抗体诱导性多肽及疫苗 |
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| 申请号 | CN202280045014.8 | 申请日 | 2022-06-24 | 公开(公告)号 | CN117897396A | 公开(公告)日 | 2024-04-16 |
| 申请人 | 渡部良広; | 发明人 | 渡部良広; 川野充弘; 细川菜津子; 三浦智行; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供一种可用于 治疗 或 预防 对象中的SARS‑CoV‑2感染的 抗体 诱导性多肽及包含该抗体诱导性多肽的 疫苗 。一种多肽，选自以下(a)～(f)所述的多肽组，并具有抗体诱导性：(a)由序列号1的336～361位、406～432位或446～480位的位点内的连续7个以上 氨 基酸组成的多肽；(b)具有与所述(a)所述的任一多肽的氨基酸序列具有80％以上序列同源性的氨基酸序列的多肽；(c)包含所述(a)或(b)所述的多肽作为部分序列，且不包含除序列号1的所述部分序列以外的位点的多肽；(d)由序列号1的1144～1161位或1174～1202位的位点内的连续10个以上氨基酸组成的多肽；(e)具有与所述(d)所述的任一多肽的氨基酸序列具有80％以上序列同源性的氨基酸序列的多肽；及(f)包含所述(d)或(e)所述的多肽作为部分序列，且不包含除序列号1的所述部分序列以外的位点的多肽。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种多肽，选自以下(a)～(f)所述的多肽组，并具有抗体诱导性，(a)由序列号1的336～361位、406～432位或446～480位的位点内的连续7个以上氨基酸组成的多肽； |
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| 说明书全文 | 抗体诱导性多肽及疫苗技术领域背景技术[0002] 新冠病毒是一组由网巢病毒目新冠病毒科正冠状病毒亚科组成的RNA病毒。新冠病毒是具有正义单链RNA基因组和螺旋对称的核衣壳的包膜病毒，其具有从衣壳表面突起有棒状突起的特殊形状。新冠病毒在RNA病毒中也属于大型病毒，其基因组大小为约26～32KB。 [0003] 已知新冠病毒是在哺乳动物、鸟类等中引起传染病的RNA病毒，特别是会引起轻度度至重度的呼吸道感染。在人体中，新冠病毒轻则导致普通感冒(除新冠病毒以外，还已知有很多导致感冒的病毒)，SARS、MERS等部分新冠病毒还会引起更为致命的症状。新型新冠病毒SARS‑CoV‑2的数量仍在持续增加，需要尽快开发及普及SARS‑CoV‑2的疫苗及治疗药物。 [0004] SARS‑Cov‑2的病毒表面存在与宿主细胞的受体结合的刺突蛋白。该刺突蛋白是具有三聚体结构的糖蛋白，每种多肽链由N端结构域(NTD)、受体结合结构域(RBD)及S2结构域构成。已知受体结合结构域(RBD)中存在“向下结构”和“向上结构”，向上结构的RBD与宿主细胞表面的血管紧张素突变酶II(ACE2)受体结合(非专利文献1)。另一方面，已知新冠病毒的S2结构域在感染时参与病毒与宿主细胞的膜融合(非专利文献2)。 [0005] 作为用于预防SARS‑CoV‑2的疫苗，目前，除将编码大部分刺突蛋白(S抗原)的mRNA封入脂质纳米粒子等载体分子中而成的mRNA疫苗以外，还开发了导入有S抗原基因序列的腺病毒表达载体、表达DNA疫苗、重组蛋白等。 [0006] 现有技术文献 [0007] 非专利文献 [0008] 非专利文献1：D.Wrapp et al.,Science,Vol.367,pp.1260‑1263(2020)[0009] 非专利文献2：A.C.Wallis et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.114,pp.11157‑11162(2017) 发明内容[0010] mRNA疫苗虽然具有无感染性、生产成本低廉且相对简单等优点，但也存在RNA分子的稳定性低、容易出现较强副反应、体内的翻译及表达效率容易产生个体差异等课题。 [0011] 另一方面，在使用S抗原整体的疫苗中，存在潜在生成会诱发抗体依赖性感染增强(ADE；antibody‑dependent infection enhancement)的抗体物种的风险。实际上，在老年重症COVID‑19患者的血清中，有一定的比例报道了存在诱导ADE的抗体。最近，使用COVID‑19患者血清，鉴定出显示该ADE诱发能力的抗体所识别的表位，从而发现有望通过从疫苗中除去这些表位来规避ADE风险。 [0012] 本发明旨在提供一种可用于治疗或予防对象中的SARS‑CoV‑2感染的抗体诱导性多肽及包含该多肽的疫苗。 [0013] 本发明人等通过全面地对S抗原、特别是对作为造成SARS‑CoV‑2感染的位点的RBD位点全部及S2结构域％R1/2领域全部进行研究，发现了多个新型中和抗体诱导多肽(中和抗体表位)，并发现这些多肽可用于诱导用于治疗或予防SARS‑CoV‑2感染的抗体。另外，还发现了多个COVID‑19患者血清共同识别的新型抗体表位，并发现具有这些表位序列的多肽可用于诱导用于治疗或予防SARS‑CoV‑2感染的抗体，从而完成了本发明。 [0015] (1)一种多肽，选自以下(a)～(f)所述的多肽组，并具有抗体诱导性， [0016] (a)由序列号1的336～361位、406～432位或446～480位的位点内的连续7个以上氨基酸组成的多肽； [0017] (b)具有与所述(a)所述的任一多肽的氨基酸序列具有80％以上序列同源性的氨基酸序列的多肽； [0018] (c)包含所述(a)或(b)所述的多肽作为部分序列，且不包含除序列号1的所述部分序列以外的位点的多肽； [0019] (d)由序列号1的1144～1161位或1174～1202位的位点内的连续10个以上氨基酸组成的多肽； [0020] (e)具有与所述(d)所述的任一多肽的氨基酸序列具有80％以上序列同源性的氨基酸序列的多肽；及 [0021] (f)包含所述(d)或(e)所述的多肽作为部分序列，且不包含除序列号1的所述部分序列以外的位点的多肽。 [0022] (2)根据(1)所述的多肽，其中，选自以下(a)～(c)所述的多肽组， [0023] (a)由序列号1的336～361位、406～432位或446～480位的位点内的连续7个以上氨基酸组成的多肽； [0024] (b)具有与所述(a)所述的任一多肽的氨基酸序列具有80％以上序列同源性的氨基酸序列的多肽；及 [0025] (c)包含所述(a)或(b)所述的多肽作为部分序列，且不包含除序列号1的所述部分序列以外的位点的多肽。 [0026] (3)根据(1)所述的多肽，选自以下(d)～(f)所述的多肽组， [0027] (d)由序列号1的1144～1161位或1174～1202位的位点内的连续10个以上氨基酸组成的多肽； [0028] (e)具有与所述(d)所述的任一多肽的氨基酸序列具有80％以上序列同源性的氨基酸序列的多肽；及 [0029] (f)包含所述(d)或(e)所述的多肽作为部分序列，且不包含除序列号1的所述部分序列以外的位点的多肽。 [0030] (4)一种用于治疗或予防SARS‑CoV‑2感染的疫苗，包含(1)所述的多肽中的至少一种多肽。 [0031] (5)根据(4)所述的疫苗，其中，包含(2)所述的多肽中的至少一种多肽及(3)所述的多肽中的至少一种多肽。 [0032] (6)根据(4)或(5)所述的疫苗，其中，多肽作为与载体分子结合后的缀合物被包含。 [0033] (7)根据(4)～(6)中任一项所述的疫苗，其中，多种多肽作为键合在相同载体分子上的缀合物被包含。 [0034] (8)根据(6)或(7)所述的疫苗，其中，缀合物具有多肽在载体分子上交联而成的环状结构。 [0035] (9)根据(7)或(8)所述的疫苗，其中，所述疫苗为粘膜疫苗。 [0036] (10)根据(9)所述的疫苗，其中，所述疫苗为舌下疫苗。 [0037] (11)一种抗体诱导组合物，包含(1)所述的多肽中的至少一种多肽。 [0038] (12)根据(1)所述的多肽，其中，所述多肽为由序列号40～44中的任意一种表示的氨基酸序列的连续7个以上氨基酸组成的多肽。 [0039] (13)一种治疗或预防SARS‑CoV‑2感染的方法，包括向对象给药(4)～(10)中任一项所述的疫苗的工序。 [0042] 图1是示出使SARS‑CoV‑2的RBD的位点的各种多肽敏化后的小鼠的血清IgG的RBD蛋白质识别能力的柱状图。纵轴表示各种血清IgG对RBD蛋白质的结合性。 [0043] 图2是示出使SARS‑CoV‑2的RBD的位点#3、#7、#11的多肽敏化后的小鼠的血清的ACE2‑RBD结合抑制能力的柱状图。纵轴示出ACE2对RBD的结合性。 [0044] 图3是示出使SARS‑CoV‑2的RBD的位点#1、#5、#11的多肽敏化后的小鼠的血清、及SARS‑CoV‑2感染恢复患者的血清的ACE2‑RBD结合抑制能力的柱状图。纵轴表示ACE2对RBD的结合性，横轴表示各种血清的稀释率。 [0045] 图4是示出使SARS‑CoV‑2的S2结构域的位点的各种多肽敏化后的小鼠的血清IgG的S2结构域蛋白质识别能力的柱状图。纵轴表示各种血清IgG对S2结构域蛋白质的结合性。 [0046] 图5是示出使混合缀合物多肽(#7、#11、#111及#115)敏化后的小鼠中追加的重复舌下敏化(SLIT)引起的IgG抗体量的变化的柱状图。纵轴表示各抗体的肽识别能力。(A)示出高剂量SLIT组、低剂量SLIT组及对照组的小鼠血清中的IgG对#7及#11的混合缀合物的反应性。(B)示出高剂量SLIT组、低剂量SLIT组及对照组的小鼠血清中的IgG对#111的缀合物的反应性。(C)示出高剂量SLIT组、低剂量SLIT组及对照组的小鼠血清中的IgG对#115的缀合物的反应性。 [0047] 图6示出使混合缀合物多肽(#7、#11、#111及#115)敏化后的小鼠中追加的反复舌下敏化(SLIT)引起的IgA抗体量的变化的柱状图。纵轴表示各抗体的肽识别能力。(A)表示高剂量SLIT组、低剂量SLIT组及对照组的小鼠血清中的IgA对#7及#11的混合缀合物的反应性。(B)表示高剂量SLIT组、低剂量SLIT组及对照组的小鼠血清中的IgA对#111的缀合物的反应性。(C)表示高剂量SLIT组、低剂量SLIT组及对照组的小鼠血清中的IgA对#115的缀合物的反应性。 [0048] 图7是示出分别使呈递#7、#10及#11后的抗原敏化后的小鼠的血清对突变型SARS‑CoV‑2的RBD表位呈递抗原的反应性的图表。(A)表示#7识别血清对野生型、K417N突变RBD表位的反应性。(B)表示#10识别血清对野生型、L452R突变RBD表位的反应性。(C)表示#11识别血清对野生型、T478K突变RBD表位的反应性。 [0049] 图8是示出从使各种缀合物肽敏化后的小鼠中收集的抗血清及这些抗血清组合对假型慢病毒感染ACE2表达CRFK细胞的控制能力的图表。 具体实施方式[0050] [1]定义 [0051] 在本说明书中，“多肽”是指通过多个氨基酸进行肽结合所形成的分子。不仅是构成的氨基酸数量多的多肽分子，氨基酸数量少的低分子量的分子(寡肽)也包括在本发明的多肽中。 [0052] 在本说明书中，“抗体诱导性”是指，诱导作为对于对象中的SARS‑CoV‑2感染的防控功能的液性免疫，并产生对于SARS‑CoV‑2的抗体的特性。特别是指，在对象中诱导产生对于SARS‑CoV‑2的中和抗体的特性。 [0053] 在本说明书中，“疫苗”是指，为了治疗或预防对象中因细菌、病毒、过敏原等病原的侵袭所导致的疾患或身体不适，给药以诱导针对对象的病原的免疫(抗体产生能力)的药物组合物。 [0054] 在本说明书中，“对象”是指哺乳动物及鸟类。鸟类是指属于脊索动物门脊椎动物亚门鸟纲的动物，可列举例如：鸡、鸭、鹌鹑、鹅、野鸭、火鸡、虎皮鹦鹉、鹦鹉、鸳鸯、天鹅等。哺乳动物是指属于脊索动物门脊椎动物亚门哺乳纲的动物，包括人及人以外的动物，包括例如：包括人和黑猩猩的灵长类动物、狗、猫等宠物动物、牛、猪、马、绵羊、山羊等家畜动物、小鼠、大鼠等啮齿类、动物园中饲养的哺乳动物动物等。本说明书中的对象优选为人。 [0055] 在本说明书中，氨基酸序列的“序列同源性”是指，使用BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)等蛋白质检索系统，在导入间隔或不导入间隔下能够确定的值。另外，在本说明书中，“数个”中“数”表示整数2～10，优选表示整数2～6、整数2～4、整数2或3或整数2。 [0056] 在本说明书中，“佐剂”是指可以通过与疫苗内的抗体诱导性物质共同向对象给药来提高其抗体诱导效果的物质。 [0057] 在本说明书中，只要没有特别说明，则“配合比”均由重量比表示。另外，只要没有特别说明，则由“％”表示的浓度均表示重量％。 [0058] [2]抗体诱导性多肽 [0059] 本发明的多肽是选自以下(a)～(f)所述的多肽组，并具有抗体诱导性的多肽。 [0060] (a)由序列号1的336～361位、406～432位或446～480位的位点内的连续7个以上氨基酸组成的多肽； [0061] (b)具有与所述(a)所述的任一多肽的氨基酸序列具有80％以上序列同源性的氨基酸序列的多肽； [0062] (c)包含所述(a)或(b)所述的多肽作为部分序列，且不包含除序列号1的所述部分序列以外的位点的多肽； [0063] (d)由序列号1的1144～1161位或1174～1202位的位点内的连续7个以上氨基酸组成的多肽； [0064] (e)具有与所述(d)所述的任一多肽的氨基酸序列具有80％以上序列同源性的氨基酸序列的多肽；及 [0065] (f)包含所述(d)或(e)所述的多肽作为部分序列，且不包含除序列号1的所述部分序列以外的位点的多肽。 [0066] 本发明的多肽通过具有上述构成而具有抗体诱导性，通过将其作为肽疫苗、缀合物疫苗等向对象给药，具有可用于预防SARS‑CoV‑2感染的效果。 [0067] 已知参与SARS‑CoV‑2感染宿主细胞的刺突蛋白具有序列号1所示的氨基酸序列。特别是，参与向宿主细胞结合的受体结合结构域(RBD)和参与与宿主细胞膜融合的S2结构域是导致SARS‑CoV‑2感染的位点。已知RBD具有序列号2(相当于序列号1的氨基酸序列的 316～519位)的氨基酸序列。已知S2结构域内存在％R1区和％R2区，它们分别具有序列号3(相当于序列号1的氨基酸序列的910～1032位)、序列号4(相当于序列号1的氨基酸序列的 1141～1223位)的氨基酸序列。 [0068] 本发明人等发现，构成SARS‑CoV‑2的RBD及S2结构域的氨基酸序列的多肽中的特定多肽在小鼠和/或人中具有高抗体诱导性。所述特定多肽是以下序列号5～9所示的序列。 [0069] CPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNC(序列号5：336‑361) [0070] EVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGC(序列号6：406‑432) [0071] GGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPC(序列号7：446‑480) [0072] ELDSFKEELDKYFKNHTS(序列号8：1144‑1161) [0073] ASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQE(序列号9：1174‑1202) [0074] 本发明的多肽包含全部具有序列号5～9的氨基酸序列的多肽，但不限定于此，也包括具有与序列号5～9的氨基酸序列具有80％以上、优选85％以上或90％以上的序列同源性的氨基酸序列的多肽。或者，也包括具有序列号5～9的氨基酸序列的多肽中的一个或数个氨基酸经修饰后的多肽。一般认为，某一多肽中低于20％、特别是低于15％或低于10％的氨基酸的修饰或者一个或数个氨基酸的修饰不会对原多肽的功能产生影响，有时甚至会增强原多肽的所需功能。实际上，已知由与原来的氨基酸序列相比一个或数个氨基酸残基经修饰(即取代、缺失、添加和/或插入)的氨基酸序列构成的修饰多肽保持原多肽的生物活性(Mark et al.,1984,Proc Natl Acad Sci USA,81:5662‑5666,Zoller and Smith,1982,Nucleic Acids Res.10:6487‑6500,Dalbadie‑McFarland et al.,1982,Proc Natl Acad Sci USA.79:6409‑6413)。因此，上述(b)及(e)的多肽也可以发挥抗体诱导性。 [0075] 另外，本发明的多肽不仅包括具有序列号5～9内的连续氨基酸序列的多肽(包含上述修饰多肽)，还包括包含其作为一部分，且不包含序列号1的其他位点的多肽，即上述(c)及(f)的多肽。 [0076] 需要说明的是，已知构成天然蛋白质的20种氨基酸可以分为具有低极性侧链的中性氨基酸(Gly、Ile、Val、Leu、Ala、Met、Pro)、具有亲水性侧链的中性氨基酸(Asn、Gln、Thr、Ser、Tyr、Cys)、酸性氨基酸(Asp、Glu)、碱性氨基酸(Arg、Lys、％is)、芳香族氨基酸(Phe、Tyr、Trp)之类具有类似性质的氨基酸，如果是它们之间的取代，则多肽的性质大多会产生变化。因此，在取代序列号5～9的氨基酸序列中的氨基酸残基的情况下，通过在以上各组之间进行取代，能够保持抗体诱导性的可能性升高。 [0077] 抗体依赖性感染增强(Antibody‑Dependent Enhancement：ADE)是开发疫苗的重大课题，对于抗体诱导性高的抗原，消除ADE的问题是一项重要的要求。最近发现，SARS‑CoV‑2的ADE表位是表1所示的位点(参见doi.org/10.1101/2020.10.08.20209114)。本发明的多肽不属于下述任何ADE表位，因此确认其是具备高抗体诱导性和安全性的多肽。 [0078] [表1] [0079] [表1] [0080] [0081] 作为SARS‑CoV‑2，报道了N501、E484、L452等突变株，本发明的多肽对于这些主要的突变株也具有感染抑制能力。 [0082] 本发明的多肽的制备方法不受特别限定，能够使用本技术领域使用的公知的用于制备多肽的手法、例如Fmoc固相合成法，Boc固相合成法等肽固相合成法、利用重组大肠杆菌的生成等中的任意方式。 [0083] [2‑1]第一方案的多肽(RBD多肽) [0084] 本发明的第一方案的多肽选自以下(a)～(c)所述的多肽组。 [0085] (a)由序列号1的336～361位、406～432位或446～480位的位点内的连续7个以上氨基酸组成的多肽； [0086] (b)具有与所述(a)所述的任一多肽的氨基酸序列具有80％以上序列同源性的氨基酸序列的多肽； [0087] (c)包含所述(a)或(b)所述的多肽作为部分序列，且不包含除序列号1的所述部分序列以外的位点的多肽。 [0088] 本发明的第一方案的多肽是SARS‑CoV‑2的RBD的位点的多肽。本发明人等确认，RBD的位点的多肽中具有高抗体诱导性的特定多肽，其在作为缀合物疫苗在小鼠中敏化时，得到的抗体会抑制SARS‑CoV‑2的RBD与ACE2受体结合。 [0089] 所述特定多肽是具有序列号5～7的序列的多肽。 [0090] CPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNC(序列号5) [0091] EVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGC(序列号6) [0092] GGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPC(序列号7) [0093] 本发明的第一方案的多肽包括序列号5～7的多肽。但不限定于此，还可以为如下多肽：(a)由序列号1的336～361位、406～432位(优选为411～427位)或446～480位(优选为459～480位)的位点内的连续7个以上、优选连续8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21或22个以上氨基酸组成的多肽；(b)具有与所述(a)所述的任一多肽的氨基酸序列具有80％以上、优选85％、90％或95％以上序列同源性的氨基酸序列的多肽；及(c)包含所述(a)或(b)所述的多肽作为部分序列，且不包含除序列号1的所述部分序列以外的位点的多肽。SARS‑CoV‑2已知很多突变型，可以为构成任意突变型SARS‑CoV‑2的RBD的多肽。 [0094] 本发明的第一方案的多肽可以为构成已知突变型SARS‑CoV‑2(突变株)的RBD的多肽，例如，下述由序列号40～44中的任意一种表示的氨基酸序列的连续7个以上氨基酸组成的多肽。 [0095] APGQTGNIADYNYKLPDDFTGC(序列号40：K417N) [0096] GGNYNYRYRLFRKSNLKPFERD(序列号41：L452R) [0097] SNLKPFERDISTEIYQAGNTPC(序列号42：S477N) [0098] SNLKPFERDISTEIYQAGSKPC(序列号43：T478K) [0099] SNLKPFERDISTEIYQAGNKPC(序列号44：S477N/T478K) [0100] 在对象中特别是诱导对于特定突变株的抗体的情况下，优选使用该突变株对应的氨基酸序列的多肽。由此，可以对于靶向突变株更有效地诱导抗体。 [0101] 本发明的第一方案的多肽通过向对象给药，诱导对象中产生对于SARS‑CoV‑2的RBD的抗体，从而在SARS‑CoV‑2侵袭对象的体内的情况下，通过抑制经由SARS‑CoV‑2的RBD与ACE2受体结合，能够防止感染。 [0102] [2‑2]第二方案的多肽(S2结构域多肽) [0103] 本发明的第二方案的多肽选自以下(d)～(f)所述的多肽组。 [0104] (d)由序列号1的1144～1161位或1174～1202位的位点内的连续10个以上氨基酸组成的多肽； [0105] (e)具有与所述(d)所述的任一多肽的氨基酸序列具有80％以上序列同源性的氨基酸序列的多肽；及 [0106] (f)包含所述(d)或(e)所述的多肽作为部分序列，且不包含除序列号1的所述部分序列以外的位点的多肽。 [0107] 本发明的第二方案的多肽是构成SARS‑CoV‑2的S2结构域的多肽。本发明人等在构成S2结构域的多肽中鉴定到了具有高抗体诱导性的特定多肽。 [0108] 所述特定多肽是具有序列号8及9的序列的多肽。 [0109] ELDSFKEELDKYFKNHTS(序列号8) [0110] ASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQE(序列号9) [0111] 本发明的第二方案的多肽包括序列号8、9的多肽。但并限定于此，还包括下述多肽：(d)由序列号1的1144～1161位或1174～1202位的位点内的连续7个以上、优选连续8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、或18个以上氨基酸组成的多肽；(e)具有与所述(d)所述的任一多肽的氨基酸序列具有80％以上、优选85％或90％以上序列同源性的氨基酸序列的多肽； 及(f)包含所述(d)或(e)所述的多肽作为部分序列的多肽。SARS‑CoV‑2已知很多突变型，可以为构成任意突变型SARS‑CoV‑2的S2结构域的多肽。 [0112] 本发明的第二方案的多肽通过向对象给药，诱导对象中产生对于SARS‑CoV‑2的S2结构域的抗体，由此即使在SARS‑CoV‑2侵袭对象的体内的情况下，通过抑制经由SARS‑CoV‑2的S2的S2结构域与宿主细胞的膜融合，也能够防止感染。 [0113] [3]疫苗 [0114] 本发明的疫苗是用于治疗或予防SARS‑CoV‑2感染的疫苗，包含“[2]抗体诱导性多肽”一项中所述的本发明的多肽中的至少一种多肽。即，本发明的疫苗是对于SARS‑CoV‑2的肽疫苗。 [0115] 本发明的疫苗可以仅包含一种本发明的多肽，另外，也可以包含多种。本发明的疫苗优选包含下述所示的第一方案的多肽中的至少一种和第二方案的多肽中的至少一种。 [0116] (i)第一方案的多肽 [0117] 一种多肽，选自以下(a)～(c)所述的多肽组。 [0118] (a)由序列号1的336～361位、406～432位或446～480位的位点内的连续7个以上氨基酸组成的多肽； [0119] (b)具有与所述(a)所述的任一多肽的氨基酸序列具有80％以上序列同源性的氨基酸序列的多肽； [0120] (c)包含所述(a)或(b)所述的多肽作为部分序列，且不包含除序列号1的所述部分序列以外的位点的多肽。 [0121] (ii)第二方案的多肽 [0122] 选自以下(d)～(f)所述的多肽组。 [0123] (d)由序列号1的1144～1161位或1174～1202位的位点内的连续10个以上氨基酸组成的多肽； [0124] (e)具有与所述(d)所述的任一多肽的氨基酸序列具有80％以上序列同源性的氨基酸序列的多肽；及 [0125] (f)包含所述(d)或(e)所述的多肽作为部分序列，且不包含除序列号1的所述部分序列以外的位点的多肽。 [0126] 即，第一方案的多肽是SARS‑CoV‑2的RBD的位点的多肽，第二方案的多肽是SARS‑CoV‑2的S2结构域的位点的多肽。本发明的疫苗的优选形式包含SARS‑CoV‑2的RBD和S2结构域这两个位点的多肽。通过包含两个位点的多肽，在向对象给药的情况下，能够同时抑制SARS‑CoV‑2感染中与ACE2受体结合和与宿主细胞膜融合这两步，可以对对象进行SARS‑CoV‑2感染的双重防御。 [0127] 在本发明的疫苗含有第一方案的多肽和第二方案的多肽的情况下，它们的配合比不受特别限定，可以采用例如1：10～10：1，优选采用1：5～5：1。更优选的配合比为1：1。在作为第一方案的多肽及第二方案的多肽分别使用多种多肽的情况下，各方案的多肽的配合比也不受特别限定，可以采用例如1：10～10：1，优选采用1：5～5：1。更优选的配合比为1：1。 [0128] 作为本发明的疫苗中所含的多肽的形式，只要保持抗体诱导性，则不受特别限制，也可以为线性肽的形式，也可以为与载体分子结合的缀合物的形式。这里所说的“载体分子”是用于保持或提高多肽的抗体诱导性的分子，例如，作为白蛋白、甲状腺球蛋白、卵清蛋白(OVA)、葡聚糖、琼脂糖凝胶(Sepharose)、以及临床使用的载体分子，可列举钥孔血蓝蛋白(KL％)、CRM197等。特别是，能够适当地使用OVA、KL％、CRM197。 [0129] 作为缀合物中的多肽的结合形式，只要保持多肽的抗体诱导性，则不受特别限定。缀合物可以采取一分子的载体分子上结合一种多肽的形式，另外，也可以采取一分子的载体分子上结合多种多肽的形式。在一分子的载体分子上结合多个多肽的情况下，每种多肽可以分别直接结合在载体分子上。多肽可以以线形形状结合在缀合物分子上，也可以经由接头结构体等在载体分子上交联，从而载体分子一同形成环状结构。特别是，闭合环状的缀合物，其表位位点的形状稳定，形成原多肽的立体结构(环结构、螺旋结构等)，因此可以优选使用。需要说明的是，接头结构体能够使用异官能团接头试剂(4‑(N‑马来酰亚胺基甲基)环己烷‑1‑羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC:Succinimidyl 4‑(N‑maleimidomethyl)cyclohexane‑ 1‑carboxylate))、Sulfo‑SMCC，LC‑SMCC，N‑ε‑马来酰亚胺己酰氧基磺基琥珀酰亚胺酯(EMCS:N‑ε‑malemidocaproyl‑oxysuccinimide ester)、4‑(4‑马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯(SMPB:succinimidyl 4‑(p‑maleimidophenyl)butyrate)、间马来酰亚胺基苯甲酰基‑N‑羟基琥珀酰亚胺酯(MBS：m‑maleimidobenzoyl‑N‑hydroxysuccinimide ester等)等。 [0130] 具有如上所述的环状结构的缀合物的制备方法不受特别限定，能够采用例如下述的方法。使载体分子、例如OVA上结合2分子以上的接头分子(例如，具有马来酰亚胺基的分子)，以相对于载体分子上的接头分子的数量不会达到过剩量的量添加多肽，并进行反应。其中，在多肽的末端不存在具有S％基的氨基酸残基(例如，半胱氨酸)的情况下，例如，可以在预先于两个末端添加有半胱氨酸残基(优选为包含半胱氨酸残基的2‑3氨基酸残基)的状态下，制备多肽，从而制成两个末端具有S％基的结构。通过两个末端的S％基分别与其他马来酰亚胺分子结合来进行交联，从而通过载体分子‑接头分子‑多肽形成环状结构。 [0131] 本发明的疫苗的给药途径不受特别限定，可以采用口服、经鼻、舌下、皮下、肌内等公知的任意给药途径。其中，优选制成通过口服、经鼻及舌下等给药的粘膜疫苗。进一步优选采用舌下疫苗。已知粘膜疫苗除诱导以IgG等为代表的全身系统免疫以外，还会有效地诱导作为SARS‑CoV‑2的侵袭口的粘膜面上的粘膜免疫、特别是抗原特异性分泌型IgA应答。因此，可以实现双重感染防御，即，防止SARS‑CoV‑2感染侵袭以及通过全身系统免疫进行防御。 [0132] 本发明的疫苗可以含有佐剂。佐剂可以使用本技术领域中公知的任意佐剂。作为公知的佐剂，可列举：弗氏完全佐剂和/或不完全佐剂、维生素E、Montanide、明矾、多聚IC及其诱导体(多聚ICLC等)、角鲨烯和/或生育酚、来自皂树(Quillya saponaria)的皂甙的QS‑21、MPL(SmithKline Beecham)、QS21(SmithKline Beecham)、沙门氏菌属的沙门氏菌(Salmonella minnesota)R595脂多糖类、作为其非毒性诱导体的MPL(3‑去酰基‑4’‑单磷酰基脂质A)、以及QS‑7、QS‑17、QS‑18及QS‑L1(So H.S.,et al.,Molecular and cells,Vol.7,pp.178‑186(1997))等。 [0133] 本发明的疫苗中的多肽(各种多肽的总量)与佐剂的配合比不受特别限定，能够采用例如适合普通疫苗的配合比。 [0134] 本发明的疫苗除抗体诱导性多肽以外还可以根据需要含有药学上可接受的载体。在此所说的“药学上可接受的载体”是指在制药技术领域中通常规方法使用的添加剂。可列举例如：赋形剂、粘合剂、崩解剂、填充剂、乳化剂、流动添加调节剂、润滑剂等。 [0135] 作为赋形剂，可列举：单糖、二糖类、环糊精及多糖类等糖(更具体而言，包括但不限于葡萄糖、蔗糖、乳糖、棉子糖、甘露醇、山梨醇、肌醇、糊精、麦芽糊精、淀粉及纤维素)、金属盐(例如，氯化钠、磷酸钠或磷酸钙、硫酸钙、硫酸镁、碳酸钙)、柠檬酸、酒石酸、甘氨酸、低、中、高分子量的聚乙二醇(PEG)、磷脂、溶血磷脂、胆固醇、脂肪酸、Pluronic(注册商标)、高岭土、硅酸或它们的组合。 [0137] 作为崩解剂，可列举：所述淀粉、及乳糖、羧甲基淀粉、交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、昆布多糖粉末、碳酸氢钠、碳酸钙、海藻酸或海藻酸钠、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯或它们的盐。 [0138] 作为填充剂，可列举所述糖和/或磷酸钙(例如，磷酸三钙或磷酸氢钙)。 [0139] 作为乳化剂，可列举：脱水山梨糖醇脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯。 [0140] 作为流动添加调节剂及润滑剂，可列举：硅酸盐、滑石粉、硬脂酸盐或聚乙二醇。 [0141] 这样的载体主要用于方便形成所述剂型，并保持剂型及药理效果，根据需要适当使用即可。除上述的添加剂以外，如有需要，还可以包含调味剂、增溶剂、悬浮剂、稀释剂、表面活性剂、稳定剂、吸收促进剂、填充剂、润湿剂、保湿剂、吸附剂、崩解抑制剂、包衣剂、着色剂、防腐剂、抗氧化剂、香料、矫味剂、甜味剂、缓冲剂等。 [0143] 本发明的疫苗的剂型只要为能够保持抗体诱导性多肽及其他添加成分的效果的形式，则没有特别限定。作为用于舌下给药的剂型，可列举例如片剂。作为用于口服给药的剂型，可列举例如：片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、细颗粒剂、散剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂等。作为用于皮下给药的剂型，可列举例如：注射剂、膏剂、经皮吸收剂等。作为用于肌内给药的剂型，可列举注射剂。 [0144] 本发明的疫苗优选按照对SARS‑CoV‑2的治疗或予防有效并且不会产生严重副作用的量包含抗体诱导性多肽。例如，抗体诱导性多肽的给药量(不包含载体分子)优选调节为合计达到0.01～100μg/kg体重、特别0.1～5.0μg/kg体重。 [0145] 作为本发明的疫苗的给药次数，只要充分诱导产生对于SARS‑CoV‑2的抗体，并且不会产生严重的副作用，则不受特别限定，例如可以每天给药一次，持续给药一个月。另外，还可以每周一次至三次间歇给药，持续给药一个月。给药时间可以为两周，也可以停药，并集中在流行期(流行季)前给药2周进行敏化。 [0146] [4]抗体诱导组合物 [0147] 本发明的抗体诱导组合物的特征在于，包含“[2]抗体诱导性多肽”一项中所述的本发明的多肽中的至少一种多肽。 [0148] 本发明的抗体诱导组合物通过包含本发明的多肽中的至少一种，当向动物给药后，可以使该动物中产生对于SARS‑CoV‑2的抗体。通过采集该动物的血清，由对于SARS‑CoV‑2的多克隆抗体和该动物的脾脏细胞来制备杂交瘤，从而可以制备对于SARS‑CoV‑2的单克隆抗体。本发明的抗体诱导组合物通过使用具有高抗体诱导性的多肽，可以高效地产生对于SARS‑CoV‑2的抗体。 [0149] 作为给药本发明的抗体诱导组合物的动物，可列举：兔、豚鼠、山羊、绵羊、牛、猪、大鼠、小鼠、鸡、骆驼、羊驼等。 [0150] 本发明的抗体诱导组合物可以仅包含一种本发明的多肽，另外，也可以包含多种。本发明的抗体诱导组合物也可以包含本发明的第一方案的多肽中的至少一种和本发明中的第二方案的多肽中的至少一种。 [0151] 作为本发明的抗体诱导组合物中所含的多肽的形式，只要保持抗体诱导性，则不受特别限制，可以为线性肽的状态，也可以为与载体分子结合的缀合物的形式。作为缀合物中的多肽的结合形式，只要保持多肽的抗体诱导性，则不受特别限定。缀合物可以采用一分子的载体分子上结合一种多肽的形式，另外，也可以采用一分子的载体分子上结合多种多肽的形式。在一分子的载体分子上结合多种多肽的情况下，每种多肽分别可以直接结合在载体分子上。多肽可以以线性形状结合在缀合物分子上，另外，也可以经由接头结构体等在载体分子上交联，与载体分子一同形成环状结构。 [0152] 本发明的抗体诱导组合物的给药途径不受特别限定，通常规方法在皮下或肌肉内进行注射剂给药。 [0153] 本发明的抗体诱导组合物可以含有佐剂。佐剂可以使用本技术领域公知的任意佐剂。本发明的疫苗中的多肽(各种多肽的总量)与佐剂的配合比不受特别限定，例如能够采用用于普通疫苗的配合比。 [0154] 本发明的抗体诱导组合物优选按照在给药动物中充分产生抗体并且不会产生严重副作用的量包含抗体诱导性多肽。例如，抗体诱导性多肽的给药量(不包含载体分子)优选调节为合计达到0.01～100μg/kg体重、特别是0.1～5.0μg/kg体重。 [0155] 只要没有特别冲突，本发明的抗体诱导组合物中所含的其他成分等其他详细的条件则与“[3]疫苗”一项所述的条件相同。 [0156] [5]治疗或予防SARS‑CoV‑2感染的方法 [0157] 本发明的治疗或予防SARS‑CoV‑2感染的方法(以下，也简称为“本发明的治疗方法”)的特征在于，包括“[3]疫苗”一项所述的、向对象给药本发明的疫苗的工序。 [0158] 只要没有特别冲突，本发明的治疗方法的对象、给药疫苗的剂型、含有成分等详细条件则如“[3]疫苗”一项所述。 [0159] 实施例 [0160] 以下，示出实施例，以更详细说明本发明，但并非旨在将本发明的范围限定在实施例的范围内。 [0161] [实施例1]SARS‑CoV‑2部分序列多肽的缀合物的制备 [0162] 通过Fmoc合成法制备表2所示的#1～14及#101～117的多肽。对于在表2所述的多肽中在末端不存在半胱氨酸残基的多肽，在N端侧添加半胱氨酸‑丝氨酸‑谷氨酰胺(CSG)、在C端侧添加谷氨酰胺‑丝氨酸‑半胱氨酸(GSC)等序列的1～3个氨基酸残基来制备。多肽的纯度及分子量通过％PLC及质谱按照常规方法法来确认。 [0163] 接着，对于每种多肽，将OVA作为载体分子来制备环状缀合物。将马来酰亚胺激活卵清蛋白(OVA：Imject(商标)Maleimide‑Activated Ovalbumin(Thermo Fisher公司制))溶解在管内的缀合缓冲液中，冰冷下添加每种多肽的水溶液，在室温下静置一晚。加入L‑半胱氨酸，封闭残存的马来酰亚胺基后，在‑30℃下保存。 [0164] [表2] [0165] [表2] [0166] [0167] [实施例2]各种缀合物对小鼠的敏化 [0168] 使用实施例2中制备的缀合物中的#1～14、#101～105及#107～117的多肽的缀合物，实施小鼠的敏化试验。用包含10μg/100μL皂甙的PBS溶解缀合物，使其达到0.1mg/mL，从而制备敏化液，分注250μL后，在‑20℃下保存。将6周龄的小鼠(BALB/c)驯化1周后，给药缀合物溶液。敏化液按照100μL/只的量皮下给药。给药每间隔2周进行3次或4次。采血在最终增强2周后进行。采血后，使用ELISA确认每种血清的抗体滴度。 [0169] [实施例3]经RBD的位点的多肽敏化后的小鼠血清的RBD识别能力 [0170] 对于使实施例2中得到的小鼠血清中的#1～14的缀合物敏化而得到的血清，确认到RBD识别能力。 [0171] 向按照100mg/孔的量固定有SARS‑CoV‑2的RBD蛋白质(AB clonal公司制，No.RP01258的微孔板中分注将各血清用PBS(磷酸缓冲液)稀释至300倍、1000倍及3000倍而成的样品，孵育30分钟。将每个孔用PBST(包含Tween20 0.05％的PBS)清洗后，加入辣根过氧化物酶(％RP)标记抗小鼠IgG单克隆抗体溶液并孵育。将每个孔用PBST清洗后，加入底物溶液(四甲基联苯胺(TMB)溶液))，孵育规定时间后，加入1N硫酸，停止反应。反应停止后，通过读板器测定每个孔在450nm处的吸光度。 [0172] 将每个样品的吸光度示于图1。明确判断，特别是在#3、#7·#8及#11的小鼠血清中，RBD的识别能力高。 [0173] [实施例4]ACE2‑RBD结合抑制试验 [0174] 对于实施例3中得到的小鼠血清中RBD识别能力高的#7及#11，研究其对ACE2与RBD的结合所带来的影响。同时，在获得同意之后，对于由SARS‑CoV‑2感染恢复后的5名患者(A～E)的血清也进行相同的研究。 [0175] 向固定有SARS‑CoV‑2的RBD蛋白质(AB clonal公司制，No.RP01258)的96孔微孔板中分注将每只小鼠血清及各患者血清用PBS稀释100倍、1000倍及10000倍而成的样品，并孵育。将作为阳性对照的市售的小鼠抗RBD多克隆抗体(Sino Biological公司制，No.40592‑T62)的PBS稀释液与样品一并分注，同样进行孵育。向每个孔中加入重组人ACE2蛋白质(Sino Biological公司制，No.10108‑％08％‑B)用PBS稀释而成的溶液，进一步孵育。将每个孔用PBST清洗后，加入％RP标记抗人ACE2单克隆抗体溶液并孵育。将每个孔用PBST清洗后，加入底物溶液(TMB溶液)，孵育规定时间后，加入1N硫酸，停止反应。反应停止后，通过读板器测定每个孔在450nm处的吸光度。 [0176] 图2中示出#3、#7、#11的小鼠血清及阳性对照的ACE2‑RBD结合抑制试验的结果。在所有小鼠血清中，均确认到抑制ACE2与RBD的结合。特别是，对于#11的小鼠血清，确认其在100倍稀释的条件下显示出与阳性对照相同的抑制能力。 [0177] 图3中示出#1、#5、#11的小鼠血清及A～E的患者血清的ACE2‑RBD结合抑制试验的结果。图3(A)是#1、#5、#11的小鼠血清的抑制效果的比较结果。在#1、#5的小鼠血清中，几乎未见抑制，而在#11的小鼠血清中，则确认到抑制。图3(B)是#11的小鼠血清与5名恢复患者的血清的抑制效果的比较结果。除显示最高抑制效果的A患者之外，确认#11的小鼠血清显示与4名患者基本相同的ACE2‑RBD结合抑制效果。 [0178] [实施例5]经S2结构域的位点的多肽敏化的小鼠血清的S2结构域识别能力[0179] 针对在实施例3得到的小鼠血清中使#101～117的缀合物敏化而得到的血清，调查S2结构域识别能力。 [0180] 向固定有SARS‑CoV‑2的S2结构域蛋白质(Sino Biological公司制，No.40590‑V08B)的96孔微孔板分注将各血清用PBS稀释至30倍、100倍及1000倍而成的样品，并孵育。将作为阳性对照的市售的小鼠抗S2结构域多克隆抗体(Sino Biological公司制，No.40590‑T62)的PBS稀释液和作为阴性对照的PBS与样品一同分注，同样进行孵育。将每个孔用PBST清洗后，加入％RP标记抗小鼠IgG单克隆抗体溶液并孵育。将每个孔用PBST清洗后，加入底物溶液(TMB溶液)，孵育规定时间后，加入1N硫酸，停止反应。反应停止后，通过读板器测定每个孔在450nm处的吸光度。 [0181] 将每个样品的吸光度示于图4。明确判断，特别是在#111及#114·#115的小鼠血清中，S2结构域的识别能力高。这些小鼠血清均是使S2结构域的％R2区的多肽敏化后的小鼠的血清。 [0182] [实施例6]S2结构域的位点的多肽与恢复者血清的反应性试验 [0183] 使用ELISA系统研究5名恢复者血清与S2结构域的每种多肽的反应性，其中，ELISA系统使用呈递每种多肽的载体抗原。用#101～117的每种多肽呈递抗原包被96孔微孔板(NUNC公司Multisorp)，用BSA/PBST溶液进行封闭。获得同意后，将从SARS‑CoV‑2感染恢复的5名患者A～E的血清分别用加入有BSA的PBS稀释，使其与每种多肽呈递抗原反应。用PBST清洗后，添加％RP标记抗人IgG抗体溶液，孵育30分钟。清洗后，加入底物溶液(四甲基联苯胺(TMB)溶液)，在450nm处将规定时间后的底物显色定量。 [0184] 将各患者血清A～E中最强效识别的多肽(主要)及第二强效识别的多肽(次要)示于表2。5名患者血清中的抗体与#111及#114/#115中的任意一种强效反应，因此确认，这些位点是对于获得产生对于SARS‑CoV‑2的抗体非常重要的位点。 [0185] [表3] [0186] [表3] [0187]患者血清 主要 次要 A #111 #114 B #114 #105、#106 C #111 #105 D #111 #105 E #115 #111 [0188] [实施例7]缀合物多肽的小鼠舌下给药(SLIT)试验 [0189] (1)皮下给药用敏化液的制备 [0190] 将四种缀合物(#7、#11、#111及#115)的1mg/mL PBS溶液分别取17.5μL后混合。向其中加入100mg/mL的皂甙/PBS溶液3.5μL并混合，然后用PBS稀释至350μL，得到皮下给药用敏化液。舌下给药用敏化液在‑20℃下保存。 [0191] (2)舌下给药用敏化液的制备 [0192] 将四种缀合物(#7、#11、#111及#115)的1mg/mL PBS溶液分别取20μL后混合。向其中加入100mg/mL的皂甙/PBS溶液1μL，得到81μL舌下给药用敏化液。舌下给药用敏化液在‑20℃下保存。 [0193] (3)向小鼠皮下给药 [0194] 将6周龄的小鼠(BALB/c)驯化1周后，给药缀合物溶液。敏化液按照100μL/只的量皮下给药。皮下给药间隔2周进行两次。 [0195] (4)向小鼠舌下给药 [0196] 第二次皮下给药2周后，对小鼠进行舌下给药。通过异氟醚汽化器将小鼠麻醉，然后，将小鼠仰卧位固定，用镊子打开口部。用移液器的先端将小鼠的舌头抬起，向舌下滴加舌下给药用敏化液10μL(高剂量)或3μL(低剂量)。然后，将小鼠静置1分钟。舌下给药每周三次，合计实施六次，最后一次给药2天后，对每只小鼠采血。将高剂量舌下给药的小鼠组作为高剂量SLIT组，将低剂量舌下给药的小鼠组作为低剂量SLIT组。将除第二次皮下给药后未进行舌下给药之外进行了相同处理的小鼠组作为对照组。每个小鼠组6只(n＝6)。 [0197] (5)小鼠的抗体滴度测定(IgG、IgA) [0198] 将#7和#11的缀合物按照重量比1：1混合，固定于96孔微孔板。同时，将#111、#115的缀合物分别固定于另一96孔微孔板。向固定有缀合物的微孔板中分注每只小鼠的血清用PBS稀释而得到的样品并孵育。将每个孔用PBST清洗后，添加％RP标记抗小鼠IgG抗体或％RP标记抗小鼠IgA抗体的PBS溶液并孵育。将每个孔用PBST清洗后，将每个孔用PBST清洗后，加入底物溶液(TMB溶液)，孵育规定时间后，加入1N硫酸，停止反应。反应停止后，通过读板器测定每个孔在450nm处的吸光度。 [0199] 将每只小鼠的抗RBD抗体滴度的测定结果示于图5、图6。图5(A)示出高剂量SLIT组、低剂量SLIT组及对照组的小鼠血清中的IgG对于#7及#11的混合缀合物的反应性。图5(B)示出高剂量SLIT组、低剂量SLIT组及对照组的小鼠血清中的IgG对于#111的缀合物的反应性。图5(C)示出高剂量SLIT组、低剂量SLIT组及对照组的小鼠血清中的IgG对#115的缀合物的反应性。图6(A)示出高剂量SLIT组、低剂量SLIT组及对照组的小鼠血清中的IgA对于#7及#11的混合缀合物的反应性。图6(B)示出高剂量SLIT组、低剂量SLIT组及对照组的小鼠血清中的IgA低于#111的缀合物的反应性。图6(C)示出高剂量SLIT组、低剂量SLIT组及对照组的小鼠血清中的IgA对于#115的缀合物的反应性。在舌下给药高剂量的缀合物的小鼠组中，与仅皮下给药的小鼠组相比，生成了对于所有缀合物反应性均显著较高的IgG抗体及IgA抗体。 [0200] [实施例8]SARS‑CoV‑2RBD分子的各表位识别抗体对于突变型RBD分子的同源表位呈递抗原的反应性 [0201] 通过与实施例1相同的方法，制作呈递分别具有K417N、L452R、T478K的突变的SARS‑CoV‑2RBD表位的突变表位抗原。 [0202] 按照100ng/孔的量，将结合有各突变RBD表位的抗原固定于96孔微孔板。同时，与实施例3相同地制备野生型RBD表位抗原固定板。将实施例2中得到的抗血清中的#7、#10及#11用PBS稀释至300倍、1500倍、7500倍、37500倍、188000倍及940000倍，#7的血清分注于固定有K417N的突变型表位抗原的板中，#10的血清分注于固定有L452R的突变型表位抗原的板中，#11的血清分注于固定有T478K的突变表位抗原的板中。将板孵育30分钟后，每个孔用PBST清洗，加入％RP标记抗小鼠IgG单克隆抗体溶液并孵育。将每个孔用PBST清洗后，加入底物溶液，孵育规定时间后，加入1N硫酸，停止反应。反应停止后，通过读板器测定每个孔在 450nm处的吸光度。试验按照n＝2进行，求得平均值。 [0203] 将每个样品的吸光度示于图7。#7及#11的小鼠血清显示，虽然对于突变型RBD的反应性稍逊于对于野生型RBD的反应性，但显示出足够高的反应性。另一方面，#10的小鼠血清显示，低于野生型RBD的中和表位和突变型RBD同源表位的反应性基本相同。因此表明，对于RBD蛋白质中具有突变的SARS‑CoV‑2，所鉴定到的中和表位识别抗体也具有感染控制效果。 [0204] [实施例9]缀合物多肽敏化小鼠抗血清对SARS‑CoV‑2假型慢病毒感染CRFK细胞的控制效果 [0205] 制备表面具有SARS‑CoV‑2的刺突蛋白的假型慢病毒，用其感染表面表达ACE2的细胞，从而构建SARS‑CoV‑2的伪感染系统(参见Pisil Y.,et al.,Pathogens,10,153(2021))。使用该伪感染系统，按照以下流程，评价由缀合物多肽诱导的抗体是否具有中和活性。 [0206] (1)小鼠抗血清及混合血清的制备 [0207] 制作包含实施例2中制作的各表位识别抗体(#1、#3、#5、#7、#11、#111、#114、#115等)的各抗血清及各表位抗血清的混合血清(2血清或3血清均匀混合)。 [0208] (2)细胞培养 [0209] 将％EK293T细胞(ATCC CRL 3216)及源自猫肾的细胞(CRFK细胞，ATCC CCL‑94)分别在添加有10％(v/v)的热灭活胎牛血清、2mM丙酮酸钠及4mM L‑谷氨酰胺的杜尔贝科改良Eagle培养基(DMEM)中培养。使用胰蛋白酶/EDTA溶液从各培养液中回收细胞。所有细胞株在5％CO2气氛下保持37℃。 [0210] (3)具有SARS‑CoV‑2刺突蛋白的假型慢病毒的制作 [0211] 如Al‑Allaf,F.A.,et al.,Microbes Infect.,Vol.12,pp.768‑777(2013)所述，所有DNA质粒的克隆通过向Escherichia coli Stbl3细胞转化来来进行。如Cronin J.,et al.,Curr.Gene Ther.,Vol.5,pp.387‑398(2005)所述那样构建慢病毒的假型病毒。即，将表面具有来自1μg/mL 2019‑nCov_pcDNA3.1(+)‑P2A‑eGFP刺突载体(No.MC_0101087(Molecular Cloud公司))的SARS‑CoV‑2刺突蛋白的假型慢病毒与1μg/mL％IV‑1NL4‑3ΔEnvΔvpr荧光素酶报告载体(pNL4‑3.Luc.R‑E‑，No.3418，由NI％提供)(参见Chen B.K.,et 5 al.,J.Virol.,Vol.68,pp.654‑660(1994))一同转染至％EK293T细胞的5×10细胞/mL，从而制备所有DNA质粒的克隆。并且，添加200μL Opti‑MEM(ThermoFisher公司)、8μL X‑Treme％P转染试剂(Sigma‑Aldrich公司)，将转染后的％EK293T细胞在5％CO2气氛下、37℃培养两天。回收上清，使其通过0.45mm过滤器，得到表面具有所生成的SARS‑CoV‑2刺突蛋白的假型慢病毒颗粒。 [0212] 将1μg/mL 2019‑nCov cDNA3.1质粒或1μg/mL 2019‑nCov CMV质粒与1μg/mL pSGΔenv载体(No.11051，由NI％提供)一同转染至％EK293T细胞，生成表面具有SARS‑CoV‑2刺突蛋白的假型慢病毒颗粒。 [0213] (4)ACE2表达细胞株的制作 [0214] 按照2.5×105细胞/mL的浓度，将CRFK细胞接种在装有DMEM的6孔板中，DMEM中添加有10％胎牛血清、2％ L‑谷氨酰胺及2％丙酮酸。将细胞株培养1天，直至其达到60～80％汇合。将2μg/mL pcDNA3.1+/C‑(K)DYK‑ACE2质粒(No.MC_0101086(Molecular Cloud公司))5 用200μL Opti‑MEM、8μL X‑Treme％P转染试剂转染至细胞株。按照2.5×10 细胞/mL的浓度，将转染后的细胞接种于6孔板，在5％CO2气氛下，37℃孵育1天。然后，将细胞接种于平底 96孔微孔板(FALCON公司)。 [0215] (5)中和测定 [0216] 将(1)中得到的各抗血清用培养基稀释至18倍、36倍、72倍(测定时最终稀释倍率为45倍、90倍、180倍)。对于两种或三种抗血清混合而成的混合血清，以使所含有的各血清的浓度进一步达到1/2或1/3的方式进行稀释。作为阳性对照，将市售的重症COVID‑19恢复者IgG阳性血清(No.CoV‑PosG‑S，Ray Biotech公司制)的720倍稀释液进一步与上述相同地用培养基稀释后使用。向96孔微孔板中分别添加血清稀释液180μL。解冻表面具有SARS‑CoV‑2刺突蛋白的假型慢病毒颗粒(LpVSpike(+))的样品，用培养基稀释至6000RLU(Relative Luciferase Unit)/mL，分别将60μL加入96孔微孔板中的血清稀释液(表位识别抗血清或混合血清等)。在5％CO2气氛下，37℃孵育1小时。 [0217] 按照2.5×105细胞/mL的浓度，将ACE2表达CRFK细胞接种于96孔微孔板中的100μL培养基，培养1天。将孵育后的各种小鼠血清稀释液各150μL添加于包含已接种的CRFK细胞的微孔板。在5％CO2气氛下，37℃孵育2天。将添加人抗SARS‑CoV‑2IgG抗体(No.E‑AB‑V1021，Elabscience公司)来代替小鼠血清的孔作为阳性对照，将添加培养基来代替小鼠血清的孔作为阴性对照。另外，将不包含细胞及抗血清的孔作为空白。各试验按照n＝3进行。测定每个孔的荧光素酶活性。 [0218] 荧光素酶活性按照Ishida Y.,et al.,J.Gen.Virol.,Vol.97,pp.1249‑1260(2016)及Matsuda K.,et al.,Virology,Vol.399,pp.134‑143(2010)所述的方法来测定。简而言之，使用以下方法。向每个孔中加入50μL细胞裂解试剂(东洋B‑NET公司)，搅拌15分钟。回收细胞裂解液30μ，转移至96孔微孔板(F96 MicroWell white plate(Nunc公司))，向每个孔中加入30μL发光底物。使用读板器(TriStar LB 941(Berthord Technologies公司))和MikroWin软件(Labsis Laborsysteme公司)测定发光量并定量。将从各实测值中减去空白值得到的值作为测定值。将阴性对照的测定值设为100％，算出各测定值的相对值。 各试验按照n＝3来进行。 [0219] (6)结果 [0220] 将经各种缀合物肽免疫的小鼠的抗血清对假型慢病毒感染ACE2表达CRFK细胞的控制效果示于图8。图中，“IgG”表示阳性对照血清的结果。经#7+#11、#7+#111、#11+#111、#7、#111的缀合物肽免疫的小鼠的抗血清及混合血清中显示浓度依赖性地防控假病毒感染。 需要说明的是，在不具备RBD蛋白质识别能力的#1、#5表位识别抗体及其混合血清中，未发现对于疑似病毒的感染抑制能力。 [0221] 本说明书中引用的全部刊物、专利及专利申请直接通过引用并入本说明书。 |
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