一种包含卡拉胶寡糖的复合物及其制备方法和应用
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; |
| 专利有效性 | 实质审查 | 当前状态 | 实质审查 |
| 申请号 | CN202410734621.6 | 申请日 | 2024-06-07 |
| 公开(公告)号 | CN118743777A | 公开(公告)日 | 2024-10-08 |
| 申请人 | 自然资源部第一海洋研究所; 青岛黄海学院; | 申请人类型 | 科研院所 |
| 发明人 | 李江; 谭姣姣; 王鹏飞; 付婷; 王鸣慧; 王芝发; 武春飞; 曹喆; | 第一发明人 | 李江 |
| 权利人 | 自然资源部第一海洋研究所,青岛黄海学院 | 权利人类型 | 科研院所 |
| 当前权利人 | 自然资源部第一海洋研究所,青岛黄海学院 | 当前权利人类型 | 科研院所 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：山东省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：山东省青岛市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：山东省青岛市高科技工业园崂山区仙霞岭路6号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：266061 |
| 主IPC国际分类 | A61L15/32 | 所有IPC国际分类 | A61L15/32 ; A61L15/28 ; A61L15/20 ; A61L15/26 ; A61L15/44 ; A61L15/64 ; A61L26/00 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 10 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 北京睿智保诚专利代理事务所 | 专利代理人 | 郭洁; |
| 摘要 | 本 发明 提供了一种包含卡拉胶寡糖的复合物及其制备方法和应用，属于 生物 医用材料技术领域。本发明包含卡拉胶寡糖的复合物，所述复合物是将ι‑卡拉胶寡糖或λ‑卡拉胶寡糖与 胶原蛋白 经过生物交联得到的；所述ι‑卡拉胶寡糖或λ‑卡拉胶寡糖与所述胶原蛋白的 质量 比为(4～6)：(3～5)。本发明的复合物中包含ι‑卡拉胶寡糖或λ‑卡拉胶寡糖，卡拉胶寡糖是利用来自海洋红藻提取的卡拉胶，经特定工程酶酶解获得的硫 酸化 寡糖，相较于多糖，与胶原蛋白进行生物交联易于反应且机制明确，能够获得具有一定交联度，一定降解速率的复合物，伤口在愈合的同时，复合物也被 机体 充分吸收，避免多次换药。 | ||
| 权利要求 | 1.一种包含卡拉胶寡糖的复合物，其特征在于，所述复合物是将ι‑卡拉胶寡糖或λ‑卡拉胶寡糖与胶原蛋白经过生物交联得到的；所述ι‑卡拉胶寡糖或λ‑卡拉胶寡糖与所述胶原蛋白的质量比为(4～6)：(3～5)。 |
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| 说明书全文 | 一种包含卡拉胶寡糖的复合物及其制备方法和应用技术领域背景技术[0002] 烧烫伤伤口愈合难度较大，愈合时间较长，对患者而言痛苦且可能引起严重的并发症。伤口愈合是一个非常复杂的过程，包括凝血、炎症、增殖和重塑，涉及细胞因子、间质细胞、细胞外基质和实质细胞参与，皮肤的损害引起皮肤屏障作用的破坏与丧失，因此用敷料覆盖创面，作为皮肤保护屏障，促进创面愈合至为重要。开发新型医用敷料治愈皮肤创面是临床治疗趋势。 [0003] 现在国内临床上多用中药化学膏剂、抗生素等治疗创面，换药次数多、伤口愈合慢、易产生抗药性。而“湿性愈合”理论，已实现大量临床研究和产品应用。湿性愈合有以下优势：调节创面氧张力；促进多种生长因子释放，如血小板生长因子、成纤维细胞生长因子等；保护创面神经末梢；保持创面恒温，利于组织生长；降低感染发生率。 [0004] 胶原蛋白‑糖类复合物作为生物敷料，经历了较长时间的研究开发，作为真皮组织成分，可被机体完全吸收，促进伤口愈合，减少疤痕的产生。本发明利用结构确定的卡拉胶λ、ι寡糖与胶原蛋白交联形成复合物，相较于硫酸软骨素等胶原蛋白‑糖类复合物交联机制明确，易于控制质量指标。 发明内容[0005] 本发明的目的在于提供一种包含卡拉胶寡糖的复合物及其制备方法和应用。本发明的复合物中包含ι‑卡拉胶寡糖或λ‑卡拉胶寡糖，卡拉胶寡糖是利用来自海洋红藻提取的卡拉胶，经特定工程酶酶解获得的硫酸化寡糖，相较于多糖，与胶原蛋白进行生物交联易于反应且机制明确，能够获得具有一定交联度，一定降解速率的复合物，伤口在愈合的同时，复合物也被机体充分吸收，避免多次换药。 [0006] 为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案： [0007] 本发明提供了一种包含卡拉胶寡糖的复合物，所述复合物是将ι‑卡拉胶寡糖或λ‑卡拉胶寡糖与胶原蛋白经过生物交联得到的；所述ι‑卡拉胶寡糖或λ‑卡拉胶寡糖与所述胶原蛋白的质量比为(4～6)：(3～5)。 [0008] 优选的，所述ι‑卡拉胶寡糖或λ‑卡拉胶寡糖的聚合度为2～8。 [0009] 优选的，所述胶原蛋白为I型胶原蛋白或II型胶原蛋白。 [0010] 本发明还提供了一种上述复合物的制备方法，包括如下步骤： [0011] (1)将ι‑卡拉胶寡糖或λ‑卡拉胶寡糖羧酸化，得到羧酸化寡糖； [0012] (2)向羧酸化寡糖的糖溶液中加入交联剂，反应，得到糖反应成分； [0013] (3)将胶原蛋白溶液与糖反应成分混合反应，经过滤，干燥，得到复合物。 [0014] 优选的，步骤(1)中，所述羧酸化的方法为：将ι‑卡拉胶寡糖或λ‑卡拉胶寡糖与氯乙酸混合反应，得到羧酸化寡糖；所述ι‑卡拉胶寡糖或λ‑卡拉胶寡糖与氯乙酸的质量体积比为(0.4～0.6)g：100ml；所述反应的温度为20～25℃，时间为3～5h，转速为300～500rpm； [0015] 步骤(2)中，所述交联剂为1‑(3‑二甲基氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺(EDC)和N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)；所述1‑(3‑二甲基氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺和N‑羟基琥珀酰亚胺的质量比为(0.5～2)：(0.5～2)；所述N‑羟基琥珀酰亚胺与所述ι‑卡拉胶寡糖或λ‑卡拉胶寡糖的质量比为1：(8～12)；所述反应的温度为20～25℃，时间为1～3h，转速为300～500rpm； [0016] 步骤(3)中，所述胶原蛋白溶液是将胶原蛋白按照(0.3～0.5)g：100ml的质量体积比溶于磷酸钠缓冲液制得的；所述反应的温度为0～4℃，时间为10～16h，转速为300～500rpm。 [0018] 本发明还提供了一种包含卡拉胶寡糖的复合生物医用材料，由包括如下质量百分比的原料制成：上述复合物5～57％，pH调节剂0.02％～0.10％，余量为水。 [0020] 本发明还提供了一种上述复合生物医用材料的制备方法，将所述复合物与pH调节剂、水混合后，与聚氨酯膜贴合，制成膜状敷料；或，将所述复合物与pH调节剂、水混合后，制成凝胶状敷料。 [0021] 本发明还提供了一种上述复合物、上述制备方法制得的复合物、上述复合生物医用材料或上述制备方法制得的复合生物医用材料在制备促进伤口愈合药物中的应用。 [0022] 本发明一种包含卡拉胶寡糖的复合物及其制备方法和应用。本发明的λ‑卡拉胶寡糖/ι‑卡拉胶寡糖与胶原蛋白复合物，具有如下的有益效果： [0023] 1、λ‑卡拉胶寡糖、ι‑卡拉胶寡糖的优势在于：①吸湿、保湿性强，为伤口愈合保持湿润愈合环境；②具有生物相容性、无免疫原性；③可降解，被机体完全吸收；④具有硫酸基团，可吸附炎症因子，促进创面由炎症期到增殖期，利于伤口愈合；⑤保护细胞生长因子，加强各生长因子对靶细胞的交互作用；⑥经特制基因工程酶生物降解法获得λ‑、ι‑卡拉胶寡糖，结构明确、活性显著。 [0024] 2、本发明首次利用λ‑、ι‑卡拉胶寡糖与胶原蛋白，在生物交联法下获得一定交联度、酶解速率的复合物。该复合物具有调节溃疡创面氧张力，促进伤口愈合的功效。以该复合物为基质制成的医用敷料中有效成分的酶解速率与伤口细胞生长速率相符合，所以在促进伤口愈合的同时，该复合物也被吸收完毕，减少换药痛苦，促进伤口愈合效果显著，明显优于k‑卡拉胶寡糖。 [0026] 图1为I型胶原蛋白赖氨酸残基结构示意图。 [0027] 图2为卡拉胶寡糖‑胶原蛋白复合物敷料的制备流程图。 [0028] 图3为卡拉胶寡糖‑胶原蛋白复合物的扫描电镜图。其中，A为实施例1的λ‑卡拉胶寡糖与胶原蛋白交联复合物；B为实施例2的ι‑卡拉胶寡糖与胶原蛋白交联复合物；C为实施例6的未发生交联的ι‑卡拉胶寡糖与胶原蛋白混合物。 [0029] 图4为卡拉胶寡糖‑胶原蛋白复合物的细胞毒性实验结果。其中，control为空白对照组，KD为k‑卡拉胶寡糖‑胶原蛋白复合物，D为I型胶原蛋白，λ‑D为λ‑卡拉胶寡糖‑胶原蛋白复合物，ι‑D为ι‑卡拉胶寡糖‑胶原蛋白复合物。 [0030] 图5为不同药物或敷料处理下，伤后14天小鼠烧烫伤伤口的愈合情况。其中，A为模型组，B为实施例1组，C为实施例2组，D为实施例3组，E为实施例4组，F为实施例5组，G为阳性对照组。 [0031] 图6为不同样品溶血实验后的细胞上清液吸光度值。其中，control为阳性对照组，KD为k‑卡拉胶寡糖‑胶原蛋白复合物；D为I型胶原蛋白；λ‑D为λ‑卡拉胶寡糖‑胶原蛋白复合物；ι‑D为ι‑卡拉胶寡糖‑胶原蛋白复合物。 具体实施方式[0032] 本发明提供了一种包含卡拉胶寡糖的复合物，由包括如下重量份原料制成：ι‑卡拉胶寡糖或λ‑卡拉胶寡糖0.4～0.6份、胶原蛋白0.3～0.5份。 [0033] 在本发明中，所述ι‑卡拉胶寡糖或λ‑卡拉胶寡糖的聚合度优选为2～8，进一步优选为2、4、6、8，再进一步优选为2。 [0034] 在本发明中，所述胶原蛋白优选为I型胶原蛋白或II型胶原蛋白，进一步优选为I型胶原蛋白。I型胶原蛋白为三螺旋结构，两条α1链和一条α2链构成，结构如图1所示。基本组成单位为Gly‑X‑Y，甘氨酸占30％以上，X为脯氨酸残基，Y为羟脯氨酸或羟赖氨酸残基。Α1链非螺旋区N端和C端均有赖氨酸残基，游离的‑NH2有极大的反应活性，可与λ‑、ι‑卡拉胶寡糖相交联形成复合物。 [0035] 本发明还提供了一种上述复合物的制备方法，包括如下步骤： [0036] (1)将ι‑卡拉胶寡糖或λ‑卡拉胶寡糖羧酸化，得到羧酸化寡糖； [0037] (2)向羧酸化寡糖的糖溶液中加入交联剂，反应，得到糖反应成分； [0038] (3)将胶原蛋白溶液与糖反应成分混合反应，经过滤，干燥，得到复合物。 [0039] 在本发明中，步骤(1)中，所述羧酸化的方法优选为：将ι‑卡拉胶寡糖或λ‑卡拉胶寡糖与氯乙酸混合反应，得到羧酸化寡糖。 [0040] 在本发明中，步骤(1)中，所述ι‑卡拉胶寡糖或λ‑卡拉胶寡糖与氯乙酸的质量体积比优选为(0.4～0.6)g：100ml，进一步优选为0.5g：100ml。 [0041] 在本发明中，步骤(1)中，所述反应的温度优选为20～25℃，进一步优选为25℃；所述反应的时间优选为3～5h，进一步优选为4h；所述反应的转速优选为300～500rpm，进一步优选为400rpm。 [0042] 在本发明中，步骤(2)中，所述交联剂优选为1‑(3‑二甲基氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺和N‑羟基琥珀酰亚胺。 [0043] 在本发明中，步骤(2)中，所述1‑(3‑二甲基氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺和N‑羟基琥珀酰亚胺的质量比优选为(0.5～2)：(0.5～2)，进一步优选为1：1。 [0044] 在本发明中，步骤(2)中，所述N‑羟基琥珀酰亚胺与所述ι‑卡拉胶寡糖或λ‑卡拉胶寡糖的质量比优选为1：(8～12)，进一步优选为1:10。 [0045] 在本发明中，步骤(2)中，所述反应的温度优选为20～25℃，进一步优选为25℃；所述反应的时间优选为1～3h，进一步优选为2h；所述反应的转速优选为300～500rpm，进一步优选为400rpm。 [0046] 在本发明中，步骤(3)中，所述胶原蛋白溶液优选是将胶原蛋白按照(0.3～0.5)g：100ml的质量体积比溶于磷酸钠缓冲液制得的，进一步优选是将胶原蛋白按照0.4g：100ml的质量体积比溶于磷酸钠缓冲液制得的。 [0047] 在本发明中，步骤(3)中，所述反应的温度优选为0～4℃，进一步优选为4℃；所述反应的时间优选为10～16h，进一步优选为12h；所述反应的转速优选为300～500rpm，进一步优选为400rpm。 [0048] 在本发明中，步骤(3)中，所述过滤优选为凝胶过滤或透析。 [0049] 在本发明中，步骤(3)中，所述干燥优选为冷冻干燥。 [0050] 本发明还提供了一种包含卡拉胶寡糖的复合生物医用材料，优选由包括如下质量百分比的原料制成：上述复合物5～57％，pH调节剂0.02％～0.10％，余量为水；进一步优选由包括如下质量百分比的原料制成：上述复合物30％，pH调节剂0.06％，余量为水。 [0051] 在本发明中，所述pH调节剂优选为醋酸溶液、柠檬酸溶液、醋酸钠溶液中的任意一种，进一步优选为醋酸钠溶液。 [0052] 本发明还提供了一种上述复合生物医用材料的制备方法，将所述复合物与pH调节剂、水混合后，与聚氨酯膜贴合，制成膜状敷料；或，将所述复合物与pH调节剂、水混合后，制成凝胶状敷料。 [0053] 本发明还提供了一种上述复合物、上述制备方法制得的复合物、上述复合生物医用材料或上述制备方法制得的复合生物医用材料在制备促进伤口愈合药物中的应用。 [0054] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。 [0055] 实施例1 [0056] (1)将0.5gλ‑卡拉胶寡糖(聚合度为2)溶于100ml氯乙酸溶液，室温(25℃)条件下，400rpm搅拌反应4h。向溶液中加入固体磷酸二氢钠(终浓度为4mg/ml)，以终止反应；用HCl调节pH至中性，透析除去未反应成分，冷冻干燥，得到羧酸化寡糖。 [0057] (2)将羧酸化寡糖溶于100ml MES缓冲液(pH6.0)中，得到糖溶液。 [0058] (3)称取0.05g EDC、0.05g NHS，用少量水溶解，加入到糖溶液中，室温(25℃)条件下，400rpm搅拌反应2h后，添加1ml 2‑巯基乙醇到反应液中，使EDC失活，凝胶过滤，冷冻干燥，得到糖反应成分。 [0059] (4)将0.4g I型胶原蛋白溶于100ml磷酸钠缓冲液(pH7.5)中，加入糖反应成分，4℃条件下，400rpm搅拌反应12h。凝胶过滤或透析，除去未反应的成分，冷冻干燥，得到λ‑卡拉胶寡糖‑胶原蛋白复合物。 [0060] (5)按照图1所示的流程图，将复合物与含0.1mol/LpH5.5醋酸钠的pH调节剂、2.099ml的水(质量百分比：复合物30％；pH调节剂0.06％；水69.94％)混合，得到半固体凝胶，再制成薄膜状的敷料，灭菌，得到复合生物医用材料。 [0061] 实施例2 [0062] (1)将0.5gι‑卡拉胶寡糖(聚合度为2)溶于100ml氯乙酸溶液，室温(25℃)条件下，400rpm搅拌反应4h。向溶液中加入固体磷酸二氢钠(终浓度为4mg/ml)，以终止反应；用HCl调节pH至中性，透析除去未反应成分，冷冻干燥，得到羧酸化寡糖。 [0063] (2)将羧酸化寡糖溶于100ml MES缓冲液(pH6.0)中，得到糖溶液。 [0064] (3)称取0.05g EDC、0.05g NHS，用少量水溶解，加入到糖溶液中，室温(25℃)条件下，400rpm搅拌反应2h后，添加1ml 2‑巯基乙醇到反应液中，使EDC失活，凝胶过滤，冷冻干燥，得到糖反应成分。 [0065] (4)将0.4g I型胶原蛋白溶于100ml磷酸钠缓冲液(pH7.5)中，加入糖反应成分，4℃条件下，400rpm搅拌反应12h。凝胶过滤或透析，除去未反应的成分，冷冻干燥，得到ι‑卡拉胶寡糖‑胶原蛋白复合物。 [0066] (5)按照图1所示的流程图，将复合物与含0.1mol/LpH5.5醋酸钠的pH调节剂、2.099ml的水(质量百分比：复合物30％；pH调节剂0.06％；水69.94％)混合，得到半固体凝胶，再制成薄膜状的敷料，灭菌，得到复合生物医用材料。 [0067] 实施例3 [0068] (1)将0.5gκ‑卡拉胶寡糖(聚合度为9‑13)溶于100ml氯乙酸溶液，室温(25℃)条件下，400rpm搅拌反应4h。向溶液中加入固体磷酸二氢钠(最终浓度为4mg/ml)，停止反应；用HCl调节pH至中性，透析除去未反应成分，冷冻干燥，得到羧酸化寡糖。 [0069] (2)将羧酸化寡糖溶于100ml MES缓冲液(pH6.0)中，得到糖溶液。 [0070] (3)称取0.05g EDC、0.05g NHS，用少量水溶解，加入到糖溶液中，室温(25℃)条件下，400rpm搅拌反应2h后，添加1ml 2‑巯基乙醇到反应液中，使EDC失活，凝胶过滤，冷冻干燥，得到糖反应成分。 [0071] (4)将0.4g I型胶原蛋白溶于100ml磷酸钠缓冲液(pH7.5)中，加入糖反应成分，4℃条件下，400rpm搅拌反应12h。凝胶过滤或透析，除去未反应的成分，冷冻干燥，得到k‑卡拉胶寡糖‑胶原蛋白复合物。 [0072] (5)按照图1所示的流程图，将复合物与含0.1mol/LpH5.5醋酸钠的pH调节剂、2.099ml的水(质量百分比：复合物30％；pH调节剂0.06％；水69.94％)混合，得到半固体凝胶，再制成薄膜状的敷料，灭菌，得到复合生物医用材料。 [0073] 实施例4 [0074] 将0.09gλ‑卡拉胶寡糖(聚合度为2)溶于0.21ml水，室温条件下，搅拌均匀，得到λ‑卡拉胶寡糖糖水。 [0075] 实施例5 [0076] 取0.9g I型胶原蛋白，与含0.1mol/LpH5.5醋酸钠的pH调节剂、2.099ml的水(质量百分比：复合物30％；pH调节剂0.06％；水69.94％)混合，制备成胶原蛋白凝胶。按照图1所示的流程图，将胶原蛋白凝胶制成薄膜状的敷料，灭菌，得到胶原蛋白生物医用材料。 [0077] 实施例6 [0078] (1)将0.5gι‑卡拉胶寡糖(聚合度为2)溶于100ml氯乙酸溶液，室温(25℃)条件下，400rpm搅拌反应4h。向溶液中加入固体磷酸二氢钠(终浓度为4mg/ml)，以终止反应；用HCl调节pH至中性，透析除去未反应成分，冷冻干燥，得到羧酸化寡糖。将羧酸化寡糖溶于100ml MES缓冲液(pH6.0)中，得到糖溶液。 [0079] (2)将0.4g I型胶原蛋白溶于100ml磷酸钠缓冲液(pH 7.5)中，加入糖溶液，4℃条件下，400rpm搅拌反应12h。得到ι‑卡拉胶寡糖‑胶原蛋白混合物。 [0080] 试验例1 [0081] 采用电镜观察实施例1、2、6制备的复合物/混合物的微观结构，结果如图3所示。其中，A为实施例1的λ‑卡拉胶寡糖‑胶原蛋白复合物；B为ι‑卡拉胶寡糖‑胶原蛋白复合物；C为未发生交联的ι‑卡拉胶寡糖‑胶原蛋白混合物。 [0082] 可以看出，本发明制备的复合物孔径约为80～200μm，此孔径适合细胞生长。而未发生交联的ι‑卡拉胶寡糖与胶原蛋白混合物不形成孔径。 [0083] 试验例2 [0084] 以注射用水为溶剂，将实施例1～3制备的复合物配制成50μM、80μM、100μM浓度梯度的溶液，同时配制50μM、80μM、100μM浓度梯度的I型胶原蛋白溶液。以成纤维细胞(HFF‑1细胞)为实验对象，分别采用实施例1～3、5的复合物溶液以及胶原蛋白溶液共培养HFF‑1细胞，评估复合物的细胞毒性，并检测共培养后的细胞炎症因子TNF‑α的浓度。具体过程如下： [0085] 取对数生长期的HFF‑1细胞，制成2×105个/细胞密度的悬液，接种于12孔板中，1ml/孔，37℃、5％CO2培养箱过夜培养至细胞贴壁后，将细胞分为5组，分别为空白对照组、实施例1组、实施例2组、实施例3组、胶原蛋白组。每组分别加入对应组别的溶液，空白对照组加入等量的注射用水(100μL/孔)。 [0086] 37℃、5％CO2共培养24h后，采用MTT法检测细胞活性，检测结果如图4所示(control为空白对照组，KD为k‑卡拉胶寡糖‑胶原蛋白复合物，D为I型胶原蛋白，λ‑D为λ‑卡拉胶寡糖‑胶原蛋白复合物，ι‑D为ι‑卡拉胶寡糖‑胶原蛋白复合物)。采用TNF‑α检测试剂盒检测细胞上清液中炎症因子TNF‑α的浓度，取平均值，检测结果如表1所示。 [0087] 表1不同复合物溶液(50μM)对成HFF‑1纤维细胞炎症因子(TNF‑α)的影响[0088]组别 实施例1 实施例2 实施例3 胶原蛋白 TNF‑α(Pg/ml) 1578 1503 1785 1767 [0089] 根据图4可以看出，与对照组相比，各个浓度的ι‑卡拉胶寡糖‑胶原蛋白复合物和λ‑卡拉胶寡糖‑胶原蛋白复合物处理后HFF‑1细胞活力均显著提高。表明，本发明的复合物在细胞培养过程中对细胞活力具有积极的影响，促进了成纤维细胞的生长，因此该复合物可用作伤口敷料，具有潜在的开发价值。 [0090] 根据表1可以看出，本发明制备的λ‑卡拉胶寡糖‑胶原蛋白复合物、ι‑卡拉胶寡糖‑胶原蛋白复合物的抗炎活性显著，显著优于k‑卡拉胶寡糖‑胶原蛋白复合物和胶原蛋白溶液。 [0091] 试验例3 [0092] 1、小鼠烧烫伤模型的构建： [0093] 选取小鼠35只，随机分成7组，每组5只，分别为(1)模型组；(2)阳性对照组(湿润烧伤膏，购自汕头市美宝制药有限公司)；(3)实施例1组；(4)实施例2组；(5)实施例3组；(6)实施例4组；(7)实施例5组。用0.15ml戊巴比妥钠(50mg/kg)进行腹腔注射麻醉。背部剪毛，面积约为2cm×2cm，用脱毛膏对小鼠剪毛处进行脱毛。采用艾柱将其烫伤，将艾柱贴近小鼠皮肤脱毛处，并间断滴热水以防止干性烫伤导致小鼠皮肤变硬。 [0094] 2、试验方法： [0095] 除模型组外，其余各组分别将对应的药物或敷料敷于创面上，覆盖凡士林纱布，医用胶带固定，单笼饲养，饲养条件相同。 [0096] 3、创面愈合情况观察： [0097] 于伤后7天、14天、21天、28天观察小鼠伤口恢复情况，分别测量创面面积并计算创面收缩率。收缩率＝(创面原始面积‑创面测量面积)/创面原始面积×100％。统计结果如表2所示。伤后14天的动物创面愈合情况如图5所示(为使创面愈合情况清晰可见，对图片进行了不同程度的缩放，因此创面大小以表2为准)，其中，A为模型组，B为实施例1组，C为实施例 2组，D为实施例3组，E为实施例4组，F为实施例5组，G为阳性对照组。 [0098] 表2各组小鼠创面收缩率(％) [0099]组别 7天 14天 21天 28天 模型组 27.3 35.7 45.8 52.7 阳性对照组 30.5 54.8 72.5 86.7 实施例1组 32.6 62.4 75.7 88.2 实施例2组 30.9 61.9 76.8 86.7 实施例3组 28.9 59.4 74.9 80.4 实施例4组 29.6 50.7 66.8 76.2 实施例5组 31.5 60.9 68.7 79.2 [0100] 根据表2和图5可以看出，实验组创面较对照组干燥，面积缩小，未见创面感染。经统计学分析，各实验组创面收缩率较对照组大，实施例1组和实施例2组的伤口收缩率较好，显示λ‑卡拉胶寡糖、ι‑卡拉胶寡糖和胶原蛋白复合物促进伤口愈合，并且结痂相较于其他组的时间更短。 [0101] 4、烧烫伤伤口成纤维细胞的相对增殖率： [0102] 试验方法：四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定细胞增殖 [0103] 取小鼠的背部皮肤组织，经1％双抗和庆大霉素的PBS冲洗处理、0.25％的胰酶消化后，获得成纤维细胞。加入含15％胎牛血清的DMEM/F12培养液后，分别转移至25mL培养瓶4 中，培养，获得第3‑5代融合培养的成纤维细胞。使用细胞计数法，以1×10 个/孔接种于96孔培养板中，培养24h。 [0104] 取上述对数生长期的细胞，以5×104个/mL接种于96孔培养板培养，每孔100μL。CO2箱培养24h。分别加入ι‑卡拉胶寡糖胶原蛋白复合物、k‑卡拉胶寡糖胶原蛋白复合物、λ‑卡拉胶寡糖胶原蛋白复合物，设置空白对照组。于36.5℃，5％CO2的培养箱中培养，48h后，加入浓度为5g/L的MTT(20μL/孔)，培养4h，加入二甲基、亚砜(150μL/孔)，于波长为570nm处测各组吸光度值。 [0105] [0106] 结果如表3所示。 [0107] 表3不同复合物处理下的烧烫伤伤口成纤维细胞的相对增殖率 [0108]组别 k‑D λ‑D ι‑D 相对增殖率RGR(％) 117 119 123 [0109] 注：ι‑D为ι‑卡拉胶寡糖胶原蛋白复合物；k‑D为k‑卡拉胶寡糖胶原蛋白复合物；λ‑D为λ‑卡拉胶寡糖胶原蛋白复合物 [0110] 根据表3可以看出，本发明制备的λ‑卡拉胶寡糖‑胶原蛋白复合物、ι‑卡拉胶寡糖‑胶原蛋白复合物更有利于提高烧烫伤伤口成纤维细胞的生长速率，优于k‑卡拉胶寡糖‑胶原蛋白复合物。 [0111] 试验例4 [0112] 溶血实验： [0113] 分别将等量的实施例1～3、5的复合物/凝胶加入到2％小鼠红细胞悬液中，同时设置等量生理盐水的阴性对照组和等量去离子水的阳性对照组，观察各组血细胞的变化，并检测细胞上清液的吸光度。 [0114] 结果发现，不同样品加入到红细胞悬液中后，血细胞均沉积到试管底部，与阴性对照生理盐水测试管中的细胞显示相同现象，而阳性对照去离子水测试管中则显示溶液呈透明红色，红细胞破裂。 [0115] 取上层溶液进行离心，并对离心后的上清测定吸光度，结果如图6所示，可以看出，λ‑卡拉胶寡糖‑胶原蛋白复合物、ι‑卡拉胶寡糖‑胶原蛋白复合物、k‑卡拉胶寡糖‑胶原蛋白复合物、胶原蛋白的溶血率均小于5％，低于生物材料的最大溶血率标准。表明，本发明提供的复合物无免疫原性，与血液接触安全，有利于细胞增殖，促进细胞生长，加速伤口愈合。 [0116] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。 |
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