一株敲除CYB2基因的酿酒酵母在制备抑制致病菌生长的产品中的应用
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; |
| 专利有效性 | 实质审查 | 当前状态 | 实质审查 |
| 申请号 | CN202310535292.8 | 申请日 | 2023-05-12 |
| 公开(公告)号 | CN118121638A | 公开(公告)日 | 2024-06-04 |
| 申请人 | 徐州医科大学; | 申请人类型 | 学校 |
| 发明人 | 李颖; 从柳; 朱作斌; 李晓; 毛珊珊; 陈超群; | 第一发明人 | 李颖 |
| 权利人 | 徐州医科大学 | 权利人类型 | 学校 |
| 当前权利人 | 徐州医科大学 | 当前权利人类型 | 学校 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：江苏省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：江苏省徐州市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：江苏省徐州市铜山路209号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：221000 |
| 主IPC国际分类 | A61K36/064 | 所有IPC国际分类 | A61K36/064 ; C12N1/16 ; A61P31/04 ; A23L33/14 ; A23L31/10 ; A23K10/18 ; C12R1/865 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 10 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 北京淮海知识产权代理事务所 | 专利代理人 | 李妮; |
| 摘要 | 一株敲除CYB2基因的酿酒 酵母 在制备抑制致病菌生长的产品中的应用， 酿酒酵母 缺失了核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的CYB2基因。本 发明 对酿酒酵母基因敲除文库中以BY4743为母体菌株的单基因缺失株进行筛选和验证，确定CYB2Δ/Δ酿酒酵母具有较好的抗菌活性。当酿酒酵母中的CYB2基因缺失后，阻滞L‑乳酸降解，造成乳酸堆积，可产生抑菌效果；CYB2Δ/Δ酿酒酵母无细胞上清液在体内外均显示出广谱的抗细菌活性，尤其对耐药细菌，CYB2Δ/Δ酿酒酵母菌体与致病菌共培养时可明显抑制致病菌的增殖，且显示出低毒性。因此，CYB2Δ/Δ酿酒酵母及其 发酵 液在制备抑制致病菌生长的产品中具有较好的应用前景。 | ||
| 权利要求 | 1.一株敲除CYB2基因的酿酒酵母在制备抑制致病菌生长的产品中的应用，其特征在于，所述酿酒酵母缺失了核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的CYB2基因，酿酒酵母的母体菌株为酿酒酵母BY4743。 |
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| 说明书全文 | 一株敲除CYB2基因的酿酒酵母在制备抑制致病菌生长的产品中的应用 技术领域背景技术[0002] 目前，细菌感染已成为全球第二大死亡原因，严重威胁人类的健康。大部分由细菌感染导致的死亡与33种常见细菌有关，其中，54.2％的死亡病例是由金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯杆菌或铜绿假单胞菌感染造成的，金黄色葡萄球菌所致死亡人数最多，其次是大肠埃希菌。 [0003] 当人体受到细菌感染时，人们往往会习惯性服用抗生素，可以在免疫反应清除感染细胞和细菌的同时，防止细菌在身体中放肆侵袭。但随着抗生素的滥用，细菌也会通过突变和获得抗生素抗性遗传元件进化出各种抵抗机制，由此产生了多重耐药性的“超级细菌”。近年来，细菌耐药现象日渐严重，给抗感染治疗带来重大挑战。《抗生素耐药性研究》显示，到2050年，预计每年因抗生素耐药性造成的死亡人数为1000万人。多黏菌素被认为是治疗多重耐药革兰氏阴性菌感染的最后一道防线，然而，我国学者于2015年首先发现质粒介导的多黏菌素耐药新基因mcr‑1，mcr‑1基因在动物肠道大肠埃希菌中携带率非常高，并在动物与人之间传播，加大了细菌感染的治疗难度。此外，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是临床上常见的毒性较强的细菌，具有广谱耐药性，对临床常用的β‑内酰胺类和头孢类抗生素均耐药。MRSA还可通过改变抗生素作用靶位，产生修饰酶，对氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、氟喹诺酮类、磺胺类、利福平等抗生素均产生不同程度的耐药，治疗极其棘手。因此，迫切需要开发新颖、天然和有效的药物来对抗细菌感染。 [0004] 益生菌是指“给予足够数量后能够对宿主产生有益作用的活的微生物”。近年来，越来越多的研究表明，益生菌可以在肠道健康、免疫发育、营养代谢、情绪管理、肝脏疾病、口腔疾病、妇科疾病以及皮肤健康这些方面发挥其益生功效。一些肠道益生菌能够通过抑制致病菌增殖、增强肠道屏障、调节肠道菌群、合成活性代谢产物等途径，发挥益生作用。目前被广泛承认的益生菌主要有乳酸菌，非致病性大肠埃希菌、芽孢杆菌、肠球菌和酵母菌等，它们大多来源于肠道或发酵食品。与细菌相比，酵母体积较大，对抗生素抵抗力更强。 [0005] 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，隶属于半知菌亚门，芽孢菌纲，隐球酵母目，隐球酵母科，酵母属，也称啤酒酵母或芽殖酵母(budding yeast)，因其具有单细胞、繁殖快、有单倍体和双倍体两种状态存在等优点，是真核模式生物。酿酒酵母全基因组的测序完成及对其基因组和蛋白组学的研究探索，为其他真核生物尤其是高等生物及人类的基因组结构和功能的研究和探索提供了基础，尤其是为人类疾病的研究提供了模型。但是目前对于酿酒酵母中哪些基因改变能够抑制细菌生长并不明确，无法有针对性对酿酒酵母进行基因改造来产生抗菌效果。 发明内容[0006] 本发明的目的是提供一株敲除CYB2基因的酿酒酵母在制备抑制致病菌生长的产品中的应用，当酿酒酵母中的CYB2被敲除后，阻滞L‑乳酸降解，造成乳酸堆积，可以产生抑菌效果。 [0007] 为实现上述目的，本发明提供了一株敲除CYB2基因的酿酒酵母在制备抑制致病菌生长的产品中的应用，所述酿酒酵母缺失了核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的CYB2基因，所述酿酒酵母的宿主为酿酒酵母BY4743。 [0008] 优选的，所述的致病菌包括普通药物敏感细菌和耐药菌。 [0009] 优选的，所述耐药菌包括携带多粘菌素耐药基因mcr‑1的大肠埃希菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA、铜绿假单胞菌耐药菌株、肺炎克雷伯杆菌耐药菌株、鲍曼不动杆菌耐药菌株。 [0010] 优选的，所述普通药物敏感细菌包括大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌标准菌株、肺炎克雷伯杆菌、伤寒沙门氏菌。 [0011] 优选的，所述产品用于升高无细胞上清液中的乳酸含量，降低pH值。 [0012] 优选的，所述产品用于抑制大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的增殖和对固体表面的粘附能力。 [0013] 优选的，所述产品用于抑制大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌生物膜的形成。 [0014] 优选的，所述的产品为发酵食品、保健食品、日化用品、饲料添加剂、益生菌制剂、药物中的一种。 [0015] 本发明还提供一种抑制致病菌生长的的药物制剂，包括(1)有效量的作为活性成分的敲除CYB2基因的酿酒酵母，(2)选择性的药学上可接受的载体。 [0016] 优选的，所述药物剂型为胶囊剂、片剂、散剂、口服液、丸剂、酊剂、糖浆剂或注射剂。 [0017] 在本发明的一种实施方式中，所述CYB2基因编码L‑乳酸‑细胞色素c氧化还原酶，在乳酸代谢中将乳酸还原为丙酮酸。CYB2基因缺失后，阻滞L‑乳酸降解，造成乳酸堆积，从而产生较好的抑菌效果。 [0018] 本发明是以从美国Invitrogen Inc公司购买的酿酒酵母双倍体单基因缺失菌株文库出发，对该文库中以BY4743为母菌株的4600多个单基因缺失株进行96孔板液体培养大规模筛选：在添加携带多粘菌素耐药基因mcr‑1的大肠埃希菌、大肠埃希菌标准菌株ATCC25922、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC29213的LB肉汤培养基上对菌株培养24h进行筛选，得到了一种具有较好抗菌活性的基因缺失菌株，说明缺失该基因后，酿酒酵母具有较好的抗菌效果。 [0019] 本发明的有益效果在于： [0020] (1)本发明中CYB2基因缺失会影响酿酒酵母中乳酸的代谢过程，影响活性代谢产物乳酸的含量；具体为阻滞乳酸降解，使无细胞上清液(CFS)中乳酸含量升高，pH降低； [0021] (2)本发明筛选出的CYB2Δ/Δ酿酒酵母CFS具有较好的抑菌活性，不仅能够抑制大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的增殖和对固体表面的粘附能力，还能够抑制其的致病性； [0022] (3)生物膜是细菌重要的毒力因子，与细菌的致病性密切相关；本发明筛选出的CYB2Δ/Δ酿酒酵母CFS可以有效抑制大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌生物膜的形成； [0023] (4)本发明筛选出的CYB2Δ/Δ酿酒酵母菌株与大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌共培养时可以显著抑制致病菌的增殖； [0024] (5)本发明筛选出的CYB2Δ/Δ酿酒酵母CFS具有广谱抗菌活性，对临床上常见的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌及其耐药菌株均有较好的抗菌活性，因此，可从该酿酒酵母基因作为研究基础出发，进行制备抑制致病菌生长的产品研发； [0026] 图1为采用最小抑菌浓度(MIC)法测定不同剂量的CYB2Δ/Δ酿酒酵母无细胞上清液处理后指示菌的生长率图； [0027] 图2为CYB2Δ/Δ酿酒酵母无细胞上清液处理下各指示菌的生长曲线；(A)携带多粘菌素耐药基因mcr‑1的大肠埃希菌；(B)大肠埃希菌ATCC25922；(C)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)；(D)金黄色葡萄球菌ATCC29213；(A)到(D)中的结果以平均值±SDs表示； [0028] 图3为CYB2Δ/Δ酿酒酵母无细胞上清液处理下各指示菌的生物膜形成情况统计图；(A)携带多粘菌素耐药基因mcr‑1的大肠埃希菌；(B)大肠埃希菌ATCC25922；(C)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)；(D)金黄色葡萄球菌ATCC29213；(A)到(D)中的结果以平均值±SDs表示； [0029] 图4为通过CFU测定CYB2Δ/Δ酿酒酵母与指示菌共培养时对指示菌活菌数的示意图；(A)CYB2Δ/Δ酿酒酵母与大肠埃希菌ATCC25922；(B)CYB2Δ/Δ酿酒酵母与金黄色葡萄球菌ATCC29213；(A)、(B)中的结果以平均值±SDs表示； [0030] 图5为大蜡暝‑大肠埃希菌模型中大蜡暝幼虫的生存曲线；(A)无细胞上清液可延长被大肠埃希菌感染的蜡暝的存活时间；(B)CYB2Δ/Δ酿酒酵母可延长被大肠埃希菌感染的蜡暝的存活时间； [0031] 以上附图中，*表示具有统计学意义的差异(*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001)。 具体实施方式[0032] 以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。 [0033] 以下实施例中涉及的供试指示菌：来自实验室保藏的革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌。 [0034] 表1试验所用菌株 [0035] [0036] 实施例1：96孔板初筛 [0037] (1)准备无细胞上清液(CFS)：‑80℃冻存的酿酒酵母单基因缺失株和BY4743母菌株在平板上划线接种，30℃静置培养24h；分别挑取单克隆接种到5mL YPD肉汤中，于30℃、200rpm振荡培养16h，培养后，于4℃下4000×g离心12min；上清液经注射器过滤器(孔径为 0.22μm)过滤，用pH计分别测量CFS的pH值后，‑80℃保存备用，其中BY4743母菌株的CFS作为对照。 [0038] YPD培养基组成：1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖；若制固体培养基，加入2％琼脂粉。 [0039] (2)选取携带多粘菌素耐药基因mcr‑1的大肠埃希菌、大肠埃希菌ATCC25922、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、金黄色葡萄球菌ATCC29213为指示菌株，指示菌株过夜培养8 到指数生长期，用LB肉汤将菌液稀释到1×10cells/mL； [0040] (3)向96孔板每个孔中加入90μL的CFS，加入10μL稀释后的菌悬液；实验组为缺失株的CFS加各种指示菌株的菌悬液(CFS+mcr‑1、CFS+ATCC25922、CFS+MRSA、CFS+ATCC29213)；对照组为BY4743的CFS加各种指示菌株的菌悬液；每个组均设置三个重复组； [0041] (4)将96孔板放入37℃培养箱孵育24h，使用酶标仪测定在600nm处的光密度，扣除空白培养基吸光度后，以各孔OD值除以对照组OD值的比率为其生长率，以抑制率(1‑生长率)大于80％的视为有抑菌活性的菌株，发现CYB2Δ/Δ菌株有抑菌活性。 [0042] 实施例2：CFS抑菌活性测定 [0043] 采用最小抑菌浓度(MIC)法测定。MIC的检测参照依照美国临床和实验标准协会(CLSI)制定的微量肉汤稀释法，具体步骤为： [0044] 本实施例使用大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌作为指示菌来评估CFS的抑菌活性。选取携带有多粘菌素耐药基因mcr‑1的大肠埃希菌、大肠埃希菌ATCC25922、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、金黄色葡萄球菌ATCC29213为指示菌株。 [0045] 依照美国临床和实验标准协会(CLSI)制定的微量肉汤稀释法，将生长到指数生长期的指示菌株用LB肉汤培养基稀释，然后在96孔板各列的A孔中加入200μL CYB2Δ/Δ酿酒酵母菌株CFS、在B至H孔中各加入100μL一种指示菌株菌液。接着从A孔开始用倍比稀释法稀6 释孔内菌液，使每孔的体积最终均为100μL，使菌液终浓度为1×10cells/mL，H孔不加CFS作为阴性对照。然后将96孔板置于35℃恒温培养箱静置培养24h。肉眼观察未见真菌生长的最小药物浓度，或者能够抑制80％真菌细胞生长的最低浓度为MIC值。 [0046] 如图1所示，CYB2Δ/Δ酿酒酵母菌株的CFS具有较好的抑菌活性，对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌生长的最大抑制率可达到97％。同时可以观察到，随着CFS添加量的减少，抗菌活性逐渐降低，可能是由于抗菌活性物质减少。 [0047] 实施例3：超高效液相色谱‑串联质谱(UPLC‑MS/MS)检测CFS中乳酸的含量[0048] 代谢物提取：将CYB2Δ/Δ酿酒酵母CFS、BY4743母菌株CFS和YPD肉汤培养基从冰柜取出置4℃冰箱解冻后，取各待测样本5μL上清液至离心管中，加入配置好的衍生化试剂2‑氨甲基吡啶(CAS号：3731‑51‑9)35μL和缩合剂O‑(7‑氮苯并三氮唑)‑N,N,N,N‑四甲基脲六氟磷酸酯(CAS号：148893‑10‑1)35μL；涡旋混匀20min后，紧接着加入100μL PBS和300μL甲基叔丁基醚，盖紧离心管盖后涡旋10min；涡旋结束后紧接着将离心管放置离心机中4℃ 6000rpm离心5min；小心地取出50μL上清于新的离心管中，然后将装有上清液的离心管放到真空浓缩仪中，40℃离心浓缩约20min；随后向挥干干燥的离心管中加入100μL10％乙腈水复溶液复溶；涡旋5min后，紧接着4℃12000rpm离心15min，然后小心地取出40μL上清转移至进样小瓶中，待测。 [0049] 标准曲线制作：标准品工作曲线的每一个点取5μL上清液(乙腈配置成2mL的标准品储备液)至新的离心管中，加入配置好的衍生化试剂2‑氨甲基吡啶(CAS号：3731‑51‑9)35μL和缩合剂O‑(7‑氮苯并三氮唑)‑N,N,N,N‑四甲基脲六氟磷酸酯(CAS号：148893‑10‑1)35μL；涡旋混匀20min后，紧接着加入100μL PBS和300μL甲基叔丁基醚，盖紧离心管盖后涡旋10min；涡旋结束后紧接着将离心管放置离心机中4℃6000rpm离心5min；小心地取出50μL上清于新的离心管中，然后将装有上清液的离心管放到真空浓缩仪中40℃离心浓缩，约20分钟；随后向挥干干燥的离心管中加入100μL 10％乙腈水复溶液复溶；涡旋5分钟后，紧接着4℃12000rpm离心15分钟，然后小心地取出80μL上清转移至进样小瓶中。对校准溶液进行LC‑MS/MS分析。y表示目标化合物的峰面积，x表示目标化合物的浓度(ng/mL)。采用最小二乘法进行线性回归，权重设为无时，校准溶液回收率(accuracy)和线性系数(R2)最好且R和R2均大于0.99。若某一校准浓度信噪比(S/N)接近或小于10，则将该浓度校准点排除。最终的校准曲线，最少5个校准点。 [0050] CYB2Δ/Δ酿酒酵母菌株是将BY4743母菌株的CYB2基因敲除，该基因与乳酸代谢相关，因此本实施例使用UPLC‑MS/MS检测了CYB2Δ/Δ酿酒酵母CFS、BY4743母菌株CFS和YPD肉汤中的乳酸含量。如表2所示，相比较野生型酿酒酵母BY4743，CYB2Δ/Δ酿酒酵母CFS中的乳酸含量约是其的20倍，乳酸能够降低CFS的pH，使环境处于酸性条件，不利于对革兰氏阳性和阴性菌的生长。 [0051] 表2CFS的pH值及乳酸含量 [0052] [0053] 实施例4：生长曲线 [0054] 选取携带有多粘菌素耐药基因mcr‑1的大肠埃希菌、大肠埃希菌ATCC25922、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、金黄色葡萄球菌ATCC29213为指示菌株。 [0055] (1)将过夜活化的指示菌株菌液用LB肉汤培养基分别稀释到相应的浓度； [0056] (2)将稀释后的指示菌株菌液、CFS、YPD肉汤和无菌水同时添加到10mLEP管中，保证最终比例为90％CFS、50％CFS、25％CFS，以不含CFS组为阴性对照，以含无菌水的为空白对照； [0057] (3)用酶标仪测定原始在600nm处的吸光度后，37℃恒温，200rpm振荡培养； [0058] (4)每隔2h取样100μL，使用酶标仪测定在600nm处的吸光度，每个组均设置三个重复组； [0059] (5)记录数值，绘制生长曲线。 [0060] 如图2所示，与阴性对照组相比，CYB2Δ/Δ酿酒酵母菌株的CFS可以显著抑制指示菌株的生长并且有剂量依赖性；90％CFS可以完全抑制大肠埃希菌的生长，对金黄色葡萄球菌的抑制率均高于85％。此外，本实施例还设置了空白对照组，用无菌水代替了YPD肉汤，以考察营养差异对实验组的影响。空白对照(代表最小附加营养量)和YPD肉汤对照(代表最大附加营养量)之间指示菌的生长差异不显著，表明指示菌培养物中营养丰富，因此营养耗竭不是导致生长变化的一个因素。 [0061] 实施例5：生物膜抑制试验 [0062] 通过结晶紫(CV)法研究CFS对生物膜的抑制。选取携带有多粘菌素耐药基因mcr‑1的大肠埃希菌、大肠埃希菌ATCC25922、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、金黄色葡萄球菌ATCC29213为指示菌株。 [0063] (1)分别将90％CFS、50％CFS、25％CFS处理过得细菌悬液100μL转移到96孔板上，37℃培养24h；对照组用YPD肉汤处理； [0064] (2)培养结束后，取出96孔板，去除细胞悬液，用150μL无菌蒸馏水洗涤两次，生物膜细胞在37℃干燥30min； [0065] (3)取出96孔板，用200μL无水乙醇固定生物膜细胞20min，然后37℃干燥； [0066] (4)用0.1％150μL结晶紫(CV)溶液染色30min；除去CV溶液，用无菌蒸馏水洗涤2次将多余的CV洗去； [0067] (5)37℃干燥，用150μL溶解液(30％甲醇和10％醋酸)处理生物膜细胞；使用酶标仪测定在595nm处的吸光度，每个组均设置三个重复组。 [0068] 生物被膜能使致病菌拥有耐药性和免疫逃逸能力，因此生物被膜的形成也是致病菌的重要毒力因子。采用结晶紫染色法测定96孔板中含不同添加量CFS的培养基中生物被膜生物量。如图3所示，随着CYB2Δ/Δ酿酒酵母菌株的CFS添加量的增加，抑制生物被膜能力逐渐增强，表现出剂量依赖性，并且对大肠埃希菌的抑制作用强于金黄色葡萄球菌。当添加量为50％时，抑制率接近50％，添加量为90％时，抑制率达到85％以上。 [0069] 实施例6：CFS抑菌谱测定 [0070] 通过MIC法测定CFS对几种常见细菌抗菌活性，结果如表3所示：CFS对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌均具有明显的抑制作用，同时，CFS的pH值降低(表2)，酸性环境也不利于细菌生长。 [0071] 表3CYB2Δ/Δ酿酒酵母菌株无细胞上清液的抑菌谱 [0072] [0073] 实施例7：CYB2Δ/Δ酿酒酵母与指示菌株共培养实验 [0074] 在特定时间取样，然后用点板计数的方法测定CYB2Δ/Δ酿酒酵母菌体对指示菌株的影响。选取大肠埃希菌ATCC25922、金黄色葡萄球ATCC29213为指示菌株。 [0075] 将过夜培养的酿酒酵母和指示菌株的细胞用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤2次，分别7 用YPD和LB肉汤培养基稀释至1×10 cells/mL。将酿酒酵母和指示菌以1：1的浓度比例混合，各1mL，作为共培养组；指示菌培养物与YPD肉汤各1mL混合，作为指示菌单培养组；指示菌培养物与无菌水各1mL混合，作为指示菌空白对照组。3个实验组在37℃恒温，200rpm振荡培养。 [0076] 每隔4h取样，10倍梯度稀释，取2μL稀释液点在添加10μg/mL两性霉素B的LB固体平板上，每个组均设置三个重复组。将点有菌液的平板置于37℃静置培养24h以上，直至长出单克隆菌落。记录平板中长出的菌落数，计算原始菌液的活菌数，并且绘图。 [0077] 本实施例探讨了CYB2Δ/Δ酿酒酵母与致病菌之间是否存在菌体之间接触性抑制。试验结果如图4，通过CFU计数来评估培养16h和24h后的致病菌的细胞数量，与致病菌单培养组相比，酿酒酵母和致病菌共培养组致病菌的存活数量显著减少，说明酿酒酵母可以显著抑制致病菌的生长。另外，用无菌水代替了YPD肉汤作为空白对照组，以考察营养差异对实验组的影响。空白对照(代表最小附加营养量)和YPD肉汤对照(代表最大附加营养量)之间指示菌的生长差异不显著(P＞0.05)，表明指示菌培养物中营养丰富，因此营养耗竭不是导致生长变化的一个因素。 [0078] 实施例8：大蜡暝‑大肠埃希菌感染模型 [0080] (2)将酿酒酵母接种到5mL YPD肉汤中，于30℃、200rpm振荡培养16h；去除上清，收集酿酒酵母菌体，PBS洗涤3次并重新悬浮；取一管酿酒酵母菌体于121℃高压灭菌15min，PBS洗涤3次并重新悬浮； [0081] (3)将过夜孵育的大肠埃希菌用PBS稀释至1×108cells/mL；将活的和灭菌后的酿4 酒酵母用PBS稀释至1×10 cells/mL；设置PBS组、大肠埃希菌组、CFS组、酿酒酵母(活菌)组、酿酒酵母(热灭活)组、CFS+大肠埃希菌组、酿酒酵母(活菌)+大肠埃希菌组、酿酒酵母(热灭活)+大肠埃希菌组，酿酒酵母(活菌)预处理组，将所有组用微量注射器对蜡暝进行血腔内注射(10μL)，每组10只蜡暝幼虫； [0082] (4)将注射后的大蜡暝幼虫放入干净的培养皿中于37℃、黑暗培养，每天记录幼虫的存活数和死亡数。 [0083] 本实施例通过建立大蜡暝‑大肠埃希菌感染模型来探究CYB2Δ/Δ酿酒酵母在体内对大肠埃希菌感染的治疗效果。经过每天观察并记录感染蜡螟的生存状态发现，用PBS或灭活的酿酒酵母菌处理的大肠埃希菌感染后的蜡暝幼虫在48h内全部死亡。从图5A中可观察到，CYB2Δ/Δ酿酒酵母CFS可明显降低大肠埃希菌的致病性，延长感染大肠埃希菌蜡暝的存活时间(P＜0.05)，并且单独注射CFS不会导致大蜡螟死亡。 [0084] 此外，将活的酿酒酵母、热灭活的酿酒酵母和活的酿酒酵母处理的大肠埃希菌注射进蜡暝血腔内，结果表明酿酒酵母本身不会导致大蜡螟死亡且可以延长感染大肠埃希菌蜡暝的存活时间(P＜0.05)。另外，预先将活的酿酒酵母注射进蜡暝，37℃培养2h后再注射大肠埃希菌，可以观察到蜡暝的死亡率降低，存活时间延长(图5B)。 |
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