[0001] 本发明涉及医学材料技术领域，具体是一种钛表面复合羟基磷灰石涂层及其制备方法。

[0002] 钛已广泛应用于骨内植入物领域，但其属于生物惰性材料，植入体内时难于快速与骨组织形成紧密键合。羟基磷灰石是天然骨的主要无机组份，被认为具有良好的骨传导和骨诱导特性，是一种“生物活性材料”。但因板块状羟基磷灰石较差的机械性能，不宜单独作为承力结构。如何充分利用羟基磷灰石的生物活性并同时保持骨内植入物的机械性能？涂层技术使这一设想成为可能。目前临床上常通过离子高温喷涂方法将羟基磷灰石涂层于相对光滑的钛金属表面，制备的厚且粗糙的涂层易剥脱，而且高温也会造成羟基磷灰石的生物活性降低。

[0003] 本发明的目的在于提供一种钛表面复合羟基磷灰石涂层及其制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

[0004] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种钛表面复合羟基磷灰石涂层的制备方法，所述方法包括：

[0005] 将钛圆片逐级打磨抛光后超声清洗并干燥；

[0006] 将干燥后的钛圆片作为阳极，电化学刻蚀和阳极氧化反应后超声清洗并干燥，于400～500℃退火处理2h；

[0007] 将处理后的钛圆片放入饱和Ca(OH)2溶液中浸泡1～3min后，用去离子水冲洗，再置于0.02mol/L(NH4)2HPO4溶液中浸泡1～3min后，用去离子水冲洗，如此交替循环浸泡，超声震荡1～3min后干燥，于400～500℃退火处理2h，以在钛表面构筑有序微纳米分级结构复合羟基磷灰石涂层。

[0008] 进一步的，所述钛圆片为TA1级的钛圆片。

[0009] 进一步的，所述阳极氧化反应的电解液为氟化氢质量比为0.5％的溶液。

[0010] 进一步的，所述交替循环浸泡为15～30个循环。

[0011] 一种钛表面复合羟基磷灰石涂层，采用上述的表面复合羟基磷灰石涂层的制备方法制得。

[0012] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明在纯钛表面联用电化学刻蚀和电化学阳极氧化，构筑出一种双重有序微纳米结构，其高比表面积的微米凹坑和纳米中空管状结构可成为良好的生物载体，在常温下采用简单的“交替循环浸泡法”，在制备的微纳米结构基础上涂层了纳米羟基磷灰石，能够保持羟基磷灰石的生物活性，整个制备工艺简单，有序微纳米结构具有超亲水性能，促进了交替循环浸泡过程中离子的吸附进而参与反应，有利于在空隙均匀的纳米管内填充类骨磷灰石，二氧化钛纳米管作为过渡层，不但可以缓解相邻层间热膨胀系数差值导致的较高的残余应力，而且纳米管可作为异相成核位点诱导涂层由层状结构变为嵌入式结构，提高涂层的结合强度，交替循环浸泡时去离子水反复冲洗以及循环后超声震荡，使得羟基磷灰石分子与微纳米结构具有较高的结合强度，从而在植入体内时不易剥脱，可以促进细胞黏附和成骨分化，并支持其细胞增殖，具有良好的成骨活性。附图说明

[0013] 图1为本发明三组试样的扫描电镜图；

[0014] 图2为本发明HA试样元素分布图；

[0015] 图3为本发明三组试样的XRD图谱；

[0016] 图4为本发明三组试样的三维轮廓图；

[0017] 图5为本发明三组试样的接触角图；

[0018] 图6为本发明MN试样和HA试样划痕实验后扫描电镜图；

[0019] 图7为本发明MN试样和HA试样的划痕载荷力图；

[0020] 图8为本发明三组样本同BMSCs共培养2d的扫描电镜图；

[0021] 图9为本发明三组样本表面的细胞黏附的DAPI染色图(1h)；

[0022] 图10为本发明三组样本与BMSCs共培养14d后ECM矿化图。

[0023] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0024] 实施例1：试样的制备

[0025] 将TA1级钛圆片(直径14.5mm，厚度1mm)用碳化硅砂纸逐级打磨抛光后超声清洗并干燥，标记为P，以P试样为阳极，以石墨片为阴极，电化学刻蚀和阳极氧化反应后，将钛圆片超声清洗并干燥，于450℃退火处理2h，标记为MN，其中，阳极氧化反应的电解液为氟化氢质量比为0.5％的溶液，将制备好的MN放入饱和Ca(OH)2溶液浸泡2min后，立即用大量的去离子水冲洗，再置于0.02mol/L(NH4)2HPO4溶液浸泡2min，到时间后立即用大量的去离子水冲洗；如此交替循环浸泡20个循环，超声震荡2min后干燥，于450℃退火处理2h，标记为HA。三组试样进行各项检测前，紫外线辐射消毒表面30min。

[0026] 试样表征通过扫描电镜观察试样的表面形貌，通过X射线能谱仪检测其元素构成，通过X射线衍射仪(XRD)检测试样的晶相结构组成，使用VK‑X250K型号激光显微系统获得试样表面三维轮廓图并测量各试样表面糙度数值，使用接触角测试仪采用悬滴法测量试样表面液体的静态水接触角，使用划痕仪测试涂层同基底的结合强度(划痕加载半径为0.2mm，锥度为120°，加载速度为39.6N/min，实验载荷1‑40N逐渐加大，运行速度为2mm/min)；如图1所示，P试样低倍镜下可见表面具有相对光滑的表面形貌，并呈现沿抛光划痕方向的细小微沟槽，高倍下未见纳米管状结构；MN试样低倍镜下可见孔径约为20μm的有序微米凹坑阵列，高倍镜下可见管径约为70nm的有序二氧化钛纳米管阵列；HA试样保留了有序微米凹坑阵列，高倍镜下可见二氧化钛纳米管阵列上出现了各向异性的花瓣样羟基磷灰石沉积，羟基磷灰石嵌入纳米管壁后呈现小团簇均匀散在点缀于纳米管基底；X射线能谱元素分析结果见表1，P试样表面含有元素Ti、O、C和Si，其中Si来源于机械抛光介质氧化硅残留，MN和HA表面含有元素Ti、O、C和F，其中F来源于电解液氢氟酸，HA还出现了Ca和P，且Ca/P比为1.37，略低于羟基磷灰石的化学计量比1.67，表明其为缺钙型类骨磷灰石，与自然骨中的磷灰石相近。而且如图2所示，Ca和P均匀分布在整个涂层中，未发生聚集现象；如图3所示，P试样仅检测出钛(Ti)基底的特征衍射峰，MN试样检测到较强的锐钛矿相(Anatase)的衍射峰和微弱的金红石相(Rutile)的衍射峰，HA试样出现了磷灰石(Hydroxyapatite)的特征衍射峰。磷灰石的衍射峰没有分开，说明试样表面沉积形成的羟基磷灰石的结晶度较低，结合试样表面的元素组成(表1)，符合交替循环浸泡制备的类骨磷灰石的特征；如图4所示，P试样表面可见轻微起伏的细小微沟槽且较光洁，MN和HA试样表面可见有序的微米凹坑阵列，表面粗糙度结果如表2所示，P、MN和HA的粗糙度依次增大；一般来说，材料表面接触角越小，亲水性就越强，如图5所示，P试样的水接触角为63.1±1.74°，MN试样和HA试样的水接触角均小于5°，从而展示出了超亲水性；如图6所示，划痕实验后，MN试样和HA试样除了在划痕附近出现了少量的裂纹，并未出现明显的涂层断裂和脱落，如图7所示，涂层剥脱时通过摩擦力变化记录临界载荷，MN试样为22.5±1.1N，HA试样为12.5±1.1N和25.3±1.2N，HA试样出现了两个涂层脱落的临界载荷，是因为表层的羟基磷灰石在划痕过程先行脱落，继续加载力值后二氧化碳纳米管会再次剥脱。

[0027] 表1：试样表面的元素组成(原子百分比)

[0028]

[0029] 表2：三组试样表面的粗糙度及蛋白吸附的比较

[0030]

[0031] 注：每组每种测量项目的样本量均为3；a表示与对照组P相同测量项目相比P＜b0.05；表示与MN相同测量项目相比P＜0.05。

[0032] 实施例2：蛋白吸附检测

[0033] 将试样置于24孔板中(设三个平行孔)，加入1mL含10％FBS的DMEM低糖培养基，孵育2h后洗脱出的蛋白浓度采用增强型BCA蛋白浓度测定试剂盒进行检测；如表3所示，三组不同样本2h吸附的蛋白量相比，其大小依次是P＜MN＜HA。

[0034] 表3：三组试样表面的DAPI染色不同时间细胞黏附数量的比较

[0035]

[0036] 注：每组每种测量项目的样本量均为3；a表示与对照组P相同测量项目相比P＜b0.05；表示与MN相同测量项目相比P＜0.05。

[0037] 实施例3：细胞培养和实验

[0038] 选用SD大鼠BMSCs(赛业科技有限公司)，选取状态良好的P4‑P6细胞用于后续细胞4
实验。试样置于24孔板(设三个平行孔)，细胞黏附实验接种量为2×10 //孔，其它细胞实验
4
接种量为2×10/孔。试样固定、脱水和喷金，扫描电镜观察试样表面细胞生长形态。培养
0.5h、1h和2h后，试样固定后用4',6‑二脒基‑2‑苯基吲哚(4,6‑diamidino‑2‑phenylindole,DAPI)染色液标记细胞核，荧光倒置相差显微镜观察，并随机选5个视野采集荧光影像，Image J软件进行细胞数计数。培养1d、3d和7d后，细胞计数试剂盒(cell counting kit‑8，CCK‑8)法进行细胞增殖检测，检测结果如表4所示。培养14d后用茜素红S染色液(1％，pH＝4.2)对细胞分泌的细胞外基质(ECM)实施染色，体式显微镜照相，用
10wt％氯化十六烷基吡啶进一步定量比较。培养14d后采用实时荧光定量PCR(real‑time quantitative polymerase chain reaction，qRT‑PCR)方法进一步对细胞中的成骨相关基因进行检测，靶基因的表达水平选择用持家基因GAPDH表达水平进行标准化，如图8所示，P试样表面的细胞大多呈细长的纺锤形，并且没有观察到明显的伪足和伪板伸出，相比之下，MN和HA试样表面的细胞黏附形态呈现三角形、多边形和星形，并伸出较多伪足和伪板于微米凹坑上，而且细胞伸展跨越微米凹坑，使得细胞间彼此紧密连接，形成大量的细胞团簇，尤其是在HA试样表面这种趋势表现的更为明显，图9和表3的细胞计数结果显示，三组不同试样三个时间点的细胞黏附相比均具有统计学意义，其大小依次是P＜MN＜HA，而且随着孵育时间的延长，各组试样表面黏附的细胞数量亦随时间的推移而增加，表4的CCK‑8检测结果显示，1d时HA试样表面细胞增殖量略高于P试样和MN试样(P＜0.05)；3d时HA试样表面细胞增殖量略低于P试样和MN试样(P＜0.05)；7d时HA试样表面细胞增殖量略低于MN试样(P＜
0.05)，但和P试样相比没有统计学差异。BMSCs在三组试样表面的增殖呈现出时间依赖性，细胞增殖随着时间的推移而逐渐增加，如图10所示，HA试样表面有较明显的钙盐结节沉积。
P、MN和HA的ECM矿化检测A值分别是(0.268±0.025)、(0.522±0.022)和(0.607±0.011)(F＝225.998，P＜0.05)，其中HA的ECM矿化显著大于P和MN(P＜0.05)，MN的ECM矿化显著大于P(P＜0.05)，成骨相关基因Runt相关转录因子2(runt‑related transcription factor 2，Runx2)、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)、骨钙素(osteocalcin，OCN)和骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)的表达水平如表5所示，三组样本间相比均具有统计学意义(P＜0.05)，其大小依次是P＜MN＜HA。

[0039] 表4：三组样本与BMSCs共培养不同时间细胞增殖的比较(A值， )

[0040]

[0041] 注：每组每种测量项目的样本量均为3；a表示与对照组P相同测量项目相比P＜b0.05；表示与MN相同测量项目相比P＜0.05。

[0042] 表5：三组样本与BMSCs共培养14天后成骨相关基因表达的比较(A值， )[0043]

[0044] 注：每组每种测量项目的样本量均为3；a表示与对照组P相同测量项目相比P＜b0.05；表示与MN相同测量项目相比P＜0.05。

[0045] 上述采用SPSS22.0软件分析，测量数值表示为均值±标准偏差 K‑S检验证实数据符合正态分布，Student‑t检验证实数据方差齐。采用单因素方差分析，LSD检验组间差异程度，以双侧P<0.05为差异有统计学意义。

[0046] 本申请中构筑的有序微纳米结构具有超亲水性能，促进了交替循环浸泡过程中离子的吸附进而参与反应，从而有利于在空隙均匀的纳米管内填充类骨磷灰石。氧化钛纳米管作为过渡层，不但可以缓解相邻层间热膨胀系数差值导致的较高的残余应力，而且纳米管可作为异相成核位点诱导涂层由层状结构变为嵌入式结构，提高涂层的结合强度，交替循环浸泡时去离子水反复冲洗以及循环后超声震荡，结合划痕实验的临界载荷和划痕后扫描电镜图，表明了羟基磷灰石分子与样本具有较高的结合强度，从而在植入体内时不易剥脱。生物医用材料植入体内后，材料表面首先快速地吸附血清中的蛋白，对后续的细胞黏附和响应起到了关键作用。经过微纳米处理的MN试样，材料表面比表面积增大，粗糙度值上升，表现出超亲水性，从而显著地提升了表面的蛋白吸附量，从而更有利于后续的细胞黏附和生长，而且实验中构筑的有序微米凹坑的直径约为20μm，这和未铺展开的BMSCs尺寸相当，也有利于其早期黏附。细胞黏附结果显示，相比对照组P试样，MN试样表面早期黏附的细胞量更多，羟基磷灰石涂层后，材料表面不但保留了原有的有序微米凹坑阵列，而且在纳米管中出现了纳米尺寸的花瓣样羟基磷灰石，使得材料表面更为粗糙，而且也提供了更多的吸附位点，协助表面蛋白吸附和细胞黏附。同时在细胞培养基中纳米羟基磷灰石涂层表面溶解，表面的电荷状态发生变化，钙位点结合负电荷基团，磷酸位点结合正电荷基团，也会吸引蛋白的吸附。同时局部形成的高钙磷浓度也可能对细胞有化学趋化作用，因而HA试样展现出了最佳的细胞黏附性能。研究发现，BMSCs也是通过粘着斑系统来感知材料表面的拓扑结构，从而引发随后的细胞骨架改变并介导了细胞的生物学行为。微米结构有助于调节合素介导的黏附细胞的排列，从而指导贴壁细胞的形状和方向。从细胞在不同钛试样上的黏附形态可见，P试样上的细胞顺着抛光形成的微米划痕凹槽排列，这是因为划痕凹槽处通常易形成蛋白吸附的位点，进而集聚蛋白团簇，介导细胞呈梭状黏附后再逐渐铺展。羟基磷灰石涂层并未改变材料表面的微米结构，所以MN和HA试样表面的BMSCs可以顺利黏附在与其尺寸相当的各个微米凹坑表面，然后逐渐铺展并跨过各个凹坑，同周围细胞形成广泛的连接，促进了细胞间的广泛通信。学者研究指出，70nm左右管径的二氧化钛纳米管具有合适的空间结构，促进了BMSCs的细胞伸展。本申请的实验也观察到了类似现象，高倍镜下可见MN和HA试样表面的BMSCs伸出大量的伪足和伪板，尤其是在HA表面这种趋势更明显，这可能是因为HA试样表面还存在散在均匀点缀的纳米羟基磷灰石。BMSCs形态越是伸展，伸出的伪足和伪板越多，就越容易向成骨向分化。而且微米凹坑间细胞间的直接通信也是细胞间细胞相互作用的一种机制，他使得相邻细胞之间的细胞质保持一致，对于细胞成骨分化也尤为重要。因此MN和HA均上调了成骨相关基因的表达水平，其中HA展示出了更佳的成骨分化能力可能与羟基磷灰石涂层的生物活性以及独特的生理功能有关。羟基磷灰石是一种生物活性材料，在细胞培养环境下，细胞和材料界面会形成富含钙和磷元素的微环境，从而促进细胞的成骨活性。而且随着成骨过程的进行，细胞不断合成并分泌与细胞分化以及细胞外基质矿化相关的蛋白(如OPN、OCN和BMP等)，反过来这些蛋白能够与羟基磷灰石结合，而这些蛋白的结合和积累也有助于细胞外基质的成熟和矿化。

[0047] 理想的骨内种植体不但应促进BMSCs的成骨分化，还应该支持BMSCs的细胞增殖。细胞增殖结果表明，相比P试样和MN试样，1d的时候，HA试样表面细胞增殖略微增加，这是因为早期较多的细胞黏附。3d的时候，HA试样表面细胞增殖略微受到抑制，这是因为其表面活跃的细胞分化和细胞增殖存在互为抑制的关系。7d的时候，HA试样表面细胞增殖虽然略低于MN，但迎头赶上对照组P试样，可能是因为其较大的比表面积以及纳米管状结构和纳米花瓣样羟基磷灰石为细胞增殖和体液交流提供更多的位点和空间。而且随着时间推移，HA表面的细胞增殖也随着增加，说明其具有良好的生物相容性。

[0048] 综上所述，HA试样可以促进BMSCs的细胞黏附和成骨分化，并支持其细胞增殖，具有良好的成骨活性。而且涂层时较低的温度能够保持羟基磷灰石的生物活性，整个制备工艺也简单便捷，适合于形状复杂的骨内植入物。

[0049] 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。