| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; 授权; |
| 专利有效性 | 有效专利 | 当前状态 | 授权 |
| 申请号 | CN202410386789.2 | 申请日 | 2024-04-01 |
| 公开(公告)号 | CN118286487A | 公开(公告)日 | 2024-07-05 |
| 申请人 | 吉林农业大学; | 申请人类型 | 学校 |
| 发明人 | 徐晨; 林文波; 董凯; 孙淑雯; | 第一发明人 | 徐晨 |
| 权利人 | 吉林农业大学 | 权利人类型 | 学校 |
| 当前权利人 | 吉林农业大学 | 当前权利人类型 | 学校 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：吉林省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：吉林省长春市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：吉林省长春市新城大街2888号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：130118 |
| 主IPC国际分类 | A61L15/18 | 所有IPC国际分类 | A61L15/18 ; A61L15/20 ; A61L15/46 ; A61L15/24 ; A61L15/38 ; A61L15/42 ; A61K38/43 ; A61K31/4375 ; A61K41/00 ; A61K47/69 ; A61K47/32 ; A61P17/02 ; A61P31/04 ; A61P29/00 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 10 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 北京盛询知识产权代理有限公司 | 专利代理人 | 张浩伟; |
| 摘要 | 本 发明 公开了一种促进复杂感染 伤口愈合 的多功能 纳米 纤维 膜的制备方法，属于功能性医用 敷料 技术领域，本发明以ZIF‑8 纳米晶 体为前驱体，经过 刻蚀 、 碳 化后得到了具有良好光热转化能 力 、类POD酶催化活性与载药能力的中空纳米酶HZC，然后负载 盐酸 小檗 碱 ，得到载药碳纳米酶HZCB，再通过静电方式包括HZCB制备多功能纳米纤维膜，本发明的多功能纳米纤维膜为 细胞增殖 、血管生成、肉芽组织形成和上皮再生提供了舒适的微环境，相容性好，安全性高，可有效 治疗 多种细菌引起的伤口复杂感染，同时 加速 创面愈合过程。 | ||
| 权利要求 | 1.一种促进复杂感染伤口愈合的多功能纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种促进复杂感染伤口愈合的多功能纳米纤维膜的制备方法技术领域背景技术[0002] 细菌感染是严重威胁公众健康的疾病之一，近几十年来引起了全世界的极大关注。传统敷料有限的抗菌能力和其他缺陷，使其无法有效地治疗复杂感染伤口。电纺纤维膜因其类似细胞外基质的三维拓扑结构和用于进一步生物功能化的大比表面积而变得越来越受欢迎。其灵活的制备方法可以轻松实现各种抗菌材料的负载或掺杂，使其成为开发先进伤口敷料的理想基质。通常，纤维的抗菌功能是通过在加工过程中引入抗生素来实现的。一般来说，受感染的伤口总是含有多种细菌，其中最常见的两种细菌是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和铜绿假单胞菌(PA)。众所周知，它们很容易形成生物膜，从而对各种抗生素不敏感，降低抗生素的功效，从而阻碍伤口的愈合。此外，多种细菌的交叉感染会导致细菌群体感应，进而对抗生素产生强烈的耐药性。这种类型的耐药细菌的风险极大地限制了抗生素的发展。抗生素的长期滥用还导致了耐药病原体正在以惊人的速度演变、增加和传播。因此，迫切需要开发新的抗菌策略和有效的药物，以更有效、更安全地对抗复杂的细菌感染。 [0003] 目前，植物源天然有效成分因其丰富的生物活性与罕见的不良反应在皮肤科制剂中得到了广泛的研究。盐酸小檗碱是一种异喹啉生物碱的盐酸盐，存在于多种药用植物中。大量研究表明，盐酸小檗碱对不同细菌均展现出了一定的抗菌效果。盐酸小檗碱可以通过抑制细菌中细胞外淀粉样蛋白肽的形成，从而干扰生物膜的形成；还可以通过结合生物膜上的一些蛋白质，破坏蛋白质结构达到对细菌生物膜完整性和通透性的破坏。鉴于其优良的抗菌活性，盐酸小檗碱可作为抗生素的理想替代品。然而，其有限的生物利用度和低的水溶性限制了其医疗用途。因此，迫切需要设计新的药物输送策略，以满足其用于创面敷料的开发需求。 发明内容[0004] 为解决上述技术问题，本发明提出了一种促进复杂感染伤口愈合的多功能纳米纤维膜的制备方法，本发明构建了近红外触发的三模协同抗菌纤维膜(PVA/HZCB)，以有效消除MRSA和PA诱导的复杂感染。以ZIF‑8纳米立方体作为前驱体，通过刻蚀、热解和载药处理，制备了携带盐酸小檗碱的中空碳纳米酶HZCB。与固体纳米结构相比，中空结构内腔中的多反射光路有助于提高近红外激光的收集效率，并且可以暴露更多的反应位点和接触界面，2 从而提高其催化活性。在低强度808nm近红外激光(0.3W/cm)照射下，PVA/HZCB纤维膜可以达到令人满意的PTT温度。在此温度下，它的类POD酶活性和药物释放均得到增强，形成了PTT‑CDT‑植物药协同抗菌体系，实现了“一箭三雕”的效果。PCB纳米纤维膜具有良好的生物相容性，在体外和体内都能有效地杀灭MRSA和PA，减轻炎症，促进复杂感染伤口的愈合。 [0005] 为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案： [0006] 本发明的技术方案之一： [0007] 一种促进复杂感染伤口愈合的多功能纳米纤维膜的制备方法，包括以下步骤： [0009] b.将所述HZIF‑8进行煅烧，冷却后得到中空碳纳米酶HZC； [0010] c.将所述中空碳纳米酶HZC分散于甲醇中，加入盐酸小檗碱，搅拌均匀后经过离心、干燥得到载药碳纳米酶HZCB； [0011] d.将所述载药碳纳米酶HZCB加入到聚乙烯醇中配制成纺丝液，进行静电纺丝，干燥，得到促进复杂感染伤口愈合的多功能纳米纤维膜。 [0012] 本发明合成了一种促进复杂感染伤口愈合的多功能纳米纤维膜，中空碳纳米酶HZC能够包裹客体分子，由金属有机骨架(MOF)衍生的多孔碳材料中空碳纳米酶HZC具有高比表面积、高容量、高包封性和良好的生物相容性，在生物医学应用、药物输送和治疗方面具有应用潜力。归因于其表面基团和独特的电子结构，MOF衍生的多孔碳材料中空碳纳米酶HZC具有多种酶活性，可实现化学动力学疗法(CDT)。此外，中空碳纳米酶HZC在近红外区具有很强的光吸收，有助于实现近红外光照射诱导的光热疗法(PTT)，并可设计为近红外激光触发的智能载药系统，提高药物递送效率。本发明将盐酸小檗碱负载于MOF衍生的中空碳纳米酶HZC上，构建PTT‑CDT‑植物药三模协同抗菌平台，以克服单一抗菌策略的有限效果或大剂量使用可能带来的副作用和代谢负担，这种三模协同抗菌平台在复杂伤口感染的治疗中几乎没有报道。 [0013] 进一步地，ZIF‑8的制备方法为：将2‑甲基咪唑溶解于100mL去离子水中，加入4mL CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)溶液，另取六水合硝酸锌溶于100mL去离子水中，缓慢加入到上述溶液中，搅拌得到乳白色溶液，将乳白色液体离心干燥后得到ZIF‑8。 [0014] 进一步地，在ZIF‑8的制备方法中，2‑甲基咪唑的添加量为8.8‑10.8g，CTAB溶液浓度为0.005M‑0.01M，六水合硝酸锌的添加量为0.5‑0.7g。 [0015] 进一步地，在ZIF‑8的制备方法中，搅拌时间为1‑3h，搅拌转速为600‑800r/min； [0016] 离心次数为1‑3次，干燥温度为40‑60℃，干燥时间为6‑8h。 [0017] 进一步地，步骤a中，ZIF‑8的添加量为80‑100mg，单宁酸溶液的浓度为10‑20g/L。 [0018] 进一步地，步骤a中，搅拌的时间为1‑5min，搅拌转速为600‑800r/min； [0019] 离心次数为1‑3次，干燥温度为40‑60℃，干燥时间为6‑8h。 [0020] 进一步地，步骤b中，HZIF‑8的煅烧温度为800‑1000℃，保温时间为1‑3h。 [0021] 进一步地，步骤c中，所述中空碳纳米酶HZC与盐酸小檗碱的质量比为(1∶2)‑(1∶4)。 [0022] 进一步地，步骤d中，载药碳纳米酶HZCB在纺丝液中的添加量为150‑250μg/mL，聚乙烯醇在纺丝液中的添加量为60‑80mg/mL。 [0024] 进一步地，步骤d中，干燥温度为40‑60℃，干燥时间为6‑8h。 [0025] 本发明的技术方案之二： [0026] 一种由上述制备方法制备得到的促进复杂感染伤口愈合的多功能纳米纤维膜。 [0027] 本发明的技术方案之三： [0028] 所述的多功能纳米纤维膜在制备促进复杂感染伤口愈合药物中的应用。 [0029] 与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果： [0030] (1)本发明首先以ZIF‑8纳米晶体为前驱体，经过刻蚀、碳化后得到了具有良好光热转化能力、类POD酶催化活性与载药能力的中空纳米酶HZC，然后负载盐酸小檗碱，得到载药碳纳米酶HZCB。此外，为了实现在伤口局部应用的目的，本发明使用具有生物相容性好、安全性高的PVA作为载体，将具有治疗作用的HZCB包裹其中，经过静电纺丝得到了PVA/HZCB纤维，这种治疗体系为细胞增殖、血管生成、肉芽组织形成和上皮再生提供了舒适的微环境。 [0031] (2)本发明多功能纳米纤维膜制备工艺流程简易、成本较低、工艺周期短。PVA/HZCB纳米纤维组分中的中空碳基纳米酶HZC与其前体HZIF‑8相比相对比表面积显著增大，3 2 HZC的孔容和比表面积分别为0.650cm /g和529.9m/g，而未碳化的HZIF‑8的孔容和比表面 3 2 积仅为0.246cm/g和101.9m/g。凭借较大的比表面积和有序的介孔结构，HZC能提供更多活性位点，有助于更有效地与底物结合，提高酶催化活性，并可以有效的负载盐酸小檗碱，负载率达到了42.3±2.2％。 [0032] (3)本发明制备的多功能纳米纤维膜具有良好的光热性能，只需要小功率激光照2 射(0.3W/cm)即可发挥光热效应，因而不易灼伤皮肤，节约能源，同时避免了传统光热疗法在高温治疗的同时对皮肤的炎症损害。同时，低强度NIR照射下达到的低温热效应增强了其类POD纳米酶催化活性与盐酸小檗碱的释放，提高了对细菌的杀伤能力，提供了协同作用。 这些不同的抗菌机制结合在一起，使PCB纳米纤维克服了单一模式高剂量带来的代谢负担，实现了低剂量下的快速高效灭菌(HZCB在纺丝液中的添加量优选为250μg/mL)。 [0033] (4)本发明制备的多功能纳米纤维膜生物相容性好，安全性高。经体外溶血实验与细胞活死染色实验，证明具有良好的生物相容性，不会对细胞活力或者小鼠皮肤造成伤害。 [0036] 图1为实施例1中中空碳纳米酶HZC、中空载药碳纳米酶HZCB和盐酸小檗碱的表征，其中A为载药碳纳米酶HZCB的SEM图，B为载药碳纳米酶HZCB的粒径分布图，C为中空碳纳米酶HZC和HZIF‑8的N2吸附‑脱附等温线，D为中空碳纳米酶HZC和HZIF‑8的孔容，E为中空载药碳纳米酶HZCB和盐酸小檗碱的FT‑IR光谱图； [0037] 图2为实施例1中PVA/HZCB纤维的表征，其中A为PVA/HZCB纤维的SEM图和纤维直径2 分布图，B为PVA/HZCB纤维在0.3W/cm低强度NIR照射下的时间‑温度曲线，对照为空白纳米纤维； [0038] 图3为实施例1中纳米材料的光热增强类POD酶活性表征，其中A为相同HZC浓度下HZCB与PVA/HZCB纳米纤维的吸收光谱，B为照射或不照射NIR激光的反应体系吸收光谱以及数码图片； [0039] 图4为实施例1中PVA/HZCB纤维的光响应释药特性； [0040] 图5为实施例1中PVA/HZCB纤维的体外抗菌性能，其中A为不同组处理后耐甲氧西林金黄色葡萄球菌与铜绿假单胞菌的菌落属数码照片，B为对应的抑菌率； [0041] 图6为实施例1中PVA/HZCB纤维的体外安全性测试结果，其中A为PVA/HZCB纤维组与不做任何处理的对照组的HaCaT细胞的细胞活力，B为PVA/HZCB纤维组与不做任何处理的对照组HaCaT细胞的荧光活死染色图，C为PVA/HZCB纤维的溶血率； [0042] 图7为实施例1中PVA/HZCB纤维体内复杂感染伤口愈合与生物安全性测试结果，其中A为PVA/HZCB纤维组与不做任何处理的对照组小鼠复杂感染伤口愈合情况的数码照片，B为PVA/HZCB纤维组与不做任何处理的对照组在第4、7与10天的伤口愈合率，C为PVA/HZCB纤维组与不做任何处理的对照组伤口组织处的菌落数； [0043] 图8中A为实施例1中PVA/HZCB纤维伤口愈合的组织学特征，B为实施例1中PVA/HZCB纤维伤口愈合的炎症水平，C为实施例1中PVA/HZCB纤维伤口愈合的愈合因子表达水平。 具体实施方式[0044] 现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。 [0045] 应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。 [0046] 除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。 [0047] 在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。 [0048] 关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。 [0049] 如无特殊说明，本发明实施例中的室温均按25±2℃计。 [0050] 本发明实施例所用各原料均为通过市售购买得到。 [0051] 以下通过实施例对本发明的技术方案做进一步说明。 [0052] 实施例1 [0053] a.将10.8g 2‑甲基咪唑溶解于100mL去离子水中，加入4mL 0.01M的CTAB溶液，得到混合溶液；另取0.7g六水合硝酸锌溶于100mL去离子水中，缓慢加入到上述溶液中，以800r/min的速率搅拌3h得到乳白色溶液，将乳白色溶液离心3次，在60℃干燥8h后得到ZIF‑ 8粉末； [0054] b.将步骤a中得到的100mg ZIF‑8粉末超声分散于25mL无水乙醇中，随后加入25mL10g/L的单宁酸溶液，以800r/min的速率搅拌5min得到混合液，上述混合液离心3次，在 60℃干燥8h后得到中空纳米晶体HZIF‑8； [0055] c.将步骤b中得到的HZIF‑8置于管式炉中，在氩气中以5℃/min的升温速率加热至800℃并保温3h，接着自然冷却至室温，得到ZIF‑8衍生中空载药碳纳米酶HZC； [0056] d.将步骤c中得到的10mg HZC超声分散于10mL甲醇中，加入40mg盐酸小檗碱，搅拌24h后离心3次，60℃干燥8h，得到载药碳纳米酶HZCB； [0057] e.将8g聚乙烯醇(PVA)溶于100mL去离子水中，得到8wt％的PVA纺丝溶液；将25mg HZCB加入到上述PVA纺丝溶液中搅拌均匀，得到PVA/HZCB纤维的纺丝液；将上述PVA/HZCB纤维的纺丝液进行静电纺丝，静电纺丝的参数如下：高压电源设置为15KV，喷嘴与接收器距离为15cm，溶液推进速度为0.4mL/h。设置完成后，开始静电纺丝过程，静电纺丝后，将产物于60℃干燥8h，最终得到PVA/HZCB纤维，即为促进复杂感染伤口愈合的多功能纳米纤维膜。 [0058] 实施例2 [0059] a.将9.8g 2‑甲基咪唑溶解于100mL去离子水中，加入4mL 0.0075M的CTAB溶液，得到混合溶液；另取0.6g六水合硝酸锌溶于100mL去离子水中，缓慢加入到上述溶液中，以700r/min的速率搅拌2h得到乳白色溶液，将乳白色溶液离心2次，在50℃干燥7h后得到ZIF‑ 8粉末； [0060] b.将步骤a中得到的90mg ZIF‑8粉末超声分散于25mL无水乙醇中，随后加入25mL 15g/L的单宁酸溶液，以700r/min的速率搅拌2.5min得到混合液，上述混合液离心2次，在50℃干燥7h后得到中空纳米晶体HZIF‑8； [0061] c.将步骤b中得到的HZIF‑8置于管式炉中，在氩气中以5℃/min的升温速率加热至900℃并保温2h，接着自然冷却至室温，得到ZIF‑8衍生中空载药碳纳米酶HZC； [0062] d.将步骤c中得到的10mg HZC超声分散于10mL甲醇中，加入30mg盐酸小檗碱，搅拌24h后离心3次，50℃干燥7h，得到载药碳纳米酶HZCB； [0063] e.将7g PVA溶于100mL去离子水中，得到7wt％的PVA纺丝溶液；将20mg HZCB加入到上述PVA纺丝溶液中搅拌均匀，得到PVA/HZCB纤维的纺丝液；将上述PVA/HZCB纤维的纺丝液进行静电纺丝，静电纺丝的参数如下：高压电源设置为14KV，喷嘴与接收器距离为12.5cm，溶液推进速度为0.3mL/h。设置完成后，开始静电纺丝过程，静电纺丝后，将产物于 50℃干燥7h，最终得到PVA/HZCB纤维，即为促进复杂感染伤口愈合的多功能纳米纤维膜。 [0064] 实施例3 [0065] a.将8.8g 2‑甲基咪唑溶解于100mL去离子水中，加入4mL 0.005M的CTAB溶液，得到溶液；另取0.5g六水合硝酸锌溶于100mL去离子水中，缓慢加入到上述溶液中，以600r/min的速率搅拌1h得到乳白色溶液，将乳白色溶液离心1次，在40℃干燥6h后得到ZIF‑8粉末； [0066] b.将步骤a中得到的80mg ZIF‑8粉末超声分散于25mL无水乙醇中，随后加入25mL 20g/L的单宁酸溶液，以600r/min的速率搅拌1min得到混合液，上述混合液离心1次，在40℃干燥6h后得到中空纳米晶体HZIF‑8； [0067] c.将步骤b中得到的HZIF‑8置于管式炉中，在氩气中以5℃/min的升温速率加热至1000℃并保温1h，接着自然冷却至室温，得到ZIF‑8衍生中空载药碳纳米酶HZC； [0068] d.将步骤c中得到的10mg HZC超声分散于10mL甲醇中，加入20mg盐酸小檗碱，搅拌24h后离心1次，40℃干燥6h，得到载药碳纳米酶HZCB； [0069] e.将6g PVA溶于100mL去离子水中，得到6wt％的PVA纺丝溶液；将15mg HZCB加入到上述PVA纺丝溶液中搅拌均匀，得到PVA/HZCB纤维的纺丝液；将上述PVA/HZCB纤维的纺丝液进行静电纺丝，静电纺丝的参数如下：高压电源设置为13KV，喷嘴与接收器距离为10cm，溶液推进速度为0.2mL/h。设置完成后，开始静电纺丝过程，静电纺丝后，将产物于40℃干燥6h，最终得到PVA/HZCB纤维，即为促进复杂感染伤口愈合的多功能纳米纤维膜。 [0070] 以实施例1为例，进行测试： [0071] 图1为实施例1中中空碳纳米酶HZC、中空载药碳纳米酶HZCB和盐酸小檗碱的表征，其中A为载药碳纳米酶HZCB的SEM图，B为载药碳纳米酶HZCB的粒径分布图，C为中空碳纳米酶HZC和HZIF‑8的N2吸附‑脱附等温线，D为中空碳纳米酶HZC和HZIF‑8的孔容，E为中空载药碳纳米酶HZCB和盐酸小檗碱的FT‑IR光谱图。如图1中A和B所示，从SEM图可以清楚地观察到HZCB明显的中空内部结构，这种内部空腔结构有助于更好地负载药物，HZCB的直径在100nm左右。如图1中C和D所示，碳化后的HZC在孔容与比表面积方面与碳化前的HZIF‑8相比有显3 2 著差异。HZC的孔容和比表面积分别为0.650cm/g和529.9m/g，而未碳化的HZIF‑8的孔容和 3 2 比表面积仅为0.246cm/g和101.9m/g。HZC凭借较大的比表面积和有序的介孔结构，能提供更多活性位点，有助于更有效地与底物结合，提高酶催化活性，并为药物负载提供了基础。 如图1中E所示FT‑IR光谱中345nm处清晰的吸收峰也证实了BBH在HZCB上的成功负载。根据标准曲线，计算得出BBH在HZCB上的负载量为42.3±2.2％。 [0072] 图2为实施例1中PVA/HZCB纤维的表征，其中A为PVA/HZCB纤维的SEM图和直径分布图，B为PVA/HZCB纤维的光热性能，对照为空白纳米纤维。如图2中A所示，PVA/HZCB纤维均具有良好的网状多孔结构，纤维直径约为195nm，且分布均匀。这表明HZCB的加入并未影响纳米纤维的形态。在近红外激光照射下，评估了PVA/HZCB纤维的光热性能。如图2中B所示，在2 0.3W/cm NIR激光照射下，空白纳米纤维未显示明显温度变化，而PVA/HZCB纤维温度在5分钟内达到45.8℃。 [0073] 图3为实施例1中纳米材料的光热增强类POD酶活性表征，其中A为相同HZC浓度下HZCB与PVA/HZCB纳米纤维的吸收光谱，B为照射或不照射NIR激光的反应体系吸收光谱以及数码图片。根据在H2O2辅助下氧化TMB的显色反应，在PBS(pH＝4.0，10mM)中测定了HZC、HZCB和PCB纳米纤维膜的类POD酶催化性能，所有反应均在37℃下进行，反应时间5min，并记录紫外‑可见光吸收光谱。其中，H2O2浓度为25mM，TMB浓度为1mM，HZC浓度为40μg/mL，反应总体系为400μL。对于NIR激光照射下的类过氧化物酶活性，在相同条件下，用NIR激光照射反应体系5min并记录紫外吸收光谱。由图3中A可知，在相同HZC含量下，载药的HZCB的催化活性与未载药的相似，说明药物载荷不影响其催化活性。此外，在HZC含量相同的情况下，PVA/HZCB纤维也表现出与之相当的催化活性，这表明PVA/HZCB纤维可作为有效的过氧化物酶模拟物。NIR辐射下652nm处的吸收峰强度高于未照射的体系(图3中B)，表明HZC的催化活性可通过光热方法增强。这种现象可能是因为NIR激光照射提高了反应体系的温度。 [0074] 图4为实施例1中PVA/HZCB纤维的光响应释药特性。如图4所示，PVA/HZCB纤维在32 次重复的0.3W/cm NIR激光照射后，累计药物释放率达到了77.7±1.6％，显著高于未照射的对照组(37.7±0.7％)。这说明PVA/HZCB纤维能通过NIR激光实现药物的响应性释放。 [0075] 以两种棘手的常见创面相关菌株(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和(铜绿假单胞菌)PA)，采用琼脂平板法系统评估了PVA/HZCB纤维三模协同治疗体系在体外的抗菌性能。图5为实施例1中PVA/HZCB纤维的体外抗菌性能。如图5中A和B所示，PVA/HZCB纤维联合2 低浓度H2O2(100μM)与低强度NIR(0.3W/cm)共同治疗时，细菌几乎完全死亡，对MRSA与PA的抑菌率分别达到了98.7±0.8％与98.6±0.7％，显示出优异的杀菌效果。此强大抗菌功效可以归功于多种抗菌模式：NIR激光照射下产生的局部温热可以杀死部分细菌(PTT功效)，并且温度升高会加速释放HZCB中封装的盐酸小檗碱，进而增强杀菌效果(药物治疗功效)； 同时，NIR激光照射下产生的热量提高了HZCB的类POD酶催化活性，更加有效地将H2O2转变为有毒物质·OH，其强氧化性能够快速破坏细菌细胞膜及胞内物质，导致细菌死亡(化学动力学功效)。这种三协同杀菌体系减少了药物用量和NIR激光强度，大大降低了对机体的毒副作用，同时达到了令人满意的抗菌效果。 [0076] 选用HaCaT细胞作为研究对象，通过MTT法考察了纳米纤维的细胞毒性，图6为实施例1中PVA/HZCB纤维的体外安全性测试结果。如图6中A所示，PVA/HZCB纤维对HaCaT细胞表现出可忽略不计的细胞毒性，细胞存活率超过90％，与不做任何处理的对照组正常细胞无显著差异。细胞活/死双染实验进一步证明了这一点，处理过后的细胞形态正常，且密度较高(图6中B)。这些结果表明PVA/HZCB纤维具有良好的细胞相容性。随后对材料的溶血率进行测试，结果如图6中C所示，溶血率小于5％。溶血率小于5％的材料通常被视为具有良好的血液相容性。和阳性以及阴性对照样相比，本发明的PVA/HZCB纤维未引起溶血现象。 [0077] 在小鼠皮肤表面创建复杂感染伤口模型，进一步研究了PVA/HZCB纤维的体内杀菌效果，在所有雌性ICR小鼠的背部构建一个直径为1cm的圆形创面，并用高浓度的MRSA和PA混合菌液感染伤口，建立了皮肤复杂感染模型。在特定治疗日期对小鼠伤口处拍照记录伤口愈合情况，图7为实施例1中PVA/HZCB纤维体内复杂感染伤口愈合与生物安全性测试结果。如图7中A和B所示，在伤口创建的初期，各组伤口面积相近。术后第四天，治疗组的伤口2 面积明显减小。PVA/HZCB纤维处理组在施加低浓度H2O2(100μM)与低强度NIR(0.3W/cm)的情况下，伤口愈合率达到58.2±2.5％，没有出现红肿、炎症的现象。术后第10天，PVA/HZCB纤维+H2O2+NIR组的伤口几乎完全愈合，愈合率高达95.8±1.9％。此外，通过平板计数法进一步评估了PVA/HZCB纤维的体内抗菌活性。如图7中C所示，结果与体外抗菌相当，PVA/HZCB纤维+H2O2+NIR组抗菌效果最佳，对照组中还存在大量的菌落。这些结果证明在低光照强度下产生的温和光热效应不仅无不良影响，反而增强了PVA/HZCB纤维的POD模拟酶性能与BBH释放，有效对抗复杂细菌感染，促进复杂感染伤口的愈合。 [0078] 通过H&E和Masson三色染色评估了伤口愈合的组织学特征，结果如图8所示。从图8中A可以看出，术后第10天，所有对照组伤口处仍有大量炎症细胞浸润与严重表皮缺损，表明复杂细菌感染情况下自然愈合情况较差，PVA/HZCB纤维+H2O2+NIR组表现出了最佳愈合情况，形成了完整表皮结构，并能观察到较多的新生皮肤附属物。Masson三色染色结果显示，PVA/HZCB纳米纤维+H2O2+NIR组的胶原蛋白沉积显著高于其他组。 [0079] 为了探索伤口愈合的内在驱动力，通过免疫组化评估了感染伤口组织的炎症水平和愈合因子的表达(图8中B、C)。IL‑1β的免疫组化结果显示，PVA/HZCB纤维+H2O2+NIR组的炎症水平最低，这可能是由于其它有效清除了伤口部位的多种细菌，从而降低了炎症因子的表达。同时PVA/HZCB纤维+H2O2+NIR组VEGF‑A的表达与对照组相比均显著较高。这些结果表明，PVA/HZCB纳米纤维膜联合H2O2与NIR激光，可以通过抑制细菌感染来减轻炎症，促进毛细血管的生成，从而有效促进伤口愈合。 [0080] 以上，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。 |
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