一种幽门螺旋杆菌IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒
阅读：1038发布：2020-08-03
专利汇可以提供一种幽门螺旋杆菌IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于医药 生物 技术领域，具体涉及一种幽 门 螺旋杆菌IgG 抗体 酶联免疫 诊断 试剂 盒 。本发明试剂盒由幽门螺旋杆菌 抗原 包被板、样品稀释液、酶标记液、洗涤液、显色液、阴性对照品、阳性对照品和终止液组成，其灵敏度高、特异性强、准确度高，且具有良好的 稳定性 ，在室温条件下有效期为1年，在4℃条件下有效期可达3年，显著提高了试剂盒的保存期。，下面是一种幽门螺旋杆菌IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒专利的具体信息内容。
1.一种幽门螺旋杆菌IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒，其特征在于，由幽门螺旋杆菌抗原包被板、样品稀释液、酶标记液、洗涤液、显色液、阴性对照品、阳性对照品和终止液组成；
其中，所述幽门螺旋杆菌抗原包被板的制备过程为：将包被用的幽门螺旋杆菌抗原用
0.05mol/L pH9.5的碳酸盐缓冲液液稀释后，按0.1mL/孔包被到微孔板内，在4 8℃吸附24~ ~
26小时后，用0.05mol/L pH9.5的磷酸盐缓冲液洗板，再用封闭液在4 8℃封闭18 20小时，~ ~
弃除多余的封闭液，经真空干燥处理后制得幽门螺旋杆菌抗原包被板；
所述样品稀释液为含0.2g/L的吐温-20和0.5g/L酪蛋白的15mmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液；
所述酶标记液为含0.5mg/L的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体、0.1 0.6mg/L的~
聚乙二醇-200和0.5 1mg/L的壳聚糖的15mmol/L pH8.5磷酸盐缓冲液；
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所述阴性对照品为含幽门螺旋杆菌IgG抗体阴性的血清溶液；
所述阳性对照品为含幽门螺旋杆菌IgG抗体阳性的血清溶液；
所述封闭液为含4 6g/L的甘油、0.5 2g/L的烷基糖苷和1.5g/L的蛋清白蛋白的~ ~
20mmol/L pH9.0的磷酸盐缓冲液；
所述烷基糖苷是碳链长度为C8 C10的烷基糖苷。
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2.如权利要求1所述的幽门螺旋杆菌IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为含0.5g/L的吐温-20的15mmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液。
3.如权利要求1所述的幽门螺旋杆菌IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒，其特征在于，所述显色液为四甲基联苯胺的甲醇溶液，浓度为0.1mg/mL。
4.如权利要求1所述的幽门螺旋杆菌IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒，其特征在于，所述终止液为3mol/L H2SO4溶液。
5.如权利要求1所述的幽门螺旋杆菌IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒，其特征在于，所述阴性对照品为在含0.2g/L的吐温-20和0.5g/L酪蛋白的15mmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液中，按5%的比例加入阴性血清制成，阴性对照的OD值应小于0.15。
6.如权利要求1所述的幽门螺旋杆菌IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为在含0.2g/L的吐温-20和0.5g/L酪蛋白的15mmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液中，加入阳性血清制成，阳性对照的OD值应大于0.80。
一种幽门螺旋杆菌IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒
技术领域
背景技术
[0002] 幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylor,Hp)是一种革兰氏阴性螺旋状杆菌，在胃上皮细胞定居繁殖。感染幽门螺旋杆菌后不仅是慢性胃炎、消化道溃疡的主要病原菌，也是引起胃癌的危险因子，而且还与胃外许多疾病相关。因此，幽门螺旋杆菌感染的诊断日益引起许多国家和地区的重视。实验室诊断检测幽门螺旋杆菌感染的方法很多，包括传统的用病理标本的直接镜检、活体组织细菌培养和尿素酶试验等，但是这些方法均属于侵入性创伤性检查，给患者造成的痛苦大，不易被患者和家属接受。而近年来的研究热点多集中在应用免疫学、基因学和蛋白质组学方法等。
[0003] 幽门螺旋杆菌感染后诱发全身细胞免疫和体液免疫反应。幽门螺旋杆菌菌体表面存在的鞭毛以及分泌的多种抗原组分均可激发宿主的免疫答应诱导抗体产生，检测血清中特异性抗体同样可以反映病原体的感染情况。幽门螺旋杆菌全身性抗体(即血清抗体)主要为IgG和IgA，而IgM极为少见。IgG常在感染后21d出现，持续时间较长；IgA在不同患者以及同一患者不同感染时期均有很大差异。这些免疫反应对机体无保护作用，但对幽门螺旋杆菌检测提供了方便，临床上常将IgG作为血清学检测幽门螺旋杆菌的主要测定指标。
[0004] 酶联免疫诊断方法是幽门螺旋杆菌血清学抗体常用的检测方法，其在幽门螺旋杆菌抗体诊断中表现出了快速、操作简便、易于标准化和高通量检验的优势。国内外研究者开发了多种幽门螺旋杆菌抗体酶联免疫诊断试剂盒，在试剂临床中得到了广泛的应用。在酶联免疫诊断试剂盒使用中，试剂盒的稳定性是制约产品市场化的关键。现在市场不同厂家生产的幽门螺旋杆菌抗体酶联免疫诊断试剂盒普遍存在着保存期短、稳定性差等问题，极大限制了幽门螺旋杆菌抗体酶联免疫诊断试剂盒在临床上推广和应用。国外已有多项的有关稳定剂的专利和产品问世，而国内在诊断试盒稳定剂方面尚在探索阶段，稳定剂研究成为我国酶联免疫诊断试剂盒研发必须克服的技术瓶颈。目前，已有针对蔗糖、海藻糖、乳糖、明胶、甘油、山梨醇、谷氨酸钠、聚乙二醇等稳定剂的研究。
发明内容
[0005] 为了解决现有幽门螺旋杆菌抗体酶联免疫诊断试剂盒中普遍存在的保存期短、稳定性差等问题，本发明提供了一种幽门螺旋杆菌IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒，该试剂盒具有良好的稳定性，在室温条件下有效期为1年，在4℃条件下有效期可达3年，显著提高了试剂盒的保存期。
[0006] 本发明提供的幽门螺旋杆菌IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒，由幽门螺旋杆菌抗原包被板、样品稀释液、酶标记液、洗涤液、显色液、阴性对照品、阳性对照品和终止液组成；
[0007] 其中，所述幽门螺旋杆菌抗原包被板的制备过程为：将包被用的幽门螺旋杆菌抗原用0.05mol/L pH9.5的碳酸盐缓冲液液稀释后，按0.1mL/孔包被到微孔板内，在4～8℃吸附24～26小时后，用0.05mol/L pH9.5的磷酸盐缓冲液洗板，再用封闭液在4～8℃封闭18～20小时，弃除多余的封闭液，经真空干燥处理后制得幽门螺旋杆菌抗原包被板；
[0008] 所述样品稀释液为含0.2g/L的吐温-20和0.5g/L酪蛋白的15mmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液；
[0010] 所述阴性对照品为含幽门螺旋杆菌IgG抗体阴性的血清溶液；
[0011] 所述阳性对照品为含幽门螺旋杆菌IgG抗体阳性的血清溶液。
[0012] 进一步的，所述洗涤液为含0.5g/L的吐温-20的15mmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液。
[0013] 进一步的，所述显色液为四甲基联苯胺的甲醇溶液，浓度为0.1mg/mL。
[0014] 进一步的，所述终止液为3mol/L H2SO4溶液。
[0015] 进一步的，所述封闭液为含4～6g/L的甘油、0.5～2g/L的烷基糖苷和1.5g/L的蛋清白蛋白的20mmol/L pH9.0的磷酸盐缓冲液。所述烷基糖苷具体为碳链长度为C8～C10的烷基糖苷。
[0016] 进一步的，所述阴性对照品为在含0.2g/L的吐温-20和0.5g/L酪蛋白的15mmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液中，按5％的比例加入阴性血清制成，阴性对照的OD值应小于0.15。
[0017] 进一步的，所述阳性对照品为在含0.2g/L的吐温-20和0.5g/L酪蛋白的15mmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液中，加入阳性血清制成，阳性对照的OD值应大于0.80。
[0018] 本发明幽门螺旋杆菌IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒的检测原理：
[0019] 本试剂盒在微孔板内包被幽门螺旋杆菌抗原，若待测样本中有幽门螺旋杆菌抗体即可与之结合，再与酶标记的羊抗人IgG抗体反应，形成“抗原-抗体-酶复合物”，酶催化显色剂显色，根据显色程度可判断幽门螺旋杆菌IgG抗体的有无。另外，本发明试剂盒在包被抗原的过程中使用了含有甘油和烷基糖苷的封闭液，在酶标记液中添加了聚乙二醇-200和壳聚糖。甘油和烷基糖苷的组合，以及聚乙二醇-200和壳聚糖的组合作为稳定剂，对包被抗原、酶标抗体起到了很好的保护作用，使包被抗原、酶标抗体的亲和力、免疫活性、灵敏度等不降低，从而显著提高本发明试剂盒的保存期。
[0020] 因此，与现有技术相比，本发明的优势在于：
[0021] 本发明幽门螺旋杆菌IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒的灵敏度高、特异性强、准确度高，且具有良好的稳定性，在室温条件下有效期为1年，在4℃条件下有效期可达3年，显著提高了试剂盒的保存期，有利于幽门螺旋杆菌抗体酶联免疫诊断试剂盒在临床上的推广和应用。
具体实施方式
[0023] 在本发明中，幽门螺旋杆菌抗原和辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体均可通过商业渠道获得。C8～C10烷基糖苷(活性物52.0wt％)购自广州市西陆化工有限公司。壳聚糖(有效物质含量99％)购自西安南斯生物科技有限公司。
[0024] 另外，下列实施例中未注明具体实验条件和操作的方法，均按照常规方法进行。
[0025] 实施例1、本发明幽门螺旋杆菌IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒
[0026] 本实施例试剂盒由幽门螺旋杆菌抗原包被板(96孔)、样品稀释液1瓶、酶标记液1瓶、洗涤液1瓶、显色液1瓶、阴性对照品1瓶、阳性对照品1瓶和终止液1瓶组成。
[0027] 其中，所述幽门螺旋杆菌抗原包被板的制备过程为：将包被用的幽门螺旋杆菌抗原用0.05mol/L pH9.5的碳酸盐缓冲液液稀释后，按0.1mL/孔包被到微孔板内，在4℃吸附24小时后，用0.05mol/L pH9.5的磷酸盐缓冲液洗板，再用封闭液在4℃封闭18小时，弃除多余的封闭液，经真空干燥处理后制得幽门螺旋杆菌抗原包被板。
[0028] 所述样品稀释液为含0.2g/L的吐温-20和0.5g/L酪蛋白的15mmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液。
[0029] 所述酶标记液为含0.5mg/L的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体、0.1mg/L的聚乙二醇-200和0.5mg/L的壳聚糖的15mmol/L pH8.5磷酸盐缓冲液。
[0030] 所述洗涤液为含0.5g/L的吐温-20的15mmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液。
[0031] 所述显色液为四甲基联苯胺的甲醇溶液，浓度为0.1mg/mL。
[0032] 所述终止液为3mol/L H2SO4溶液。
[0033] 所述封闭液为含4g/L的甘油、0.5g/L的C8～C10烷基糖苷和1.5g/L的蛋清白蛋白的20mmol/L pH9.0的磷酸盐缓冲液。
[0034] 所述阴性对照品为在含0.2g/L的吐温-20和0.5g/L酪蛋白的15mmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液中，按5％的比例加入阴性血清制成，阴性对照的OD值应小于0.15。
[0035] 所述阳性对照品为在含0.2g/L的吐温-20和0.5g/L酪蛋白的15mmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液中，加入阳性血清制成，阳性对照的OD值应大于0.80。
[0036] 实施例2、本发明幽门螺旋杆菌IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒
[0037] 本实施例试剂盒由幽门螺旋杆菌抗原包被板(96孔)、样品稀释液1瓶、酶标记液1瓶、洗涤液1瓶、显色液1瓶、阴性对照品1瓶、阳性对照品1瓶和终止液1瓶组成。
[0038] 其中，所述幽门螺旋杆菌抗原包被板的制备过程为：将包被用的幽门螺旋杆菌抗原用0.05mol/L pH9.5的碳酸盐缓冲液液稀释后，按0.1mL/孔包被到微孔板内，在8℃吸附26小时后，用0.05mol/L pH9.5的磷酸盐缓冲液洗板，再用封闭液在8℃封闭20小时，弃除多余的封闭液，经真空干燥处理后制得幽门螺旋杆菌抗原包被板。
[0039] 所述样品稀释液为含0.2g/L的吐温-20和0.5g/L酪蛋白的15mmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液。
[0040] 所述酶标记液为含0.5mg/L的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体、0.6mg/L的聚乙二醇-200和1mg/L的壳聚糖的15mmol/L pH8.5磷酸盐缓冲液。
[0041] 所述洗涤液为含0.5g/L的吐温-20的15mmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液。
[0042] 所述显色液为四甲基联苯胺的甲醇溶液，浓度为0.1mg/mL。
[0043] 所述终止液为3mol/L H2SO4溶液。
[0044] 所述封闭液为含6g/L的甘油、2g/L的C8～C10烷基糖苷和1.5g/L的蛋清白蛋白的20mmol/L pH9.0的磷酸盐缓冲液。
[0045] 所述阴性对照品为在含0.2g/L的吐温-20和0.5g/L酪蛋白的15mmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液中，按5％的比例加入阴性血清制成，阴性对照的OD值应小于0.15。
[0046] 所述阳性对照品为在含0.2g/L的吐温-20和0.5g/L酪蛋白的15mmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液中，加入阳性血清制成，阳性对照的OD值应大于0.80。
[0047] 实施例3、本发明幽门螺旋杆菌IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒
[0048] 本实施例试剂盒由幽门螺旋杆菌抗原包被板(96孔)、样品稀释液1瓶、酶标记液1瓶、洗涤液1瓶、显色液1瓶、阴性对照品1瓶、阳性对照品1瓶和终止液1瓶组成。
[0049] 其中，所述幽门螺旋杆菌抗原包被板的制备过程为：将包被用的幽门螺旋杆菌抗原用0.05mol/L pH9.5的碳酸盐缓冲液液稀释后，按0.1mL/孔包被到微孔板内，在6℃吸附24小时后，用0.05mol/L pH9.5的磷酸盐缓冲液洗板，再用封闭液在6℃封闭18小时，弃除多余的封闭液，经真空干燥处理后制得幽门螺旋杆菌抗原包被板。
[0050] 所述样品稀释液为含0.2g/L的吐温-20和0.5g/L酪蛋白的15mmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液。
[0051] 所述酶标记液为含0.5mg/L的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体、0.3mg/L的聚乙二醇-200和0.8mg/L的壳聚糖的15mmol/L pH8.5磷酸盐缓冲液。
[0052] 所述洗涤液为含0.5g/L的吐温-20的15mmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液。
[0053] 所述显色液为四甲基联苯胺的甲醇溶液，浓度为0.1mg/mL。
[0054] 所述终止液为3mol/L H2SO4溶液。
[0055] 所述封闭液为含5g/L的甘油、1g/L的C8～C10烷基糖苷和1.5g/L的蛋清白蛋白的20mmol/L pH9.0的磷酸盐缓冲液。
[0056] 所述阴性对照品为在含0.2g/L的吐温-20和0.5g/L酪蛋白的15mmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液中，按5％的比例加入阴性血清制成，阴性对照的OD值应小于0.15。
[0057] 所述阳性对照品为在含0.2g/L的吐温-20和0.5g/L酪蛋白的15mmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液中，加入阳性血清制成，阳性对照的OD值应大于0.80。
[0058] 对比例1
[0059] 与实施例3相比，本对比例的区别仅在于：所述封闭液中不添加C8～C10烷基糖苷，甘油含量由5g/L改为6g/L。
[0060] 对比例2
[0061] 与实施例3相比，本对比例的区别仅在于：所述封闭液中C8～C10烷基糖苷的含量由1g/L改为3g/L，甘油含量由5g/L改为3g/L。
[0062] 对比例3
[0063] 与实施例3相比，本对比例的区别仅在于：所述酶标记液中不添加壳聚糖，聚乙二醇-200含量由0.3mg/L改为1.1mg/L。
[0064] 对比例4
[0065] 与实施例3相比，本对比例的区别仅在于：所述酶标记液中壳聚糖的含量由0.8mg/L改为3mg/L。
[0066] 试验例一、本发明幽门螺旋杆菌IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒的检测：
[0067] 1.检测方法的操作过程：
[0068] (1)试剂准备：将试剂盒平衡至室温；
[0069] (2)加样：将所需数量的幽门螺旋杆菌抗原包被板条固定于板架上，各孔加入100μl样品稀释液，按序加入5μl待测样本；每次实验设空白对照(用双波长检测时可以不设空白对照)、阴性对照、阳性对照各2孔，分别加入阴性对照品、阳性对照品各100μl/孔；震荡混匀，封板，37℃温育10分钟，用洗涤液洗板5次，拍干。
[0070] (3)加酶：每孔加入酶标记液100μl，震荡混匀，封板，37℃温育10分钟，用洗涤液洗板5次，拍干。
[0071] (4)显色读值：每孔加入显色液50μl，混匀，封板，置37℃避光显色10分钟。每孔加终止液50μl，混匀，10分钟内完成结果测定。单波长测定：可用空白对照调零，在酶标仪450nm波长下测定各孔的OD值；双波长检测：在酶标仪450nm/630nm波长下测定各孔OD值。
[0072] 阴性对照的OD值应<0.15，阳性对照的OD值应>0.80。
[0073] 本方面试剂盒检测样本为血清，分离的样本可在2～8℃保存下存储7天，长期存储应置-20℃，避免反复冻融，冷藏或冷冻保存的样本使用前应平衡至室温，并充分混匀。
[0074] 2.检验结果的解释：
[0075] (1)临界值(Cutoff)计算：Cutoff＝阴性对照品OD值+0.2
[0076] (2)检验结果的判断：
[0077] [样本的OD值]≤[Cutoff]为：幽门螺旋杆菌IgG抗体阴性。
[0078] [样本的OD值]>[Cutoff]为：幽门螺旋杆菌IgG抗体阳性。
[0079] 3.性能指标：
[0080] (1)符合率：使用企业参考品进行检测，其中阳性参考品和阴性参考品符合率为100％。
[0081] (2)精密度：试验内不精密度<15％；试验间不精密度<15％。
[0082] (3)常见药物、病理状态和内源性物质干扰：
[0083] A.下列药物在2.5倍治疗水平不影响检测结果：利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、链霉素、阿米卡星、青霉素、头孢曲松、红霉素、地高辛、心痛定、雷尼替丁、呋塞米、利多卡因、酮康唑、甲基强的松龙、强的松。
[0084] B.下列情况对于检测结果无干扰：轻度溶血、血甘油三酯升高(>980mg/dL)、血糖升高(>11.1mmol/L)、胆红素升高(>6.3mg/mL)、注射流感疫苗、HBV阳性、HCV阳性、HIV阳性、类风湿因子阳性、肺炎、肺癌等。
[0085] 试验例二、本发明幽门螺旋杆菌IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒的稳定性考察：
[0086] 1.包被抗原的活性检测：
[0087] 将实施例1～3和对比例1～2的幽门螺旋杆菌抗原包被板放置在37℃温箱中进行加速破坏试验，每隔2d取出2条放入4℃冰箱，连续取样6次，在第6次取样后，将所有酶标板按照间接ELISA程序进行测定，检测包被抗原的活性。结果见下表1。
[0088] 表1各包被抗原稳定性比较试验结果
[0089]
[0090] 由上表1可知：实施例1～3酶标板随着时间的延长，P/N值变化不明显，而对比例1(不含烷基糖苷)和对比例2(甘油和烷基糖苷的配比为1:1)酶标板随着时间的延长，P/N值均明显下降，可见本发明甘油和烷基糖苷的组合能延长抗原的保存时间。
[0091] 2.酶标抗体的活性检测：
[0092] 将实施例1～3和对比例3～4的酶标记液放置在37℃温箱中进行加速破坏试验，每隔1天取出并测定其D450值，连续测定12d。结果见下表2。
[0093] 表2各酶标抗体稳定性比较试验结果
[0094]
[0095] 由上表2可知：经过37℃温箱加速破坏试验，实施例1～3酶标抗体活性在12d仍然很高，在1.6左右，而对比例3(不含壳聚糖)的酶标抗体很快失去活性，在第7d左右低于1.0，可见本发明聚乙二醇-200和壳聚糖的组合对酶标抗体有很好的保护作用。另外，对比例4增加了壳聚糖的用量，但是其对酶标抗体的保护作用并没有提高，反而产生了影响。
[0096] 3.试剂盒的有效期考察：
[0097] 对实施例1～3和对比例1～4试剂盒分别在室温和4℃条件下的有效期进行考察，结果，实施例1～3试剂盒在室温下保存12个月，在4℃下保存36个月，其灵敏度及线性良好，与刚制备的试剂盒无明显差别。因此，实施例1～3试剂盒在室温条件下有效期为1年，在4℃条件下有效期可达3年，显著提高了试剂盒的保存期。而对比例1～4试剂盒在室温条件下有效期在6个月以内，对比例1～3试剂盒在4℃条件下有效期在12个月以内，对比例4试剂盒在4℃条件下有效期约为18个月。
[0098] 本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。
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