备
用含有10％胎牛血清(GIBCO-BRL制)的RPMI 1640培养基(GIBCO -BRL制)将上述实施例1中得到的纯化抗HM1.24抗体调整为0，0.2， 2，20μg/ml，然后向上述1中制作的96孔平板的各孔中各加入50μl。 于37℃、5％CO2条件下在高湿培养箱中(TABAI制)培养60分钟后，用 低速离心机05PR-22(日立制)，1000rpm，离心5分钟，除去上清50μ l。
3.补体的制备
每1小玻璃瓶1ml的精制水溶解“乳鼠补体”(Baby Rabbit Complement)(CEDARLANE制)，再用不含FCS的RPMI1640培养基(GIBCO -BRL制)5ml稀释。然后加入到上述2的96孔平板的各孔中，每孔50 μl，于37℃、5％CO2条件下在高湿培养箱中(TABAI制)培养2小时。
4.CDC活性的测定
培养后，向上述3的96孔平板各孔中各加入Alamar Bule(BIO SOURCE 制)10μl，于37℃、5％CO2条件下在高湿培养箱中(TABAI制)温育4 小时后，用荧光测定系统CytoFluor 2350(MILLIPORE制)测定各孔的 荧光强度(激发波长530nm，检测波长590nm)。细胞杀伤活性(％)可 以用(A-C)/(B-C)×100计算。其中，A是抗体存在下温育后的荧 光强度，B是不含抗体只是培养液温育后的荧光强度，C是不含细胞的孔 的荧光强度。
测定结果就象图24和25给出的那样。在FCM解析中没有与抗HM1.24 抗体反应的K562即使添加抗HM1.24抗体也不引起细胞杀伤，与此相反， 与抗HM1.24抗体反应的CCRF-CEM，CCRF-HSB-2，HPB-MLT，EB-3， MC116和CCRF-SB可以看到细胞杀伤依赖于抗HM1.24抗体的浓度。这一 现象表明抗HM1.24抗体对细胞表面存在抗HM1.24抗体特异结合的抗原 蛋白的淋巴细胞系肿瘤显示出CDC活性。
实施例4.抗HM1.24抗体对人淋巴细胞系肿瘤移植小鼠的抗肿瘤效果
1.实验用抗体的制备
1-1.抗HM1.24抗体的制备
上述实施例1中得到的纯化抗HM1.24抗体用过滤灭茵的PBS(-)调 整为1mg/ml，200μg/ml，用于以下实验。
1-2.对照小鼠IgG2a的制备
上述实施例2中得到的纯化抗HM1.24抗体用过滤灭菌的PBS(-)调 整为1mg/ml，用于以下实验。
2.抗HM1.24抗体对人淋巴细胞系肿瘤移植小鼠的抗肿瘤效果
2-1.人淋巴细胞系肿瘤移植鼠的制备
人淋巴细胞系肿瘤移植鼠可以象以下那样制备。用含有10％胎牛血清 (GIBCO-BRL制)的RPMI1640培养基将使用SCID小鼠(日本クレア) 体内(in vivo)传代的来自急性成淋巴细胞系白血病CCRF-HSB-2细胞 (ATCC CRL-120.1)调整为1×108个/ml。将上述制备的细胞悬浊液注 入于前一天腹腔注入了抗唾液酸基缺乏GM1(和光纯药工业制)100μl 的SCID小鼠(雄性、6周龄)(日本クレア)的腹部皮下。
2-2.抗体注入
肿瘤移植后第7天，用卡尺测量急性淋巴细胞肿瘤移植小鼠CCRF-HSB -2移植部位的肿瘤直径，算出肿瘤体积后，使各组的肿瘤体积的平均值 大致相等那样进行分组(各组都是8只，共3组)。从同日开始，将上述 1制备的1mg/ml或200μg/ml的抗HM1.24抗体，以及对照小鼠IgG2a各 100μl注入各群鼠腹腔中。每周注入2次，同样注入总计进行19次。注 入期间，每周两次用卡尺测量肿瘤直径，算出肿瘤体积。
2-3.抗HM1.24抗体对人淋巴细胞系肿瘤移植鼠抗肿瘤效果的评价
关于抗HM1.24抗体抗肿瘤效果是用肿瘤体积的变化和小鼠的生存期 间评价的。结果如图26所示的那样，抗HM1.24抗体注入组与对照鼠IgG2a 注入组相比，其肿瘤体积的增加被抑制了。又如图27所示，抗HM1.24 抗体注入组与对照鼠IgG2a注入组相比，可以看到其生存期间延长了。 以上现象表明抗HM1.24抗体对人淋巴细胞系肿瘤移植鼠具有抗肿瘤效 果。
参考例1.产生小鼠抗HM1.24抗体杂交瘤的制备
按照Goto，T.等，《血液》(Blood)(1994)84，1922-1930记载的 方法制备产生鼠抗HM1.24抗体杂交瘤。
将取自人多发性骨髓瘤患者骨髓的浆细胞株KPC-32(1×107个) (Goto，T.等，《日本临床血液学杂志》Jpn.J.Clin.Hematol.(1991) 32，1400)相隔6周向BALB/C小鼠(チヤ-ルスリバ-制)的腹腔内注 入两次。
为了使小鼠的抗体效价进一步提高，在处死小鼠之前3天再向小鼠的 脾脏内注入1.5×106个KPC-32(Goto，T.等，《德岛实验医学杂志》 Tokushima J.Exp.Med.(1990)37，89)。在将小鼠处死后，摘出脾脏， 按照Groth，de St.&Schreidegger的方法(《癌症研究》Cancer Research (1981)41，3465)，使摘出的脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。
通过使用KPC-32的Cell ELISA(Posner，M.R.等，《免疫学方法杂 志》(J.Immunol.Methods)(1982)48，23)进行杂交瘤培养上清中的抗 体的筛选。将5×104个的KPC-32悬浮于50ml的PBS中，分别注入96 孔板(U型，Corning，Iwaki制)，于37℃风干过夜。用含有1％血清白 蛋白(BSA)封闭后，加入杂交瘤培养上清，于4℃培养2小时。然后使 其与过氧化物酶标记的抗小鼠IgG山羊抗体(Zymed制)反应，洗净后， 于室温与间苯二胺底物溶液(Sumitomo Bakelite制)反应30分钟。
用2N硫酸中止反应，用ELISA reader(Bio-Rad制)测定492nm处 的吸光度。为了除去产生抗人免疫球蛋白抗体的杂交瘤，首先使阳性杂 交瘤培养上清吸附于人血清，通过ELISA筛选对其它细胞株的反应性。 选择阳性的杂交瘤，用流式细胞测量法研究对各种细胞的反应性。对最 后选择的杂交瘤克隆进行2次克隆，再将它注入进行了降植烷处理的 BALB/C小鼠的腹腔，取得腹水。
单克隆抗体可以通过硫酸铵沉淀和蛋白A亲和层析试剂盒(Ampure PA、 Amersham)从小鼠的腹水中纯化。纯化抗体通过使用Quick Tag FITC结 合试剂盒(Boehringer Mannheim制)进行FITC标记。
结果30个杂交瘤克隆产生的单克隆抗体可以与KPC-32和RPMI8226 反应。克隆后，考查这些杂交瘤的培养上清与其它细胞株或外周血液单 核细胞的反应性。
其中有3个克隆是对浆细胞特异反应的单克隆抗体。这3个克隆中， 在流式细胞测量法中最有用的，而且选择对RPMI8226具有CDC活性的 杂交瘤克隆，取名HM1.24。这个杂交瘤产生的单克隆抗体的亚类是通过 使用了亚类特异的抗小鼠兔抗体(Zymed制)的ELISA确定的。抗HM1.24 抗体具有IgG2aκ亚类。产生抗HM1.24抗体的杂交瘤HM1.24于平成7年 9月14日，以FERM BP-5233的名称，按照布达佩斯条约于工业技术院 生命工学工业技术研究所(茨城县筑波市东1丁目3号)进行国际保藏。
参考例2.类人化抗HM1.24抗体的制备
类人化抗HM1.24抗体通过下述方法得到。
从参考例1中制备的杂交瘤HM1.24中利用常规方法制备总RNA。通过 聚合酶链式反应(PCR)法和5′-RACE法由总RNA合成、扩增编码小鼠 抗体V区的cDNA，得到含有编码小鼠抗体V区基因的DNA片段，将这些 DNA片段分别连接于各个质粒pUC系克隆载体中，导入大肠杆菌感受态细 胞，得到大肠杆菌转化体。从该转化体可以得到上述质粒，通过常规方 法可以确定质粒中的cDNA编码区的碱基序列，进而确定各个V区的互补 决定区(CDR)。
为了制备表达嵌合抗HM1.24抗体的载体，将分别编码小鼠抗HM1.24 抗体L链和H链V区的cDNA插入HEF载体。而为了制备类人化抗HM1.24 抗体，利用CDR移植法将小鼠抗HM1.24抗体的V区CDR向人抗体移植。 作为人抗体的L链用人抗体REI的L链，而关于作为人抗体H链的框架 区(FR)1-3，使用人抗体HG3的FR1-3，对于FR4使用人抗体JH6的 FR4。为了使移植了CDR的抗体形成恰当的抗原结合部位进行了H链V区 的FR的氨基酸置换。
为了使这样制备的类人化抗HM1.24抗体的L链和H链的基因能在哺乳 动物细胞中表达，将各个基因分别导入HEF载体，制备表达类人化抗HM1.24 抗体的L链或H链的载体。
通过将这两个表达载体同时导入CHO细胞，建立了产生类人化抗HM1.24 抗体的细胞株。通过Cell ELISA研究培养上述细胞株得到的类人化抗 HM1.24抗体对来自人羊膜的细胞株WISH的抗原结合活性和结合抑制活 性。结果类人化抗HM1.24抗体具有与嵌合抗体同等的抗原结合活性，即 便就使用了生物素化小鼠抗HM1.24抗体的结合抑制活性来说，也具有与 嵌合抗体或鼠抗体同等的活性。
另外，含有编码嵌合抗HM1.24抗体的L链V区和H链V区的DNA质 粒的大肠杆菌分别以Escherichia coli DH5α(pUC19-1.24L-gκ)和 Escherichia coli DH5α(pUC19-1.24H-gγ1)的名称于平成8年8 月29日，按照布达佩斯条约于工业技术院生命工学工业技术研究所(茨 城县筑波市东1丁目1号)进行国际保藏，保藏号分别为FERM BP-5246， FERM BP-5644。含有编码类人化抗HM1.24抗体的L链V区a区(序列 号：2)以及H链V区r区(序列号：3)的DNA的质粒大肠杆菌分别作 为Escherichia coli DH5α(pUC19-RVLa-AHM-gκ)和Escherichia coli DH5α(pUC19-RVHr-AHM-gγ1)于平成8年8月29日，按照布 达佩斯条约保藏于工业技术院生命工学工业技术研究所(茨城县筑波市 东1丁目1号)，保藏号分别为FERM BP-5645，FERM BP-5643。另外含 有编码类人化抗HM1.24抗体的L链V区s区(序列号：4)DNA质粒的 大肠杆菌作为Escherichia coli DH5α(pUC19-RVHs-AHM-gγ1)于 平成9年(1997年)9月29日，按照布达佩斯条约保藏于工业技术院生 命工学工业技术研究所(茨城县筑波市东1丁目1号)，保藏号为FERM BP -6127。
参考例3.HM1.24抗原蛋白质cDNA的克隆
对编码抗HM1.24抗体特异识别的HM1.24抗原蛋白质进行克隆。
1.cDNA文库的制备
1)总RNA的制备
根据Chirgwin等人(生物化学(Biochemistry)，18，5294(1979)) 的方法从人多发性骨髓瘤细胞株提取总RNA。即将2.2×108个KPMM2于 20ml的4M的胍基硫氰酸盐(ナカライテスク制)中使其充分匀浆。
将匀浆液加到离心管中的5.3M氯化铯溶液上，然后在Beckman SW40 转子中用31,000rpm于20℃离心24小时，使RNA沉淀。用70％乙醇洗 RNA沉淀物，然后溶解于含有1mM EDTA和0.5％SDS的10mM Tris-HCl(pH7.4)300μl中，然后加入最后浓度达到0.5mg/ml的链霉蛋白酶 (Boehringer制)，于37℃温育30分钟。混合物用苯酚和三氯甲烷萃取， 用乙醇使RNA沉淀。RNA沉淀物溶解于含有1mM EDTA的10mM Tris-HCl(pH7.4)200μl中。
2)poly(A)+RNA的制备
以上述那样制备的总RNA中的大约500μg作为材料，使用Fast Track 2.0 mRNA Isolation Kit(Invitrogen制)，按照试剂盒附带的处方纯化 poly(A)+RNA。
3)cDNA文库的构建
以上述poly(A)+RNA 10μg作为材料用cDNA合成试剂盒TimeSaver cDNA Synthesis Kit(Pharmacia制)，按照试剂盒附带的处方合成双链 cDNA，再用Directional Cloning Toolbox(Pharmcia)，用试剂盒附带 的EcoRI结合体按照试剂盒附带的处方连接。EcoRI连接体的カイネ-シ ョン以及限制酶NotI处理都是按照试剂盒附带的处方进行。另外用1.5 ％低熔点的琼脂糖凝胶(Sigma制)分离、纯化大约500bp以上的大的带 有连接体的双链cDNA，得到带有连接体的双链cDNA约40μl。
象上面那样制备的带有连接体的双链cDNA用事先经限制酶EcoRI和 NotI及碱性磷酸酶(宝酒造制)处理的pCOSI载体(特愿平8-255196) 和T4DNA连接酶(GIBCO-BRL制)连接，构建cDNA文库。构建的cDNA 文库转入大肠杆菌细胞株DH5α(GIBCO-BRL制)，据推测总转化数大约 是2.5×106个独立的克隆。
2.通过直接表达法进行克隆
1)转染COS-7细胞
上述转化的大约2.5×105克隆大肠杆菌通过在含有50μg/ml的氨苄 青霉素的2-YT培养基(《分子克隆实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Mannual.)Sambrook等人、冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))，进行cDNA扩增，利用碱法(《分子 克隆实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Mannual.)Sambrook 等人、冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))从大肠杆菌中回收质粒DNA。得到的质粒DNA用Gene Pulser 装置(Bio-Rad制)通过电穿孔法转染COS-7细胞。
即，将纯化的质粒DNA 10μg加到悬浮于PBS中的COS-7细胞液0.8ml (1×107细胞/ml)，以1500V，25μFD容量加脉冲。于室温下经10分钟 恢复期间后，经电穿孔处理的细胞于含有10％胎牛血清(GIBCO-BRL制) 的DMEM培养液(GIBCO-BRL制)中，在37℃，5％CO2的条件下培养3 天。
2)淘选盘(パンニングデイツシュ)的制备
根据B.Seed等人(美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)， 84，3365-3369(1987))的方法制备铺了小鼠抗HM1.24抗体的淘选盘。 即，将鼠抗HM1.24抗体加到50mM Tris-HCl(pH9.5)中，溶液中抗体最 后浓度为10μg/ml。将这样制备的抗体溶液3ml加到直径60mm的细胞培 养皿中，于室温培养2小时。用0.15M NaCl溶液洗3次后，加入含有5 ％胎牛血清、1mM EDTA、0.02％NaN3的PBS，封闭后，用于下面的克隆。
3)cDNA文库的克隆
象上述那样转染的COS-7细胞通过含有5mM EDTA的PBS剥离，用含 有5％胎牛血清的PBS洗一次后悬浮于含有5％胎牛血清和0.02％NaN3的 PBS中，使细胞的密度变为1×106细胞/ml，然后加到上述那样制备的淘 选盘中，于室温培养2小时。用含有5％胎牛血清和0.02％NaN3的PBS 温和地洗三次后，然后用含有0.6％SDS和10mM EDTA的溶液从结合于淘 选盘上的细胞进行质粒DNA的回收。
回收的质粒DNA再转化导入大肠杆菌DH5α，象上述那样使质粒DNA 扩增后，用碱法回收。回收的质粒DNA通过电穿孔法转染COS-7细胞， 与上述一样从结合的细胞回收质粒DNA。同样的操作再重复一次，回收的 质粒DNA用限制酶EcoRI和NotI消化，结果可以确认大约0.9kbp大小 的插入片段被浓缩。将转化导入了回收的质粒DNA的一部分的大肠杆菌 接种于含有50μg/ml的氨苄青霉素的2-YT琼脂板，培养过夜后，从单 一的菌落回收质粒DNA。用限制酶EcoRI和NotI消化，得到显示插入片 段的大小大约为0.9kbp的克隆p3.19。
就本克隆用PRISM，Dye Terminater Cycle Sequencing试剂盒(Perkin Elmer制)，根据试剂盒附带的处方进行反应，通过ABI 373A DNA测序 仪(Perkin Elmer制)确定碱基序列。该碱基序列和对应的氨基酸序列 表示在序列号1中。
FCM解析的结果表明，抗HM1.24抗体可以与来自几乎所有的人淋巴细 胞系肿瘤的细胞进行强烈的反应。这表示在许多淋巴细胞系肿瘤中，强 烈地显示出具有抗HM1.24抗体识别的抗原决定部位的多肽。另外，在移 植了与抗HM1.24抗体反应的人淋巴细胞系肿瘤移植鼠实验中，确认通过 抗HM1.24抗体的注入抑制了肿瘤体积的增加，而且生存期间延长。从这 些现象表明抗HM1.24抗体或识别具有抗HM1.24抗体识别的抗原决定部 位的多肽的抗体对很多淋巴细胞系肿瘤表现出细胞杀伤活性，其结果对 淋巴细胞系肿瘤患者的治疗非常有用。
根据《专利合作条约》细则13条之二的微生物的保藏以及保藏机构、 保藏机构 名称：工业技术院生命工学工业技术研究所
地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1-3 微生物(1) 名称：Escherichia coli DH5α(pRS38-pUC19)
保藏号：FERM BP-4434
保藏日：1993年10月5日
(2) 名称：杂交瘤HM1.24
保藏号：FERM BP-5233
保藏日：1995年9月14日
(3) 名称：Escherichia coli DH5α(pUC19-RVHr-AHM-gγ1)
保藏号：FERM BP-5643
保藏日：1996年8月29日
(4) 名称：Escherichia coli DH5α(pUC19-1.24H-gγ1)
保藏号：FERM BP-5644
保藏日：1996年8月29日
(5) 名称：Escherichia coli DH5α(pUC19-RVLa-AHN-gκ)
保藏号：FERM BP-5645
保藏日：1996年8月29日
(6) 名称：Escherichia coli DH5α(pUC19-1.24L-gκ)
保藏号：FERM BP-5646
保藏日：1996年8月29日
(7) 名称：Escherichia coli DH5α(pUC19-RVHs-AHM-gγ1)
保藏号：FERM BP-6127
保藏日：1997年9月29日
序列表
序列号：1
序列长度：1013
序列类型：核酸
链数：一条链
拓扑学：直链型
序列种类：cDNA
GAATTCGGCA CGAGGGATCT GG ATG GCA TCT ACT TCG TAT GAC TAT TGC 49
Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys
1 5
AGA GTG CCC ATG GAA GAC GGG GAT AAG CGC TGT AAG CTT CTG CTG GGG 97
Arg Val Pro Met Glu Asp Gly Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly
10 15 20 25
ATA GGA ATT CTG GTG CTC CTG ATC ATC GTG ATT CTG GGG GTG CCC TTG 145
Ile Gly Ile Leu Val Leu Leu Ile Ile Val Ile Leu Gly Val Pro Leu
30 35 40
ATT ATC TTC ACC ATC AAG GCC AAC AGC GAG GCC TGC CGG GAC GGC CTT 193
Ile Ile Phe Thr Ile Lys Ala Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu
45 50 55
CGG GCA GTG ATG GAG TGT CGC AAT GTC ACC CAT CTC CTG CAA CAA GAG 241
Arg Ala Val Met Glu Cys Arg Asn Val Thr His Leu Leu Gln Gln Glu
60 65 70
CTG ACC GAG GCC CAG AAG GGC TTT CAG GAT GTG GAG GCC CAG GCC GCC 289
Leu Thr Glu Ala Gln Lys Gly Phe Gln Asp Val Glu Ala Gln Ala Ala
75 80 85
ACC TGC AAC CAC ACT GTG ATG GCC CTA ATG GCT TCC CTG GAT GCA GAG 337
Thr Cys Asn His Thr Val Met Ala Leu Met Ala Ser Leu Asp Ala Glu
90 95 100 105
AAG GCC CAA GGA CAA AAG AAA GTG GAG GAG CTT GAG GGA GAG ATC ACT 385
Lys Ala Gln Gly Gln Lys Lys Val Glu Glu Leu Glu Gly Glu Ile Thr
110 115 120
ACA TTA AAC CAT AAG CTT CAG GAC GCG TCT GCA GAG GTG GAG CGA CTG 433
Thr Leu Asn His Lys Leu Gln Asp Ala Ser Ala Glu Val Glu Arg Leu
125 130 135
AGA AGA GAA AAC CAG GTC TTA AGC GTG AGA ATC GCG GAC AAG AAG TAC 481
Arg Arg Glu Asn Gln Val Leu Ser Val Arg Ile Ala Asp Lys Lys Tyr
140 145 150
TAC CCC AGC TCC CAG GAC TCC AGC TCC GCT GCG GCG CCC CAG CTG CTG 529
Tyr Pro Ser Ser Gln Asp Ser Ser Ser Ala Ala Ala Pro Gln Leu Leu
155 160 165
ATT GTG CTG CTG GGC CTC AGC GCT CTG CTG CAG TGA GATCCCAGGA 575
Ile Val Leu Leu Gly Leu Ser Ala Leu Leu Gln ***
170 175 180
AGCTGGCACA TCTTGGAAGG TCCGTCCTGC TCGGCTTTTC GCTTGAACAT TCCCTTGATC 635
TCATCAGTTC TGAGCGGGTC ATGGGGCAAC ACGGTTAGCG GGGAGAGCAC GGGGTAGCCG 695
GAGAAGGGCC TCTGGAGCAG GTCTGGAGGG GCCATGGGGC AGTCCTGGGT GTGGGGACAC 755
AGTCGGGTTG ACCCAGGGCT GTCTCCCTCC AGAGCCTCCC TCCGGACAAT GAGTCCCCCC 815
TCTTGTCTCC CACCCTGAGA TTGGGCATGG GGTGCGGTGT GGGGGGCATG TGCTGCCTGT 875
TGTTATGGGT TTTTTTTGCG GGGGGGGTTG CTTTTTTCTG GGGTCTTTGA GCTCCAAAAA 935
AATAAACACT TCCTTTGAGG GAGAGCACAC CTTAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 995
AAAATTCGGG CGGCCGCC 1013
序列号：2
序列长度：379
序列类型：核酸
拓扑学：直链型
序列种类：cDNA
ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT 48
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
-15 -10 -5
GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG AGC GCC 96
Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
-1 1 5 10
AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT AAG GCT AGT CAG GAT GTG 144
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val
15 20 25
AAT ACT GCT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA AAG GCT CCA AAG 192
Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
30 35 40 45
CTG CTG ATC TAC TCG GCA TCC AAC CGG TAC ACT GGT GTG CCA AGC AGA 240
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg
50 55 60
TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC ACC TTC ACC ATC AGC AGC 288
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser
65 70 75
CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCT ACC TAC TAC TGC CAG CAA CAT TAT AGT 336
Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser
80 85 90
ACT CCA TTC ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379
Thr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
95 100 105
序列号：3
序列长度：418
序列类型：核酸
拓扑学：直链型
序列种类：cDNA
ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA GGT 48
Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly
-15 -10 -5
GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96
Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
-1 1 5 10
CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC 144
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
15 20 25
ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT 192
Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
30 35 40 45
GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240
Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser
50 55 60
CAG AAG TTC AAG GGC AGA GTC ACC ATG ACC GCA GAC AAG TCC ACG AGC 288
Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser
65 70 75
ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
80 85 90
TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
95 100 105
TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
110 115 120
序列号：4
序列长度：418
序列类型：核酸
拓扑学：直链型
序列种类：cDNA
ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA GGT 48
Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly
-15 -10 -5
GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96
Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
-1 1 5 10
CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC 144
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
15 20 25
ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT 192
Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
30 35 40 45
GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240
Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser
50 55 60
CAG AAG TTC AAG GGC AGA GTC ACC ATC ACC GCA GAC AAG TCC ACG AGC 288
Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser
65 70 75
ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
80 85 90
TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
95 100 105
TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
110 115 120
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