一种海蜇胶原蛋白海绵及其制备方法

专利类型 发明公开 法律事件 公开; 实质审查;
专利有效性 实质审查 当前状态 实质审查
申请号 CN202410538883.5 申请日 2024-04-30
公开(公告)号 CN118649274A 公开(公告)日 2024-09-17
申请人 原海生物(大连)有限公司; 申请人类型 企业
发明人 邹惠园; 应芳; 王玉; 李京泽; 刘婧钰; 范丽娟; 程泽华; 第一发明人 邹惠园
权利人 原海生物(大连)有限公司 权利人类型 企业
当前权利人 原海生物(大连)有限公司 当前权利人类型 企业
省份 当前专利权人所在省份:辽宁省 城市 当前专利权人所在城市:辽宁省大连市
具体地址 当前专利权人所在详细地址:辽宁省大连市经济技术开发区光悦路1-1号2层 邮编 当前专利权人邮编:116199
主IPC国际分类 A61L15/32 所有IPC国际分类 A61L15/32A61L15/42A61L15/44A61L15/64A61L27/24A61L27/54A61L27/56A61L27/58A61L31/04A61L31/14A61L31/16C07K14/78C12P21/06C07K1/34C07K1/30C07K1/36
专利引用数量 0 专利被引用数量 0
专利权利要求数量 10 专利文献类型 A
专利代理机构 北京易捷胜知识产权代理有限公司 专利代理人 齐云;
摘要 本 发明 涉及医用 敷料 技术领域,具体涉及一种海蜇 胶原蛋白 海绵 及其制备方法,其包括如下步骤:S1、将分子量在80kDa以上胶原蛋白原料用纯 水 调节浓度,得到 质量 浓度为0.2‑0.5%的胶原蛋白溶液;S2、向上述胶原蛋白溶液中加入 乙醇 ,搅拌、静置;S3、离心取沉淀或抽滤取 滤饼 ;S4、 真空 下 冷冻干燥 ,制得胶原蛋白海绵;S5、用Co60辐照灭菌、 包装 入库。本发明制备的胶原蛋白海绵结构缜密,胶原蛋白未发生变性,吸收液体能 力 强,遇水不易 变形 和塌陷。本发明的方法可避免盐析引入的杂质和pH析出效率低或胶原海绵力学强度较低等技术问题。
权利要求

1.一种海蜇胶原蛋白海绵的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1、将分子量在80kDa以上胶原蛋白原料用纯调节浓度,得到质量浓度为0.2‑0.5%的胶原蛋白溶液;
S2、向上述胶原蛋白溶液中加入乙醇,搅拌、静置;
S3、离心取沉淀或抽滤取滤饼
S4、将上述沉淀或滤饼在真空冷冻干燥,制得胶原蛋白海绵;
60
S5、用Co 辐照灭菌、包装入库。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,S1中,分子量在80kDa以上胶原蛋白原料为:采用截留分子量为80kDa的超滤膜过滤,超过滤过程中实时监控超滤液的电导率,在超滤液的电导率为20‑35μS/cm时,结束超滤,得到的胶原蛋白的超滤浓缩液。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,S1中,海蜇胶原蛋白分子量在300kDa以上。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,S2中,乙醇的加入方式为以下任一种:
方式1:多次小批量添加乙醇,观察胶原蛋白的沉淀情况,直至达到预期的沉淀速度和沉淀量即停止加乙醇;预期沉淀量可根据胶原蛋白干物质的25‑35倍体积估算;
方式2:按照胶原蛋白溶液的体积1‑4倍量一次性加入乙醇,搅拌均后,静置18‑26h。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,S3中,采用高速冷冻离心机11500‑
12500rpm离心50‑80min取离心沉淀。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,S3中,所述抽滤采用具有预定凹槽形状的抽滤器,将S2的溶液转入该抽滤器的凹槽中,经抽滤去除乙醇、水和杂质,得到果冻状胶原蛋白滤饼。
7.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,S4中,冷冻干燥条件为:真空度5‑10Pa下、在冷阱温度‑45℃~‑50℃下冷冻2‑8h,制得胶原蛋白海绵。
8.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,S3中,在抽滤过程中边抽滤边采用质量浓度为0.01‑0.5%交联剂溶液和去离子水先后对抽滤器凹槽内的胶原蛋白进行淋洗。
9.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,在S1之前还包括海蜇胶原蛋白的提取过程,海蜇胶原蛋白的提取过程为:
当海蜇为新鲜海蜇时,海蜇胶原蛋白的提取过程如下:
步骤1:对海蜇清洗,去除杂质并处理成小
步骤2:加酸溶胀后,胶体磨匀浆;
步骤3:酸性蛋白酶酶解,离心去除杂质和部分细菌,保留上清液;
步骤4:微滤膜除菌;
步骤5:采用截留分子量为80kDa的超滤膜过滤,得到超滤浓缩液;
当海蜇为盐渍海蜇时,海蜇胶原蛋白的提取过程如下:
步骤1:清水浸泡或流水冲洗脱盐,并处理成小块;
步骤2:浸泡处理24‑48h后,转入清水浸泡,多次换水直至水呈中性;
步骤3:酸性蛋白酶酶解,离心去除杂质和部分细菌,保留上清液;
步骤4:微滤膜除菌;
步骤5:采用截留分子量为80kDa的超滤膜过滤,得到超滤浓缩液。
10.一种海蜇胶原蛋白海绵,其采用权利要求1‑9任一项所述的制备方法制得。

说明书全文

一种海蜇胶原蛋白海绵及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及医用敷料技术领域,具体涉及一种海蜇胶原蛋白海绵及其制备方法。

背景技术

[0002] 胶原蛋白海绵通常是由动物组织中提取的胶原蛋白,经纯化、交联(如果有)、冷冻干燥、灭菌等工艺处理后制备的海绵状敷料,具有良好的止血和填充作用,能够促进伤口愈合和肉芽组织的生长,可以用于修复和替代受损的关节软骨、肌肉和皮肤组织,也可以用于制作人工血管、骨板等植入材料。此外,胶原蛋白海绵还可以用于制造药物控释体系,提高药物的稳定性和疗效。
[0003] 目前市售胶原蛋白海绵的胶原蛋白原料来自哺乳动物组织如猪的皮或肌。但是哺乳动物胶原蛋白,特别是猪、牛等哺乳动物来源的胶原蛋白,其引发免疫反应和过敏反应的险较高,胶原蛋白中脂肪含量相对较高,存在疯牛病(BSE)或疫等动物源性疾病传播的风险。此外原料资源受限,生产工艺复杂,生产周期长,导致生产成本高,产品价格居高不下。于是人们将目光投向了生物,以寻求更优的胶原蛋白来源。目前水产类胶原海绵多以鱼源为主提取,如鱼皮、鱼骨、鱼鳞等,但鱼源胶原海绵存在脱色难、腥味儿难除去等问题,导致相应产品的应用大大受限。另外,传统胶原蛋白海绵还存在学性能差、易塌陷、难以维持其固有形态等的缺陷,通常会使它们用于制备的组织工程支架无法在较长时间内维持较为固定的形态。为了改善胶原蛋白的力学性能,常常加入戊二、尼京平等一种或几种交联剂。为了提高产品的力学性能,交联剂的用量或者或交联时间变长,而交联剂超过一定浓度后会使胶原蛋白海绵的生物相容性受到影响,尤其作为填充物使用时,可能会对人体组织造成毒性反应或过敏反应。
[0004] 此外,现有的胶原蛋白海绵制备方法存在制备周期过长,生产效率较低的问题。例如,中国专利申请CN105601731A公开一种通过调节胶原溶液的pH至中性使胶原充分析出的方法,代替了传统盐析胶原的方法,有效避免了氯离子的引入。但该方法析出的胶原蛋白沉淀量很少,导致胶原蛋白海绵得率很低,工艺耗时至少在60‑62h。中国专利申请CN116772523A通过调节胶原蛋白溶液浓度和设置多阶段的冻干模式,在未使用冻干保护剂的前提下得到孔隙更均匀的胶原海绵。该工艺通过循环抽真空实现胶原蛋白溶液脱气,以防止海绵结构过于松散。但该工艺仅通过反复抽真空并不能实现充分的脱气效果,且工艺制备的胶原海绵力学性能较差,无法应用于对胶原海绵力学强度要求较高的场合,如半月板等组织工程支架。此外,该工艺以动物来源组织牛跟腱为原料,采用饱和氯化钠溶液盐析,得到胶原蛋白固状物,纯化水洗涤后得到的胶原蛋白溶于0.5mol/L的醋酸溶液中,透析后得到胶原蛋白溶液,将透析纯化后的胶原蛋白溶液用缓冲盐稀释后制备成0.1%‑0.6%的胶原蛋白溶液,用于胶原海绵的制备。该工艺无法避免氯离子的引入,限制了应用范围。

发明内容

[0005] (一)要解决的技术问题
[0006] 鉴于现有技术的上述缺点、不足,本发明提供一种海蜇胶原蛋白海绵及其制备方法,该方法选择相对分子量在80kDa以上的海蜇胶原蛋白为原料,对经过超滤和浓缩后的胶原蛋白上清液进行醇析,醇析后采用离心或抽滤得到沉淀,对沉淀冷冻升华制得海蜇胶原蛋白海绵;本发明的方法可避免盐析引入的杂质和pH析出效率低或胶原海绵力学强度较低等技术问题。
[0007] (二)技术方案
[0008] 第一方面,本发明提供一种海蜇胶原蛋白海绵的制备方法,其包括如下步骤:
[0009] S1、将分子量在80kDa以上胶原蛋白原料用纯水调节浓度,得到质量浓度为0.2‑0.5%的胶原蛋白溶液;
[0010] S2、向上述胶原蛋白溶液中加入乙醇,搅拌、静置;
[0011] S3、离心取沉淀或抽滤取滤饼
[0012] S4、将上述沉淀或滤饼在真空下冷冻干燥,制得胶原蛋白海绵;
[0013] S5、用Co60辐照灭菌和去除内毒素、包装入库。
[0014] 根据本发明的较佳实施例,S1中,分子量在80kDa以上胶原蛋白原料为:采用截留分子量为80kDa的超滤膜过滤,超过滤过程中实时监控超滤液的电导率,在超滤液的电导率为20‑35μS/cm时,结束超滤,得到的胶原蛋白的超滤浓缩液。
[0015] 超滤液的电导率大小与离子性杂质的含量呈正向关系,在超滤浓缩过程中胶原蛋白浓缩液的电导率越高则表示浓缩液中离子性杂质(盐分、基酸、肽段或其他离子)含量越高;随着超滤的进行,离子性杂质进入滤过液中,浓缩液中杂质含量随之减少,电导率下降;在电导率为20‑35μS/cm时表示胶原蛋白的超滤浓缩液纯度已达到86%以上,而继续超滤生产效率和成本效率较低,因此在电导率为20‑35μS/cm时结束超滤。
[0016] 根据本发明的较佳实施例,S1中,海蜇胶原蛋白分子量在300kDa以上。
[0017] 根据本发明的较佳实施例,S2中,所述乙醇的加入方式为以下任一种:
[0018] 方式1:多次小批量添加乙醇,观察胶原蛋白的沉淀情况,直至达到预期的沉淀速度和沉淀量即停止加乙醇。预期沉淀量可根据胶原蛋白干物质的25‑35倍体积估算。
[0019] 方式2:按照胶原蛋白溶液的体积1‑4倍量一次性加入乙醇,搅拌均后,静置18‑26h。
[0020] 经过醇析对胶原蛋白进行沉淀,可进一步去除残留在胶原蛋白的超滤浓缩液中的杂质。
[0021] 根据本发明的较佳实施例,S3中,采用高速冷冻离心机11500‑12500rpm离心50‑80min取离心沉淀。采用离心方式获得的沉淀进行冷冻干燥后,所得胶原蛋白海绵的吸水率高,适于用作止血等辅料。
[0022] 根据本发明的较佳实施例,S3中,所述抽滤采用具有预定凹槽形状的抽滤器,将S2的溶液转入该抽滤器的凹槽中,经抽滤去除乙醇、水和杂质,得到果冻状胶原蛋白滤饼。
[0023] 根据本发明的较佳实施例,S4中,冷冻干燥条件为:真空度5‑10Pa下、在冷阱温度‑45℃~‑50℃下冷冻2‑8h,制得胶原蛋白海绵。
[0024] 根据本发明的较佳实施例,S3中,在抽滤过程中边抽滤边采用低浓度的交联剂溶液和去离子水先后对抽滤器凹槽内的胶原蛋白进行淋洗。交联剂溶液的质量浓度为0.01‑0.5%。采用交联剂溶液进行淋洗,可进一步增强胶原蛋白海绵的力学强度;切换成去离子水清洗并同时抽滤,可减少胶原蛋白海绵中交联剂的残留。
[0025] 在本申请中,海蜇胶原蛋白原料可来自新鲜海蜇或盐渍海蜇。
[0026] 根据本发明的较佳实施例,在S1之前还包括海蜇胶原蛋白的提取过程,海蜇胶原蛋白的提取过程为:
[0027] 当海蜇为新鲜海蜇时,海蜇胶原蛋白的提取过程如下:
[0028] 步骤1:对海蜇清洗,去除杂质并处理成小
[0029] 步骤2:加酸溶胀后,胶体磨匀浆;
[0030] 步骤3:酸性蛋白酶酶解,离心去除杂质和部分细菌,保留上清液;
[0031] 步骤4:微滤膜除菌;
[0032] 步骤5:采用截留分子量为80kDa的超滤膜过滤,得到超滤浓缩液;
[0033] 当海蜇为盐渍海蜇时,海蜇胶原蛋白的提取过程如下:
[0034] 步骤1:清水浸泡或流水冲洗脱盐,并处理成小块;
[0035] 步骤2:浸泡处理24‑48h后,转入清水浸泡,多次换水直至水呈中性;
[0036] 步骤3:酸性蛋白酶酶解,离心去除杂质和部分细菌,保留上清液;
[0037] 步骤4:微滤膜除菌;
[0038] 步骤5:采用截留分子量为80kDa的超滤膜过滤,得到超滤浓缩液。
[0039] 第二方面,本发明提供一种海蜇胶原蛋白海绵,其采用上述任一实施例的制备方法制得。
[0040] (三)有益效果
[0041] (1)本发明采用海蜇为原料制备胶原蛋白海绵,具有资源丰富、胶原蛋白含量高、具有良好的水溶性、成膜性、乳化性、消费者接受度高、超滤后能够获得高纯度的产品的优点,相较于陆生动物资源可持续性好、疾病风险低、安全性更高,相较于鱼类胶原蛋白,海蜇胶原蛋白具有腥气更少,自然呈乳白色,不需要专进行脱色等优点。海蜇生长速度快,繁殖能力强,养殖周期相对较短,资源恢复能力强,更符合可持续发展的理念,作为一种海洋生物资源,其养殖和捕捞活动有助于海洋生态系统的平衡,同时也为沿海地区带来经济效益。
[0042] (2)本发明采用分子量在80kDa以上胶原蛋白为原料制备胶原蛋白海绵,优选使用分子量在300kDa以上胶原蛋白,由于蛋白分子量较大,借此能尽可能地保留胶原蛋白的三螺旋结构,在无任何交联剂加入的情况下,分子量大的原料制备的胶原海绵已具有一定力学强度,能满足止血性等医用敷料的力学强度需求,产品纯度高、生物相容性好、可降解,具有快速止血,防止粘连,加速伤口愈合,减少术后并发症等功效。
[0043] (3)本发明利用乙醇析出代替传统的盐析或pH析出,不引入氯离子并提高析出效率,析出的胶原蛋白沉淀经高速离心后,结构缜密,胶原蛋白未发生变性,吸收液体能力强,遇水不易变形和塌陷,适于作为医用止血海敷料等。乙醇不仅可消泡,有助于胶原蛋白的脱气(胶原蛋白溶液中气泡越多冻干后产品越易失空和坍塌);另一方面可破坏蛋白质的水化膜,进而使沉淀析出对胶原蛋白进一步纯化,得到的沉淀经冷冻干燥得胶原蛋白海绵。乙醇易挥发,在离心和冷冻干燥后无任何残留,提高胶原蛋白用作止血敷料或填充物的生物相容性和安全性。
[0044] (4)本发明在进行醇析后,进一步采用抽滤的方式获取滤饼,抽滤的凹槽可设置成胶原蛋白海绵的模具形状。采用这种方式时,胶原蛋白海绵的形状与抽滤器的凹槽相匹配,且在抽滤压力下,对醇析后的胶原蛋白沉淀实现充分脱气,使果冻状胶原蛋白滤饼已经形成更密实的结构,可有效增强胶原蛋白海绵的力学强度,更适于制备力学强度要求较高的组织工程支架等,如骨板或关节软骨等。
[0045] (5)在抽滤过程中还可使用低浓度交联剂溶液对滤饼进行冲洗并同时抽滤,之后切换去离子水冲洗并同时抽滤,由此可进一步强化胶原蛋白海绵的力学强度,以满足高强度填充物的需求。在抽滤过程中将小分子的交联剂采用抽滤方式去除,减少游离交联剂残留,提高胶原蛋白海绵的生物相容性。
[0046] (6)交联剂为AcA‑PEG‑OH、Nanocs交联剂(Nanocs公司开发的水溶性PEG交联剂)或者1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)二亚胺盐酸盐(EDC)‑N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)。这些交联剂都是具有良好生物相容性、低细胞毒性、生物安全性、交联效果稳定、生物可降解性。在抽滤作用和去离子水淋洗作用下,可快速抽滤并高效去除交联剂,减少游离的交联剂残留。附图说明
[0047] 图1为本发明制备胶原蛋白海绵的工艺流程图
[0048] 图2为本发明在制备高力学强度胶原蛋白海绵的抽滤器结构示意图。

具体实施方式

[0049] 为了更好的解释本发明,以便于理解,下面结合附图,通过具体实施方式,对本发明作详细描述。
[0050] 如图1所示,为本发明制备胶原蛋白海绵的工艺流程图,包括将分子量在80kDa以上胶原蛋白原料用纯水调节浓度,得到质量浓度为0.2‑0.5%的胶原蛋白溶液;然后向上述胶原蛋白溶液中加入乙醇,搅拌、静置18‑26h,接着采用高速冷冻离心机11500‑12500rpm离心50‑80min取离心沉淀;或者直接采用抽滤方式获取滤饼;将沉淀或滤饼置于冷冻干燥机60
中进行冷冻干燥,设置真空度5‑10Pa、冷阱温度为‑45℃~‑50℃,制得胶原蛋白海绵。用Co辐照灭菌,包装入库。
[0051] 其中,将分子量在80kDa以上胶原蛋白原料为胶原蛋白的超滤浓缩液,具体是采用截留分子量为80kDa的超滤膜过滤,超过滤过程中实时监控超滤液的电导率,在超滤液的电导率为20‑35μS/cm时结束超滤,得到胶原蛋白的超滤浓缩液。
[0052] 在醇析过程中,将乙醇加入到胶原蛋白溶液中的方式为以下任一种:
[0053] 方式1:多次小批量添加乙醇,观察胶原蛋白的沉淀情况,直至达到预期的沉淀速度和沉淀量即停止加乙醇。预期沉淀量可根据胶原蛋白干物质的25‑35倍体积估算。
[0054] 方式2:按照胶原蛋白溶液的体积1‑4倍量一次性加入乙醇,搅拌均后,静置18‑26h。经过醇析对胶原蛋白进行沉淀,可进一步去除残留在胶原蛋白的超滤浓缩液中的杂质。
[0055] 抽滤的方法为:采用具体预定凹槽形状的抽滤器,将S2的溶液转入该抽滤器的凹槽中,经抽滤去除乙醇、水和杂质,得到果冻状胶原蛋白滤饼。优选地,还可在抽滤过程中边抽滤边采用低浓度的交联剂溶液和去离子水先后对抽滤器凹槽内的胶原蛋白进行淋洗。交联剂溶液的质量浓度为0.01‑0.5%。采用交联剂溶液进行淋洗,可进一步增强胶原蛋白海绵的力学强度;切换成去离子水清洗并同时抽滤,可减少胶原蛋白海绵中交联剂的残留。
[0056] 以下结合具体实施例对本发明方案和技术效果说明如下。下述实施例中质量体积比(w:v)具体是指g/mL或Kg/L。
[0057] 实施例1
[0058] 本实施例采用新鲜海蜇制备胶原蛋白海绵,工艺步骤如下:
[0059] (1)清洗:将海蜇放入清水中进行清洗,除去杂质。
[0060] (2)酸溶胀:将清洗后的样品切成均匀的小块,按照质量(g)体积(mL)比W:V=1:3比例加入0.25mol/L的柠檬酸溶液,浸泡6h,沥干备用。
[0061] (3)匀浆:利用胶体磨将上述样品进行匀浆处理,得到胶状样品。
[0062] (4)酶解:将匀浆后的样品的pH调整至2以下,加入0.3wt%的胃蛋白酶,9℃条件下,连续搅拌酶解反应24h。
[0063] (5)离心:将上述酶解液经12000r/min离心20min,保留上清液。
[0064] (6)将上述上清液过0.22μm的PES微滤膜,去除细菌。
[0065] (7)超滤及浓缩:采用膜分离装置超滤,截留浓缩分子量在80kDa以上的胶原蛋白大分子,超滤至电导率为20‑35μS/cm之间,停止超滤,得到超滤浓缩液。
[0066] (8)向超滤浓缩液加纯水调节胶原蛋白浓度至0.3%,加入胶原蛋白溶液的体积3倍的乙醇,搅拌混匀,于4℃下静置24h。
[0067] (9)用高速冷冻离心机12000r离心60min,取沉淀。
[0068] (10)将沉淀置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥,设置真空度5~10Pa、冷阱温度为‑45℃~‑50℃,冷冻6h后升华干燥,制得海蜇胶原蛋白海绵。
[0069] (11)用Co60辐照灭菌,包装入库。
[0070] 实施例2
[0071] 本实施例采用盐渍海蜇制备胶原蛋白海绵,工艺步骤如下:
[0072] (1)将盐渍海蜇放入清水中在,在箱0‑4℃下冰镇浸泡隔夜,之后换清水浸泡每隔1‑2h换一次水或者采用流水冲洗脱盐,取浸泡的清水或冲洗的流水,向其中滴加硝酸若无白色浑浊,则表示脱盐完成。
[0073] (2)将脱盐后的海蜇样品带皮切块,按照质量(g)体积(mL)比=1:6加入0.1mol/L的氢化钠溶液,浸泡48h,每隔24h更换一次氢氧化钠溶液。将碱处理好的样品按照1:2的比例加入纯水进行浸泡,每次约60min,重复洗至中性,沥干水分,备用。
[0074] (3)匀浆:利用胶体磨将上述样品进行匀浆处理,得到胶状样品。
[0075] (4)将打浆后的样品,按照1:0.5(w:v)比例加入0.5mol/L的柠檬酸溶液,并将pH调整至2以下,再加入0.3wt%的胃蛋白酶,9℃条件下,连续搅拌酶解反应42h。
[0076] 其余步骤参见实施例1的(5)‑(11);制得海蜇胶原蛋白海绵。
[0077] 实施例3
[0078] 本实施例是在实施例1的基础上,将步骤(8)改为:将胶原蛋白浓度调节至0.48%,加入胶原蛋白溶液的体积2.5倍的乙醇,搅拌混匀,于4℃下静置24h。
[0079] 实施例4
[0080] 本实施例是在实施例1的基础上,将步骤(8)改为:将胶原蛋白浓度调节至0.22%,加入胶原蛋白溶液的体积1.6倍的乙醇,搅拌混匀,于4℃下静置24h。
[0081] 实施例5
[0082] 本实施例是在实施例1的基础上,将步骤(8)改为:将胶原蛋白浓度调节至0.3%;取胶原蛋白溶液体积3.2倍的无水乙醇,在24h小时内,分4批加入到胶原蛋白溶液中,每次加入后,对胶原蛋白溶液的上部进行搅动使乙醇分散均匀,然后静置8h再添加一次乙醇。
[0083] 实施例6
[0084] 设计如图2所示的抽滤器,抽滤器1底部设有若干独立的凹槽2,凹槽的形状可为圆形或方形,底部抽滤嘴连接负压;抽滤器周围具有一定深度的围沿3,可蓄积一定量溶液。围沿3内侧底部铺滤纸。设置若干独立凹槽2的模具可拆换地安装在围沿3内核滤纸上方,根据需要可替换不同的模具。
[0085] 本实施例的步骤(1)‑(8)与实施例1相同,只是将实施例1步骤(9)改成:将醇析静置结束后的溶液转入图2所示抽滤器的凹槽中,经抽滤去除乙醇、水和杂质。抽滤至难以产生连续的水流即停止抽滤。在抽滤器中可一次性成型形状和规格各异的多块果冻状胶原蛋白滤饼。然后,将沉淀置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥,设置真空度5~10Pa、冷阱温度为‑45℃~‑50℃,冷冻2.5h后升华干燥,制得形状和规格各异的不同海蜇胶原蛋白海绵产品。
60
最后用Co 辐照灭菌,包装入库。
[0086] 实施例7
[0087] 本实施例是在实施例6的基础上,进一步在抽滤过程中,先采用质量浓度为0.05%的交联剂溶液对滤饼进行淋洗3min,之后换成去离子水对滤饼进行淋洗8min。其中交联剂溶液为EDC‑NHS,EDC‑NHS摩尔比1:1,总浓度为0.05%。抽滤至难以产生连续的水流即停止抽滤。其余步骤与实施例6相同。
[0088] 将胶原海绵进行横切测试孔径大小,上述各例制备的海蜇胶原蛋白海绵的平均孔径约为1μm‑60μm。进一步将实施例1‑7制备的海蜇胶原蛋白海绵进行吸水性、酸碱度、可消化性、抗拉性能、抗压变性率等进行测试。测试方法如下:
[0089] ①吸水性测试:取质量约为20mg的试样,浸入盛有20℃士1℃水的烧杯中,用手指轻揉直至完全浸湿,且所有空气被除去,待吸足水分后,用小镊子轻轻夹住一将其从水中取出,轻持镊子在水面上排水1min后,再次称量。每个样品做3个平行,最终取平均值。
[0090] ②酸碱度测试:将0.2g样品,剪成约1cm2碎块,加入盛有12mL水的烧杯中,在37℃±1℃于密闭容器中浸泡24h,轻轻倒出液体(必要时用玻璃棒轻轻挤压),混匀,用酸度计测定溶液pH。
[0091] ③可消化性测试:取50mg块状试样一块,浸入盛水的烧杯中,用手指轻揉直至完全浸湿,且所有空气被除去。取出,用滤纸除去多余的水,将该潮湿的样品放入150ml具塞三角瓶中,瓶中已装有100mL预加热到37℃±1℃质量分数为1%胃蛋白酶(活力约为3000U/mg)的盐酸溶液[c(HCI)=0.1mol/L]。在37℃±1℃,约150r/min轻轻振摇直至完全消化。重复操作两次。报告3次完全消化的时间,取平均值。
[0092] ④抗拉性能测试:取胶原蛋白海绵剪成1cm宽的条状试样,一端固定,另一端施加可变化的拉力。拉力从0.5N开始每隔20s增加一档拉力,一档拉力为0.2N,直至样品断裂,记录断裂时的拉力大小。
[0093] ⑤抗压变性率测试:选取待测试的胶原蛋白海绵样品切成正方形小块,面积为2
4cm ,边长为2cm,厚度为2cm,无明显缺陷或损伤。记录每个样品的初始厚度(h0=2cm),精确至毫米级别。
[0094] 按照ISO 13359:2011《生物医学和外科植入用天然高分子材料胶原蛋白海绵的物理性能测试》中的规定进行测试。测试过程中,将胶原蛋白海绵样品放置在试验机的压缩夹具之间,确保接触面平整,避免夹持不均导致的局部应力集中。启动试验机,按照设定的加载速率对样品施加压力。至对样品加载压力达10kPa,保持恒定压力1min,模拟实际应用中可能遇到的持续受压情况。然后释放压力,让样品在无外力作用下自由恢复5min,以观察其复原性能。在压缩过程中和恢复阶段,记录样品的高度变化。压缩至预设程度时的厚度(h1),即受限器的高度。压缩结束后样品恢复后的最终厚度(h2)。抗压变性率计算使用公式:
[0095] 抗压变性率(%)=(h0‑h2)(h0‑h1)×100%
[0096] 该值表示样品在受压后未能恢复到初始厚度的程度,数值越小,说明胶原蛋白海绵的抗压变性和恢复性能越好。
[0097] 统计实施例1‑7胶原蛋白海绵的测试结果如下表:
[0098]
[0099]
[0100] 由以上测试结果可知,本发明制备的海蜇胶原海绵为酸性胶原溶液冻干品,其中实施例1‑5的海蜇胶原海绵产品吸水性较好,用于制作止血敷料;实施例6‑7制备的海蜇胶原海绵产品的力学性能较强,更适于纤维骨再生治疗
[0101] 最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
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