| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 实质审查; |
| 专利有效性 | 实质审查 | 当前状态 | 实质审查 |
| 申请号 | CN202411950001.2 | 申请日 | 2024-12-27 |
| 公开(公告)号 | CN119868623A | 公开(公告)日 | 2025-04-25 |
| 申请人 | 大连民族大学; | 申请人类型 | 学校 |
| 发明人 | 刘裕; 姚子昂; 韩琳; 胡冰; 曹际娟; 彭鑫; 王一冰; | 第一发明人 | 刘裕 |
| 权利人 | 大连民族大学 | 权利人类型 | 学校 |
| 当前权利人 | 大连民族大学 | 当前权利人类型 | 学校 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：辽宁省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：辽宁省大连市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：辽宁省大连市经济技术开发区辽河西路18号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：116600 |
| 主IPC国际分类 | A61L15/40 | 所有IPC国际分类 | A61L15/40 ; A61L15/32 ; A61L15/42 ; A61L15/44 ; A61L15/64 ; A61L27/36 ; A61L27/22 ; A61L27/54 ; A61L27/56 ; A61L27/58 ; A61L27/60 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 10 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 大连智高专利事务所 | 专利代理人 | 祝诗洋; |
| 摘要 | 本 发明 涉及 生物 医药技术领域，公开了一种基于方格星虫体壁仿生 皮肤 敷料 的制备方法和应用。本发明选取方格星虫作为仿生皮肤敷料基质，对方格星虫进行处理与加工制备出仿生皮肤敷料。该仿生皮肤敷料由蛋白 纤维 丝规则交错形成，具有均一的多孔结构，增加敷料与伤口的 接触 表面积的同时具有较强的机械性能；与传统伤口敷料相比，本发明的伤口敷料具有较高的透气性，能通过 水 分的 蒸发 使伤口 温度 降低，减少 疼痛 感；同时具有良好的黏附性、抗 氧 化等功能，可以促进伤口快速愈合；具有较低的细胞毒性、良好的 生物相容性 ；并且符合国家安全标准的溶血率，可快速富集血液形成凝血 支点 ，在皮肤组织修复、皮肤再生、皮肤类器官等领域具有良好的应用前景。 | ||
| 权利要求 | 1.一种基于方格星虫体壁仿生皮肤敷料，其特征在于，通过对方格星虫体壁进行处理，制备出蛋白纤维丝规则交错、具有均一多孔的体壁结构，得到能够促进皮肤创伤修复的仿生皮肤敷料。 |
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| 说明书全文 | 一种基于方格星虫体壁仿生皮肤敷料的制备方法和应用技术领域背景技术[0002] 根据世界卫生组织(WHO)不完全统计，全球每年有数百万人因割伤、擦伤、磨损、撕裂、刺伤等各种原因导致皮肤受到创伤需要进行药物和敷料治疗，在大面积创伤治疗中，皮肤移植是选择之一，但是皮肤移植供体来源有限、移植之后皮肤功能会受到损伤，因此创伤后的治疗是一个急需解决的问题。 [0003] 皮肤不仅是人体最大的器官，保护身体内部的组织和器官免受外界物理因素的伤害，而且是人体免疫系统的第一道防线，能分泌一些抗菌物质，形成天然的抗菌环境，减少病原体在皮肤表面的定植和感染的机会。但皮肤较为脆弱，极易受到损伤。皮肤破损后，外界的病原体容易侵入人体，引起局部的炎症反应，如红肿、疼痛、发热等。如果伤口感染得不到及时控制，感染则会扩散到更深层的组织和器官，引发更严重的疾病。伤口愈合是人身体自然的生理反应，通常分为四个主要阶段：凝血和炎症、新生组织形成、上皮细胞再生、瘢痕形成。整个愈合过程可能需要几个星期或数月，一个健康的身体和适当的处理会提高伤口愈合的速度并减少并发症的发生。 [0004] 敷料是一种覆盖在伤口表面对伤口进行保护和促进修复的材料，可以降低物理刺激对伤口造成二次影响、吸收伤口渗出的血液和渗出液保持伤口及周围组织干燥清洁、降低伤口感染风险、对伤口愈合进行促进作用、提供舒适性和保护、减少疼痛和不适感。目前存在的伤口敷料主要是用于包扎和覆盖伤口的材料。在目前已有的相关文献专利中，通常是利用改性合成的方法来提高材料的生物相容性或者提高敷料促进伤口愈合的速率，一般所采用的形式为水凝胶(CN115869459B)或者纤维材料(CN106120327B)等。水凝胶敷料或纤维材料大多采用天然高分子材料，通过氢键作用、离子交联、共价交联等方式相互连接形成三维网状结构，生物相容性较差；多种材料不含活性成分，与生物体交互作用较弱；通过高分子材料合成的伤口敷料结构和生物性质不同于人体皮肤，对皮肤修复的引导作用弱；并且水凝胶、纤维材料等伤口敷料制备过程复杂、一些新型敷料有特殊的使用方法、材料的选择可能会引起过敏或者不适感等。因此，构建一种具有天然三维网络结构、具有高生物相容性、与皮肤结构高度相似、具有活性成分的仿生皮肤敷料具有重要意义。 [0005] 方格星虫，又名光裸星虫，俗称“沙虫”、“沙肠子”等，属星虫动物门、星虫纲、方格星虫目，属于海洋无脊椎动物，是海洋渔业资源中具有重要价值的生物资源之一。方格星虫的营养成分有多糖、多肽、蛋白质、矿物质、脂肪酸和微量元素等，具有抗氧化、降血压、免疫调节、抗菌促愈合、促骨形成等生物活性。在方格星虫中含有超过80％的蛋白质，对肌肉、组织生长和修复具有重要作用。 [0006] 方格星虫体壁由蛋白纤维丝规则交错形成，具有均一的多孔网状结构，具有较强的机械性能，与哺乳动物皮肤具有相似功能；均一的多孔结构使其具有较高的透气性，能通过水分的蒸发使伤口温度降低，减少疼痛感；同时具有良好的具有良好的黏附性、抗氧化等功能，可以促进伤口快速愈合；具有较低的细胞毒性、良好的生物相容性；并且具有国家安全标准的溶血率，可快速富集血液形成凝血支点；天然的三维网状结构可以使细胞很好的与体壁融为一体，促进细胞的生长；在皮肤组织修复、皮肤再生领域、皮肤类器官构建等领域具有良好的应用前景。本发明结合方格星虫体壁良好的生物特性制备了方格星虫体壁仿生皮肤敷料，目前尚未有以该原料为制备基础制备的伤口敷料。 发明内容[0007] 本发明的目的是基于海洋生物天然体壁的特殊空间结构和生物活性物质，提供一种基于方格星虫体壁仿生皮肤敷料的伤口敷料，以解决皮肤修复过程中的难题。针对目前伤口敷料生物相容性差、与生物体交互作用弱、引导修复作用差等不足，本发明提供了一种方格星虫体壁仿生皮肤敷料，解决了传统敷料复杂的三维结构构建工艺、透气性差、缺乏生物活性成分、具有一定的细胞毒性、使用方法繁琐等问题。 [0008] 本发明利用方格星虫体壁天然的三维网络结构、良好的黏附性、较好的透气性、较好的延展性、较好的吸水溶胀性和降解性、良好的溶血性和凝血性、良好的生物相容性、良好的细胞贴附性、促进细胞的生长等优点，采用活性炭除色素、生物酶脱脂、超声波脱内毒素、超临界二氧化碳干燥等方法制备方格星虫体壁仿生皮肤敷料。在促进伤口愈合、医用消炎敷料、细胞培养支架、皮肤组织再生修复、皮肤类器官构建等研究领域具有广阔的应用前景。 [0009] 为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了一种方格星虫体壁仿生皮肤敷料的制备方法，包括以下步骤： [0010] S1.将方格星虫干用去离子水清洗，清洗掉表面杂质；处理好的样品在去离子水中浸泡，使方格星虫干充分吸水膨胀； [0011] S2.将S1处理好的样品去除表面纤维，得到平整光滑的材料； [0012] S3.将S2处理好的样品采用活性炭除色素法，除去体壁残存色素； [0013] S4.将S3处理好的样品采用生物酶脱脂法，除去体壁部分脂质； [0014] S5.将S4处理好的样品采用超声波脱内毒素法，除去体壁残留内毒素； [0015] S6.将S5处理好的样品用去离子水及PBS进行清洗；用戊二醛进行样品固定； [0016] S7.将S6处理好的样品采用超临界二氧化碳干燥法进行干燥；得到材料备用，命名为方格星虫体壁仿生皮肤敷料。 [0017] 可选地，步骤S1的具体步骤为：将从广西北海购买的方格星虫干用去离子水清洗2～3次，清洗至溶液为无色透明；清洗过后的方格星虫在去离子水中浸泡30min，换水，重复2～3次。 [0018] 可选地，步骤S2的具体步骤为：充分浸泡后的方格星虫体壁材料，借助刮刀等工具去除表面凸起纤维，在0.5％～2％的木瓜蛋白酶中浸泡2～6h，至方格星虫敷料厚度为0.3～0.5mm。 [0019] 可选地，步骤S3的具体步骤为：准备0.3～0.5g的活性炭粉末，将10g含有色素的固体组织放入一个合适的容器中，加入适量的去离子水，制成溶液。向其中加入准备好的活性炭粉末，搅拌均匀，搅拌速度适中，大约每分钟30～50转，持续搅拌30～60分钟，使活性炭与色素充分接触。搅拌结束后，使用如滤纸过滤，将体壁和活性炭分离，即可得到色素减少的方格星虫体壁。 [0020] 可选地，步骤S4的具体步骤为：将脂肪酶用缓冲液(磷酸盐缓冲液，pH＝7.4)配制成0.1～1％浓度的酶液。将处理后的方格星虫体壁放入容器中，加入酶液，酶液的体积一般是样品体积的2～4倍。然后在37℃下进行反应，同时适当搅拌，搅拌速度在80～150转/分钟，反应时间在0.5～2小时之间。反应结束后，通过过滤将液体部分与体壁分离，得到脱脂样品。 [0021] 可选地，步骤S5的具体步骤为：将方格星虫体壁置于含有磷酸盐缓冲液的容器中，放入超声波清洗器中。设置超声功率在200～220W，处理时间为15～30分钟，使部分内毒素从体壁脱离进入缓冲液中，之后通过更换缓冲液等方式将含有内毒素的液体除去。 [0022] 可选地，步骤S6的具体步骤为：处理好的样品用0.1～0.2M、pH为7.4的PBS进行冲洗，重复2～3次，将冲洗干净的材料在紫外灯下照射杀菌，正反面各1～3h。 [0023] 可选地，步骤S7的具体步骤为：将灭菌后的方格星虫体壁浸泡在2～5％的戊二醛溶液中，4℃下固定4～6小时。将固定好的方格星虫体壁转移到乙醇中，浸泡时间2～4小时，确保样品内部的有机溶剂被充分置换。进行超临界二氧化碳干燥，后取出样品，得到方格星虫体壁仿生皮肤敷料。 [0025] 本发明第三个目的是，请求保护上述方格星虫体壁仿生皮肤敷料的应用，特别是在制备伤口敷料、促进皮肤组织修复再生、类器官等材料中应用。 [0026] 本发明的技术方案中，提出一种方格星虫体壁仿生皮肤敷料，包括方格星虫体壁及所含提取物，所述方格星虫体壁具有天然的三维网络结构、良好的黏附性、较好的透气性、较好的延展性、较好的吸水溶胀性和降解性、良好的溶血性和凝血性、良好的生物相容性、良好的细胞贴附性、支持细胞三维培养、促进细胞的生长、抗炎促愈合等优点。 [0027] 与现有技术相比，本发明的有益效果：本发明制备的基于方格星虫体壁的仿生皮肤敷料由蛋白纤维丝规则交错形成，具有均一的多孔结构，增加敷料与伤口的接触表面积的同时具有较强的机械性能；与传统伤口敷料相比，本发明制备的伤口敷料具有较高的透气性，能通过水分的蒸发使伤口温度降低，减少疼痛感；同时具有良好的黏附性、抗氧化等功能，可以促进伤口快速愈合；具有较低的细胞毒性、良好的生物相容性；并且符合国家安全标准的溶血率，可快速富集血液形成凝血支点，在皮肤组织修复、皮肤再生、皮肤类器官等领域具有良好的应用前景。 附图说明 [0028] 为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，所描述的附图仅仅是发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。 [0030] 图2是实施例方格星虫体壁仿生皮肤敷料所得透气性图； [0031] 图3是实施例方格星虫体壁仿生皮肤敷料所得抗氧化性图； [0032] 图4是实施例方格星虫体壁仿生皮肤敷料所得血液相容性图； [0033] 图5是实施例方格星虫体壁仿生皮肤敷料所得凝血性图； [0034] 图6是实施例方格星虫体壁仿生皮肤敷料对RAW264.7细胞活性影响示意图； [0035] 图7是实施例RAW264.7细胞在方格星虫体壁仿生皮肤敷料上的生长。 [0036] 本发明目的的实现及特点将结合实施例，参照附图做进一步说明。 具体实施方式[0037] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。 [0038] 实施例中使用到的药品及试剂：方格星虫(购自于广西北海)；ABTS；过硫酸钾；DPPH；无水乙醇；硫酸亚铁；水杨酸；30％H2O2；MTT；DMSO；磷酸二氢钠；磷酸氢二钠；氢氧化钠；无水氯化钙；DMEM；胎牛血清；双抗；25％戊二醛；活性炭粉；脂肪酶；去离子水等。 [0039] 实施例中使用的试验设备明细如下： [0040] 为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的发明技术，下面将结合附图对本发明作进一步的详细介绍。 [0041] 如图1‑7所示，本发明实施例提供一种技术方案：一种方格星虫体壁仿生皮肤敷料，由蛋白纤维丝规则交错形成，具有均一的多孔结构，具有较高的透气性，具有良好的具有良好的黏附性、抗氧化等功能，具有较低的细胞毒性、良好的生物相容性；并且具有国家安全标准的溶血率等。 [0042] 一种方格星虫体壁仿生皮肤敷料的制备方法，包括如下步骤： [0043] S1.将方格星虫用去离子水清洗，清洗掉表面杂质；处理好的样品在去离子水中浸泡，使方格星虫干吸水膨胀； [0044] S2.将S1处理好的样品去除表面纤维，得到平整光滑的材料； [0045] S3.将S2处理好的样品采用活性炭除色素法，除去体壁残存色素； [0046] S4.将S3处理好的样品采用生物酶脱脂法，除去体壁部分脂质； [0047] S5.将S4处理好的样品采用超声波脱内毒素法，除去体壁残留内毒素； [0048] S6.将S5处理好的样品用去离子水及PBS进行清洗；用戊二醛进行样品固定； [0049] S7.将S6处理好的样品采用超临界二氧化碳干燥法进行干燥；得到材料备用，命名为方格星虫体壁仿生皮肤敷料。 [0050] 实施例1 [0051] 方格星虫体壁仿生皮肤敷料的制备 [0052] 将从广西北海购买的方格星虫用去离子水清洗2～3次，清洗至溶液为无色透明；清洗过后的方格星虫在去离子水中浸泡30min，换水，重复2～3次。充分浸泡后的方格星虫体壁材料，借助刮刀等工具去除表面凸起纤维，至方格星虫敷料厚度为0.5mm。准备0.3～ 0.5g的活性炭粉末，将10g含有色素的固体组织放入一个合适的容器中，加入适量的去离子水，制成溶液。向其中加入准备好的活性炭粉末，搅拌均匀，搅拌速度适中，大约每分钟30‑ 50转，持续搅拌30～60分钟，使活性炭与色素充分接触。搅拌结束后，使用如滤纸过滤，将体壁和活性炭分离，即可得到色素减少的方格星虫体壁。将脂肪酶用缓冲液(磷酸盐缓冲液，pH＝7.4)配制成0.5％浓度的酶液。将处理后的方格星虫体壁放入容器中，加入酶液，酶液的体积一般是样品体积的3倍。然后在37℃下进行反应，同时适当搅拌，搅拌速度在100转/分钟，反应时间在1小时之间。反应结束后，通过过滤将液体部分与体壁分离，得到脱脂样品。将方格星虫体壁置于含有磷酸盐缓冲液的容器中，放入超声波清洗器中。设置超声功率在220W，处理时间为20分钟，使部分内毒素从体壁脱离进入缓冲液中，之后通过更换缓冲液等方式将含有内毒素的液体除去。处理好的样品用0.1M、pH为7.4的PBS进行冲洗，重复2～3次，将冲洗干净的材料在紫外灯下照射杀菌，正反面各1h。将灭菌后的方格星虫体壁浸泡在 2.5％的戊二醛溶液中，4℃下固定数小时4小时。将固定好的方格星虫体壁转移到乙醇中，浸泡时间2小时，确保样品内部的有机溶剂被充分置换。进行超临界二氧化碳干燥，后取出样品，得到方格星虫体壁仿生皮肤敷料。 [0053] 实施例2 [0054] 方格星虫体壁仿生皮肤敷料光学显微镜及扫描电子显微镜观察 [0055] 将制备好的方格星虫体壁仿生皮肤敷料在光学显微镜下进行观察；干燥样品喷金，在扫描电子显微镜下拍摄观察。得到结果如附图1所示(其中，图A光学显微镜方格星虫体壁形态；图B扫描电子显微镜45×方格星虫体壁形态)。 [0056] 效果验证：参考附图1，实施例2在光学显微镜和扫描电子显微镜下均能看到清晰均一的纤维网状结构，结构完整。 [0057] 实施例3 [0058] 方格星虫体壁仿生皮肤敷料所得透气性 [0059] 根据医药行业标准YY/T047.2‑2004《接触性创面敷料实验方法第2部分：透气膜敷料水蒸气透过率》对方格星虫体壁仿生皮肤敷料的水蒸气透过率(WVTR)进行测试。在内径20mm的西林瓶中加入足量去离子水，将所制备的方格星虫体壁仿生皮肤敷料覆盖到管口，瓶中留取部分空气(5±1mm)，并用封口膜将管口壁与方格星虫体壁仿生皮肤敷料密封，对其称重，重量记作W1。之后将整个样品放置于恒温培养箱中，24h后再次称重，记作W2。每组样品重复三次，取平均值。得到结果如图2所示。计算公式如下： [0060] WVTR(g·m‑2·d‑1)＝24×(W1‑W2)/A/tA为离心管口的面积，m2；t代表时间间隔，h；W1和W2分别为样品的初始重量和样品在培养箱放置24h后的重量。 [0061] 效果验证：参考附图2，方格星虫体壁仿生皮肤敷料与传统的医用纱布相比，具有更优的透气性，可以保证通过水分的蒸发使伤口温度降低，减少疼痛感。 [0062] 实施例4 [0063] 方格星虫体壁仿生皮肤敷料所得抗氧化性 [0064] 将制备好的方格星虫体壁仿生皮肤敷料进行处理，得到方格星虫伤口敷料浸提液，即液体状态。然后进行ABTS自由基清除活性、DPPH自由基清除活性、羟自由基清除活性，结果如图3所示。 [0065] 对ABTS自由基清除活性：首先配置7mmol/L的ABTS溶液和2.457mmol/L的过硫酸钾溶液，两者按体积比1:1混合后，在避光、低温条件下反应48h，形成ABTS自由基溶液，使用前用无水乙醇稀释至734nm处吸光度为0.700±0.02。然后将方格星虫伤口敷料浸提液与ABTS溶液混合，同时设立对照空白组，将方格星虫体壁仿生皮肤敷料浸提液替换为等量去离子水。混合后置于暗处反应6min，然后在734nm波长下测定并记录吸光值，分析方格星虫体壁仿生皮肤敷料对ABTS自由基的清除能力。得到计算公式如下： [0066] ABTS清除能力(％)＝(A0‑A1)/A0×100A0空白组吸光度，A1方格星虫体壁仿生皮肤敷料浸提液处理组的吸光度 [0067] 对DPPH自由基清除活性：将DPPH溶于无水乙醇中，配制成0.04mg/mL的标准溶液。随后，将方格星虫体壁仿生皮肤敷料浸提液与DPPH溶液混合，形成反应体系；同时设立对照组，将方格星虫体壁仿生皮肤敷料浸提液替换为等量无水乙醇。另外，设置空白组以校正吸光值，采用去离子水与DPPH溶液按照1:1比例进行混合。混合后在避光条件下静置反应 30min。最后，在517nm波长处测定各组样本的吸光值，分析方格星虫体壁仿生皮肤敷料对DPPH自由基的清除能力。得到计算公式如下： [0068] DPPH清除能力(％)＝(1‑(A1‑A2)/A0)×100A0空白组吸光度，A1方格星虫体壁仿生皮肤敷料浸提液组吸光度，A2对照组吸光度[0069] 对羟自由基清除活性：将FeSO4溶解于去离子水中配制为2mmol/L的溶液，水杨酸溶于去离子水中配置成6mmol/L溶液，同时将H2O2稀释成1mmol/L的溶液。取3mL 2mmol/LFeSO4溶液、1mL 1mmol/LH2O2溶液及3mL 6mmol/L水杨酸溶液，然后加入方格星虫体壁仿生皮肤敷料浸提液进行混合。对照组则以等体积的去离子水替代方格星虫伤口敷料浸提液进行同样步骤操作。空白组的设计是为了排除方格星虫体壁仿生皮肤敷料浸提液本身对吸光度的影响。所有混合后的样品均置于37℃恒温水浴环境中反应15min，之后在510nm波长处测定各组的吸光值，分析方格星虫体壁仿生皮肤敷料对羟自由基的清除能力。得到计算公式如下： [0070] 羟自由基清除能力(％)＝(1‑(A1‑A2)/A0)×100A0空白组吸光度，A1方格星虫体壁仿生皮肤敷料浸提液组吸光度，A2对照组吸光度[0071] 效果验证：参考附图3，方格星虫体壁仿生皮肤敷料具有良好的抗氧化性，对氧自由基由清除作用，也证明了方格星虫体壁仿生皮肤敷料在抗炎方面有一定作用。 [0072] 实施例5 [0073] 方格星虫体壁仿生皮肤敷料所得体外抗菌活性将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌种于LB液体培养基中进行活化。将活化好的菌液用无菌生理盐水稀释至600nm处OD值为0.1，在96孔板中加入50μL生理盐水为空白对照、加入‑1 50μL浓度为50mg·mL 的方格星虫体壁仿生皮肤敷料浸提液为样品组，各组均加入50μL LB培养基和50μL稀释后的菌液，混匀，600nm测定吸光度，记录为0h OD值，然后放入37℃培养箱中培养8h测定一次OD值，24h测定一次OD值。结果如图4所示。分别计算抑菌率： [0074] 抑菌率(％)＝((AN空‑A0空)‑(AN样‑A0样))/A0空×100AN空是N h后空白对照的OD值，A0空是0h空白对照的OD值，AN样是Nh后方格星虫伤口敷料组的OD值，A0样是0h方格星虫伤口敷料组的OD值，其中N＝8、24，单位：h[0075] 效果验证：参考附表1，方格星虫体壁仿生皮肤敷料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用，其中对大肠杆菌具有一定长效作用。 [0076] 表1是实施例方格星虫体壁仿生皮肤敷料所得体外抗菌活性；“‑”表示无抑菌作用 [0077] 实施例6 [0078] 方格星虫体壁仿生皮肤敷料所得血液相容性 [0079] 取新鲜血液，7000rpm离心5min，收集红细胞。红细胞用PBS洗涤并制备成20％的红细胞悬液。然后加入蒸馏水、PBS、方格星虫体壁仿生皮肤敷料，然后轻轻混匀，于37℃孵育4h，7000rpm离心5min后，收集上清液，用酶标仪检测溶液在540nm处的吸光度，结果如图4所示。计算溶血率： [0080] 溶血率(％)＝(A2‑A0)/(A1‑A0)×100A0为加入PBS后的吸光度；A1为加入蒸馏水后的吸光度；A2为加入方格星虫伤口敷料浸提液后的吸光度 [0081] 效果验证：参考附图4，红细胞与去离子水孵育1h后，样品溶液呈红色，红细胞发生溶血现象；红细胞与PBS孵育1h后，样品上清呈现浅黄色，说明没有溶血现象；方格星虫体壁仿生皮肤敷料上清颜色较浅，表明发生一小部分溶血现象，但溶血率低于溶血率的临界安全范围5％。 [0082] 实施例7 [0083] 方格星虫体壁仿生皮肤敷料所得凝血性将方格星虫体壁仿生皮肤敷料裁剪成直径为14mm的圆片状，置于六孔板中并于37℃下孵育10min。然后，在样品上滴加100μL血液，随后立即滴加20μL的0.2mol/L CaCl2溶液。将含有样品与血液的六孔板置于37℃条件下孵育20min。孵育之后，在六孔板中加入 10mL去离子水，继续在37℃下孵育5min。空白对照组不放任何样品，其余实验条件相同。最后，用酶标仪测试样品溶液在540nm处的吸光度值，结果如图5所示。根据样品的吸光度值计算凝血指数(BCI)： [0084] BIC(％)＝Is/Iw×100Is为实验样品组的吸光度值；Iw为空白对照样品组的吸光度值 [0085] 效果验证：参考附图5，在样品上加入血液后，血液被样品完全吸收，表明方格星虫体壁仿生皮肤敷料具有良好的凝血性能。 [0086] 实施例8 [0087] 方格星虫体壁仿生皮肤敷料对RAW264.7细胞增殖活性影响 [0088] 将制备好的方格星虫体壁仿生皮肤敷料在紫外灯下正反照射1h，在完全培养基中浸泡24h，取出后将方格星虫伤口敷料转移至6孔板中，将RAW264.7细胞接种于含有10％FBS、1％双抗的DMEM高糖培养基，在37℃、5％CO2细胞培养箱中进行培养。取对数生长期的细胞，经过细胞计数板计数后将RAW264.7细胞接种于6孔板中，使每个孔中的细胞数约为53 ×10个。样品组设3个平行孔，空白对照组同样设3个平行孔。培养箱中孵育24h，加MTT染液(MTT终浓度为0.5mg/mL)继续培养4h，弃上清，每孔加入150μL DMSO溶液，37℃摇床震荡 15min，取上清加入96孔板中，用酶标仪在570nm处检测吸光度，结果如图6所示。计算RAW264.7细胞增殖活性： [0089] 细胞增殖活性(％)＝(A样品‑A空白)/(A对照‑A空白)×100 [0090] 效果验证：参考附图6，通过检测RAW264.7细胞与方格星虫体壁仿生皮肤敷料培养后的细胞活力来评估其细胞毒性，表明方格星虫体壁仿生皮肤敷料具有良好的细胞相容性，样品的相对活力值远高于对照组。 [0091] 实施例9 [0092] RAW264.7细胞在方格星虫体壁仿生皮肤敷料上的生长 [0093] 用扫描电子显微镜对RAW264.7细胞在方格星虫体壁仿生皮肤敷料上生长的架构进行观察。在进行扫描电镜观察之前，对细胞及敷料进行前处理。用PBS清洗细胞1～2遍，然后用2.5％的戊二醛常温下固定1h，用去离子水清洗2～3遍，用40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的乙醇对细胞进行逐级脱水，每次10分钟，在真空冷冻干燥机中干燥，喷金观察。结果如图7所示。 [0094] 效果验证：参考附图7，细胞在方格星虫体壁仿生皮肤敷料上黏附生长，形状呈立体类球体，保持了细胞形态与功能稳定。进一步说明，方格星虫体壁仿生皮肤敷料的三维结构有利于细胞贴附生长。 [0095] 综上，我们公布的方格星虫体壁仿生皮肤敷料具有天然的三维网络结构、良好的黏附性、较好的透气性、较好的延展性、较好的吸水溶胀性和降解性、良好的溶血性和凝血性、良好的生物相容性、良好的细胞贴附性、支持细胞三维培养、促进细胞的生长、抗炎促愈合等优点。具体的该发明中的方格星虫体壁仿生皮肤敷料由蛋白纤维丝规则交错形成，具有均一的多孔结构，增加敷料与伤口的接触表面积的同时具有较强的机械性能；与传统伤口敷料相比，本发明制备的伤口敷料具有较高的透气性，能通过水分的蒸发使伤口温度降低，减少疼痛感；同时具有良好的具有良好的黏附性、抗氧化等功能，可以促进伤口快速愈合；具有较低的细胞毒性、良好的生物相容性；并且具有国家安全标准的溶血率，可快速富集血液形成凝血支点，在皮肤组织修复、皮肤再生、皮肤类器官领域具有良好的应用前景。 [0096] 以上显示和描述了本发明的基本技术和主要特征和本发明的优点，对于本领域研究技术人员而言，显然本发明不限于上述实施例的细节，并且在不背离发明精神或基本特征的情况下，能够以其他具体的形式实现本发明。本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附属图标记视为限制所涉及的权利要求。 [0097] 此外，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，实施例中的技术方案也可以适当调整，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。 |
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