【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は生物適合性フィルムを有する生体用材に関するものである。 より詳しくは本発明は、フィルム状の生物適合剤を有し、そして生物適合性が強化された種々の生体用材およびその製造方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】代用血管、合成物の眼内レンズ、電極、
カテーテルその他のような生体用材の体内および体表への移植は急速に発展している医学の分野である。 合成の血管用グラフト（移植片）のような生体用材移植物を長期間使用する際の第一の障害は満足すべきグラフト表面を持たないことである。 例えば、プラスチック製の合成血管の非処理表面は、急速な血栓形成作用を刺激することが多い。 種種の血漿蛋白質はプラスチック表面において血小板およびフイブリン沈着を起こさせる。 このような作用が血流障害となる血管圧縮につながり、それに引き続く炎症反応が合成移植物の機能を失わせることにつながる。 「生体用材」（バイオマテリアル）とは、実際上、体液に不溶で、体内または体表面に置くか、体液と接触させるように設計され、つくられた機材を云う。 血管グラフトおよびコンタクトレンズが生体用材の例である。

【０００３】理想的には、生体用材は次のような性質を持つ。 １． 凝血、組織死、腫瘍形成、アレルギー反応、異物反応（拒否反応）または炎症反応のような、体内での望ましくない反応を誘導しない。 ２． 目的通りに機能するために要求される、強度、弾性、透過性および柔軟性のような物理的性質を持つ。 ３． 容易に精製、製造および滅菌できる。 ４． １時間であれ一生涯であれ、体内に移植され、または体と接触している間は、その物理的住質および機能を実際上保っている。

【０００４】生物体に対し、正味で有益な効果を与えつつ生物体の生物学的液体および／または組織と接触して機能し、存在し得るならば、ここに使ったように、その生体用材の固体表面は「生物適合性」としての性質を持つ。 宿主生物にとっての妨害を低減するために長期の生物適合性が望まれる。

【０００５】移植物体の生物適合性を改善するため多くの解決法が提案されてきた。 ひとつの解決法は、望ましくない蛋白質の付着を防ぐために生体用材に低分極性表面、負荷電表面または酵素、内皮細胞や蛋白質のような生物学的物質によって被覆した表面を与えることによって、生体用材の表面を修飾することであった。 固体表面をヘパリン、アルブミンおよびストレプトキナーゼのような生化学材で被覆して血栓耐性を強化した。 特にアルブミンはポリマー表面に物理的に吸着され、静電的および共有的に結合される。

【０００６】アメリカ特許第４，５３０，９７４号明細書においてマンロー等（Ｍｕｎｒｏｅｔ ａｌ）は、アルブミンが選択的に結合する非イオン性疎水性脂肪族鎖を表面に共有結合させることにより、ポリウレタンのような水不溶性ポリマーにアルブミンを吸着させる方法を発表している。 アメリカ特許第４，３７８，２２４号明細書においてニンニ等（Ｎｉｍｎｉｅｔ ａｌ）は、補綴物をつくるために使用される動物組織を、主としてカルシウム化阻害剤からなる三次元架橋マトリックスを形成させることにより被覆する方法を示している。

【０００７】生体用材の存在で起る副作用の一例はコンタクトレンズ上への蛋白質の沈着である。 コンタクトレンズ装着者は時間が経つにつれてコンタクトレンズに対してしばしば我慢ができなくなる。 これは装着している間にレンズ上に沈着した生化学物質（蛋白質、脂質、ムコ多糖その他）に対する刺激およびアレルギー反応と結びついている。 現在行われている洗浄および消毒法でこれら沈着物をある程度除去できるが、これらの方法はしばしばレンズに穴やひびを残し、それが装着者の眼への刺激を更に加えたシ、一層生化学物質沈着の中心になったりする。

【０００８】アメリカ特許第３，９５９，０７８号明細書においてガイア（Ｇｕｉｒｅ）はアミノエチルセルロースまたはアルキルアミンガラスに酵素を共有結合する試薬を使用することを記載している。 下記のものも参照。 ガイア（Ｇｕｉｒｅ）、酵素安定化および固定化のための段階的熱光化学的架橋；エンザイム エンジニアリング３巻６３−７０頁（１９７８年）（Ｅｎｚｙｍｅ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ３：６３−７０（１９７
８））およびガイア（Ｇｕｉｒｅ）、酵素および他の生化学物質の光化学的固定化、メソーズ イン エンザイモロジー ＸＬＩＶ巻、２８０−２８８頁（１９７６
年）（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
ＸＬＩＶ：２８０−２８８（１９７６））。 固体表面に連結試薬を熱化学的にカップリングさせ、次いでこの連結試薬に酵素を光化学的にカップリングさせることによク、調節した孔を持つガラス、セルロース、アガロースおよびポリアクリルアミドのような基質に酵素を共有的に結合させて体外診断分析を行う際に有用な表面をつくる方法がこれらの文献に記載されている。

【０００９】〔課題を解決するための手段〕本発明は望ましい生物適合性表面を与えられた生体用材に関する。
生体用材の固体表面を修飾する方法には、生物適合性剤の分子と、活性化することにより固体表面に共有結合することができる光化学反応性基および活性化することにより生物適合性剤の離れた分子に共有結合することができる別の反応性基を持つ化学的連結性基の分子を使用する。 これらの基の一方は他方の基が応答する刺激による活性化に対して応答しない。 本方法は、刺激を加えて基を順次活性化し、連結基の上記の別の反応性基を生物適合性剤の分子に共有結合させ、次いで生物適合性剤の分子が固体表面を効果的に覆いつくすに十分な表面密度を持たせて固体表面に連結基を光化学的に共有結合させることにより、生物適合性の効果ある表面を得ることを特徴とする。

【００１０】生物適合性の「効果ある」表面は、連結基を介して生体用材の固体表面に共有結合的に連結されて、生物適合性剤が持っているものと実質的に同じ生物適合性の性質を持つ表面を得るようにした、生物適合性剤の複数の分離した分子から形成されている。 生物適合性剤の分子によって形成された効果ある表面は生体用材の全表面を覆う必要はない。 表面を点で覆ってよい。 例えば、血管グラフトの表面に沿った点をフィブロネクチンのような細胞付着因子で被覆してよい。 このような点で形成された生物適性の効果ある表面はこの修飾した表面への細胞付着の中心として働く。 連結基の別の反応性基は、最初に述べた光化学的な反応性基が応答する刺激に応答せず、生物適合性剤が共有結合する熱化学的基または光化学的基であることが望ましい。

【００１１】本発明のもうひとつの実施態様として、化学的連結基残基で器具の固体表面に共有的に連結された生物適合性剤の離れた分子で形成された、生物適合性の効果ある表面を持つ器具を得ることである。 化学的連結基残基には、固体表面に共有的に結合された光化学的反応性基の残基、および、生物適合性剤の分子に共有結合された別の反応基の残基で、その反応基はもうひとつの反応基が応答する刺激に応答しない反応基のひとつであるものを含む。 生物適合剤の個々の分子は、たがいに十分に近づいて固体表面を効果的に覆い、生物適合性の効果ある表面となるように、固体表面に連結基残基を介して付着している。 生物適合性剤はそれぞれの器具の機能を高めるようなものを選択する。 例えば、コンタクトレンズの機能は、ポリエチレングリコール分子をレンズ表面に付着させて表面への蛋白質の沈着を低減することで高められる。 もうひとつの例としては、フイブロネクチンまたはラミニンのような細胞付着因子をポリ塩化ビニル表面を持つ器具に結合させて器具への細胞付着を増加させる。 これはカテーテルや付用血管のような移植物の場合に望ましい。

【００１２】更に、もうひとつの本発明の実施態様に、
生物適合性剤をたがいに結びつけて生物適合性のフィルムとした生物適合剤の分子と、生体用材の固体表面にこのフィルムを連結することができる化学的連結基を使用する、生体用材の固体表面を修飾する方法が含まれる。
この化学的連結基には、活性化によって固体表面に共有結合され得る光化学反応性基、およびフィルムに共有結合された（例えば、フィルムをつくっている生物適合性剤の残基に共有結合された）反応基の残基が含まれる。
反応基のひとつは他の反応基が応答する刺激に応答しない。 この方法には光化学的反応基を刺激で活性化して生物適合性分子を共有結合させることが含まれる。 本明細書で「結びつける」ということは、隣接した生物適合性剤分子を共有結合させるだけでなく、水素結合、イオン結合、ファンデルバール力による結合その他のような力により引起される相互作用を云う。 たがいに結びつけられてフィルムを形成した分子を持つ生物適合性剤は、一種の剤の分子でもよいし、ヘパリンとアルブミンのような二種以上の剤の分子でもよい。

【００１３】〔発明の実施の形態〕本発明の生物適合性を示す固体表面は生理的液体に不溶の合成または天然の材料が望ましい。 その表面は、生きている生物の組織および／または液体に接触して機能するよう意図された器具のひとつ以上の表面であってよい。 器具の固体表面は研磨されたチタンまたはステンレススチールのようないかなる好適な金属、またはポリウレタン、ポリビニルピロリドン、シリコンエラストマー、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ−（ｐ−フェニレンテレフタルアミノード）、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリエステル、ポリアクリレート（ポリメタクリレートを含む）のようなポリマー；ヒドロキシアパタイトのようなミネラルまたはセラミックス；骨、皮ふおよび歯のような人の組織；木材、セルロースおよび圧縮炭素のような有機材料；およびガラス、
ゴム、木材のような他の天然および合成の材料であってよい。 本発明の生物適合性表面を持った器具の例は、血管グラフトチューブ、透析チューブまたは膜、血液オキシジェネイターチューブまたは膜、限外▲ろ▼過膜、大動脈内バルーン、血液バッグ、カテーテル、縫合糸、軟質または硬質組織補綴、合成補綴、人工器官、およびコンタクトおよび眼内レンズのような眼のためのレンズである。

【００１４】固体表面は熱化学的に反応性のないものが望ましい。 「熱化学的に反応性のない」とは熱化学的に反応する表面の能力を高めるために考えられたいかなる表面処理もされていないという意味である。 熱化学的に反応性のない表面の例はポリテトラフルオロエチレン、
ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリビニルピロリドン、シリコンエラストマー、ステンレススチールおよびチタンである。

【００１５】生物適合性剤の分子を生体用材の表面に付着させて生物適合性を改善する。 生物適合性剤は、内皮細胞増殖因子、造骨細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、血小板誘導増殖因子、神経生長因子、または脈管形成生長因子のような増殖因子；ライソザイムまたはペニシリンのような抗菌剤；ヘパリン、アルブミン、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰ
Ａ）またはウロキナーゼのような抗血栓形成剤；コラーゲンのような血栓形成剤またはポリエチレングリコール、ヒアルウロン酸、キトサンまたはメチルセルロース、その他の蛋白質、炭水化物、脂肪酸のような親水性ポリマーである。 生物適合性剤は上記の剤の一種の剤の分子であってもよいし、二種以上の剤の分子であってもよい。 例えば、生物適合性剤はアルブミンとヘパリン両方を含んでいてよい。

【００１６】ひとつの実施態様において、生物適合性材料をたがいに結びつけてフィルムとし、それを連結基により固体表面に付着させる。 生物適合性剤はヒアルウロン酸またはアルブミンが望ましい。 フィルムを付着させた生物適合性器具としてフィルムまたはヒアルウロン酸で被覆された人工股関節が挙げられる。

【００１７】化学的連結基は、次式： Ａ−Ｘ−Ｂ （式中、Ａは特別の活性化に応答して固体表面に共有的に結合できる光化学的反応性基を表わし；ＢはＡで表わされる基が応答しない特別の活性化に応答して生物適合性剤と共有結合を形成することができる別の反応性基を表わし、ＸはＡおよびＢで表わされる両基を結び合わせる相対的に不活性で非妨害性の骨格基で、水性の生理的液体中で分解されにくいものを表わす）で表わされることが望ましい。 この生理的液体とはＸが接触するであろう液体を云う。 Ｘはポリメチレンのような炭素原子数１
乃至１０のアルキル基、ポリメチロールのような炭水化物、ポリエチレングリコールのようなポリオキシエチレン、またはポリリジンのようなポリペプチドであることが望ましい。 Ｂで表わされる反応性基は好適な活性化により蛋白性またはその他の生物適合性剤と共有結合する基である。 典型的なこのような基は、本明細書で参照文献として示したガイア（Ｇｕｉｒｅ）、アメリカ特許第３，９５９，０７８号明細書に記載し例示されているような、熱化学的基および光化学的基である。

【００１８】光化学的反応性基（Ａ）（活性照射により活性化されて共有結合）は、アリール、アルキルおよびアシルアジド、オキサジデイン、イソシアネート（ニトレン生成剤）、アルキルおよび２−ケトジアゾ誘導体およびジアジリン（カルベン生成剤）、芳香族ケトン（トリプレット酸素生成剤）、芳香族ジアゾニウム誘導体およびカルボニウムイオンおよびラジカル生成剤の多くの群で代表される。 参照文献であるフレデリックジェイ．
ダーフラー アンドアンドルー エム． トメツコ、ケミストリー アンド バイオケミストリー オブ アミノアシッズ、ペプタイズ アンド プロテインズ（ボリス ワインスタイン編）５巻、マーセルデッカー、インコーポレイテッド． ニューヨーク１９７８年の２章（Ｆｒ
ｅｄｅｒｉｃｋ Ｊ． Ｄａｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ａｎｄ
ｒｅｗ Ｍ． Ｔｏｍｅｔｓｋｏ、ｃｈａｐｔｅｒ ２
ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ、Ｐｅｐｔｉｄ
ｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｂｏｒｒｉｓ Ｗｅ
ｉｎｓｔａｉｎ、ｅｄ． ）ｖｏｌ． ５、Ｍａｒｃｅｌ
Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７８）
に光化学的反応性基について更に記載されている。 暗黒下での化学反応条件に安定であり、ほとんどの生体用材に無害の波長の光による活性化に応答して、生体用材のほとんどの部位について有用である収率で共有結合を形成できる短寿命の反応性中間体を形成できることから、
アジドニトニフェニル、フルオロアジドニトロベンゼンおよび芳香族ケトンが望ましい基を形成する。

【００１９】ニトロフェニルアジド誘導体（Ｘで表わされる基を含むとして示される）は、大部分の光化学的反応性基がフルオロ−２−ニトロ−４−アジドベンゼンから誘導されるので使用するのに適当であり、４−アジド−２−ニトロフェニル（ＡＮＰ）−４−アミノ−ブチリール、ＡＮＰ−６−アミノカプロイル、ＡＮＰ−１１−
アミノウンデカノイル、ＡＮＰ−グリシル、ＡＮＰ−アミノプロピル、ＡＮＰ−メルカプトエチルアミノ、ＡＮ
Ｐ−ジアミノヘキシル、ＡＮＰ−ジアミノプロピル、およびＡＮＰ−ポリエチレングリコールが含まれる。 ＡＮ
Ｐ−６−アミノカプロイル、ＡＮＰ−１１−アミノウンデカノイル、およびＡＮＰ−ポリエチレングリコールが望ましい。 光化学的反応性基として使用するに望ましい芳香族ケトンにベンジルベンゾイルおよびニトロベンジルベンゾイルが含まれる。

【００２０】熱化学的反応性基（熱エネルギーで活性化される）はニトロフェニルハライド、アルキルアミノ、
アルキルカルボキシル、アルキルチオール、アルキルアルデヒド、アルキルメチルイミデート、アルキルイソシアネート、アルキルイソチオシアネートおよびアルキルハライド基が代表的なもので、これらが含まれる。 熱化学的反応性基として使用するに適当な基にはカルボキシル基、ヒドロキシル基、第一アミノ基、チオール基、マレイミドおよびハライド基が含まれる。 ６−アミノヘキサン酸およびアミノウンデカン酸のような基のＮ−オキシスクシンイミドカルボン酸エステル、メルカプトスクシニックアンヒドリドおよびβ−メルカプトプロピオン酸、ホモシステインチオラクトン、およびポリエチレングリコール誘導体が望ましい。

【００２１】本発明の器具は生物適合性剤の分子および化学的連結基残基を含む生物適合性固体表面を持っている。 化学的連結基残基は、固体表面に結合された光化学的反応性基の残基並びに生物適合性剤に共有結合された別の基の残基を持っている。 光化学的反応性基の残基は一般式において「Ａ」で表わされる光反応性基（前述）
の一部で、共有結合形成後も残っている。 光反応基がＡ
ＮＰで固体基質がポリエチレンの時、その残基は炭素−
窒素結合である。 ＡＮＰが光活性化されて形成されたニトレンはポリエチレンの炭素と反応して共有結合を形成する。 光反応性基がＢＢＡで固体基質がポリエチレンである時、残基は炭素−炭素結合である。 ＢＢＡが光で刺激されると、２個のフェニル基を結び合わせている炭素が活性化されてトリプレット状態となり、炭素−炭素結合をポリエチレンとＢＢＡの間に形成し、ヒドロキシル基を形成する。 別の反応性基（「Ｂ」）がＮＯＳである場合、その残基はフィブロネクチンのような生物適合性剤の酸素または窒素基に結合された基のカルボキシル炭素である。

【００２２】生物適合性剤として使用する酵素、細胞付着因子およびある種の他の物質はやゝ高温に感受性であるため、本発明に使用する連結基上の別の反応性基は、
中程度の熱（例えば体温またはそれ以下）および光のような容易に適用できて無害の刺激によって活性化（すなわち、それに応答して共有結合を生ずる）されることが望ましい。 光化学的反応性基が応答する刺激に応答しない反応性基は、ｐＨ変化、またはもうひとつの化学分子種その他の添加に反応する基である。

【００２３】化学的連結基は、固体表面を遮蔽して生物適合性の効果ある表面をつくり得るような密度で、表面に共有結合することが望ましい。 効果ある表面をつくるに必要な結合化学基の密度は使用する生物適合性剤によって変る。

【００２４】〔実施例〕本発明は以下の非限定的な実施例を参照することにより理解が深かまる。 第１表は以下の記載に使用した用語の略記の表である。

【００２５】実施例１ 内皮細胞付着／生育 １． プラスチック表面 種々の細胞因子をインビトロで（試験管で）試験するための重合体表面に結合させ、これらの因子の細胞付着と過剰生育への効果を測定した。 重合体表面としては、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）およびポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）ＧＯＲＥ−ＴＥＸ（６ｍｍの強化伸展ＰＴ
ＦＥ、ダブリュー・エル． ゴア アンド アソシエイツ、インコーポレイテッド（Ｗ．Ｌ．Ｇｏｒｅ ａｎｄ
Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ． ）の商標付製品）であった。 試験した市販のチューブはポリエステル（Ｄａ
ｃｒｏｎ，Ｄ，６ｍｍの真直に編んだダクロン ベロア、デュポン（Ｄｕｐｏｎｔ）の商標付製品）シリコンエラストマー（Ｓｉｌａｓｔｉｃ ^Ｒ ，Ｓ，０．０３内径のチューブ、ダウ コーニング（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎ
ｇ）の商標付製品）およびポリウレタンである。 ポリスチレンプレートを対照として使用した。 ２． 化学的連結基の調製 これらの実施例に使用した化学的連結基は４−アジド−
２−ニトロフェニルε−アミノカプロン酸（ＡＮＰ−Ｅ
ＡＣＡ）、４−アジド−２−ニトロフェニルアミノウンデカン酸（ＡＮＰ−ＡＵＤＡ）およびベンゾイル安息香酸（ＢＢＡ）のＮ−オキシスクシンイミド（ＮＯＳ）エステルであった。 ＡＮＰ−ＥＡＣ−ＮＯＳとＡＮＰ−Ａ
ＵＤ−ＮＯＳは本明細書に参考文献として示したピー．
ガイア、ディー． フリガーおよびジェイ． ホドグソン、
「哺乳動物細胞への酵素の光化学的カップリング」、ファーマコロジカル リサーチ コミュニケーションズ、
９巻、１３１−１４１頁（１９７７年）（Ｐ．Ｇｕｉｒ
ｅ，Ｄ． Ｆｌｉｇｅｒａｎｄ Ｊ． Ｈｏｄｇｓｏｎ，″
Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ
Ｅｎｇｙｍｅｓ ｔｏ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌ
ｌｓ″ ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｊｉｃａｌ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌ．
９，ｐｐ１３１−１４１（１９７７））に記載された方法で調製した。 要約すると、フルオロ−２−ニトロ４−
アジドベンゼンをε−アミノカプロン酸またはアミノウンデカン酸と反応させて比較的反応性の低いフッ素をアミノアルキルカルボキシル基で置換する。 次いでカルボキシル基をカルボジイミド活性化により）Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドでエステル化してＮ−オキシスクシンイミドカルボン酸エステルを得る。 ベンゾイル安息香酸のＮＯＳエステルはカルボキシル基をカルボジイミド活性化によりＮ−ヒドロキシスクシンイミドでエステル化して調製した。 ＡＮＰ−ＥＡＣ−ＮＯＳまたはＡＮＰ−
ＡＵＤ−ＮＯＳを化学的連結基として使用した時、ＡＮ
Ｐ基が前述の一般式Ａ−Ｘ−Ｂの「Ａ」で表わされる光化学的反応性基である。 ＮＯＳ基はこの式の「Ｂ」で表わされる別の反応性基である。 ＥＡＣまたＡＵＤ基は２
個の反応性基の間でスペーサーとして作用し、一般式の「Ｘ」で表わされる。 ＢＢＡ−ＮＯＳが化学的連結基である場合には、ベンゾイル安息香酸基が一般式の「Ａ」
で表わされる光化学的反応性基であり、ＮＯＳ基は「Ｂ」で表わされる別の反応性基である。 Ｘで表わされる基は２個の反応性基を結びつける炭素である。 ３． 化学的連結基への生長因子の共有結合 生物適合性剤フイブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、内皮生育因子、およびヒト血漿アルブミンについて合成生体用材への内皮細胞付着および過剰増殖を促進できるかどうかを試験した。 これらの剤を４−アジド−２
−ニトロフェニルε−アミノカプロン酸（ＡＮＰ−ＥＡ
ＣＡ）、４−アジド−２−ニトロフェニル−ウンデカンアミノ酸（ＡＮＰ−ＡＵＤＡ）またはベンゾイル安息香酸（ＢＢＡ）のＮ−オキシスクシンイミド（ＮＯＳ）エステルに次のようにしてカップリングさせた。 ここで使用する「光標識した」とは別の反応性基によって化学的連結基にカップリングさせて光化学的反応性基を持つ生物適合性剤を云う。 Ａ． 連結基へのフイブロネクチンおよびラミニンの共有結合 ヒトのフイブロネクチン（ウィスコンシン大学医学部）
およびマウスのラミニン（ベセスダ リサーチラブＢｅ
ｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ． から入手）
を別々に０．１Ｍホウ酸塩、ｐＨ９．０に１ｍｇ／ｍｌ
の濃度で溶解した。 脱水したジメチルホルムアミド（″
ＤＭＦ″）に溶解したＡＮＰ−ＥＡＣ−ＮＯＳまたはＡ
ＮＰ−ＡＵＤ−ＮＯＳまたは脱水したジオキサンに溶解したＢＢＡ−ＮＯＳの溶液をフイブロネクチンまたはラミニン溶液に対し、蛋白質のε−アミノ基（リジン残基）の濃度に当モルになるように、暗黒下で１６時間かけ、４℃で注射器を使ってゆっくりと加えた。 次いで、
その混合物を冷却しつつ４時間攪拌した。 このフイブロネクチンまたはラミニン溶液を遠心分離して不溶物を除き、セファテックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−７５カラムに流して未カップリングの光反応剤を除いた。 画分について光基／蛋白質比を調べるため２６０ｎｍと４６２
ｎｍで追跡した。 Ｂ． 化学的連結基へのＥＧＦ、コラーゲンおよびＨＳＡ
の共有結合 ヒト胎盤ＩＶ型コラーゲン（シグマ ファーマシューティカルＳｉｇｍａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）、
内皮生長因子（シグマ ファーマシューティカルＳｉｇ
ｍａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ−ｃａｌ）、およびヒト血漿アルブミン（シグマ ファーマシューティカルＳｉ
ｇｍａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）を別々に０．
１Ｍホウ酸塩、ｐＨ９．０に２ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。 ＤＭＦに溶解したＡＮＰ−ＥＡＣ−ＮＯＳ、ＤＭ
Ｆに溶解したＡＮＰ−ＡＵＰ−ＮＯＳまたはシオキサンに溶解したＢＢＡ−ＮＯＳの溶液を、ε−アミノ基（リジン）の濃度に対し５Ｘモル量で、生物適合性剤を含む溶液に対して、注射器を使い４℃で暗黒下、１６時間かけてゆっくりと加えた。 次いで、この溶液をリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）１０００ｍｌを４回交換して透析し、不溶物を遠心分離で除く。 生成物について光基／蛋白質比を知るため２６０ｎｍ、２８０ｎｍおよび４６２
ｎｍで分析した。 ４． プラスチック表面への生物適合性剤の共有結合 ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリウレタン、ダクロン（Ｄａｃｒｏｎ ^Ｒ ）（ベロア）、シラスチック（Ｓｉｌａｓｔｉｃ ^Ｒ ）（医学用）、およびポリテトラフルオロエチレンの種々のシート、チューブおよび平板片を使用した。 光標識した生物適合性剤０乃至５００μｇ／ｍｌを含む溶液０．０５ｍｌをプラスチック表面各０．５ｃｍ ^２切片に加える。 この溶液を暗黒下、室温で３時間、各片に吸収させた。 過剰の液体を除き、適当な波長で（ＡＮＰにはタングステン「スポットライトＳｐｏｔｌｉｔｅ」およびＢＢＡには長波長Ｕ
Ｖ）１２時間光分解することにより生物適合性剤を表面に共有結合させた。 光分解後、光標識生物適合性剤の共有結合していない分子を除くために標本片にＰＢＳを４
秒間流して洗浄した。 その後、標本片を組識培養中に置き、下記により細胞因子への内皮細胞の反応を調べた。 ５． 修飾した表面について行ったインビトロ試験 Ａ． 放射性標識生物適合性剤 放射性標識した〔 ^３ Ｈ〕生物適合性剤を上記のようにして光標識し、プラスチック表面に光カップリングした。
このプラスチック表面をＰＢＳで十分に洗浄し、有機溶剤に溶解して液体シンチレーション分光法で測定した。
代表的な結果を第２表に示す。

角膜、大動脈およびへその内皮細胞を無菌的に集めた。

細胞を、２５ｍｍｏｌｅＨＥＰＥＳ緩衝液、１０％仔ウシ血清および２．５μｇアンホテリシンＢ／ｍｌを加えたダルベッコの改良イーグル培地（アール．ダルベッコおよびジー．フリーマン、バイロロジー８巻．３９６頁（１９５９年）（Ｒ．Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ａｎｄ Ｇ．

Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ． ８：３９

６（１９５９））およびジェイ． ディー． スミス、ジー． フリーマン、エム． ボグトおよびアール． ダルベッコ、バイロロジー１２巻、１８５−１９６頁（１９６０

年）（Ｊ．Ｄ．Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｍ．

Ｖｏｇｔ ａｎｄ Ｒ． Ｄｕｌｂｅｃｃｏ，Ｖｉｒｏｌ

ｏｇｙ Ｖｏｌ． １２：１８５−１９６（１９６０））

に記載）のような公知の高グルコース細胞生育培地（「生育培地」）中で、３７℃、５％ＣＯ

_２インキュベイターで生育させた。 プレート、チューブまたはシートを準備する毎に、細胞培養は一次培養から調製した。 細胞を０．２５％トリプシン溶液で細胞株から取り、生育培地に再懸濁した。 次いでトリパンブルー（０．４％）

溶液と血球計を使って細胞数を計測した。 種々の濃度の細胞を準備した材料の上に層状に置いた。 細胞の付着を５分から１４日間の種々の時間間隔で追跡した。 付着は少くとも２種の方法で測定した。 第一の方法においては、試料材料を培地から離し、殺菌した食塩液で２回洗浄した。 次いで細胞染色を行い、表面上の全細胞数を計測した。 第二の方法では、トリプシン溶液を使って細胞を表面から離し、トリパンブルー法で細胞数を計測した。 予備被覆したポリ塩化ビニルプラスチック上の内皮細胞の付着および生育について代表的結果を第３表に示す。 各片に付着した生細胞数はトリパンブルー染色法で測定した。

【００２６】

【００２７】Ｃ． ヒト臍の内皮細胞の付着 一次のヒト内皮細胞を新鮮なヒト臍帯（４日令以前）から採取した。 帯を２０ｍｌのコード（ｃｏｒｄ）緩衝液（０．１４４ＭＮａＣｌ、０．００４Ｍ ＫＣｌおよび０．００１Ｍ ＰＯ _４ ）で２回洗浄して血液および凝固物を除く。 コラゲナーゼを帯の中に注入し、室温で２０
分間放置した。 温コード（ｃｏｒｄ）緩衝液１０ｍｌを使い、コラゲナーゼと剥離した細胞を試験に噴出させる。 試験管内の懸濁液を合せて、１５００ｒｐｍで５〜
１０分間遠心分離した。 上清を捨て、細胞を１０ｍｌのコード（ｃｏｒｄ）緩衝液に再懸濁した。 二回目の遠心分離後、細胞をコード（ｃｏｒｄ）緩衝液に再懸濁し、
組織培養ディスクに置いた。 すべての細胞を５％ＣＯ _２
を流した３７℃のインキュベイター中でインキーベイトした。 細胞は仔ウシ血清を含まないコード（ｃｏｒｄ）
培地中で^５Ｉ Ｃｒを使って放射性標識した。 この放射標識した細胞を細胞付着試験に使用した。 上記のプラスチックのプレート、シートおよびチューブは前述の通りに調製した。 細胞をトリプシン処理し、トリパンブルー法で細胞数を測定した。 細胞を調製したプラスチックに３
時間乃至７日間付着させるようにした。 細胞をすすぎ落し、残りの付着している細胞全数を付着していない細胞数と比較した。 代表的な結果を第３表に示す。 Ｄ． 内皮細胞を使った生育の測定 下記のようにして修飾した上記のプラスチック表面を細胞が生育して習う時に、開始時から次の方法で細胞の生育を追跡した。 細胞因子０乃至５００μｇを含む生物適合性剤溶液を１乃至６ｃｍの長さの表面を濃度勾配をつけて被覆した。 細胞を組織からトリプシンまたはなにかプロテイナーゼを使って取るという処理は行わなかった。 この組織を勾配の低い方の開始点に置いて印をつけた。 室温で１５分間組織を落ちつかせ、生育培地をプラスチック上を湿めって覆うように加えた。 すべての手順は無菌的に行った。 次いで、プレートを５％ＣＯ _２インキュベイター中、３７℃でインキュベートした。 生育を２週間またはプラスチックの長さが完全に覆われるまで毎日測定した。 第３表に示したように、処理した表面上の生育を非処理対照の表面と比較した。 すべての材料をすすぎ、永久走査電顕観察のために染色した。 これらの結果は、生育因子のフィブロネクチン（ＦＮ）およびコラーゲン（ＣＯＬ）をプラスチック表面に共有的に付着させると、プラスチックのウシ内皮細胞への生物適合性が改善されることを示した。 細胞がプラスチック表面で生育した距離で示されるように、細胞は対照表面より修飾表面に優先的に付着した。 ６． イン ビボ（生体内）試験 この試験のために２匹の条件付けしたイヌ準備した。 Ｇ
ＯＲＥ−ＴＥＸ（強化伸展ポリテトラフルオロエチレン、ダプリュー．エル．ゴア アンド アソシエイツ、
インコーポレイテッド（Ｗ．Ｌ．Ｇｏｒｅ ａｎｄ Ａ
ｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ． ）の商標付製品）の小片をＦＮ，ＡＮＰ−ＥＡＣ−ＦＮ（吸着および光カップリング）、ＡＮＰ−ＥＡＣ−ＦＮ（吸着のみ）およびＰＢ
Ｓ対照により前被覆した。 試験はブラインド試験で行った。 グラフトは文字によって標識されているが、外科のチームはどのグラフトが修飾表面で、どれが対照かを知らない。 各イヌの左右の腸骨動脈に２個の６ｍｍ×５ｃ
ｍのＧＯＲＥ−ＴＥＸ片を移植した。 グラフトをイヌの中で１ケ月（３０日）間放置した。 ヒトでの移植手順を模放するために、抗炎症剤ペルソンチン（Ｐｅｒｓｏｎ
ｔｉｎｅ）およびアスピリン（Ａｓｐｉｒｉｎ）をイヌに与えた。 両対照グラフト（ＰＢＳとＦＮ）は開いていて十分な口径を持っていた。 吻合線はそのままで、内部表面は滑らかであった。 対照グラフトについては内皮化は不十分であった。 有意な血栓の証拠はみられなかった。 ＡＮＰ−ＥＡＣ−ＦＮが結合した両グラフト（光カップリングと吸着のみ）に血栓はなく、内皮化は完全で、グラフト内部表面は平滑で輝いて見えた。

【００２８】実施例２ コンタクトレンズおよび眼内レンズ移植物の表面の修飾 本実施例の実験においては、化学的連結基に結合した親水性ポリマー（生物適合性剤）の調製、コンタクトレンズ表面への基の光カップリング、および非処理レンズと比較したこれらレンズへの人工涙液からのインビトロでの蛋白の沈着測定を行った。 生物適合性剤の角膜片とのインビトロでの適合性およびインビボでのウサギ眼内での適合性を知る実験を行い、レンズへの毒性または刺激性反応がないことを確かめた。 １． 化学的連結基への生物適合性剤の結合 Ａ． 光標識ポリエチレングリコールの調製 分子量１０００（ＰＥＧ−１０００）と４０００（ＰＥ
Ｇ−４０００）のポリエチレングリコールを、本明細書に参考文献で取り入れた「キムラ、及びエス．レーゲン、ジャーナル オブ オーガニック ケミストリー４
８巻、１９５頁（１９８３年）（Ｋｉｍｕｒａ，ａｎｄ
Ｓ． Ｒｅｇｅｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＯｒｇａｎｉ
ｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４８：１９５（１９８３）」
の相輸送法の修飾法により、フルオロニトロアジドベンゼン（ＦＮＡＢ）で標識した。 要約すると、４−アジド−２−ニトロフェニルポリエチレングリコール（ＡＮＰ
−ＰＥＧ）の相輸送合成では、６０％水酸化カリウム水溶液（「ＫＯＨ」）／トルエンとＦＮＡＢおよびＰＥＧ
を混合し、抽出して下記のように薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）精製を行う。 ＡＮＰ−ＰＥＧ−１０００ ＡＮＰ−ＰＥＧ−１０００は０．０５ｍｍｏｌｅ ＰＥ
Ｇ−１０００を５ｍｌの６０％ＫＯＨおよび０．５ｍｍ
ｏｌｅ ＦＮＡＢ、１０ｍｌのトルエンに加えて調製した。 この反応混液を室温で１６時間、急速に攪拌した。
生成物を有機溶媒層から分離した。 クロロホルム／メタノール／Ｈ _２ Ｏ／酢酸または水酸化アンモニウム、８５
／１５／１／１でのＴＬＣにより、非標識ＰＥＧからＡ
ＮＰ−ＰＥＧ−１０００のモノ−およびジ−置換誘導体を分離した。 ＡＮＰ−ＰＥＧ−１０００に相当するバンド（低いＲ _ｆ値）をシリカゲルからＴＬＣ溶媒で抽出し、残存の酸または塩基を除くために共沸蒸溜した。 最絡生成物は水に可溶で、出発物質ＰＥＧの３０―４０％
がＡＮＰ−ＰＥＧ−１０００に転換した。 ＡＮＰ−ＰＥＧ−４０００ ＡＮＰ−ＰＥＧ−４０００を、反応中にすべての試薬を溶液中に止まらせつつ５０℃で反応混液を急速に攪拌すること以外は、上記と同じ方法で調製した。 ＡＮＰ−Ｐ
ＥＧ−４０００−ＯＨの収率は１０％であった。 Ｂ． 光標識ジエファミンの調製 ポリオキシプロピレンポリアミンおよびポリオキシエチレンポリアミン（ジエファミン（Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ
ｓ）と呼ぶ。 ジエファーソン ケミカル カンパニー、
インコーポレイテッド（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｃｏ． ，Ｉｎｃ． ）の商標）を、これらポリマーにＡＮＰ−ＥＡＣＡ，ＢＢＡおよびｎＢＢＡのＮ−
オキシスクシンイミド（「ＮＯＳ」）エステルをカップリングすることによって光標識した。 これらのＮＯＳ−
誘導体を０．５×量で１×量ジエファミンに高度に脱水した（高純度）溶媒中で加えた（ＡＮＰ−ＥＡＣ−ＮＯ
Ｓは脱水テトラヒドロフラン中、ＢＢＡ−ＮＯＳは脱水ジオキサンまたはジメチルホルムアミド中、ニトロＢＢ
Ａ−ＮＯＳは脱水ジオキサンまたはジメチルホルムアミド中）。 暗黒下、室温で１６時間反応させた後、生成物をクロロホルム／メタノール／Ｈ _２ Ｏ／酢酸、８５／１
５／１／１のＴＬＣで分離した。 モノ置換ジエファミン誘導体をＴＬＣ溶媒で抽出し、水と共沸蒸溜して残存する酢酸を除いた。 水溶性生成物ＡＮＰ−ＥＡＣ−ジエファミン、ＢＢＡ−ジエファミン、およびｎＢＢＡ−ジエファミンをそれぞれ１５％、１０％および１２％の収率で分離した。 Ｃ． ＡＮＰ−ヒアルウロン酸の調製 ヒト胎盤ヒアルウロン酸（見かけの分子量１００−１３
０，０００）の末端糖を、イー． ジヤノウイッツ及びエス． イー． チャーム「蛋白固定化およびアフィニティークロマトグラフィーのための酸化多糖の誘導」ビオキミカ エ ビオフィジカ アクタ４２８巻、１５７―１６
５頁（１９７６年）（Ｅ．Ｊｕｎｏｗｉｃｚ ａｎｄ
Ｓ． Ｅ． Ｃｈａｒｍ，″Ｔｈｅ Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ
ｏｆＯｘｉｄｉｚｅｄ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄ
ｅｓｆｏｒ ＰｒｏｔｅｉｎＩｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉ
ｏｎ ａｎｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａ−ｔｏ
ｇｒａｐｈｙ″，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏ
ｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ Ｖｏｌ． ４２８：１５７―
１６５（１９７６））に記載され、本明細書に参考文献とした、過ヨウ素酸法によって活性化した。 この方法では、このように末端の糖を活性化しているヒアルウロン酸溶液に過ヨウ素酸ナトリウムまたはカリウムを加えることを伴う。 ヒアルウロン酸を１０倍量のジエファミンに加え、室温で４時間反応させる。 シアノ水素化ホウ素ナトリウムで還元することによって連結を安定化させ、
十分に透析して過剰のジエファミンを除去した。 ＤＭＦ
に溶解した１０倍モルのＡＮＰ−ＥＡＣ−ＮＯＳを、
０．１Ｍ炭酸塩、ｐＨ９．０に溶解したジエファミンに注射器で加えた。 この添加は１６時間かけて暗黒下、室温で行った。 過剰のＡＮＰ−ＥＡＣ−ＮＯＳとＡＮＰ−
ＥＡＣ−ジエファミンをゲル▲ろ▼過クロマトグラフィーによって除いた。 コンタクトレンズポリマー骨格への基の光カップリングに必要なアジド基の組込みはＡＮＰ
基を検出するために赤外吸収分光法で分析し、ジエファミンスペーサーを検出するためにポリエチレングリコール分析を、また誘導体のウロン酸含量を定量するために、ここに参考文献として挙げるティー． ビター及びエイチ． ミュアー、アナリティカルバイオケミストリー４
巻、３３０−３３４頁（１９６２年）（Ｔ．Ｂｉｔｔｅ
ｒａｎｄ Ｈ Ｍｕｉｒ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＶｏｌ． ４：３３０−３３４（１
９６２））に記載された修正カルバゾール分析を行った。 ポリエチレングリコール分析はドラゴンドルフ試薬で検出した（テトラヨウドビスマス酸−塩化バリウム）。 貯蔵試薬（酢酸と水に４２５ｍｇ硝酸ビスマス、
１０ｇヨードカリウムを溶解）５ｍｌを１０％塩化バリウム水溶液１０ｍｌに加え、５１６ｎｍでバックグランウンドを読む。 次いで、０．１ｍｌの試料を加え、キュベットを逆転させて内味を混合し、１分間のインキュベイション後に５１６ｎｍで読みとった。 値を標準曲線と比較した。 カルバゾール分析は以下のように行った：硫酸試薬（硫酸中に０．０２５Ｍ四ホウ酸ナトリウム−１
０Ｈ _２ Ｏ）３．０ｍｌを−７０℃に冷却した。 これに試料０．５７ｍｌを乗せ、混合物を室温になるまで攪拌した（３０分間）。 試験管を１００℃に加熱し（１０分間）、カルバゾール試薬（無水エタノール中に０．１２
５％カルバゾール）０．１ｍｌを加えて内容物を混合した（５分間）。 １００℃に加熱した後、氷浴で室温に冷却した。 硫酸試薬をブランクとして試料を５３０ｎｍで分光法分析した。 結果を４−４０μｇ／ｍｌグルクロノラクトン標準でつくった標準曲線と比較した。 この分析はヒアルウロン酸２０ｐｍｏｌｅを検出できる感度を持っていた。 １個のＡＮＰ、１個のジエファミンおよび１
個のヒアルウロン酸分子を持つ画分を集め、生物適性剤として使用した。 Ｄ． 光標識ヒアルウロン酸、メチルセルロースおよび硫酸コンドロイチン ＡＮＰ−ＥＡＣ−ジエファミン、ＢＢＡ−ジエファミンおよびニトロ−ＢＢＡ−ジェファミンをヒアルウロン酸および硫酸コンドロイチンのウロン酸残基のカルボキシル基にカルボジイミドを使って以下の方法により連結した。 ５モル過剰の光標識ジエファミンと１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドをＨ
Ｃｌと共に多糖ポリマーと、０．１ＮＨＣｌでｐＨ４．
５に調節した水中で混合した。 混合物を暗黒下、室温で２４時間反応させた。 生成物をゲル▲ろ▼過クロマトグラフィーで精製し、光基と炭水化物含量を上記のようにして分析した。 Ｅ． 光標識したコラーゲンの調製 ヒト胎盤ＩＶ型コラーゲン（シグマ ファーマシューティカルズ（ＳｉｇｍａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
ｓ）から入手）を０．１Ｍホウ酸塩、ｐＭ９．０に１ｍ
ｇ／ｍｌの濃度で溶解した。 ＤＭＦに溶解したＡＮＰ−
ＥＡＣ−ＮＯＳ、ジオキサンに溶解したＢＢＡ−サルファ−ＮＯＳまたはジオキサンに溶解したニトロＢＢＡ−
ＮＯＳをコラーゲン溶液に５０×モル過剰にして、暗黒下、４℃で注射器により１６時間かけてゆっくりと加えた。 完全に添加した後、混合物を冷却して４時間攪拌した。 コラーゲン生成物をＰＢＳを４回交換して透析した後、遠心分離して不溶物を除去した。 上清を２６０ｎ
ｍ、２８０ｎｍおよび４６２ｎｍで分光法的に測定して光基／蛋白比を分析した。 Ｆ． 光標識プロティナーゼの調製 有機溶媒に２５ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解したＡＮＰ−Ｅ
ＡＣ−ＮＯＳ，ＢＢＡ−ＮＯＳおよびｎＢＢＡ−ＮＯＳ
光基を５０モル過剰にしてパパイン（パパヤ、分子量２
３，４２６）に対し、暗黒下、４℃で注射器をつかって１６時間かけて加えた。 光基の添加終了後、混合物を更に４時間攪拌し、次いでＰＤＳに透析してカップリングしていない光基を除去した。 上清を２６０ｎｍ、２８０
ｎｍ、および４６２ｎｍで分光法的に測定して光基／蛋白比を分析した。 ２． レンズ表面に対する生物適合性剤の光カップリング 上記のようにして得られた光標識生物適合性剤を第４表記載のコンタクトレンズ材料に２５０−１０００ｐｍｏ
ｌｅ／コンタクトレンズの濃度で加えた。 溶液をコンタクトレンズ上に暗黒下、室温で３時間吸着させた。 次いで光標識剤を適当な波長で（ＡＮＰでは４５０ｎｍ、Ｂ
ＢＡおよびｎＢＢＡ誘導体では３２０ｎｍ）１２時間、
光分解によってプラスチックに共有結合させた。 光分解後、コンタクトレンズを５×５ｍｌの正常な食塩液（０．８５％ＮａＣｌ）で洗浄して共有結合していない基を除去した。 放射性標識基をレンズ材料にカップリングし、レンズ片をテトラヒドロフラン、次いでＤＭＳＯ
で処理して放射性標識を固体表面から放出させることができる。 シンチレイション剤を加え、液体シンチレイション分光法により生物適合性剤／ｃｍ ^２を測定した。 代表的な結果を第４表に示す。

【００２９】

【００３０】ソフスピン（Ｓｏｆｓｐｉｎ）コンタクトは水分約３８．６％を持つポリマコン（ポリメタクリレート）でつくられ、バウシュ アンド ロン、インコーポレイテッド（Ｂａｕｓｃｈ ＆ Ｌｏｍｂ，Ｉｎ
ｃ． ）の商標付製品である。 パーマフレックス（Ｐｅｒ
ｍａｆｌｅｘ）コンタクトは水分約７４％を持つポリメタクリレートがらつくられ、コーパービジョン、インコーポレーテッド（Ｃｏｏｐｅｒｖｉｓｉｏｎ，Ｉｎ
ｃ． ）の商標付製品である。 ビスタマーク（Ｖｉｓｔａ
ｍａｒｃ）コンタクトは水分約５８％を持つポリメタクリレートからつくられ、ジョンソン アンド ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ）の商標付製品である。 リドフィルコン（Ｌｉｄｏｆｉｌｃｏｎ）コンタクトは水分約７０％を持つポリメタクリレートからつくられ、バウシュ アンド ロン、インコーポレイテッド（Ｂａｕｓｃｈ ＆ Ｌｏｍｂ，Ｉｎｃ．）の製品である。 第４表の値は平方センチメートル表面積当りのｐ
ｍｏｌｅ生物適合性剤またはｎｇ／ｃｍ ^２で表わされている。 カップリング効率は２６０ｐｍｏｌｅ／ｃｍ ^２生物適合性剤／コンタクトレンズ材料、７１０ｐｍｏｌｅ
／ｃｍ ^２生物適合性剤／シリコン、および６６０ｐｍｏ
ｌｅ／ｃｍ ^２生物適合性剤／ｃｍ ^３ポリマコンボタンの添加に基く。 ＡＮＰ−ヒアルウロネートはシリコンに対し３５７ｐｍｏｌｅ／ｃｍ ^２およびポリマコンボタンに対し１６５５ｐｍｏｌｅ／ｃｍ ^３で加えた。 ハイドロゲルコンタクトレンズ材料に対しｎＢＢＡ−ジェフよりＡ
ＮＰ−誘導体の方が高い負荷密度でカップリングした。
この結果はシリコン化合物では逆になった。 ３． インビトロ（試験管内）吸着試験 人工ヒト涙液を、ここに参考文献としたビー． ピー． グルア、「涙装置」、アドラーの眼の生理学：臨床応用（アール．エイ・モーゼス編）、シー． ブイ． モスビー カンパニー、セントルイス ミズリー（１９８１年）
（Ｂ．Ｐ．Ｇｌｏｏｒ，″Ｔｈｅ Ｌａｃｒｉｍａｌ
Ａｐｐａｒａｔｕｓ″ｉｎＡｄｌｅｖ′ｓＰｈｙｓｉｏ
ｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｙｅ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ａｐｐｌｉ−ｃａｔｉｏｎｓ（Ｒ．Ａ．Ｍｏｓｅｓ，ｅ
ｄ． ），Ｃ． Ｖ． Ｍｏｓｂｙ Ｃｏ． ，Ｓｆ． Ｌｏｕｉ
ｓ，Ｍｏ（１９８１））に記載されている配合に従って調製した。 この文献に示されているように、ヒトの涙に存在する主要蛋白は血清アルブミン（ＨＳＡ）、ガンマグロブリン（ＨＧＧ）およびリゾチーム（ＬＹＺ）である。 ヒトの涙に存在する主要なステロールはコレステロールとコレステロールエステルである。 Ａ． ^３ Ｈ蛋白質 蛋白成分を、ここに参考文献としたエヌ． ジェントフト及びディー． シー． ディアボーン、ジャーナルオブ バイオケミストリー２５４巻４３５９−４３６５頁（１９
７９年）（Ｎ．Ｊｅｎｔｏｆｔ ａｎｄ Ｄ．Ｃ．Ｄｅ
ａｒｂｏｒｎ、Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ Ｖｏｌ． ２５４：４３５９−４３６５（１９
７９））に記載されているようにホルムアルデヒドおよびトリチウム標識された水素化ホウ素ナトリウムで還元的にメチル化してトリチュウム標識した。 要約すると０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４に１ｍｇ／ｍｌ濃度に溶解した生物適合性剤をトリチウム標識された水素化ホウ素ナトリウムと反応させ、２２℃で２時間ゆり動かしつつ、ホルムアルデヒドによりメチル化した。 生成物を０．０１Ｍリン酸塩、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐ
Ｈ７．４のＰＢＳに対して透析し、ゼラチンセファローズを使った親和クロマトグラフィーで精製した。 結合した剤を１Ｍ臭化ナトリウム、０．０２Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０で溶出し、ＰＢＳ、ｐＨ７．４に対して透析した。 Ｂ． 人工涙液の調製 上記の放射性標識蛋白質を人工涙液の調製に使用した。
放射性標識した蛋白質の１種またはトリチュウム標識されたコレステロールを各人工涙液混液に含ませた。 他の成分は放射性標識されていない。 コンタクトレンズ材料を人工涙液中に３７℃で１週間、ゆるやかにゆすりながらインキュベートした。 終了後、レンズ材料を０．８５
％ＮａＣｌの５×１０ｍｌで洗浄した。 次いで、レンズ材料に吸着した蛋白質の量を液体シンチレイション測定で分析した。 インビトロ蛋白沈着の結果を第５表に示す。 全蛋白質沈着の減少はＡＮＴ−１０００−ＯＨ修飾ソフスピンレンズで８５％に達した。 各生物適合性剤は対照コンタクトレンズ材より高いか、同じレベルであったが、ＡＮＰ−１０００−ＯＨ被覆ポリマコンボタン、
ＡＮＰ−４０００−ＯＨ被覆ポリマコンボタンおよびＡ
ＮＰ−ヒアルウロネート被覆ポリマコンボタンを除くすべてのレンズ材料で全体の蛋白量は減少していた。 成績の悪いものはすべてポリマコン材料そのものについてであり、これはソフスピンレンズのようなポリマコンコンタクトレンズと異って反応しているようであった。 全体的に見て、これらインビトロ蛋白沈着試験により、１週間でコンタクトレンズ材料上に人工涙液からおこる蛋白沈着に有意にあるいは劇的に減少していた。

【００３１】

【００３２】インビトロのコレステロール沈着試験結果を第６表に示す。 人工涙液中に７日間インキュベイトした後のコレステロール沈着量はポリ塩化ビニルの場合より８３％減少していた。 ポリマコンボタン以外のすべての型のコンタクトレンズでコレステロール沈着の減少が見られた。 この場合もこれらの材料は同じポリマーでつ〈られたコンタクトレンズと異る反応をする。

【００３３】

【００３４】Ｃ． アミノ酸分析 対照および表面修飾したレンズを３７℃で１週間、ゆるやかにゆすりながら人工涙液中でインキュベイトした。
レンズを５×１０ｍｌの０．８５％ＮａＣｌで洗浄し、
６ＮＨＣｌで加水分解した後、加水分解物をアミノ酸分析機によって標準的なアミノ酸分析を行った。 対照と表面修飾したレンズの全アミノ酸含量をたがいに比較した。 全アミノ酸含量のの減少は蛋白質吸収の減少を示す。 酸水解したコンタクト レンズの全アミノ酸分析を第８表に示す。 これらの結果は全アミノ酸をｎｍｏｌｅ
／ｍｌで示している。 これらの結果から、ソフスピンポリマコンレンズのＡＮＰ−１０００−ＯＨ，ＡＮＰ−４
０００−ＯＨおよびｎＢＢＡ−ジェフ修飾は人工ヒト涙液に７日間インキュベイトした後のレンズへの蛋白質沈着を減少させることが明らかになった。

【００３５】

【００３６】４． インビトロ毒性試験 上記の生物適合性レンズ材料について刺激性または毒性反応を調べた。 対照および生物適合性レンズをラミナーフロー（層状流）フード内で最終洗浄を行って無菌的に調製した。 レンズを、１０％仔ウシ胎仔血清と５％グルタミンを加えたダルベツコ修正エッセンシャル培地（抗生物質および抗かび剤を添加）のような公知の高グルコース細胞培地の溶液中に置いた。 生きている３−５ケ月令胎仔ウシ角膜をレンズ上に置いた。 角膜の上皮表面をいくつかの試験ではレンズ表面と接触させ、他の試験では内皮細胞表面をレンズ表面に直接置く。 この系を７−
１０％ＣＯ _２培養器内で３７℃、１−２週間置いた。 培養開始から種々の時間後に上皮および／または内皮細胞の生存を染色法で測定した。 ５． 共有結合の安定性のインビトロ試験 表面修飾したポリマコン（ポリメタクリレート）を酵素クリーナー（パパイン）、熱殺菌および化学殺菌（塩化ナトリウム、ホウ酸ナトリウムおよびホウ酸を含む緩衝化した水溶液）処理することによって共有結合の安定性を調べた。 これらの結果を第８表に示す。

【００３７】

【００３８】共有結合は酵素的洗浄と熱殺菌に対して１
００％安定であった。 化学殺菌に対してＡＮＰ−ヒアルウロン酸以外は生物適合性剤の幾分の損失があった。 ６． 生物適合性のインビボ（生体内）試験 予備的なインビボ生物適合性試験をウサギ系で行った。
少くとも２４匹の動物を各試験に使用した。 ウサギの眼に合うようにデザインした鞏膜レンズをこの試験で使用した。 ウサギには次のスケジュールでレンズを着用させた。 ６匹のウサギ 左眼はレンズなし。 右眼に対照のレンズ。 ６匹のウサギ 左眼に対照のレンズ。 右眼に物理的に処理したレンズ（表面修飾レンズと同じ物理的処理をしたが、生物適合性剤で被覆していない）。 １２匹のウサギ 左眼に対照のレンズ。 右眼に表面修飾したレンズ。 ウサギの眼にレンズを装着する前に、ケラタミン／キシラジンによりウサギを麻酔した。 メチルセルロース／正常食塩液湿潤液を１時間毎に与えて眼とレンズの適当な潤滑性を保った。 コンタクト レンズを８時間／日装着させた。 適当な時間、レンズ着用後、スリットランプと螢光染料法でウサギを検査した。 眼刺激の程度を、参考文献としたティー． オウ． マクドナルド及びジェイ． エイ． シャダック、「眼刺激」、アドバンシズインモダントキシコロジー ４巻１６２−１６６頁（１９７７年）
（Ｔ．Ｏ．ＭｃＤｏｎａｌｄ ａｎｄ Ｊ．Ａ．Ｓｈａ
ｄｄｕｃｋ，″Ｅｙｅ ｌｒｒｉｔａｔｉｏｎ，″ｉｎ
Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎＭｏｄｅｒｎＴｏｘｉｃｏｌ
ｏｇｙ，Ｖｏｌ． ４，ｐｐ １６２−１６６（１９７
７））に記載されているマクドナルド−シャダック（Ｍ
ｃ Ｄｏｎａｌｄ−Ｓｈａｄｄｕｃｋ）スケールによってグレード付を行った。 マクドナルド−シャダック法では、結膜充血、結膜肥厚、眼脂、水性発赤、虹彩異常および角膜混濁およびその他の病状を０−４のスケールでグレード付けし、その際、０は正常、＋４が異常が最高とした。 インビボのウサギ試験結果を第９表に示す。 ウサギについてのマクドナルド−シャダックスコアを表に示した。 これらの結果についてマン−ホイットニー（Ｍ
ａｎｎ−Ｗｈｉｔｕｅｙ）Ｕ検定を行い、表面修飾および対照レンズ間に統計学的に有意差が認められなかった（Ｐ＜０．０５）。 したがって、これらの検定から、このウサギにおける４日間の試験で、表面修飾レンズの結膜充血、結膜肥厚、眼脂、水性発赤、虹彩異常、角膜混濁、パンヌス血管新生、上皮由来損傷は対照レンズに比較して差は認められないことが明らかになった。 対照および修飾レンズで見られた刺激はウサギのコンタクトレンズへの耐性発現と関連しているようであった。

【００３９】

【００４０】ポリウレタンチューブへのアルブミン、ヘパリンおよびウロキナーゼのカップリング １． 光標識アルブミンの調製 血清アルブミン（イヌ）を０．１Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ
９．０に溶解した。 ＤＭＦに２５ｍｇ／ｍｌに溶解した４−アジド−２−ニトロフェニル−６−アミノカプロイル−Ｎ−オキシスクシンイミド（ＡＮＰ−ＥＡＣ−ＮＯ
Ｓ）溶液をアルブミンに対してＡＮＰ−ＥＡＣ−ＮＯＳ
が１０倍モル過剰になるような量を、暗黒下、室温で攪拌しつつ注射器で１２時間かけてアルブミンに加えた。
次いで、この溶液を暗黒下、１ｌのリン酸緩衝化食塩液（ＰＢＳ）に対しての透析を６回行った。 透析後、溶液を遠心分離して不溶物質を除去した。 １／１００に希釈して４７０ｎｍでの吸収を分光学的に測定してＡＮＰ／
アルブミン比を測定した。 ２． ポリウレタン チューブへのアルブミンの光カップリング ポリウレタンチューブをジオキサンに３０秒間浸漬し、
直ちに脱イオン水ですすいだ。 このエッチングしたチューブを暗黒下、室温で攪拌しつつ少くとも２時間、光反応性アルブミン溶液に浸漬した。 次いで、チューブを暗黒下で少くとも１０分間、風乾し、次いで少くとも１時間、強烈な可視光線に露光した。 光反応性アルブミンへの浸漬、乾燥および光反応を２回繰返し、最後は浸漬を一夜行う。 次いでチューブを室温で１時間、１．０Ｎ
ＮａＣｌで洗浄した。 ＮａＣｌ溶液は１時間の間に少くとも１回交換した。 ３． ポリウレタンチューブ上のアルブミンへのヘパリンのカップリング アルブミン−ポリウレタンチューブを脱イオン水５．０
ｍｌに浸漬した。 １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）２００ｍｇを水に溶解し、ｐＨを１ＮＨＣｌで４．０に調整した。 ヘパリン３０ｍｇを含む水１ｍｌをＥＤＣ溶液に加えｐＨを再び１ＮＨＣｌで４．０に調整した。 浸漬したポリウレタンチューブを含む溶液を室温で２時間攪拌し、その後、更にＥＤＣを２００ｍｇを加えた。 反応を室温で一夜、続け、次いでチューブをＰＢＳ中ですすぎ、カップリングしていないヘパリンと反応副生成物を除去した。 ４． ポリウレタンチューブ上のアルブミンへのウロキナーゼのカップリング 血清アルブミンを固定化したポリウレタンチューブを０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０に溶解した１．２５
％グルタルアルデヒドに室温で１５−１８時間浸漬した。 次いで、チューブを脱イオン水中で３０分間洗浄し、その間、少くとも一回水を交換した。 ポリウレタン−アルブミン−グルタルアルデヒドを次に０．１Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ９．０に溶解したウロキナーゼ溶液（８．３ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、２−３ｍｇ／ｍｌ）に浸漬し、４℃で一夜攪拌した。 チューブをＰＢＳで４時間すすぎ、その後、ウロキナーゼ活性を測定した。 ポリウレタンとポリヘマの二種のポリマーを固体表面として使用した。 修飾表面は１−１０ｍｇヘパリン／ｃｍ ^２ 、０．
６−１．３ｍｇウロキナーゼ／ｃｍ ^２を持っていた。

【００４１】実施例４ 固体表面へのフィルムのカップリング被覆フィルムの形成と表面へのその共有結合 ＡＮＰ−ヒアルウロン酸の調製 ヒアルウロン酸の光標識誘導体（ＡＮＰ−ＥＡＣ−ジェファミン、ＢＢＡ−ジェファミンおよびニトロＢＢＡ−
ジェファミン）を前述のようにして調製した。 光反応性被覆材からフィルムをつくり、暗黒下にコンタクトレンズの表面上に置く（浸漬して乾燥による）。 生体用材表面への共有結合および分子間架橋によるフィルムの強化を照明によって行った。 もうひとつの実施例において、
人工股関節をＡＮＰ−ＥＡＣ−ジェファミン−ヒアルウロン酸（１．１：１ｍｇ／ｍｌ）に暗黒下で３時間浸漬した。 これを溶液から取り出し、乾燥して人工関節上に被覆材料の薄いフィルムを形成させた。 次いで、フィルムを関節に対し、４℃で８時間、４００乃至４５０ｎｍ
で照明を当てて共有結合させた。 次に、関節を生理食塩液ですすいで未カップリングのＡＮＰ−ＥＡＣ−ジェファミン−ヒアルウロン酸を除去した。 骨に結合したヒアルウロン酸は摩擦を低減し、関節領域での骨の磨耗を減らす。 ウシ血清アルブミン１００ｍｇを２ｍｌの０．１
Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ９に溶解した。 ＡＮＰ−ＡＵＤ−
ＮＯＳ１４ｍｇを５０μｌのジメチルホルムアミド（Ｄ
ＭＦ）に溶解し、このＡＮＰ−ＡＵＤ−ＮＯＳ溶液をＢ
ＳＡ溶液に対し、暗黒下、室温で十分攪拌しながら１５
時間かけてゆっくりと加えた。 更に３乃至４時間攪拌した後、溶液を０．１Ｍホウ酸緩衝液ｐＨ９に対し暗黒下で２４時間透析し、この間少くとも４回、各２ｌの緩衝液を交換した。 透析したＡＮＰ−ＢＳＡを暗黒下でパラフィンフィルム上にピペットで１００μｌ置き、乾燥させた。 フィルムが乾燥した後、ホウ酸緩衝液、ｐＨ９中の１．２５％グルタルアルデヒド１００μｇを重ねて載せ、暗黒下、室温で１時間インキュベイトした。 次いでフィルムをパラフィンフィルム上で水をゆっくりと滴下して洗浄し、水を流しておく。 この洗浄を１時間行った後、フィルムを再乾燥して、注意深くパラフィンフィルムからフィルムを持ち上げ、プラスチック表面に移す（例えばポリウレタン）。 プラスチック表面上で、フィルムを再び２０％ジオキサン含有水で湿らせ、暗黒下で再乾燥した。 プラスチック表面上のフィルムを４℃で４
時間、強烈な可視光線に露光してフィルムを表面に結合させるが、この間表面の過熱を防ぐためにファンで通気した。 本発明の望ましい実施態様を記載したが、本発明の主旨、特許請求の範囲から離れることなしに、種々の変更、適応および修飾を行うことができることを銘記すべきである。