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用于制备产生免疫原性复合蛋白的转基因 植物的方法及由其获得的免疫原性复合蛋白

阅读：1028发布：2020-10-20

专利汇可以提供用于制备产生免疫原性复合蛋白的转基因植物的方法及由其获得的免疫原性复合蛋白专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及用于制备产生免疫原性复合蛋白的转基因植物的方法及由其获得的免疫原性复合蛋白，更具体地，涉及用于制备产生免疫原性复合蛋白的转基因植物的方法、通过所述方法制备的植物以及从所述植物获得的免疫原性复合蛋白，其中所述方法包括以下步骤：(a)制备表达抗原的转基因植物；(b)制备表达对步骤(a)中的抗原具有特异性的抗体的转基因植物；以及(c)将步骤(a)和(b)中的植物杂交育种以制备杂交植物。免疫原性复合蛋白可以通过本发明的包括步骤(a)至(c)的用于制备转基因植物的方法以及通过所述方法制备的转基因植物来大量产生。此外，从所述植物获得的免疫原性复合蛋白(抗原‑抗体复合物)具有庞大的四维结构，从而具有优异的免疫应答增强效果，因此即使不使用免疫佐剂，其也可在宿主动物中表现出优异的抗体产生能力。，下面是用于制备产生免疫原性复合蛋白的转基因植物的方法及由其获得的免疫原性复合蛋白专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于制备产生免疫原性复合蛋白的转化的植物的方法，所述方法包括：
(a)制备表达抗原的转化的植物；
(b)制备表达对步骤(a)中的抗原具有特异性的抗体的转化的植物；和
(c)使步骤(a)和(b)中的植物交配以制备交配的植物。
2.权利要求1的方法，其中所述抗原是包含以下(i)和(ii)的嵌合抗原：
(i)含有抗原蛋白的免疫应答结构域；和
(ii)含有Fc抗体片段的靶结合结构域。
3.权利要求2的方法，其中所述靶结合结构域(ii)还包含免疫球蛋白的铰链区、重链CH1结构域或接头。
4.权利要求1的方法，其中所述步骤(a)中的抗原是结肠直肠癌细胞表面蛋白GA733。
5.权利要求2的方法，其中所述Fc抗体片段(ii)包含对GA733具有特异性的IgG的铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
6.权利要求1的方法，其中所述步骤(a)中的抗原是由SEQ ID NO:9表示的GA733-FcK嵌合抗原。
7.权利要求1的方法，其中所述步骤(b)中的抗体是单克隆抗体。
8.权利要求1的方法，其中所述步骤(b)中的抗体是二价抗体。
9.权利要求1的方法，其中所述步骤(b)中的抗体是对GA733-FcK嵌合抗原具有特异性的抗体，该抗体包含由SEQ ID NO:12表示的重链和由SEQ ID NO:13表示的轻链。
10.权利要求1至9中任一项的方法，其中所述步骤(a)中的抗原和所述步骤(b)中的抗体包含内质网滞留信号序列。
11.权利要求1的方法，其中所述植物是烟草(Nicotiana tabacum)。
12.一种产生免疫原性复合蛋白的植物，所述植物是通过权利要求1的方法制备。
13.权利要求12的方法，其中所述免疫原性复合蛋白是GA733-FcK嵌合抗原和其特异性抗体的抗原-抗体复合物。
14.一种由权利要求12的植物获得的免疫原性复合蛋白。
15.权利要求14的方法，其中免疫原性复合蛋白是选自以下的至少一种：嵌合抗原-抗体单分子形式、通过将所述嵌合抗原-抗体单分子单体聚合而获得的五聚体形式、通过将所述嵌合抗原和抗体交联而获得的线性结构。
16.一种疫苗组合物，其包含权利要求14的免疫原性复合蛋白和药学上可接受的载体或稀释剂。
17.权利要求14的免疫原性复合蛋白，其用于制备疫苗。
18.一种用于免疫的方法，所述方法包括将有效量的权利要求14的免疫原性复合蛋白给予需要其的受试者。

说明书全文

用于制备产生免疫原性复合蛋白的转基因 植物的方法及由其

获得的免疫原性复合蛋白

技术领域

[0001] 本申请要求于2014年6月12日提交的韩国专利申请第10-2014-0071607号的优先权和权益，其全部内容通过引用并入本文中。

[0002] 本发明涉及用于制备产生免疫原性复合蛋白(immunogenic complex protein)的转化的(或转基因)植物的方法及由其获得的免疫原性复合蛋白，更具体地，涉及用于制备产生免疫原性复合蛋白的转化的(或转基因)植物的方法，所述方法包括：(a)制备表达抗原的转化的(或转基因)植物；(b)制备表达对步骤(a)中的抗原具有特异性的抗体的转化的(或转基因)植物；以及(c)使步骤(a)和(b)中的植物交配以制备交配的植物，涉及通过所述方法产生的植物，并涉及从所述植物获得的免疫原性复合蛋白。

背景技术

[0003] 疫苗是用于诱导针对抗原的免疫应答以防御病原感染的药物，而近些年开发的疫苗主要使用重组蛋白作为抗原。重组蛋白的副作用更少，并且比灭活疫苗或减毒活疫苗更安全，但是由于它们的免疫原性低，所以同时使用免疫佐剂以诱导足够的免疫力来防御感染。免疫佐剂是一种疫苗添加剂，其刺激针对疫苗抗原的免疫应答以诱导增强的免疫力，而其本身不具有特异性的抗原-抗体免疫应答，其名称来源于拉丁语中的“adjuvare”——有“帮助”或“增强”的含义。

[0004] 免疫佐剂根据其机制大致分为三种类型：抗原载体；免疫增强剂；刺激免疫应答并用作针对抗原的基质的物质。免疫佐剂的有效使用能够获得各种效果：(1)增加重组抗原的免疫原性；(2)减少抗原的剂量或免疫的次数；和(3)改善免疫力低下的婴儿和老年人的免疫原性。

[0005] 目前，铝盐、MF59、AS03和AS04等在美国和欧盟的批准下作为免疫佐剂用于疫苗。1926年开发的作为白喉类毒素疫苗的免疫佐剂铝盐目前是应用最广泛的免疫佐剂，并且在过去80年中几乎专门用于人类疫苗。铝盐被认为会广泛用于各种疫苗且非常安全，但被认为会引起过敏反应且具有神经毒性。此外，铝盐强烈诱导用抗体介导的体液免疫应答，但几乎不诱导细胞免疫应答且不能低温保存。

[0006] 因此，免疫佐剂用于疫苗接种，但是已知其使用会引起不良反应(例如孤独症谱系障碍(ASD)和过敏)，因此需要无免疫佐剂的疫苗。

[0007] 【现有技术文献】

[0008] 【专利文献】

[0009] (专利文献1)韩国专利第10-1054851号

[0010] 【非专利文献】

[0011] (非专利文献1)Zhe Lu，Kyung-Jin Lee，Yingxue Shao，Jeong-Hwan Lee，Yangkang So，Young-Kug Choo，Doo-Byoung Oh，Kyung-A Hwang，Seung Han Oh，Yeon Soo Han and Ki sung Ko，Expression of GA733-Fc Fusion Protein as a Vaccine Candidate for Colorectal Cancer in Transgenic Plants,Journal of Biomedicine and Biotechnology.第2012卷,文章编号364240,11页。

发明内容

[0012] 技术问题

[0013] 本发明人在研究无免疫佐剂的疫苗的制备时，证实了通过将分别表达抗原和抗体的转化的(或转基因)植物异花传粉而产生的第一代植物所产生的抗原-抗体复合物，即使没有免疫佐剂也触发超免疫应答，从而完成了本发明。

[0014] 因此，本发明的一个方面是提供用于制备产生免疫原性复合蛋白的转化的(或转基因)植物的方法，所述方法包括：

[0015] (a)制备表达抗原的转化的(或转基因)植物；

[0016] (b)制备表达对步骤(a)中的抗原具有特异性的抗体的转化的(或转基因)植物；和[0017] (c)使步骤(a)和(b)中的植物交配以制备交配的植物。

[0018] 本发明的另一个方面是提供制备免疫原性复合蛋白的植物，所述植物是通过所述方法产生的。

[0019] 本发明的另一个方面是提供来自所述植物的免疫原性复合蛋白。

[0020] 本发明的另一个方面是提供疫苗组合物，其包含免疫原性复合蛋白和药学上可接受的载体或稀释剂。

[0021] 本发明的另一个方面是提供免疫原性复合蛋白用于制备疫苗的用途。

[0022] 本发明的另一个方面是提供免疫方法，其包括向需要其的受试者给予有效量的免疫原性复合蛋白。

[0023] 技术方案

[0024] 根据本发明的一个方面，提供用于制备产生免疫原性复合蛋白的转化的(或转基因)植物的方法，所述方法包括：

[0025] (a)制备表达抗原的转化的(或转基因)植物；

[0026] (b)制备表达对步骤(a)中的抗原具有特异性的抗体的转化的(或转基因)植物；和[0027] (c)使步骤(a)和(b)中的植物交配以制备交配的植物。

[0028] 根据本发明的另一个方面，提供产生免疫原性复合蛋白的植物，所述植物是通过所述方法制备的。

[0029] 根据本发明的另一个方面，提供来自所述植物的免疫原性复合蛋白。

[0030] 根据本发明的另一个方面，提供疫苗组合物，其包含免疫原性复合蛋白和药学上可接受的载体或稀释剂。

[0031] 根据本发明的另一个方面，提供免疫原性复合蛋白用于制备疫苗的用途。

[0032] 根据本发明的另一个方面，提供免疫方法，其包括向需要其的受试者给予有效量的免疫原性复合蛋白。

[0033] 在下文中将详细描述本发明。

[0034] 本发明提供用于制备产生免疫原性复合蛋白的转化的(或转基因)植物的方法，所述方法包括：

[0035] (a)制备表达抗原的转化的(或转基因)植物；

[0036] (b)制备表达对步骤(a)中的抗原具有特异性的抗体的转化的(或转基因)植物；和[0037] (c)使步骤(a)和(b)中的植物交配以制备交配的植物。

[0038] 在步骤(a)中，制备表达抗原的转化的(或转基因)植物。

[0039] 如本文所用，术语“抗原”是指这样的任何物质，即所述物质通过与合适的细胞接触而进入，以在体内或体外以能证实的方式诱导致敏目标的免疫细胞和/或抗体的敏感和/或免疫反应状态和应答。如本文所用，术语“抗原”通常可以与术语“免疫原”相同的含义来使用，并且优选地是指包含至少一个表位的分子，所述表位能够促进宿主免疫系统以触发对抗原具有特异性的分泌性的体液和/或细胞免疫应答。此外，术语“抗原性”或“免疫原性”是指抗原或免疫原的性质，并且是指触发分泌性的体液和/或细胞免疫应答的性质。

[0040] 术语“免疫应答”是动物体内存在的自身防御系统，是一种生物现象，其中将从外部侵入的多种物质或生物体与生物体自身区别开来，然后清除这些侵入物。这种自身防御的监视系统主要包括两种机制：一种是体液免疫机制，另一种是细胞免疫机制。体液免疫机制是由血清中存在的抗体产生，而抗体通过与抗原物质结合而起到去除侵入的外部抗原物质的重要作用。同时，细胞免疫机制是由属于淋巴系统的几种细胞产生，这些细胞起着直接破坏侵入的细胞或组织的作用。因此，体液免疫机制对主要存在于细胞外的外部物质(如细菌、病毒、蛋白质和复合碳水化合物)有效，而细胞免疫机制对各种寄生虫、组织、细胞内感染和癌细胞发挥其作用。这种双重防御系统主要由两种淋巴细胞(如B细胞或T细胞)来实现。B细胞产生抗体，而T细胞参与细胞免疫机制。这些由B细胞或T细胞产生的免疫应答首先响应于侵入机体的抗原，并在相同种类的抗原继续存在或反复侵入时必要地构建免疫系统。因此，这些免疫应答是针对特定抗原的独特应答。除了这些抗原特异性的免疫应答之外，在体内存在一种天然免疫应答，其中攻击性细胞甚至在不暴露于某种抗原的情况下被直接应答破坏。这些免疫应答的特征在于，无论待攻击的靶细胞的种类如何，嗜中性粒细胞、巨噬细胞、天然杀伤(NK)细胞等都会参与这种免疫应答以发挥多种功能。

[0041] “表位”是指复杂抗原分子的抗原决定簇的最简单形式，其是被抗体或T细胞受体识别的抗原的特定部分。

[0042] 如本文所用，本发明的抗原包括但不限于多肽或蛋白质、非蛋白质分子或其片段。优选地，本发明的抗原是指多肽或蛋白质及其片段。

[0043] 本发明的抗原可以是本领域中已知的免疫原性物质，抗原的实例包括但不限于细菌抗原或表位、真菌抗原或表位、植物抗原或表位、霉菌抗原或表位、病毒抗原或表位、肿瘤(癌症)细胞抗原或表位、毒素抗原或表位、化学抗原或表位以及自体抗原或表位。

[0044] 本发明的抗原可优选地是肿瘤相关抗原。肿瘤相关抗原的种类没有限制，只要其是本领域中已知的肿瘤(或癌症)相关抗原，而其实例包括乳腺癌抗原、卵巢癌抗原、前列腺癌抗原、宫颈癌抗原、胰腺癌抗原、肺癌抗原、膀胱癌抗原、结肠癌抗原、睾丸癌抗原、成胶质细胞瘤癌抗原、与B细胞恶性肿瘤相关的抗原、与多发性骨髓瘤相关的抗原、与非霍奇金淋巴瘤相关的抗原、与慢性淋巴细胞性白血病相关的抗原或结肠直肠癌抗原。

[0045] 更具体地，肿瘤相关抗原可以是A33；ADAM-9；ALCAM；B1；BAGE；β-连环蛋白；CA125；羧肽酶M；CD5；CD19；CD20；CD22；CD23；CD25；CD27；CD28；CD32B；CD36；CD40；CD45；CD46；
CD56；CD79a；CD79b；CD103；CD154；CDK4；CEA；CTLA4，细胞角蛋白8；EGF-R；肝配蛋白受体；
ErbB1；ErbB3；ErbB4；GAGE-1；GAGE-2；GD2；GD3；GM2；gplOO；HER-2/neu；人乳头瘤病毒-E6；
人乳头瘤病毒-E7；整合素α-V-β-6；JAM-3；KID3；KID31；KSA(17-1A)；LUCA-2；MAGE-1；MAGE-
3；MART；MUC-1，MUM-1；N-乙酰葡糖胺基转移酶；抑瘤素M(抑瘤素受体β)；p15；PIPA；PSA；
PSMA；RAAG1O；ROR1；SART；sTn；TES7；TNF-α受体；TNF-β受体；TNF-γ受体；转铁蛋白受体；
VEGF受体或GA733，但不限于此。

[0046] 本发明的抗原可优选地是结肠直肠癌细胞表面蛋白GA733。GA733是上皮细胞粘附分子(EpCAM；或也称为17-1A抗原、KSA、EGP40、GA733-2、ks 1-4或esa)。EpCAM是由简单上皮细胞和由其而来的肿瘤细胞表达的表面糖蛋白。EpCAM分子出现在健康组织的细胞表面上，但在恶性组织中其表达上调。EpCAM的作用是以定向和高度有序的方式粘附上皮细胞(Litvinov,J Cell Biol.1997,139,1337-1348)。

[0047] 本发明的GA733可优选地是由SEQ ID NO:1所示的多肽。

[0048] 此外，如本文所用的“抗原”还可以包括内质网信号肽(意指内质网靶向序列)。内质网信号肽(ER信号序列)是指允许内质网(cytoplasmic reticulum)上的信号识别颗粒识别蛋白质以允许蛋白质在ER腔中易位的氨基酸序列。在本文中，内质网信号肽的种类和氨基酸序列不受限制，只要其是植物内质网信号肽，并且它们可以是例如US 20130295065和WO 2009158716的文献中提及的。在本文中，内质网信号肽可优选地是选自以下的任一种多肽：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32，并可最优选地是由SEQ ID NO:3所示的多肽。

[0049] 内质网信号肽的特征在于被添加(或连接)到意欲在植物细胞中表达或合成的蛋白质的N末端。

[0050] 在本文中，步骤(a)中的抗原可优选地以与Fc抗体片段的融合形式来提供。术语“融合”意指包括所有的化学融合和基因融合，并且在本文中，优选地是指基因融合。“基因融合”是指这样的连接，其包括通过编码蛋白质的DNA序列的基因表达而形成的线性共价连接。

[0051] 在本文中，以这种形式提供的抗原称为嵌合抗原。即，本发明的抗原优选地为包含以下(i)和(ii)的嵌合抗原：(i)包含抗原蛋白的免疫应答结构域(IRD)；和(ii)包含Fc抗体片段的靶结合结构域(TBD)。

[0052] 免疫应答结构域(IRD)(i)是指诱导重要免疫应答(即体液和/或T细胞反应)的抗原蛋白的一部分，包括其全部或片段。

[0053] 抗原蛋白是指多肽或蛋白质的抗原物质，并且抗原如上文所述。

[0054] 靶结合结构域(TBD)(ii)包括至少一个Fc抗体片段衍生的CH2和CH3结构域，并且是指能够与抗原呈递细胞(APC)结合的部分。

[0055] 如本文所用，术语“抗体”与“免疫球蛋白”(在下文中，由“Ig”表示)可互换使用，而它是选择性作用于抗原并参与生物学免疫应答的蛋白质的通用名称。抗体包括两对轻链和重链。抗体的这些轻链和重链是包括几个结构域的多肽。在完整抗体中，每条重链包括重链可变区(VH)和重链恒定区。重链恒定区包括重链恒定结构域CH1、CH2和CH3(抗体种类：IgA、IgD和IgG)和任意重链恒定结构域CH4(抗体种类；IgE和IgM)。每条轻链包括轻链可变结构域(VL)和轻链恒定结构域(CL)。IgG抗体是天然存在的完整抗体之一，其结构示于例如图2中。可变结构域VH和VL可再分成称为互补决定区(CDR)的高变区，其被散布在更保守的称为构架区(FR)的区域内。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR，从氨基末端到羧基末端以如下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(Janeway,C.A.,Jr.et al.,(2001).Immunobiology.,第5版,Garland Publishing；以及Woof,J.,Burton,D.,Nat Rev Immunol 4(2004)89-99)。两对重链和轻链(HC/LC)可以特异性地与相同的抗原结合。因此，完整抗体是二价的单特异性抗体。

[0056] 存在5种由希腊字母表示的哺乳动物抗体重链：α、δ、ε、γ和μ(Janeway,C.A.,Jr.et al.,(2001).Immunobiology.,第5版,Garland Publishing)。抗体的种类是由其重链的类型确定；分别在IgA、IgD、IgE、IgG和IgM抗体中发现这些链(Rhoades R.A.,Pflanzer RG(2002).Human Physiology,第4版,Thomson Learning)。不同重链的大小和组成不同；α和γ含有约450个氨基酸，而μ和ε含有约550个氨基酸。每条重链有两个区域：恒定区和可变区。恒定区在相同同种型(isotype)的所有抗体中相同，而在不同同种型的抗体中不同。重链γ、α和δ具有包含三个恒定结构域CH1、CH2和CH3(排成一列(in a line))的恒定区以及用于增加柔性(flexibility)的铰链区(Woof,J.,Burton,D.,Nat Rev Immunol 4(2004)89-99)；重链μ和ε具有包含四个恒定结构域CH1、CH2、CH3和CH4的恒定区(Janeway,C.A.,Jr.et al.,(2001).Immunobiology.,第5版,Garland Publishing)。不同B细胞产生的抗体中的重链可变区不同，但单个B细胞或B细胞克隆产生的所有抗体的重链可变区是相同的。
每条重链的可变区的长度约为110个氨基酸且包含单一抗体结构域。

[0057] 在哺乳动物中，仅存在两种类型的轻链，称为兰布达(λ)和卡帕(κ)。轻链具有两个连续的结构域：一个恒定结构域CL和一个可变结构域VL。轻链的近似长度为211至217个氨基酸。

[0058] 在本说明书中，除非另有特别说明，IgG应被理解为抗体的代表性基本结构。

[0059] 本发明中使用的Fc片段可以来源于选自以下的任一种：IgG、IgA、IgD、IgE和IgM，优选来源于IgG的Fc片段。IgG可以再分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，而本发明的Fc片段可最优选地是来源于IgG1的Fc片段。

[0060] 如本文所用，术语“Fc片段”是免疫球蛋白分子上除了轻链的可变区(VL)和恒定区(CL)以及重链的可变区(VH)和恒定区1(CH1)以外的区域，其是用木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白(Ig)分子获得的片段。即，Fc片段是指两条CH2-CH3结构域链的二聚体，而所述两条链通过二硫键形成二聚体结构。另外，Fc片段可以含有重链恒定区中的铰链区肽的全部或一部分。此外，Fc片段可以是含有重链恒定区1(CH1)和/或轻链恒定区1(CL1)的全部或一部分的延长的Fc片段，只要其与天然的Fc片段相比具有基本相同或改善的效果。此外，Fc片段可以是具有对应于CH2和/或CH3的相对长的氨基酸序列缺失的片段。

[0061] 另外，Fc抗体片段可来源于与待给予含有嵌合抗原的分子或组合物的宿主(受试者)相同的物种，或来源于与宿主异源的物种。例如，当宿主是人时，Fc抗体片段可以来源于人抗体，异源Fc抗体片段可以是来源于非人哺乳动物(例如牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠或豚鼠)的Fc抗体片段。

[0062] 本发明的“Fc抗体片段”的种类和氨基酸序列不受限制，只要其是本领域中已知的Fc抗体片段即可。例如，本发明的“Fc抗体片段”可以是由SEQ ID NO:4(人IgG1的Fc片段序列)表示的多肽或将铰链区添加到所述多肽序列而获得的多肽，如SEQ ID NO:6所示。

[0063] 如本文所用，术语“抗原呈递细胞(APC)”是指用于抗原诱导事件的辅助细胞，其内化抗原、加工抗原并在主要组织相容复合物(MHC)I或II类的环境中主要通过将抗原表位呈递到淋巴细胞来起作用。APC和抗原之间的相互作用是免疫诱导中的必需步骤，因为淋巴细胞与之接触并识别所述接触，因此可以被激活。APC的实例包括巨噬细胞、单核细胞、朗格尔汉斯细胞、相互联锁的树突细胞、滤泡树突细胞和B细胞。

[0064] 本发明的“靶结合结构域(TBD)”含有至少一个来源于Fc抗体片段的CH2和CH3结构域，因此可以与APC上的Fc受体结合。所述Fc抗体片段具有Fc受体结合位点，它在该位点与APC上的Fc受体结合。

[0065] 可通过基因融合手段将免疫应答结构域(IRD)和靶结合结构域(TBD)相互直接或间接连接。因此，本发明的嵌合抗原包括使用连接TBD与IRD的接头分子。示例性的接头分子包括亮氨酸拉链和生物素/抗生物素蛋白。例如，可用于嵌合抗原的其他接头是肽序列。这种肽接头的长度为约2至约40个氨基酸(例如约4至10个氨基酸)。示例性的肽接头包括氨基酸序列“SRPQGGGS”。其他接头是本领域中已知的，并且考虑到由这些接头连接的区域之间的柔性，它们通常富含甘氨酸和/或丙氨酸。

[0066] 本发明的嵌合抗原可以是单体的(即，它们具有含IRD和TBD的信号单元)，或可以是多聚体的(例如，它们具有含IRD和TBD的多个单元)。多聚体可以是例如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体或八聚体。在这些多聚体中，各个单元可以彼此相同或不同，并且一些可以彼此相同，其他可以彼此不同。本发明的嵌合抗原优选地为二聚体，图1示出了本发明的二聚体嵌合抗原。

[0067] 此外，二聚体嵌合抗原可以参考US 8,465,745；US 8,029,803；以及韩国专利第10-1054851号。

[0068] 本发明的嵌合抗原优选地包含：

[0069] (i)含有抗原蛋白的免疫应答结构域(IRD)；和

[0070] (ii)含有铰链区、CH2结构域和CH3结构域的靶结合结构域(TBD)，

[0071] 其中嵌合抗原是二聚体蛋白，其中免疫应答结构域的C末端通过肽键连接至靶结合结构域的N末端。

[0072] 另外，在步骤(a)中，“抗原”还可含有内质网滞留信号序列(或ER滞留信号肽)。内质网滞留信号序列的种类不受限制，只要其是本领域中已知的植物内质网滞留信号序列，并且其细节可以参考WO 2009158716或以下文献：Pagny et al.，Signals and mechanisms for protein retention in the endoplasmic reticulum,Journal of Experimental Botany,Vol.50,No.331,第157-164页,1999年2月。

[0073] 本发明的内质网滞留信号序列可优选地为KDEL(SEQ ID NO:8)、HDEL(SEQ ID NO:23)及其中向上述序列添加1至5个氨基酸的序列(例如，SEQ ID NO:24的SEKDEL、SEQ ID NO:25的KHDEL、SEQ ID NO:26的KEEL和SEQ ID NO:27的SEHDEL)，最优选地为由SEQ ID NO:
8表示的KDEL。

[0074] 通过将编码KDEL的核苷酸插入特定基因(在本文中为表达抗原的基因)可使KDEL暴露于终产物的氨基酸序列的末端。这使得所产生的蛋白质存在于转化的细胞的内质网中而不被释放出植物细胞。宿主细胞(向其中引入了特定基因)中产生的蛋白质通过KDEL序列储存在内质网中，并且经历可以在植物中实施的翻译后修饰。这在解决由于不同物种之间的糖结构差异导致的问题中起关键作用，其在不同物种之间的细胞内抗体蛋白的表达量和免疫应答的增加中起重要作用。已知，在通过KDEL序列进行的内质网(ER)滞留过程(retention procedure)产生的抗体中，产生高甘露糖聚糖结构，并且认为糖蛋白中的ER型聚糖链(或也称为寡甘露糖聚糖型)通过树突细胞或巨噬细胞中的甘露糖受体增加免疫应答(Zhe Lu et al.,Expression of GA733-Fc Fusion Protein as a Vaccine Candidate for Colorectal Cancer in Transgenic Plants,Journal of Biomedicine and Biotechnology,第2012卷,文章编号364240,11页,doi:10.1155/2012/364240)。

[0075] 内质网滞留信号序列(KDEL)的插入位点不受限制，只要其不影响抗原的免疫原性或抗体结合能力即可。在以如上所述的嵌合抗原的形式提供本发明的抗原的情况下，内质网滞留信号序列的插入位点不限于此，并且可优选地是Fc抗体片段的C末端区域。

[0076] 步骤(a)中的抗原可以是由SEQ ID NO:9表示的GA733-FcK嵌合抗原。GA733-FcK嵌合抗原是二聚体蛋白，其中连接有内质网信号肽的结肠直肠癌细胞表面蛋白GA733、包含铰链区的人IgG1Fc片段和内质网滞留信号序列(用K表示)彼此连接(参见图1)，细节参考本发明人的韩国专利第10-1054851号。

[0077] 术语“转化”是指由于引入外源多核苷酸而对宿主细胞的基因型的修饰，并且意指将外源多核苷酸引入宿主细胞，而不论转化方法如何。引入到宿主细胞中的外源多核苷酸被并入并保留在宿主细胞的基因组中，或被保留而不并入其中，本发明包括它们两者。

[0078] 术语“引入”是指人工插入基因或基因群(gene group)使其在靶细胞中表达的操作或将另一基因(群)添加到细胞的基因组中的操作。基因的引入可通过经由噬菌体(细菌)的转导，经由土壤细菌土壤杆菌属种(Agrobacterium spp.)的间接方法、基因枪、电穿孔和显微注射等来进行，而本领域技术人员可以根据靶细胞和插入基因的特征选择性地使用已知的基因引入技术。

[0079] 步骤(a)中的转化是指将编码抗原(特别是抗原蛋白)的多核苷酸引入植物细胞中。在步骤(a)中“制备表达抗原的转化的植物”可以通过已知的植物细胞转化方法进行，例如将所需基因插入载体中以制备重组载体，并将所述重组载体转化到土壤杆菌属种的菌株中，用所述菌株侵染到植物细胞中。

[0080] 载体通常包括信号序列、复制起点、至少一个标记基因、增强组件、启动子和转录终止序列中的至少一种，优选表达载体。表达载体是可以表达所选择的多核苷酸的一种类型的载体。将单个多核苷酸序列与调控序列“可操作地连接”，此时调控序列影响多核苷酸序列的表达(例如，在其水平、时间或表达基因座方面)。调控序列是影响与其可操作地连接的核酸的表达(例如，在水平、时间或表达位置方面)的序列。例如，调控序列可以直接对被调控的核酸施加其作用或通过一种或多种其他分子(例如，与所述调节序列和/或所述核酸结合的多肽)的作用施加其作用。调控序列包括启动子、增强子和其他表达控制元件。

[0081] 作为本领域中已知的分子生物学技术，标准重组DNA和分子克隆技术描述于以下文献中。(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2 nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor,NY,1989；Silhavy,T.J.,Bennan,M.L.and Enquist,L.W.,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor,NY,1984；Ausubel,F.M.et al.,Current Protocols in Molecular Biology,published by Greene Publishing Assoc.and Wiley-lnterscience,1987)。

[0082] 在安全转化后，繁殖转化(或转基因)植物。繁殖意指增加植物的数量。繁殖植物的方法不受限制，只要所生殖的植物的特征和母本基因移植植物的表达特征保持相同，并且可优选地是微增殖(micro-proliferation)。

[0083] 微增殖是从单一组织样品生长第二代植物的方法，单一组织样品取自所选择的母本植物或栽培种。该方法允许大量产生具有更好的组织并表达靶蛋白的植物。新产生的植物具有与原始植物相同的遗传成分，并且具有所有与原始植物相同的特征。微增殖能够在短时间内大量产生优异的植物材料，并且能够使所选择的作物在迅速增殖的同时保留原始基因移植或转化的(或转基因)植物的特征。植物克隆方法具有实现迅速的植物增殖和优异且一致的植物的优点。

[0084] 在步骤(b)中，制备表达对步骤(a)中的抗原具有特异性的抗体的转化的(或转基因)植物。

[0085] “抗体”如上文所述。

[0086] 术语“特异性的”是指特异性结合的分子之一从不显示与除一个或多个相对应分子(counter molecule)之外的分子显著结合的状态。在本文中，该术语是指这样的特异性，即具有所述特异性的抗体仅能与一种抗原结合，并且还用于这样的情况：在某种抗原所包含的多个表位中，抗原结合结构域特异性针对一种特定表位。此外，在与抗原结合结构域结合的表位被包含在多种不同抗原中的情况下，具有相应抗原结合结构域的抗原结合分子可与含有相应表位的各种抗原结合。

[0087] 在本文中，“对步骤(a)中的抗原具有特异性的抗体”可以是选自以下的任何类型：IgG、IgA、IgD、IgE和IgM，并且可以源于自然界的完整抗体的形式提供。此外，对步骤(a)中的抗原具有特异性的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体，优选单克隆抗体。

[0088] 如本文所用，术语“单克隆抗体”是指针对单一抗原区(单一表位)并与其特异性结合的蛋白质分子。单克隆抗体实质上代表从一组同质(homogenous)抗体中获得的抗体。换句话说，除了可能天然存在的少量突变体以外，构成所述组的各个抗体是相同的。单克隆抗体可以通过单克隆抗体制备领域中已知的方法制备，例如但不限于在以下文献中首先记载的杂交瘤法(参见Kohler et al.,(1975)Nature 256:495)、或重组DNA法(参见USP 4,816,567)。也可以使用以下文献中记载的技术将单克隆抗体从噬菌体抗体库中分离(参见，Clackson et al.(1991)Nature 352:624-628；Marks et al.(1991)J.Mol.Biol.222:581-
597；Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116:731)。

[0089] 如本文所用，术语“多克隆抗体”是指含有两种或更多种单克隆抗体的抗体混合物，并且可以对多种表位作出反应。

[0090] 另外，“对步骤(a)中的抗原具有特异性的抗体”包括所有类型的多价抗体，但可优选地是二价抗体。二价抗体具有双臂抗体的结构，双臂抗体具有两个相同的ABS，如图2所示。

[0091] “多价”抗体是包含两个或更多个抗原结合位点的抗体。多价抗体包括二价、三价、四价、五价、六价、七价或更高结合价的抗体。

[0092] 当在步骤(a)中使用嵌合抗原时，优选地将源自所述嵌合抗原中包含的Fc片段的相同种类的抗体用作步骤(b)中的抗体。例如，当在步骤(a)中使用含有源自IgG的Fc片段的嵌合抗原时，步骤(b)中的抗体是对步骤(a)中的嵌合抗原具有特异性的IgG。

[0093] 步骤(b)中的抗体可源于与待给予步骤(a)中的含有嵌合抗原的分子或组合物的宿主(受试者)相同的物种，或来源于与宿主异源的物种。例如，当宿主是人时，抗体可源于人，而异源抗体可以是源于非人哺乳动物(例如牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠或豚鼠)的抗体。

[0094] 在本发明的步骤(b)中，抗体还可以包括内质网滞留信号序列(KDEL)。内质网滞留信号序列如上文所述，并且插入位点不受限制，只要其不影响抗体的抗原识别和结合能力，但插入位点可优选地是抗体蛋白肽序列的末端，更优选抗体蛋白肽序列的C末端。

[0095] 本发明步骤(b)中的抗体的特征在于其是对GA733-FcK嵌合抗原具有特异性的二价抗体(二聚体蛋白)，该抗体是由SEQ ID NO:11(重链)和SEQ ID NO:13(轻链)表示。对GA733-FcK嵌合抗原具有特异性的抗体是针对GA733蛋白的抗体，其实质上是抗原位点，并命名为CO17-1A。在本文中，优选地，步骤(b)中的抗体是在SEQ ID NO:11的重链的C末端包含内质网滞留序列的SEQ ID NO:12(重链)和SEQ ID NO:13(轻链)所表示的二价抗体，并且在本文中命名为CO17-1AK(参见图2)。

[0096] 步骤(b)中的转化是指将编码抗体的多核苷酸引入植物细胞中，并且转化的植物的“转化”和增殖已在上文描述。

[0097] 在步骤(c)中，使步骤(a)和(b)中的植物交配以制备交配的植物。

[0098] 术语“交配”是指这样的过程：为了有性生殖的目的，通过各种方法使具有相反性别或不同交配型的两个个体受精，雄性和雌性配子融合在一起产生合子，本文中，双亲的基因型之间的共同性或差异无关紧要。具有不同基因型的两个个体的交配称为“杂交”，本发明的“交配”包括杂交。

[0099] 本发明的交配可通过已知的交配或杂交方法来进行。例如，交配可以通过异花授粉来进行，但不限于此。

[0100] 步骤(a)至(c)中的“植物”的物种包括以下所有的情况：一种情况是步骤(a)和(b)中使用的植物是同源物种，并且在步骤(c)中通过交配所述植物获得的植物也是同源物种；一种情况是步骤(a)和(b)中使用的植物是异源物种，并且在步骤(c)中通过交配所述植物获得的植物也是异源物种(特别是杂种)。优选地，步骤(a)和(b)中使用的植物可以是同源物种，并且在步骤(c)中通过交配所述植物获得的植物也可以是同源物种。

[0101] 步骤(a)至(c)中的“植物”不受限制，只要其是可以引入外源基因的植物，但可以是例如单子叶植物，包括水稻、小麦、大麦、竹笋、玉米、芋头、芦笋、洋葱、大蒜、叶葱、韭菜、野生细香葱、山药和姜。双子叶植物的实例可包括但不限于拟南芥(Arabidopsis thaliana)、茄子、烟草(Nicotiana tabacum)、辣椒、番茄、牛蒡、茼蒿、莴苣、桔梗花、菠菜、甜菜、甘薯、芹菜、胡萝卜、水欧芹、欧芹、大白菜、甘蓝、芥菜根、西瓜、甜瓜(oriental melon)、黄瓜、南瓜、草莓、大豆、绿豆、云豆(kidney bean)、百脉根、马铃薯、浮萍、紫苏籽、鸽子豆(dove bean)和豌豆。优选地，双子叶植物可以是烟草。

[0102] 在步骤(c)中制备的交配的植物中，可以同时表达亲代植物(即步骤(a)和(b)中的植物)产生的异源蛋白，并且可以产生新型融合蛋白(其中异源蛋白的全部或一些结构域是融合的)。具体地，本发明中产生的新型融合蛋白是指这样的蛋白质：其中一些结构域(分别来自步骤(a)中的嵌合抗原和步骤(b)中的抗体)是融合的，而其实例示于图10c中。

[0103] 具有图10c中的结构的融合蛋白被称为“Fab臂交换的融合蛋白”，具体是指具有包括以下的结构的融合蛋白：

[0104] (i)抗原蛋白；

[0105] (ii)对上述(i)中的抗原蛋白具有特异性的Fab抗体片段；和

[0106] (iii)Fc抗体片段。

[0107] 术语“抗原蛋白”和“Fc抗体片段”已经如上文所述。

[0108] 如本文所用，术语“Fab抗体片段(或臂)”是指包括CH1结构域(第一恒定结构域)以及一条轻链和一条重链的各自的可变区的抗体片段。即，Fab抗体片段是包括重链的VH和CH1结构域以及轻链的VL和CL结构域，并且对抗原表现出单一特异性的片段。用木瓜蛋白酶消化所述抗体产生两种相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段，每个具有单一抗原结合位点)和剩余的“Fc”片段。

[0109] 如本文所用，术语“Fab臂交换”是指具有一个Fab片段的抗体半分子(即，一条重链和与其连接的轻链)的交换。

[0110] 本发明的“Fab臂交换的融合蛋白”的结构特征在于，基于作为对称轴的Fc抗体片段，位于Fc抗体片段(iii)一侧的CH2和CH3结构域与抗原蛋白(i)连接，而另一侧的CH2和CH3结构域与Fab片段(ii)连接(参见图10c)。

[0111] 本文中，位于Fc抗体片段(iii)一侧的CH2和CH3结构域与抗原蛋白(i)来源于步骤(a)中的嵌合抗原，而Fc抗体片段(iii)另一侧的CH2和CH3结构域与Fab片段(ii)来源于步骤(b)中的抗体。

[0112] 优选地，本发明的Fab臂交换的融合蛋白是通过将GA733-FcK嵌合抗原中的一些结构域与对GA733-FcK嵌合抗原具有特异性的抗体(即CO17-1AK)融合来制备，具体地，Fab臂交换的融合蛋白可以是融合蛋白：

[0113] (i)结肠直肠癌细胞表面蛋白GA733；

[0114] (ii)对上述GA733蛋白(i)具有特异性的IgG Fab片段；和

[0115] (iii)Fc抗体片段。

[0116] 本文中，位于IgG Fc片段(iii)一侧的CH2和CH3结构域与GA733(i)来源于步骤(a)中的GA733-FcK嵌合抗原，而位于Fc抗体片段(iii)另一侧的CH2和CH3结构域与Fab片段(ii)来源于对步骤(b)中的GA733-FcK嵌合抗原具有特异性的抗体(即CO17-1AK)。

[0117] 步骤(c)中制备的交配的植物的特征在于在植物细胞中表达免疫原性复合蛋白。

[0118] 如本文所用，术语“免疫原性复合蛋白”是指将抗原的表位与抗体的抗原结合位点结合而获得的抗原-抗体复合物。具体地，该术语是指将步骤(a)中的嵌合抗原蛋白的表位区域(在下文中称为“抗原位点”)与步骤(b)中的抗体的抗原结合位点(ABS)结合而获得的蛋白复合物)。“将抗原蛋白的表位位点与抗体的抗原结合位点结合”是本领域中已知的，并且可优选地通过非共价键实现。

[0119] 因此，本发明的免疫原性复合蛋白仅由抗原位点的表位与抗体的抗原结合位点(ABS)之间的结合获得，与前述的融合的含义不同。

[0120] 对于步骤(a)中的嵌合抗原与步骤(b)中的抗体的两种的组合，抗原-抗体复合物的具体形式是但不限于，例如，嵌合抗原-抗体单分子形式，其中一个嵌合抗原和一个抗体结合(如图10a所示)；线性形式，其中嵌合抗原之间的连接是由起桥接作用的抗体介导(即，嵌合抗原和抗体的交联，如图10b所示)；以及聚合结构，其中嵌合抗原-抗体单分子单体被聚合(例如，嵌合抗原-抗体单分子单体的五聚体形式，如图11a和11b所示)。

[0121] 另外，本发明的免疫原性复合蛋白可包括前述的Fab臂交换的融合蛋白。例如，可以结合两个Fab臂交换的融合蛋白(如图10d所示)，或者以线性形式结合两个或更多个仅Fab臂交换的融合蛋白(如图10e所示)。或者，如图10f所示，可以线性形式结合前述的嵌合抗原、其特异性抗体和Fab臂交换的融合蛋白。本文中，本发明的免疫原性复合蛋白的结构多样性是由于其中Fab臂交换的融合蛋白同时具有抗原和对抗原具有特异性的抗原结合位点的结构特征。

[0122] 几种免疫原性复合蛋白的组合具有大蛋白的四级结构，如图10至11所示。

[0123] 蛋白质的结构由一级、二级、三级和四级结构定义。一级结构表示构成蛋白质的氨基酸序列的信息。二级结构表示螺旋、链或无规卷曲，其是通过氨基酸残基聚集形成的特定模式。另外，三级结构表示二级结构聚集成的三维结构。四级结构表示其中一些蛋白质链聚集以彼此相互作用的形式。

[0124] 因此，包括步骤(a)至(c)的本发明的方法具有优异的效果，即通过该方法制备的免疫原性复合蛋白形成较强的键，如上文所述，并进入树突细胞，最终与调理作用类似通过从线性形式或环状形式形成大的四级分子结构的方案，从而构建允许在植物中的有效呈递抗原的疫苗结构。

[0125] 这在本发明的以下实施例中充分描述。

[0126] <实施例4>证实了本发明的免疫原性复合蛋白是以类似于IgM的嵌合抗原-抗体单分子的五聚体结构产生的，如图11所示。<实施例5>证实了本发明的免疫原性复合蛋白具有优异的疫苗效应。

[0127] 因此，本发明提供用于产生免疫原性复合蛋白的植物，其通过包括步骤(a)至(c)的方法产生。

[0128] 免疫原性复合蛋白如上文所述，具体而言，免疫原性复合蛋白可以是GA733-FcK嵌合抗原与其特异性抗体的嵌合抗原-抗体复合物。抗原-抗体复合物的组合(即，免疫原性复合蛋白的组合)和形态(结构)如上文所述。

[0129] 另外，本发明提供来源于植物的免疫原性复合蛋白。

[0130] 免疫原性复合蛋白是从通过上述步骤(a)至(c)制备的植物获得。

[0131] “从植物获得蛋白质”可以通过用于获得植物细胞来源的蛋白质的已知的方法进行，该方法的实例可以包括但不限于用于破裂和粉碎交配的植物并将其在提取缓冲液中匀浆的方法。提取缓冲液可以是已知的植物蛋白提取缓冲液，其实例可以包括但不限于磷酸盐缓冲盐水(PBS)或含有Tris-HCl pH 8、二硫苏糖醇(DTT)、蛋白酶抑制剂(例如，抑肽酶、胃蛋白酶抑制剂、亮抑蛋白酶肽、苯甲基磺酰氟和[(N-(N-(L-3-反式-羧基环氧乙烷-2-羰基)-L-亮氨酰)-胍基丁胺]的组合物。

[0132] 本文还可包括蛋白质纯化过程。“蛋白质纯化”可以通过常规方法进行，例如可以单独使用或组合使用盐析(例如硫酸铵沉淀、磷酸钠沉淀)、溶剂沉淀(例如，使用丙酮、乙醇等的蛋白质级分沉淀)、透析、凝胶过滤、离子交换、柱层析(例如反相柱层析)和超滤(Deutscher,M.,Guide to Protein Purification Methods Enzymology,第182卷.AcademicPress.Inc.,San Diego,CA(1990))。通过蛋白质纯化过程，仅可获得高浓度的本发明的免疫原性复合蛋白(即，大的四级结构抗原-抗体复合物)。

[0133] 因此，本发明的免疫原性复合蛋白可以通过包括以下步骤的方法制备。

[0134] (a)制备表达抗原的转化的(或转基因)植物；

[0135] (b)制备表达对步骤(a)中的抗原具有特异性的抗体的转化的(或转基因)植物；

[0136] (c)使步骤(a)中的植物与步骤(b)中的植物交配以制备交配的植物；和

[0137] (d)从交配的植物中获得蛋白质组分。

[0138] 此外，该方法还可以包括

[0139] (e)纯化步骤(d)中获得的蛋白质。

[0140] 本发明的免疫原性复合蛋白的组合和形态(结构)如上文所述(参见图10和11)，并且包括所有的线性形式或环状形式。优选地，免疫原性复合蛋白可以是环状形式。

[0141] 如图10和11所示，本发明的免疫原性复合蛋白的特征在于具有大的四级结构。当免疫原性复合蛋白具有线性形式时，其可以大于作为单体存在的蛋白质，并且处于形成环状形式的前期且可以小于环状形式。当本发明的免疫原性复合蛋白具有环状形式时，其可优选地具有10-50nm的直径，更优选20-30nm，最优选用于抗原呈递。

[0142] 如图10和11所示，本发明的免疫原性复合蛋白具有大分子的四级结构，从而表现出优异的增强免疫应答的效果。特别地，本发明的免疫原性复合蛋白在宿主动物中具有优异的抗体产生能力，即使不使用已知会引起副作用的免疫佐剂。另外，与在现有技术中将抗原和抗体置于体外同一点时产生的现有抗原-抗体结合相比，由本发明的植物交配产生的抗原-抗体复合物具有更紧密的结合，产生优异的免疫增强效应。

[0143] 因此，本发明提供包含免疫原性复合蛋白的疫苗组合物。

[0144] 此外，本发明提供免疫原性复合蛋白用于制备疫苗的用途。

[0145] 如本文所用，术语“疫苗”或“疫苗组合物”是指刺激免疫应答的组合物，在本文中，该术语与具有相同含义的免疫原性组合物可互换使用。疫苗包括预防性疫苗和治疗性疫苗。预防性疫苗是为了在受试者暴露于抗原时内化更强的免疫应答，而在暴露于含有抗原的物质之前诱导免疫应答，从而增强抵抗转运所述抗原的物质或细胞的能力。治疗性疫苗可以说是用于给予已经患有与抗原相关的疾病的受试者(所述抗原与所述疫苗有关)，其提供增强的对抗疾病或转运抗原的细胞的能力，从而增强受试者对抗原的免疫应答。

[0146] 疫苗组合物的特征在于含有本发明的免疫原性复合蛋白。因此，疫苗组合物所靶向的靶疾病是由包含在免疫原性复合蛋白中的实质性免疫反应结构域决定。例如，当所述免疫应答结构域是肿瘤相关抗原时，给予本发明的疫苗组合物以预防和治疗相应的肿瘤疾病。

[0147] 本发明的疫苗组合物可以单独给予或与已知的有效预防和治疗靶疾病的化合物结合给予。

[0148] 可以通过任何方法向包括人在内的哺乳动物给予本发明的疫苗组合物。例如，本发明的疫苗组合物可以经口服或肠胃外给予。肠胃外给药可以是但不限于静脉内、肌内、动脉内、髓内、硬膜内、心内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下或直肠给药。

[0149] 本发明的疫苗组合物的特征在于含有免疫原性复合蛋白，并且还可以含有药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。如本文所用，术语“药学上可接受的”是指意指生理学上可接受的无毒的，当给予人时不抑制活性成分的作用，并且不通常引起过敏反应或类似反应，例如胃肠道不适和头晕。

[0150] 术语“载体”是指有助于将化合物添加到细胞或组织中的物质。药学上可接受的载体的实例还可包括用于口服给药的载体或用于肠胃外给药的载体。用于口服给药的载体可以包括乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸等。此外，用于口服给药的载体可以包括用于肽制品口服给药的各种药物递送材料。此外，用于胃肠外给药的载体可以包括水、合适的油、盐水、葡萄糖水溶液和乙二醇，并且还可以包括稳定剂和防腐剂。稳定剂的合适的实例包括抗氧化剂，例如亚硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸。防腐剂的合适的实例包括苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯和氯丁醇。除了上述成分之外，本发明的药物组合物还可以包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂等。其他药学上可接受的载体和制品可参考文献(Remington's Pharmaceutical Sciences,第19版,Mack Publishing Company,Easton,PA,1995)。

[0151] 此外，本发明提供免疫方法，其特征在于向需要其的受试者给予有效量的免疫原性复合蛋白。

[0152] 术语“受试者”是指动物，优选哺乳动物，特别是包括人在内的动物，并且可以是来源于动物的细胞、组织、器官等。受试者可以是需要治疗的患者。

[0153] 术语“免疫”是指当将本发明的免疫原性复合蛋白给予受试者时，在受试者中诱导对免疫原性复合蛋白的分泌性的体液和/或细胞免疫应答，其中这样的免疫带来对靶疾病的预防或治疗效果。

[0154] 靶疾病是由包含在本发明的免疫原性复合蛋白中的抗原(即，实质的免疫应答结构域)决定。靶疾病可以包括任何疾病，只要已知疾病是由特定抗原引起，即，这样的引起疾病的抗原包含在本发明的免疫原性复合蛋白中，因此可以有利地用于其预防或治疗。靶疾病的种类不受限制，但其实例可以包括肿瘤疾病、自身免疫疾病、转移性疾病、退行性疾病、病毒或细菌感染、朊病毒病、运动神经元病(MND)等。

[0155] 靶疾病的具体实例可包括黑色素瘤、腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、膀胱癌、结肠癌、结肠直肠癌、睾丸癌、B细胞恶性肿瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、肌肉癌、胰腺癌、脑瘤、星形母细胞瘤、成胶质细胞瘤、乳腺癌、脊索瘤、过敏症、哮喘、多发性硬化(MS)、糖尿病、类风湿性关节炎、尿失禁、骨质疏松症、阿尔茨海默病、由突触核蛋白(synuclein)异常引起的路易体紊乱(LBD)、退行性神经系统疾病(如帕金森病(PD)和多系统萎缩症(MSA))、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、由乙型或丙型肝炎病毒引起的肝炎、人乳头状瘤病毒(HPV)感染和由其引发的肿瘤、肺炎衣原体(Chlamydia pneumonia)感染、大肠杆菌(Escherichia coli)感染、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)引起的胃溃疡、疟疾、结核病、念珠菌属(Candida)(如白色念珠菌(Candida albicans))感染、炭疽、败血病、变异型克雅病(variant Creutzfeldt-Jakob disease，vCJD)、绵羊瘙痒病和肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。

[0156] 优选地，本发明的免疫原性复合蛋白的靶疾病可以是肿瘤疾病，更优选地，是结肠直肠癌或结肠癌。

[0157] 术语“有效量”是指表现出本发明的免疫原性复合蛋白对靶疾病的预防或治疗效果的量，以及是指足以诱导给予了本发明的免疫原性复合蛋白的受试者中诱导对免所述疫原性复合蛋白的分泌性的体液和/或细胞免疫应答的量。

[0158] 本发明的蛋白质的总有效量可以单一剂量给予受试者，或在长期给药中经分次治疗方案以多个剂量给予。此外，活性成分的含量可根据给药的目的而变化。可根据各种因素确定对每个受试者的有效剂量，例如需要给药的受试者的年龄、体重、健康状况、性别、疾病严重性、饮食和排泄速率，以及靶疾病的类型和严重性、给药途径和给药频率。因此，本领域普通技术人员可以根据给药的目的确定合适的有效剂量。可使用测定给予本发明蛋白质后免疫细胞活性的测定方法或广为人知的体内测定法来监测治疗效力以确定有效剂量。本发明的药物组合物不特别限于所述剂型、给药途径和给药方法，只要可以表现出本发明的效果即可。

[0159] 上文已经描述了本发明的免疫原性复合蛋白的给药途径。本发明的免疫原性复合蛋白可与药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂一起给予。载体、赋形剂或稀释剂已在上文中描述。

[0160] 本发明的免疫原性复合蛋白可以单独给予或与具有预防和治疗靶疾病的效果的已知化合物结合给予。

[0161] 有益效果

[0162] 通过包括步骤(a)至(c)的用于制备转化的(或转基因)植物的方法以及通过该方法制备的转化的(或转基因)植物，可以安全并经济地大量产生免疫原性复合蛋白。从植物获得的免疫原性复合蛋白(抗原-抗体复合物)具有大的四级结构，从而具有优异的增强免疫应答的效果，因此即使不使用免疫佐剂也在宿主动物中表现出抗体产生能力。附图说明

[0163] 图1描绘了嵌合抗原，并具体地，阐明了结肠直肠癌细胞表面特异性蛋白-Fc(GA733-FcK)的结构。

[0164] 图2描绘了针对抗原的二价的单特异性抗体，并具体地，阐明了结肠直肠癌细胞表面特异性蛋白-Fc-特异性抗体(CO17-1AK)的结构。

[0165] 图3是通过分别表达结肠直肠癌细胞表面特异性蛋白-Fc(GA733-FcK)和结肠直肠癌细胞表面特异性蛋白-Fc特异性抗体(CO17-1AK)的植物的异花授粉获得T1代植物的过程的示意图。

[0166] 图4示出了使用PCR从T1代植物(1至13号)中选择具有两种基因(GA733-FcK和CO17-1AK)的植物的结果(GA：标准GA733-FcK，CO：标准mAb CO17-1AK，NT：非转基因植物，HC：CO17-1AK的重链，LC：CO17-1AK的轻链)。

[0167] 图5示出了在3、4、6、9和11号植物中表达GA733-FcK基因(A)和CO17-1AK基因(B)的蛋白质印迹(western blot)结果。

[0168] 图6示出了使用SDS-PAGE研究是否在4号T1代植物中纯化了两种蛋白质(GA733-FcK和CO17-1AK)的结果。

[0169] 图7示出了使用双色蛋白质印迹研究从4号T1代植物纯化的蛋白质样品是否同时表达两种蛋白质(GA733-FcK和CO17-1AK)的结果。

[0170] 图8a是示出在夹心ELISA中，捕获抗体和抗原(本发明中的嵌合抗体，具体地，GA733-FcK蛋白)的结合以及检测抗体(识别结合抗原-抗体复合物)的结合类型的示意图(捕获抗体：绿色，检测抗体：蓝色)。

[0171] 图8b示出了在夹心ELISA中，当用相同的捕获抗体(COM或COP)处理不同的蛋白质样品(GAP、GAP+COP、GAP×COP)时，捕获抗体和蛋白质的结合信号的对比结果。

[0172] 图9a示出了用COM、COP、GAP+COP和GAP×COP样品处理GAP-固定芯片时的SPR测量结果。

[0173] 图9b示出了用GAM、GAP、GAP+COP和GAP×COP样品处理COP-固定芯片时的SPR测量结果。

[0174] 图10举例说明了本发明的T1代植物中表达的免疫原性复合蛋白中呈现为线性形式的复杂结构。具体地：

[0175] 图10a示出了T1代植物中表达的嵌合抗原-抗体复合物中的嵌合抗原-抗体二聚体形式的最简单类型。

[0176] 图10b示出了T1代植物中表达的嵌合抗原-抗体复合物中的嵌合抗原-抗体复合物的线性形式的实例。

[0177] 图10c示出了作为T1代植物中表达的融合蛋白的实例，在本文中称为“Fab臂交换的融合蛋白”的融合蛋白的结构。

[0178] 图10d示出了“Fab臂交换的融合蛋白”的蛋白二聚体形式。

[0179] 图10e示出了“Fab臂交换的融合蛋白”的蛋白复合物中的复合物的线性形式的实例。

[0180] 图10f示出了“Fab臂交换的融合蛋白”的蛋白复合物中的复合物的线性形式的另一个实例。

[0181] 图11举例说明了本发明的T1代植物中表达的免疫原性复合蛋白中，呈现为环状形式的复杂结构。具体地：

[0182] 图11a示出了T1代植物中表达的嵌合抗原-抗体单分子的环状聚合类型中的五聚体结构的实例。

[0183] 图11b示出了T1代植物中表达的嵌合抗原-抗体单分子的环状聚合类型中的五聚体结构的另一个实例。

[0184] 图12示出了从被转化以表达GA733-FcK(嵌合抗原)的亲代植物获得的蛋白质样品结构的电子显微镜观察图像。在每个图像上，由白色横条表示的比例尺代表10nm。

[0185] 图13示出了从T1代植物获得的蛋白样品结构的电子显微镜观察图像。在每个图像上，由白色横条表示的比例尺代表10nm。

[0186] 图14示出了在无免疫佐剂的情况下，将每种蛋白质样品注入小鼠后，疫苗接种效果(血清中的抗体产生效果)的SPR确认结果。

[0187] 图15示出了用各个蛋白质接种的小鼠中白细胞介素-4(IL-4)产生的确认结果。

[0188] 图16示出了用各个蛋白质接种的小鼠中白细胞介素-10(IL-10)产生的确认结果。

[0189] 图17示出了从给予了各个疫苗候选物质的小鼠获得的血清中的抗结肠直肠癌抗体的活性的确认，示出了随时间变化的结肠直肠癌的尺寸。

[0190] 图18示出了通过纯化植物中的GAP(GA733-FcK)、COP(CO17-1AK)和GAP×COP(GA733-FcK×CO17-1AK)而获得的糖结构的质量分析结果，确认了通过异花授粉获得的GAP×COP具有与其亲代植物相似的糖结构模式。

具体实施方式

[0191] 在下文中，将详细描述本发明。

[0192] 然而，以下实施例仅用于举例说明本发明，并非意图限制本发明的范围。

[0193] <实施例1>

[0194] 制备表达抗原的转化的(或转基因)植物以及表达抗体的转化的(或转基因)植物[0195] 结肠直肠癌细胞表面特异性蛋白-Fc(GA733-FcK抗原)是通过与本发明人的韩国专利第10-1054851号和Zhe Lu等人的文献中描述的相同的方法制备。

[0196] 简言之，将编码经修饰的(N末端用30-aa植物ER信号肽(SEQ ID NO:3)进行延伸)结肠直肠癌细胞表面特异性蛋白GA733(SEQ ID NO:1)的基因和人IgG1Fc序列(SEQ ID NO:6)(在IgG Fc C末端添加ER滞留信号(SEQ ID NO:8))进行布置以排列成基因序列(参见SEQ ID NO:10)，以表达GA733-FcK重组融合蛋白(SEQ ID NO:9)。通过将花椰菜花叶病毒(CaMV)
35S启动子和烟草蚀刻病毒5-前导序列(TEV)放置在GA733-FcK基因之前来构建表达盒。使用限制酶HindIII将所构建的结肠直肠癌细胞表面特异性蛋白-Fc表达盒插入pBINPlus载体中以制备植物表达载体。

[0197] 为了在植物中表达已知为针对结肠直肠癌细胞表面特异性蛋白(GA733)的抗体的mAb CO17-1A(重链：SEQ ID NO:11，轻链：SEQ ID NO:13)，将ER滞留信号的基因序列添加到mAb CO17-1A的IgG重链的C末端，其称为mAb CO17-1AK(重链：SEQ ID NO:12，轻链：SEQ ID NO:13)。将编码mAb CO17-1AK的重链和轻链的基因序列插入pBI121植物表达载体中。插入花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子和苜蓿花叶病毒非翻译前导序列(AMV)以放置在重链基因之前。此外，将马铃薯蛋白酶抑制剂II启动子(Pin2p)插入在轻链基因之前以构建表达盒。用限制酶HindIII和EcoRI处理所构建的重链和轻链表达盒，随后将其插入植物表达载体pBI121中。

[0198] 使用电穿孔将所制备的植物表达载体分别引入根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。然后选择并培养保留了插入基因的土壤杆菌。在使嫩叶形成1-3cm大小的切口后，将培养的土壤杆菌插入其中。然后将植物叶子转移到固体植物培养基中，然后在补充有激素(例如NAA(乙酸)和BA(6-苄基氨基-嘌呤))和卡那霉素(100mg/L)的Murashige and Skoog固体培养基(Dachfu，Haarlem，荷兰)中培养，直到产生愈伤组织。培养3-4周后产生新的转化体植物。

[0199] <实施例2>

[0200] 使抗原表达植物和抗体表达植物交配并筛选同时表达亲代性状的第一代植物[0201] 通过以下方式进行异花授粉(参见图3)：将结肠直肠癌细胞表面特异性蛋白-Fc抗体(mAb CO17-1AK抗体)的雄蕊人工置于由实施例1产生的表达结肠直肠癌细胞表面特异性蛋白-Fc抗体(GA733-FcK抗原)的花芽上。将通过异花授粉获得的种子在23℃下发芽以生长出植物，从而获得总共13株T1代(GA733-FcK×CO17-1AK)植物。使用PCR方法确认T1代植物中是否存在两种基因。在每个植物受试者中选择并筛选具有两种基因的植物(参见图4)。具体实验方法如下。

[0202] 使用Dneasy 试剂盒(Quiagen，Hilden，德国)从表达结肠直肠癌细胞表面特异性蛋白-Fc(GA733-FcK抗原)的植物、表达结肠直肠癌细胞表面特异性蛋白-Fc抗体(mAb CO17-1AK)的植物以及通过上述两种植物的异花授粉获得的植物(GA733-FcK×CO17-1AK)的叶子中分离和纯化基因组DNA。取约90-100g植物叶子，立即在液氮中冷冻，然后粉碎。粉碎后，根据Dneasy试剂盒制造商推荐的方法纯化纯的植物基因组DNA。进行PCR：使用每种分离的基因组DNA作为模板、结肠直肠癌细胞表面特异性蛋白-Fc(GA733-FcK抗原)的引物以及结肠直肠癌细胞表面特异性蛋白-Fc抗体(mAb CO17-1AK)的重链和轻链的引物。将在先分离的基因组DNA(1μl)和iTaq预混合物(Intron Biotechnol.Inc.，Seongnam，韩国)混合，并以
10pmol/μl加入GA733-FcK的正向引物5'-GTCGACACGGCGACTTTTGCCGCAGCT-3'(SEQ ID NO:
17)和反向引物5'-GAGTTCATCTTTACCCGGGGACAG-3(SEQ ID NO:18)。PCR条件如下：在94℃下
30s、在67℃下30s以及在72℃下30s的30个循环的变性-退火-延伸。以相同的方式，使用mAb CO17-1AK的重链的正向引物5'-ATGGAATGGAGCAGAGTCTTT-3'(SEQ ID NO:19)和反向引物
5'-ATCGATTTTACCCGGAGTCCG-3(SEQ ID NO:20)以及CO17-1AK的轻链的正向引物5'-ATGGGCATCAAGATCGAATCA-3'(SEQ ID NO:21)和反向引物5'-ACACTCATTCCTGTTGAAGCT-3(SEQ ID NO:22)进行各PCR。

[0203] 如图4中所示，结果证实GA733-FcK和CO17-1AK两者都在4号、6号和11号植物中表达。

[0204] <实施例3>

[0205] 在所选择的T1代植物中的基因表达的验证

[0206] 研究了在<实施例2>中选择的植物的抗原和抗体的表达。

[0207] <3-1>蛋白质印迹

[0208] 从<实施例1>的GA733-FcK和CO17-1AK以及<实施例2>的GA733-FcK×CO17-1AK(T1代植物)中的每种转化的(或转基因)植物取100mg新鲜叶子，并放入300μl的1×PBS(NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4)中，随后充分粉碎。将粉碎的叶子的上清液在10％SDS-PAGE凝胶上进行电泳。将上清液转移至硝酸纤维素膜上，然后用5％脱脂乳(Fluka，Buchs，瑞士)在4℃下封闭16h。对于二级抗体处理，处理以1:5000比例稀释的抗EpCAM/TROP1(R&D系统，Minneapolis，MN)和抗小鼠IgG H+L(Bethyl，Montgomerty，TX)。使用1×PBS(吐温0.1％)缓冲液洗涤膜三次，每次10min。从膜上除去缓冲液后，使膜与Supersignal化学发光底物(Thermo，Fisher Scientific，Roskilde，Rosilde，丹麦)反应，然后在X射线胶片上光敏化。

[0209] 蛋白质印迹试验证实抗原(图5a)和抗体(图5b)两者在4号、6号和11号T1代植物中具有高表达率。

[0210] <3-2>电泳和双色蛋白质印迹

[0211] 在实施例<3-1>中确认已表达抗原和抗体的植物中，使4号植物在体内条件(温室)中生长。纯化所转化的(或转基因)植物的叶子，然后确认其蛋白质分子大小，同时通过双色蛋白质印迹证实表达所述两种基因的植物。具体实验方法如下。

[0212] 将在体外条件证实的植物株系4、6和11种植在苗床土壤(Sunshine Mix5，Agawam，MA)中。温室的温度和湿度为34℃和64％RH，这是七月至九月的平均条件。当植物生长为成年植物并产生花时，仅收集并收获叶子，然后在-70℃下储存。使用所收集的叶子纯化抗原-抗体蛋白。使用蛋白G柱(GE healthcare，Little Chalfont，英国)进行植物纯化。在每种样品中，GAM是使用GA733蛋白和购自R&D系统的“抗人EpCAM/TROP1 MAb[克隆158210](小鼠IgG2A，CATALOG#MAB960)”通过与<实施例1>中所述的相同的方法产生的嵌合抗原蛋白，COMM P P P P P是指来源于小鼠的mAb CO17-1A。GA (GA733P-FcK)、CO (mAb CO17-1AK)和GA ×CO(GA733P-FcK×mAbPCO17-1AK)是这样的植物，即其表达嵌合抗原和针对其的抗体，以及从通过如实施例1和2中所述的植物的异花授粉而制备的植物获得的重组蛋白。将SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)制成10％凝胶，并将各个蛋白质样品进行电泳。

[0213] 对于双色蛋白质印迹，将8μl各个纯化样品GAM(GA733的嵌合抗原和抗人EpCAM/TROP1 MAb)、GAP(GA733P-FcK)、COM(mAbM CO17-1A)、COP(mAbP CO17-1AK)、GAP×COP(GA733P-FcK×mAbP CO17-1AK)以0.5μg/μl的浓度与2μl的5×上样缓冲液混合。使用10％SDS-PAGE进行电泳，将膜转移至硝酸纤维素膜上，然后用5％脱脂乳(Fluka，Buchs，瑞士)缓冲液在4℃下封闭16h。对于二级抗体处理，将山羊抗人IRDye 800CW(LI-COR，Lincoln，NE)和山羊抗小鼠IRDye 680LT(LI-COR，Lincoln，NE)与脱脂乳以1:15000的比例混合，然后在室温下处理16h。使用1×PBS(吐温0.1％)缓冲液洗涤膜三次，每次10min。除去膜的缓冲液，然后使用红外成像系统Odyssey检测器(LI-COR，Lincoln，NE)确证蛋白质条带。

[0214] 结果使用SDA-PAGE证实，在T1代植物中纯化了GA733-FcK和CO17-1AK两种蛋白质(参见图6)。另外，通过双色蛋白质印迹证实，从T1代植物纯化的样品同时表达GA733-FcK和CO17-1AK两种蛋白质(参见图7)。

[0215] <实施例4>

[0216] 蛋白的形态和结构的确认

[0217] <4-1>通过夹心ELISA预测蛋白复合物的结构

[0218] 使用在实施例<3-2>中纯化的样品进行夹心ELISA。

[0219] 具体地，将100μl作为捕获抗体的COM(mAbM CO17-1A)或COP(mAbP CO17-1AK)以5ng/μl的浓度分配在96孔板的每个孔中，并在4℃下培养过夜。为了除去未结合抗体，从孔中除去处理的溶液，然后将板孔用1×PBS洗涤三次。此外，在4℃下过夜分配150μl的3％BSA溶液。除去处理过的3％BSA后，用200μl的1×PBS洗涤孔三次。将抗原GAP(GA733P-FcK)和GAP+COP(GA733P-FcK+mAbP CO17-AK，从植物纯化，将相同量的从植物纯化的蛋白质在体外混合)、以及GAP×COP(GA733P-FcK×mAbP CO17-1AK，从4号T1代植物中纯化的蛋白质)分别在样品上以700ng、350ng、125ng和62.5ng进行处理，随后在37℃下孵育1 1/2小时。此外，用1×PBS重复洗涤三次。将比例为1:10000的作为检测抗体的抗人Fc-HRP(Jackson
ImmunoReseach Labs，west Grove，PA)和3％BSA溶液以150μl/孔分配，然后在室温下孵育
2h。孵育后，用TMB(3.3,5.5-四甲基联苯胺)底物(KPL，Gaithersburg，MD，USA)处理每个孔。
此外，在450nm处确认吸光度。捕获抗体与抗原(本发明的嵌合抗原，特别是GA733-FcK蛋白)的结合以及识别结合的抗原-抗体复合物的检测抗体的结合如图8a所示。

[0220] 结果，如图8b中所示，GAP×COP比GAP和GAP+COP表现出更高的吸光度。特别地，GAP+COP的吸光度信号比GAP的小，将该结果与GAP×COP比GAP表现出更高的吸光度的事实进行比较，表明在GAP+COP中没有产生大的四级结构。因此，推测从T1代转化的(或转基因)植物(特别是4号植物)纯化的蛋白质的抗原-抗体复合物构成更强的复合物，并形成比通过抗原和抗体的体外人工结合所产生的抗原-抗体复合物更大的分子。

[0221] <4-2>通过表面等离子体共振(SPR)预测蛋白复合物的结构

[0222] 为了验证从T1代转化的(或转基因)植物(特别是4号转化的(或转基因)植物)纯化的蛋白质的抗原-抗体复合物构成了更强的复合物并形成了大分子，使用涂覆有GA或抗GA抗体的SPR芯片进行SPR。具体地，使用ProteOn XPR36表面仪器(Bio-Rad)进行SPR。根据制造商提供的方案，使用胺偶联化学作用将GAM(R&D系统)或COM固定于GLC 传感器芯片(Bio-Rad)。共振单位(RU)约为1,6001,800。通过使PBS-T缓冲液以100μL/min的流速流动60s来进行芯片稳定化。使每种样品(15μg/mL)在25℃下以50μL/min的流速在pH 6.0下在固定的受体上流动。每次测量后，使用磷酸再生所述传感器芯片的表面。在所有实验中，数据为0或根据标准通道调整。使用Proteon Manager(Bio-Rad)计算解离和速率常数。

[0223] 结果，如图9a中所示，在涂覆有GA的SPR芯片上，GAP×COP和GAP+COP的动力学信号(kinetic signal)显著低于COP和COM的动力学信号。此外，如图9b所示，在涂覆有抗GA抗体的SPR芯片上，GAP×COP的信号水平低于GAP+COP的信号水平。这些结果证明本发明的T1代植物产生构成大的四级结构的抗原-抗体复合物。

[0224] <4-3>电子显微镜观察

[0225] 从实施例<4-1>和<4-2>的结果预测，T1代植物产生图10和11中所示的大的四级结构，并且这种预测得到证实。具体地，对于从<实施例1>中制备的亲代抗原表达植物(GA733-FcK抗原)和<实施例2>制备的后代T1代获得的每种蛋白质样品，通过染色和电子显微镜监测蛋白质结构和形态。将蛋白样品在37℃下孵育1h。离心后，将每种样品重新分散在PBS中以制备透射电子显微镜(TEM)的样品。通过辉光喷射将样品溶液上样到具有亲水性的涂覆有碳膜的TEM网格上。90s后，用蒸馏水擦去过量的样品溶液。对于阴性染色，将1％乙酸双氧铀上样到所述网格上1min，然后用滤纸擦拭过量的染色溶液。用生物透射电子显微镜对样品进行拍照。

[0226] 图12示出了亲代植物中表达的GA733-FcK蛋白(抗原)的结构，图13示出了从T1代植物(其中同时表达GA733-F cK和针对其的抗体CO17-1AK)获得的蛋白质样品的结构的电子显微镜结果。如图12所示，观察到GA733-FcK蛋白(抗原)呈Y形(～15nm)和多种形状，并观察到单独存在的抗原蛋白。此外，如图13所示，在从T1代植物获得的蛋白质样品中观察到如图11所示的回路形环状形式(loop-shaped circular form)(20-30nm)，同时还观察到30nm或更大的球形形式和30nm或更大的聚集体。

[0227] 从上述结果可以看出，在通过表达结肠直肠癌细胞表面特异性蛋白-Fc(GA733-FcK抗原)的植物和表达结肠直肠癌细胞表面特异性蛋白-Fc抗体(mAb CO17-1AK抗体)的植物的异花授粉产生的后代(A733-FcK×CO17-1AK)植物中，抗原和抗体构成了多种形状的具有大的四级结构的复合物。

[0228] <实施例5>

[0229] 疫苗效果的测量

[0230] <5-1>通过疫苗接种进行的免疫的测量(体内抗体产生的测量)

[0231] 通过将四种蛋白质样品注射到小鼠中来研究疫苗接种的效果。

[0232] 用于本测试的四种蛋白质样品如下：GAM(通过与<实施例1>相同的方法使用GA733蛋白和由R&D系统出售的“抗人EpCAM/TROP1 MAb[克隆158210](小鼠IgG2A，CATALOG#P P M M.MAB960)”产生的嵌合抗原蛋白)、GA (GA733 -FcK)、GA+CO (通过在体外将相同量的以下蛋白质混合而获得：GA733与抗人EpCAM/TROP1 MAb的嵌合抗原以及mAbM CO17-1A)、GAP×COP(GA733P-FcK×mAbP CO17-1AK)。

[0233] 每组使用五只小鼠，注射四种蛋白质样品而不注射免疫佐剂。向对照组给予1×PBS。注射样品后，获得各组的血清，使用如实施例<4-2>所示的表面等离子体共振(SPR)法检查每组血清中产生的抗体量。简言之，对于表面等离子体共振(SPR)，将结肠直肠癌候选蛋白GAP(GA733-FcK)连接于金芯片，然后使10μl的每只接种的小鼠的血清流过金芯片。

[0234] 如图14所示，由于通过测量小鼠血清中产生的抗体量来检查组间差异，证实注射了1×PBS的小鼠(阴性对照)的血清显示的信号最低，而GAP×COP显示的值高于其他测试组，因此GAP×COP诱导比任何其他疫苗候选组更高的免疫应答。特别证实了，与GAM+COM(在体外制备的免疫复合物)的给药效果相比，GAP×COP(从本发明的植物获得的免疫原性复合物)表现出优异的免疫增强作用。这些结果是由于以下事实：与在现有技术中将抗体和抗原在体外置于相同点时产生的抗原-抗体结合相比，通过本发明的植物交配产生的抗原-抗体复合物通过更强的结合构成了复合物。

[0235] <5-2>免疫细胞激活的测定(细胞因子产生的测定)

[0236] 从实施例<5-1>中的每只接种小鼠中取出脾脏，与培养基一起破碎，然后共培养树突状细胞和作为抗原的GA733-FcK。将共培养的烧瓶在37℃下培养3天。培养后，使用FACS测量IL-4和IL-10的激活。本测试检查T细胞的CD4+是否被激活。CD4+可以分为典型的Th1/Th2/Th17应答，而IL-4和IL-10是包含于Th2中的因子。

[0237] 结果，如图15和16所示，与用1×PBS、GAM、GAP或GAM+COM免疫的小鼠相比，注射GAP×COP的小鼠的脾脏显示出最高的IL-4和IL-10细胞因子值。这些结果表明，注射GAP×COP的小鼠中T细胞激活增强。这些结果证实本发明的大分子抗原-抗体复合物增加了CD4+，并进一步影响抗体的形成。

[0238] <5-3>体内癌生长抑制效果的比较

[0239] 在6周龄BALB nu/nu小鼠(每组三只，Japan SLC Inc.,Hamamatsu，Shizuoka，日本)的背部皮内(i.d.)接种人结肠癌细胞——SW 620细胞(1×106)以构建肿瘤异种移植小鼠模型。将从用1×PBS、GAM、GAP、GAM+COM或GAP×COP免疫的每只BALB/c小鼠获得的40μl血清腹腔注射到6组肿瘤异种移植物小鼠模型中，每三天共注射4次(7天给予总计160μl)。给阳性对照组注射100μg纯化的mAb CO17-1A(COM)。在最初注射癌细胞后的第8、10、12和15天记录并基于有刻度的卡尺测量的三个主直径由以下方程计算肿瘤的生长即肿瘤体积：(mm3)＝宽×长×高。

[0240] 试验结果示于图17中，在用血清(获自用SW 620人结肠癌细胞异种移植的BALB/c小鼠)注射并用1×PBS、GAM、GAP、GAM+COM或GAP×COP免疫的裸小鼠中，肿瘤症状出现在癌细胞移植的第8天。此后，与其他测试组相比，在1×PBS处理组中肿瘤尺寸突然增加。与GAP×COP血清或COP血清给药组相比，GAM血清、GAP血清和GAM+COM血清给药组中的肿瘤显著地快速生长。在第15天，GAP×COP给药组的肿瘤尺寸显著小于其他试验组的肿瘤尺寸。GAP×COP给药组中的肿瘤生长抑制效果与COP给药组中的类似。

[0241] <实施例6>

[0242] 第一代蛋白质的糖组成分析

[0243] 为了比较GAP、COP和GAP×COP中的N-聚糖特征，进行质量分析。

[0244] 首先使用胃蛋白酶将从亲代(GAP、COP)和T1代(GAP×COP)植物中纯化的重组蛋白样品消化成糖肽。使用PNGas A(Roche)从糖肽中释放N-聚糖，并将所释放的N-聚糖使用Carbograph(Alltech)的石墨化碳树脂纯化。将纯化的聚糖重悬于90μL二甲基亚砜(DMSO)、2.7μL水和35μL碘甲烷的混合物中，然后使用离心柱(spin-column)法(Goetz JA et al.，
2009)进行固相完全甲基化。将如此获得的完全甲基化聚糖与10mg/mL 2,5-二羟基苯甲酸溶液(在1mM乙酸钠溶液中制备)等体积混合。将所得混合物施加到基质辅助激光解吸电离(MALDI)MSP96磨光钢靶板(ground steel target plate)上并干燥，然后进行MALDI-TOF质谱。在20kV加速电压下获得所有质谱。

[0245] 如图18所示，质量分析结果证实低聚甘露糖聚糖(Man 79)存在于所有样品中。证实COP主要具有Man 7聚糖结构，而GAP具有Man 79低聚甘露糖聚糖结构。与COP和GAP一样，GAP×COP也具有低聚甘露糖聚糖结构。此外，GAP×COP中的Man 7和Man 9的相对比例(4:1)与它们在COP和GAP中的总和接近。因此，可以看出，T1代表达的免疫复合物含有与亲代的蛋白质中几乎相同的聚糖结构。

[0246] 工业实用性

[0247] 如上所述，本发明涉及用于制备产生免疫原性复合蛋白的转化的(或转基因)植物的方法及由其获得的免疫原性复合蛋白，更具体地，涉及用于制备产生免疫原性复合蛋白的转化的(或转基因)植物的方法，所述方法包括：(a)制备表达抗原的转化的(或转基因)植物；(b)制备表达对步骤(a)中的抗原具有特异性的抗体的转化的(或转基因)植物；以及(c)使步骤(a)和(b)中的植物交配以制备交配的植物，涉及通过该方法产生的植物以及从该植物获得的免疫原性复合蛋白。

[0248] 通过包括步骤(a)至(c)的用于制备转化的(或转基因)植物的方法和通过该方法产生的转化的(或转基因)植物，可以安全并经济地大量产生免疫原性复合蛋白。此外，从所述植物获得的免疫原性复合蛋白(抗原-抗体复合物)具有大的四级结构，从而具有优异的增强免疫应答的效果，因此即使不使用免疫佐剂也在宿主动物中表现出显著的抗体产生能力。

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