试剂、试剂盒、血小板反应指数的测定方法及应用
阅读：1046发布：2020-06-05
专利汇可以提供试剂、试剂盒、血小板反应指数的测定方法及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及蛋白检测领域，具体涉及一种 试剂 、 试剂盒 、血小板反应指数的测定方法及应用。该试剂包括磷 酸化 VASP蛋白-胶乳偶联物，所述 磷酸 化VASP蛋白-胶乳偶联物包含经EDC和NHS活化的胶乳颗粒和磷酸化VASP蛋白单克隆 抗体 的偶联物，所述胶乳颗粒的粒径为100～400纳米；稳定剂； 防腐剂 ；和缓冲液。基于上述试剂，本发明还提供了试剂盒、血小板反应指数的测定方法，以及抗血小板药物的筛选方法。通过本发明提供的试剂、试剂盒可以评估抗血小板药物药效，操作简便、成本低，特异性高。，下面是试剂、试剂盒、血小板反应指数的测定方法及应用专利的具体信息内容。
1.一种试剂，其特征在于，包括：
磷酸化VASP蛋白-胶乳偶联物，所述磷酸化VASP蛋白-胶乳偶联物包含经EDC和NHS活化的胶乳颗粒和磷酸化VASP蛋白单克隆抗体的偶联物，所述胶乳颗粒的粒径为100～400纳米，优选为300～400纳米；
稳定剂；
防腐剂；
和缓冲液。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述稳定剂包括选自小牛血清白蛋白、酷蛋白、明胶、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000中的至少一种；
任选地，所述稳定剂的质量体积浓度为0.5％～2.0％(w/v)；
任选地，所述防腐剂包括选自叠氮钠、procline300中的至少一种；
任选地，所述防腐剂的质量体积浓度为0.01％～0.04％(w/v)；
任选地，所述缓冲液包括选自磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MOPS缓冲液中的至少一种；
任选地，所述磷酸化VASP蛋白单克隆抗体至少包括两种。
3.权利要求1或2所述的试剂的制备方法，其特征在于，包括：
利用EDC和NHS溶液活化胶乳颗粒，得到经EDC和NHS活化的胶乳颗粒，所述胶乳颗粒的粒径为100～400纳米，优选为300～400纳米；
将磷酸化VASP蛋白单克隆抗体和所述经EDC和NHS活化的胶乳颗粒混合，偶联，获得磷酸化VASP蛋白-胶乳偶联物；
将所述磷酸化VASP蛋白-胶乳颗粒偶联物和稳定剂混合，分离获得沉淀物；
利用缓冲液将所述沉淀物配置成溶液，并与防腐剂混合，获得含有磷酸化VASP蛋白-胶乳偶联物的溶液。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，利用质量体积浓度为0.1％～0.5％(w/v)的EDC溶液和质量体积浓度为0.1％～0.5％(w/v)的NHS溶液活化所述胶乳颗粒，得到经EDC和NHS活化的胶乳颗粒；
任选地，所述活化的时间为2～5小时；
任选地，所述偶联温度为30～38摄氏度；
任选地，所述偶联时间为2～4小时。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，通过离心分离得到沉淀物，所述离心速率为4000～7000rpm，所述离心时间为15～30分钟；
任选地，进一步包括：
将至少两种磷酸化VASP蛋白单克隆抗体和所述经EDC和NHS活化的胶乳颗粒混合，偶联，获得至少两种磷酸化VASP蛋白-胶乳偶联物。
6.一种试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1或2所述的试剂。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括下列中的至少一种：
激活剂，所述激活剂包括前列腺素E1；
抑制剂，所述抑制剂包括前列腺素E1和二磷酸腺苷；
第一试剂，所述第一试剂包括组织裂解液、缓冲液、促凝剂和表面活性剂。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述激活剂进一步包括缓冲盐，所述激活剂为粉剂；
任选地，所述缓冲盐选自磷酸盐、碳酸盐、HEPES、Tris-HCl、MOPS中的至少一种；
任选地，所述抑制剂进一步包括缓冲盐，所述抑制剂为粉剂；
任选地，所述缓冲盐选自磷酸盐、碳酸盐、HEPES、Tris-HCl、MOPS中的至少一种；
任选地，所述组织裂解液包括选自四癸基三甲铵溴华物、溶血素和Triton X-100中的至少一种；
所述表面活性剂包括选自：吐温-20、吐温-80、Brij35、十二烷基硫酸钠、Triton X-100中的至少一种；
所述促凝剂包括选自PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG20000中的至少一种。
9.一种利用权利要求6～8中任一项所述的试剂盒测定血小板反应指数的方法，其特征在于，包括：
(1)将部分血液样本与所述激活剂混合，得到样本激活物，将所述样本激活物和所述第一试剂混合，孵育，获得第一混合溶液，在特定波长下测定所述第一混合溶液的吸光度为A1；
将所述第一混合溶液和第二试剂混合，孵育，获得第二混合溶液，在特定波长下测定所述第二混合溶液的吸光度为A2；
基于吸光度A2和吸光度A1的吸光度差，计算所述血液样本在激活剂作用下的磷酸化VASP蛋白浓度C激活；
(2)将部分血液样本和所述抑制剂混合，得到样本抑制物，将所述样本抑制物和所述第一试剂混合，孵育，获得第三混合溶液，在特定波长下测定所述第三混合溶液的吸光度为A3；
将所述第三混合溶液和第二试剂混合，孵育，获得第四混合溶液，在特定波长下测定所述第四混合溶液的吸光度为A4；
基于吸光度A4和吸光度A3的吸光度差，计算所述血液样本在抑制剂作用下的磷酸化VASP蛋白浓度C抑制；
(3)根据如下公式计算所述血液样本的血小板反应指数：
血小板反应指数(PRI)＝[(c激活-c抑制)/c激活×100％]；
其中所述第二试剂为权利要求1或2所述的试剂，所述特定波长为500～580纳米，优选为540～570纳米；
任选地，所述血液样本为全血样本。
10.一种抗血小板药物的筛选方法，其特征在于，包括：
取受试者的血液样本，对受试者给予候选药物治疗，分别取受试者在治疗前和治疗后的血液样本，依照权利要求9所述的方法计算所述血样样本的血小板反应指数；
其中给予候选药物治疗后所述受试者的血液样本的血小板反应指数降低的所述候选药物作为抗血小板药物。
试剂、试剂盒、血小板反应指数的测定方法及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及蛋白检测领域，具体涉及一种试剂、试剂盒、血小板反应指数的测定方法及应用。
背景技术
[0003] 心脑血管疾病是由于长期的动脉粥样硬化，从而引起血小板功能异常，最终呈现脑血栓或脑出血等疾病。有数据显示，我国缺血性脑卒中处复发率高达17.7％。有研究显示抗血小板治疗能显著降低既往伴有缺血性脑卒中或TIA患者严重血管事件的发生风险(非致命性心肌梗死、非致命性脑卒中和血管源性死亡)。
[0004] 血小板的活化聚集发生于动脉粥样硬化病变的发生、发展和恶化全过程，故对血小板的治疗对心脑血管疾病患者至关重要。目前循证医学证据充分证明氯吡格雷是具有抗血小板作用的药物。同时《中国缺血性脑卒中和短暂性脑缺血发作二级预防指南2014》推荐意见，阿司匹林或氯吡格雷单药治疗均可以作为首选抗血小板药物(I级推荐，A级证据)。
[0005] 如何评价抗血小板药物的疗效，还需要进一步改进。
发明内容
[0006] 本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种试剂、试剂盒、血小板反应指数的测定方法及应用，利用本发明提供的试剂、试剂盒，参照本发明提供的血小板反应指数的测定方法，可以测定血液样本的血小板反应指数进行测定。同时可以用来筛选能够抗血小板的药物，从而抑制血小板的聚集，治疗由于血小板功能异常所引起的心脑血管疾病。
[0007] 本发明所提供的试剂、试剂盒以及血小板反应指数的测定方法，采用胶乳增强免疫比浊法的技术原理，在各种生化分析仪上通过分别同步测定经过激活剂(PGE1)或抑制剂(PGE1+ADP)处理的血液样本(例如为全血)中血管扩张刺激磷酸蛋白(VASP)浓度，进而计算血小板反应指数，从而可体外评估抗血小板药物对血小板膜表面二磷酸苷受体(P2Y12受体)的拮抗作用。本测试方法具有操作方便、测定时间短、成本低，适用设备广泛以及测定结果的特异性高等特点。
[0008] 具体而言，本发明提供了如下技术方案：
[0009] 根据本发明的第一方面，本发明提供了一种试剂，包括：磷酸化VASP蛋白-胶乳偶联物，所述磷酸化VASP蛋白-胶乳偶联物包含经EDC和NHS活化的胶乳颗粒和磷酸化VASP蛋白单克隆抗体的偶联物，所述胶乳颗粒的粒径为100～400纳米，优选为300～400纳米；稳定剂；防腐剂；和缓冲液。其中NHS为N-羟基琥珀酰亚胺；EDC为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。在存在碳二亚胺类化合物如EDC时，羧化物(-COOH)可能与NHS或者磺基-NHS反应，形成一个半稳定的NHS或者磺基-NHS酯。NHS或者磺基-NHS酯可以继续与伯胺(-NH2)反应，形成酰胺键。同时采用NHS和EDC活化胶乳颗粒，可以极大的提高偶联效率。
[0010] 根据本发明的实施例，以上所述试剂进一步包括如下技术特征：
[0012] 在本发明的一些实施例中，所述稳定剂的质量体积浓度为0.5％～2.0％(w/v)。当稳定剂的浓度过低时，可能无法完全发挥稳定剂对于试剂的稳定功能，而浓度过高时，也会影响到试剂的性能。
[0013] 在本发明的一些实施例中，所述防腐剂包括选自叠氮钠、procline 300中的至少一种。
[0014] 在本发明的一些实施例中，所述防腐剂的质量体积浓度为0.01％～0.04％(w/v)。在该质量体积范围时的防腐剂，即可以达到抑菌的目的，又不会因为加入过多，而影响试剂产品的性能。所用到的防腐剂的浓度范围过小时，无法起到抑菌的作用；如果使用浓度过高，防腐剂中的盐离子会影响到产品的性能。
[0015] 在本发明的一些实施例中，所述缓冲液包括选自磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MOPS缓冲液中的至少一种。
[0016] 在本发明的一些实施例中，所述磷酸化VASP蛋白单克隆抗体至少包括两种，优选为两种。磷酸化VASP蛋白单克隆抗体的结合位点单一，如果仅用一种抗体，容易出现漏检(即容易出现假阴性的情况)；用至少两种不同结合位点的抗体，可增加磷酸化VASP的免疫结合率，同时也增大免疫结合物的分子量，从而影响检测的光透射率而易于检出。
[0017] 根据本发明的第二方面，本发明提供了一种试剂的制备方法，所述试剂为本发明第一方面所述的试剂，所述制备方法包括：利用EDC和NHS溶液活化胶乳颗粒，得到经EDC和NHS活化的胶乳颗粒，所述胶乳颗粒的粒径为100～400纳米，优选为300～400纳米；将磷酸化VASP蛋白单克隆抗体和所述经EDC和NHS活化的胶乳颗粒混合，偶联，获得磷酸化VASP蛋白-胶乳偶联物；将所述磷酸化VASP蛋白-胶乳颗粒偶联物和稳定剂混合，分离获得沉淀物；利用缓冲液将所述沉淀物配置成溶液，并与防腐剂混合，获得含有磷酸化VASP蛋白-胶乳偶联物的溶液。
[0018] 根据本发明的实施例，以上所述试剂的制备方法可以进一步包括如下技术特征：
[0019] 在本发明的一些实施例中，利用质量体积浓度为0.1％～0.5％(w/v)的EDC溶液和质量体积浓度为0.1％～0.5％(w/v)的NHS溶液活化胶乳颗粒，得到经EDC和NHS活化的胶乳颗粒。
[0020] 在本发明的一些实施例中，所述活化的时间为2～5小时。活化时间过短，胶乳微球上的羧基上的化学键未能完全打开且不稳定，导致偶联效率降低；活化时间过长，羧基过度活化，胶乳微球间彼此凝聚，影响产品的质量。经活化处理2～5小时，可以获得稳定的将活化的胶乳颗粒。
[0021] 在本发明的一些实施例中，所述偶联温度为30～38摄氏度。抗体活性的最适宜温度是与机体接近的温度，过高的偶联温度易致使抗体失活，影响产品的质量和增加成本；过低的温度也会影响偶联的效果。在30～38摄氏度条件下可以获得良好的偶联物。
[0022] 在本发明的一些实施例中，所述偶联时间为2～4小时。
[0023] 在本发明的一些实施例中，通过离心分离得到沉淀物，所述离心速率为4000～7000rpm，所述离心时间为15～30分钟。离心主要是分离沉淀物，除去上清液中含有多余的盐离子(比如EDC和NSH等)，当速率过高时或时间过长，多余的盐离子也会随沉淀物析出；如果速率过低或时间过短，则沉淀物分离不彻底。
[0024] 在本发明的一些实施例中，进一步包括：将至少两种磷酸化VASP蛋白单克隆抗体和所述NHS活化的胶乳颗粒混合，偶联，获得至少两种磷酸化VASP蛋白-胶乳偶联物。
[0025] 根据本发明的第三方面，本发明提供了一种试剂盒，包括本发明第一方面任一实施例所述的试剂。由含有本发明第一方面所述试剂制备而成的试剂盒，可以用作血液样本反应指数的测定，进而可以用作评估抗血小板药物的药物效果，或者用来筛选抗血小板的药物。利用该试剂盒，可以配合含有前列腺素E1的激活剂，以及含有前列腺素E1和二磷酸腺苷的抑制剂，在特定波长下，例如540nm波长下测定血小板激活状态下和抑制状态下的磷酸化VASP蛋白的浓度。根据血小板激活状态下与抑制状态下磷酸化VASP蛋白的变化，计算血小板的反应指数，从而用作血小板药物的药效评估。当然，试剂盒中也可以直接含有这些激活剂或者抑制剂。
[0026] 根据本发明的实施例，以上所述的试剂盒，可以进一步包括如下技术特征：
[0027] 在本发明的一些实施例中，所述试剂盒进一步包括下列中的至少一种：
[0028] 激活剂，所述激活剂包括前列腺素E1；
[0029] 抑制剂，所述抑制剂包括前列腺素E1和二磷酸腺苷；
[0030] 第一试剂，所述第一试剂包括组织裂解液、缓冲液、促凝剂和表面活性剂。第一试剂中含有组织裂解液，组织裂解液可以促进血红细胞的理解，同时还含有表面活性剂，用于稳定第一试剂的溶液体系。利用第一试剂可以裂解红细胞，从而释放出VASP蛋白同时稳定反应体系。
[0031] 在本发明的一些实施例中，所述激活剂进一步包括缓冲盐，所述激活剂为粉剂。利用缓冲盐将激活剂稀释到一定的浓度，然后分装到西林瓶中，冻干成粉剂，可以方便保存和使用。在使用时，利用去离子水复溶到一定浓度即可使用。
[0032] 在本发明的一些实施例中，所述缓冲盐选自磷酸盐、碳酸盐、HEPES、Tris-HCl、MOPS中的至少一种。
[0033] 在本发明的一些实施例中，所述抑制剂进一步包括缓冲盐，所述抑制剂为粉剂。用缓冲盐将抑制剂稀释到一定的浓度，然后分装到西林瓶中，冻干成粉剂，可以方便保存和使用。在使用时，利用去离子水复溶到一定浓度即可使用。
[0034] 在本发明的一些实施例中，所述缓冲盐选自磷酸盐、碳酸盐、HEPES、Tris-HCl、MOPS中的至少一种。
[0035] 在本发明的一些实施例中，所述组织裂解液包括选自四癸基三甲铵溴华物(TTAB)、溶血素和Triton X-100中的至少一种。
[0036] 在本发明的一些实施例中，所述表面活性剂包括选自：吐温-20、吐温-80、Brij35、十二烷基硫酸钠、Triton X-100中的至少一种。在第一试剂中加入表面活性剂，可以稳定该试剂。
[0037] 在本发明的一些实施例中，所述促凝剂包括选自PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG20000中的至少一种。该促凝剂可以促进磷酸化VASP蛋白与单抗结合后大分子的凝聚，从而增加吸光度差值，有利于增大检测范围。
[0038] 根据本发明的第四方面，本发明提供了一种利用本发明第三方面所述的试剂盒测定血小板反应指数的方法，包括：(1)将部分血液样本与所述激活剂混合，得到样本激活物，将所述样本激活物和所述第一试剂混合，孵育，获得第一混合溶液，在特定波长下测定所述第一混合溶液的吸光度A1；将所述第一混合溶液和第二试剂混合，孵育，获得第二混合溶液，在特定波长下测定所述第二混合溶液的吸光度A2；基于吸光度A2和吸光度A1吸光度差，计算所述血液样本在激活剂作用下的磷酸化VASP蛋白浓度C激活；(2)将部分血液样本和所述抑制剂混合，得到样本抑制物，将所述样本抑制物和所述第一试剂混合，孵育，获得第三混合溶液，在特定波长下测定所述第三混合溶液的吸光度为A3；将所述第三混合溶液和第二试剂混合，孵育，获得第四混合溶液，在特定波长下测定所述第四混合溶液的吸光度为A4；基于吸光度A4和吸光度A3的吸光度差，计算所述血液样本在抑制剂作用下的磷酸化VASP蛋白浓度C抑制；(3)根据如下公式计算所述血液样本的血小板反应指数：
[0039] 血小板反应指数(PRI)＝[(c激活-c抑制)/c激活×100％]；
[0040] 其中所述第二试剂为本发明第一方面所述的试剂，所述特定波长为500～580纳米，优选为540～570纳米。
[0041] 血液样本(例如全血)可以在激活剂(例如前列腺素E1)的作用下激活血小板磷酸化；同样也可以在样本抑制剂(例如二磷酸腺苷)的作用下通过P2Y12受体抑制血小板的磷酸化。当血小板内磷酸化形成的VASP与本发明所提供的试剂即含有磷酸化VASP蛋白-胶乳偶联物的溶液发生免疫结合，形成不溶性免疫复合物，从而产生浊度。基于分光光度法原理，利用全自动生化分析仪，在特定波长(例如可以为540nm、570nm等)测定吸光度，吸光度变化与磷酸化VASP蛋白的浓度成正相关。通过同时测定血小板激活状态下和抑制状态下的磷酸化VASP蛋白的浓度，进而通过计算血小板反应指数(PRI)可体外评估P2Y12受体拮抗剂的作用。其中，步骤(1)和(2)可以同时进行，也可以分开测定，顺序不分先后。
[0042] 在本发明的一些实施例中，所述血液样本为全血样本。
[0043] 根据本发明的第五方面，本发明提供了一种抗血小板药物的筛选方法，包括：取受试者的血液样本，对受试者给予候选药物治疗，分别取受试者在治疗前和治疗后的血液样本，依照本发明第四方面所述的方法计算所述血样样本的血小板反应指数；其中给予候选药物治疗后所述受试者的血液样本的血小板反应指数降低的所述候选药物作为抗血小板药物。通过对受试者给予候选药物治疗，然后比较治疗前和治疗后受试者血液样本的血小板反应指数的变化，来筛选抗血小板药物。例如可以在治疗一周后测定受试者的血液样本的血小板反应指数。根据本发明的实施例，可以选择在治疗前后相比，受试者的血液样本的血小板反应指数降低80％以下的候选药物，作为抗血小板药物。
具体实施方式
[0044] 氯吡格雷是前体药物，需要在体内转化为活性代谢物后通过不可逆地与血小板膜表面二磷酸苷(ADP)受体(P2Y12)结合，从而阻断ADP对腺苷酸环化酶的抑制作用，并促进环磷酸腺苷依赖前列腺素E1(PGE1)刺激的血管扩张刺激磷蛋白(VASP)的磷酸化，从而抑制血小板聚集。如何评价抗血小板药物的疗效,目前常用的实验室检查方法很多,如光透射血小板聚集法(比浊法)、血小板功能分析系统、血栓弹力图(TEG)法等。目前使用TEG法评价抗血小板药物的疗效可以获得可靠且有效的结果，同时该方法的敏感度和特异性高，但耗时长，检测费用高、检测设备专一。
[0045] 胶乳增强免疫比浊法是通过在高分子乳胶微球表面交联单克隆抗体，而当抗原与交联有抗体的微球结合后，能够在短时间内迅速聚集在一起，从而改变反应溶液的吸光度。而且，反应液吸光度的改变与被测抗原的浓度在一定范围内具有线性关系，可用来反映被测抗原的浓度。采用该方法测定，操作简单，不必进行反复孵育和洗板等操作，而且具有良好的灵敏度和稳定性。
[0046] 本发明基于胶乳增强免疫比浊法的原理，提供了一种试剂、试剂盒，利用该试剂、试剂盒可以用来测定血液样本的血小板反应指数。血液样本(全血)可以在样品激活剂(前列腺素E1)的作用下激活血小板磷酸化；同样也可以在样本抑制剂(二磷酸腺苷)的作用下通过P2Y12受体抑制血小板的磷酸化。当血小板内磷酸化形成的VASP与本发明所提供的试剂中的胶乳偶联磷酸化VASP蛋白鼠源单克隆抗体的混合物发生免疫结合，形成不溶性免疫复合物，从而产生浊度。基于分光光度法原理，利用全自动生化分析仪，在特定波长(如540nm处)测定吸光度，吸光度变化与磷酸化VASP蛋白的浓度成正相关。
[0047] 通过同时测定血小板激活状态下和抑制状态下的磷酸化VASP蛋白的浓度，进而通过计算血小板反应指数(PRI)可体外评估P2Y12受体拮抗剂的作用。
[0048] 试剂
[0049] 本发明提供了一种试剂，该试剂是含有磷酸化VASP蛋白-胶乳偶联物的溶液，包含NHS活化后的胶乳颗粒与磷酸化VASP蛋白鼠源单克隆抗体偶联的混合物、稳定剂、防腐剂、缓冲液。在至少一些实施方式中，所述稳定剂包括不限于小牛血清白蛋白、酷蛋白、明胶、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000中一种或多种。在至少一些实施方式中，所述缓冲液包括不限于磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MOPS缓冲液。在至少一些实施方式中，所述防腐剂包括不限于叠氮钠、procline 300中一种或多种。在至少一些实施方式中，所述试剂R2通过如下方法制备而成：先用0.1％～0.5％(w/v)NHS溶液活化胶乳颗粒(粒径300～400nm)2～5h，然后将活化的胶乳分成两份，分别加入磷酸化VASP蛋白鼠源单克隆抗体1和磷酸化VASP蛋白鼠源单克隆抗体2进行偶联，置于37℃条件下偶联2～4h后，加入0.5％～2.0％(w/v)的稳定剂，用离心机离心(4000～7000rpm，20min),弃去上清液收集沉淀物，最终用相同体积的缓冲液复溶后，将两种复溶液按1：1比例混合成0.5％～2％(w/v)的磷酸化VASP蛋白胶乳混合物，并加入终浓度为0.01％～0.04％(w/v)的防腐剂，2～8℃保存备用。本文中，当表示质量体积浓度(w/v)时，代表质量(g)和体积(mL)之间的百分比。
[0050] 本文中所用到的胶乳颗粒多是惰性微球、羧基化微球以及氨基化微球。加入氨基或者羧基等修饰的功能性微球，与抗体通过共价键的形式结合，提高与抗体结合率的同时也为抗体提供了合适的3D结构与抗原进行结合，提升了检测的敏感性和特异性。由于纳米级粒子尺寸属于原子簇和宏观体系的过度区域，具有高比表面积的特性，它的应用加快达到吸附平衡的时间和吸附平衡的稳定性，提高了反应速度和结果的稳定性。根据本发明的实施例，这些胶乳可以是带有羧基的微球，可以通过购买获得，例如可以购自于Merck Millipore。
[0051] 试剂盒
[0052] 本发明还提供了一种血管扩张刺激磷酸蛋白(VASP)测定试剂盒，该试剂盒适于利用胶乳增强免疫比浊法测定血管扩张刺激磷酸蛋白的浓度，其包括上述试剂。在本发明的至少一些实施方式中，所述试剂盒还可以进一步包括激活剂、抑制剂和第一试剂中的至少一种。为了区分，上述试剂称为第二试剂。
[0053] 激活剂：包含前列腺素E1的缓冲液，制备成冻干粉，使用前用纯水复溶。在至少一些实施方式中，激活剂通过如下方法制备而成：使用缓冲液稀释前列腺素E1至10～50μM，分装至西林瓶中，1.0mL/瓶，经冻干工艺制备成粉剂。使用前用1.0mL去离子水复溶后即可使用。其中所用到的缓冲液包括不限于磷酸盐(PBS)缓冲液、HEPES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MOPS缓冲液等等。
[0054] 抑制剂：包含前列腺素E1和二磷酸腺苷混合物的缓冲液，制备成冻干粉，使用前用纯水复溶。在至少一些实施方式中，所述抑制剂通过如下方法制备而成：使用缓冲液稀释前列腺素E1至10～50μM，加入终浓度为5～25μM二磷酸腺苷，混匀后分装至西林瓶中，1.0mL/瓶，经冻干工艺制备成粉剂。使用前用1.0mL去离子水复溶后即可使用。其中，所用到的缓冲液包括但不限于磷酸盐(PBS)缓冲液、HEPES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MOPS缓冲液等等。
[0055] 第一试剂：包含组织裂解液、缓冲液、促凝剂、表面活性剂。其中缓冲液包括但不限于磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MOPS缓冲液等。在至少一些实施方式中，所述促凝剂包括但不限于PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG20000中的一种或多种。在至少一些实施方式中，所述表面活性剂包括但不限于吐温-20、吐温-80、Brij35、十二烷基硫酸钠、Triton X-100中的一种或多种。在至少一些实施方式中，所述试剂R1通过如下方法制备而成：配制pH(6.0～8.5)浓度(10～50mmol/L)缓冲液(包括不限于)，加入0.3％～3％(w/v)促凝剂和0.1％～2％(w/v)表面活性剂溶解均匀，保存备用。
[0056] 利用上述试剂或者试剂盒，可以参照下述方法测定血液样本的血小板反应指数。包括：
[0057] 首先，分别用1.0mL去离子水复溶激活剂和抑制剂，充分溶解(例如10min)备用。
[0058] 其次，分别取一定体积(例如5.0～10.0μL)的全血样本同时加入到激活剂和抑制剂溶液中，颠倒混匀后静置5min。
[0059] 再次，分别取上述处理后的样本，加入一定体积的第一试剂中，37℃孵育5min后读取吸光度A1，再加入一定体积第二试剂(样本：第一试剂：第二试剂的体积比＝5：200：50)，37℃孵育5min后读取吸光度A2，根据吸光度差(ΔA＝A2-A1)分别计算磷酸化VASP蛋白浓度CPGE1和CPGE1+ADP。
[0060] 最后，根据公式计算血小板反应指数，计算公式如下：
[0061] 血小板反应指数(PRI)＝[(cPGE1-c(PGE1+ADP))/cPGE1×100％]
[0062] 下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。其中实施例中试剂R1作为第一试剂，试剂R2作为第二试剂。
[0063] 实施例1
[0064] 实施例1提供了血管扩张刺激磷酸蛋白(VASP)测定试剂盒，包括激活剂、抑制剂、试剂R1和试剂R2。同时提供了各试剂的制备方法。
[0065] 实验组1a
[0066] (1)激活剂的制备：
[0067] 用5mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)稀释前列腺素E1至20μM，分装至西林瓶中，1.0mL/瓶，经冻干工艺制备成粉剂。
[0068] (2)抑制剂的制备：
[0069] 用5mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)稀释前列腺素E1至20μM，加入终浓度为10μM二磷酸腺苷，分装至西林瓶中，1.0mL/瓶，经冻干工艺制备成粉剂。
[0070] (3)试剂R1的制备：
[0071] 制备100mL磷酸盐缓冲液(10mmol/L,pH＝7.2)，加入3％(w/v)PEG 20000和1％w/v Triton X-100，混匀即制得试剂R1。
[0072] (4)试剂R2的制备：
[0073] 第一步，取2.0mL胶乳微球(粒径100nm，5％w/v，购自于Merck Millipore，货号为：39414082FR，以下实验组也相同)加入10mL MES缓冲液(5mM,pH＝5.0)中混匀，然后分别加入质量体积浓度0.1％(w/v)EDC和0.1％(w/v)NHS，混匀后置于37℃条件下孵育2h进行活化。
[0074] 第二步，将活化后的胶乳分为两等份，分别加入磷酸化VASP蛋白鼠源单克隆抗体1和磷酸化VASP蛋白鼠源单克隆抗体2(均购自于Merck Millipore，货号为：05-611)，混匀后置于37℃条件下孵育3h进行偶联。
[0075] 第三步，偶联结束后再加入1％(w/v)BSA混匀后，5000rpm离心20min，弃去上清液后加入少量的磷酸盐缓冲液(5mmol/L,pH＝7.2)溶解沉淀物，在超声机上反复超声5次，每次超声2～3s。
[0076] 最后用磷酸盐缓冲液(5mmol/L,pH＝7.2)稀释至10mL后，将两种抗体标记的偶联物按1:1体积比进行混合，并加入0.04％(w/v)叠氮钠充分溶解后即得试剂R2，2～8℃保存备用。
[0077] 实验组1b
[0078] 实验组1b与实验组1a相比，区别在于：在制备试剂R2时，所用到的胶乳颗粒的粒径为200纳米。
[0079] 实验组1c
[0080] 实验组1c与实验组1a相比，区别在于：在制备试剂R2时，所用到的胶乳颗粒的粒径为300纳米。
[0081] 实验组1d
[0082] 实验组1d与实验组1a相比，区别在于：在制备试剂R2时，所用到的胶乳颗粒的粒径为400纳米。
[0083] 然后利用以上各实验组的试剂盒，以磷酸化VASP蛋白重组抗原作为标准品，分别配制系列浓度为0ng/L，200ng/L，400ng/L，600ng/L，800ng/L和1000ng/L，然后利用上述试剂盒中的试剂R1和试剂R2分别测定这些不同浓度的标准品，得到各标准品的测定浓度，平行测定三次。
[0084] 其测定方法为：将磷酸化VASP蛋白重组抗原和试剂盒中的试剂R1混合后在37摄氏度孵育5分钟后，在540纳米波长下读取吸光度A1，然后再加入一定体积试剂R2，在37摄氏度孵育5分钟后，在540纳米波长下读取吸光度A2，然后根据吸光度的差值计算磷酸化VASP蛋白重组抗原的浓度。然后以标准品浓度作为自变量，以计算得到的磷酸化VASP蛋白重组抗原的浓度作为因变量，计算相关系数。
[0085] 其结果如下：
[0086] 表1各实验组的标准品浓度测定值
[0087]
[0088] 从表1的结果可以看出，利用不同粒径的胶乳颗粒制备的R2试剂测定线性范围时，相关系数均符合要求(r≥0.990)。
[0089] 从实验组1a和实验组1b的结果也可以看出，粒径小的胶乳颗粒制备的R2在测定低浓度样本时，测定结果的相对偏差较大；
[0090] 综合所有试验结果，选择实验组1c和实验组1d所示粒径大小的胶乳颗粒进行测定，效果更优。
[0091] 实施例2
[0092] 实施例2提供了血管扩张刺激磷酸蛋白(VASP)测定试剂盒，包括激活剂、抑制剂、试剂R1和试剂R2。同时提供了各试剂的制备方法。
[0093] 实验组2a
[0094] (1)激活剂的制备：
[0095] 用10mM MOPS缓冲液(pH7.0)稀释前列腺素E1至50μM，分装至西林瓶中，1.0mL/瓶，经冻干工艺制备成粉剂。
[0096] (2)抑制剂的制备：
[0097] 用10mM MOPS缓冲液(pH7.0)稀释前列腺素E1至50μM，加入终浓度为25μM二磷酸腺苷，分装至西林瓶中，1.0mL/瓶，经冻干工艺制备成粉剂。
[0098] (3)试剂R1的制备：
[0099] 制备200mL Tris-HCl缓冲液(20mmol/L,pH＝7.5)，加入3％(w/v)PEG 4000、2％(w/v)PEG 8000和2％Brij35，混匀即制得试剂R1。
[0100] (4)试剂R2的制备：
[0101] 第一步，取4.0mL胶乳微球(粒径400nm，5％w/v)加入20mL MES缓冲液(5mM,pH＝5.0)中混匀，然后加入0.1％(w/v)EDC，混匀后置于37℃条件下孵育4h进行活化。
[0102] 第二步，将活化后的胶乳分为两等份，分别加入磷酸化VASP蛋白鼠源单克隆抗体1和磷酸化VASP蛋白鼠源单克隆抗体2，混匀后置于37℃条件下孵育5h进行偶联。
[0103] 第三步，偶联结束后再加入2％(w/v)BSA、0.1％(w/v)酷蛋白混匀后，5000rpm离心20min，弃去上清液后加入少量的Tris-HCl缓冲液(20mmol/L,pH＝7.5)溶解沉淀物，在超声机上反复超声5次，每次超声2～3s。
[0104] 最后用Tris-HCl缓冲液(20mmol/L,pH＝7.5)稀释至20mL后，将两种抗体标记的偶联物按1:1体积比进行混合，并加入0.02％(w/v)procline 300充分溶解后即得试剂R2，2～8℃保存备用。
[0105] 实验组2b
[0106] 实验组2b与实验组2a相比，区别在于：在制备试剂R2时，所用到的活化溶液为质量体积浓度为0.1％的EDC和质量体积浓度为0.1％的NHS溶液。
[0107] 实验组2c
[0108] 实验组2c与实验组2a相比，区别在于：在制备试剂R2时，所用到的活化溶液为质量体积浓度为0.5％的EDC溶液。
[0109] 实验组2d
[0110] 实验组2d与实验组2a相比，区别在于：在制备试剂R2时，所用到的活化溶液为质量体积浓度为0.5％的EDC和质量体积浓度为0.5％的NHS溶液。
[0111] 实验组2e
[0112] 实验组2e与实验组2a相比，区别在于：在制备试剂R2时，所用到的活化溶液为质量体积浓度为1.0％的EDC溶液。
[0113] 实验组2f
[0114] 实验组2f与实验组2a相比，区别在于：在制备试剂R2时，所用到的活化溶液为质量体积浓度为1.0％的EDC和质量体积浓度为1.0％的NHS溶液。
[0115] 然后利用以上各实验组的试剂盒，以磷酸化VASP蛋白重组抗原作为标准品，分别配制系列浓度为0ng/L，250ng/L，500ng/L，750ng/L和1000ng/L，然后在全自动生化分析仪上用上述试剂盒中的试剂R1和试剂R2分别测定这些不同浓度的标准品，并读取各浓度标准品相应的吸光度差作为反应度值。其结果如表2所示。
[0116] 测定方法为：将磷酸化VASP蛋白重组抗原和试剂R1混合，在37摄氏度孵育5分钟后，在540纳米波长下读取吸光度A1，然后再加入一定体积试剂R2(其中磷酸化VASP蛋白重组抗原和试剂R1以及试剂R2的体积比为5:200:50)，在37摄氏度条件下孵育5分钟后，在540纳米波长下读取吸光度A2，然后由全自动生化分析仪自动计算吸光度A2和A1的差值。
[0117] 表2各实验组的反应度值
[0118]
[0119] 从表2的结果可以看出，根据实验组2a～2f的定标结果比较，加入NHS的实验组(2b、2d、2f)比不添加NHS的实验组(2a、2c、2e)的反应度大，说明使用NHS可提高磷酸化VASP抗体与胶乳的交联效率。
[0120] 根据实验组2b、实验组2d、实验组2f的定标结果比较，结果无明显的差异，主要是由于在交联过程中离心去除多余的EDC和NHS。
[0121] 同时实验组2b、实验组2d、实验组2f提供的试剂R2分别在37摄氏度老化7天，然后利用老化处理后的试剂R2测定磷酸化VASP蛋白重组抗原标准品的浓度。即以磷酸化VASP蛋白重组抗原作为标准品，分别配制系列浓度为0ng/L，200ng/L，400ng/L，600ng/L，800ng/L和1000ng/L，然后利用实验组2b、实验组2d、实验组2f提供的试剂R1以及经过老化处理后的各试剂盒中的相应试剂R2测定这些不同浓度的标准品，得到各标准品的测定浓度，平行测定三次获得均值，来测定各实验组试剂R2的稳定性。
[0122] 测定方法为：将磷酸化VASP蛋白重组抗原和试剂盒中的试剂R1混合后在37摄氏度孵育5分钟后，在540纳米波长下读取吸光度A1，然后再加入一定体积试剂R2(经老化处理后的)，在37摄氏度孵育5分钟后，在540纳米波长下读取吸光度A2，然后根据吸光度的差值计算磷酸化VASP蛋白重组抗原的浓度。然后以标准品浓度作为自变量，以计算得到的磷酸化VASP蛋白重组抗原的浓度作为因变量，计算相关系数。
[0123] 其结果如下：
[0124] 表3各实验组测定值
[0125]
[0126] 从表3给出的结果可以看出，将实验组2b、实验组2d和实验组2f的试剂R2置于37℃老化7天后测定相关系数，结果显示实验组2f的试剂R2在老化处理后，所测定的相关系数有所下降。
[0127] 实施例3氯毗格雷疗效的体外评估
[0128] 以实施例1实验组1c所提供的试剂盒为例，使用实施例1实验组1c的试剂盒，在全自动生化分析仪(迈瑞BS-330E)上定标，测定45例经皮冠状动脉介入治疗(PCI)患者的抗凝血。从每例患者中取血液样本，然后利用实施例1实验组1c所提供的试剂盒，按照如下方法计算每个血液样本的血小板反应指数(PRI)：
[0129] 首先，分别用1.0mL去离子水复溶激活剂和抑制剂，充分溶解(例如10min)备用。
[0130] 其次，分别取一定体积(例如5.0～10.0μL)的全血样本同时加入到激活剂和抑制剂溶液中，颠倒混匀后静置5min。
[0131] 再次，分别取上述处理后的样本，加入一定体积的第一试剂(即试剂R1)中，37℃孵育5min后，在540nm波长下读取吸光度A1，再加入一定体积第二试剂(第二试剂即试剂R2，其中样本：第一试剂：第二试剂的体积比＝5：200：50)，37℃孵育5min后，在540nm波长下读取吸光度A2，根据吸光度差(ΔA＝A2-A1)分别计算磷酸化VASP蛋白浓度CPGE1和CPGE1+ADP。
[0132] 最后，根据公式计算血小板反应指数，计算公式如下：
[0133] 血小板反应指数(PRI)＝[(cPGE1-c(PGE1+ADP))/cPGE1×100％]。
[0134] 选择血小板反应指数大于60％的作为阴性率，血小板反应指数小于60％的作为阳性率。
[0135] 同时与上市产品PLT VASP/P2Y12试剂盒(生产厂家：BIOCYTEX)测定结果进行临床比对。其测定结果如下表4和表5所示。该PLT VASP/P2Y12试剂盒是利用双色流式细胞测定术，通过VASP的磷酸化状态测定，从而检测P2Y12受体的活性。
[0136] 表4各试剂盒血小板反应指数测定结果
[0137]
[0138]
[0139] 表5测定结果统计表
[0140]
[0141] 阴性符合率＝(32/34)*100％＝94.1％
[0142] 阳性符合率＝(10/11)*100％＝90.9％
[0143] 总符合率＝(32+10)/45*100％＝93.3％
[0144] 通过计算血小板反应指数，可以辅导临床医生对于药物的治疗效果进行评估。
[0145] 本文中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
[0146] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
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