一种高效产麦角甾醇的酵母工程菌株及其构建方法与应用 |
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申请号 | CN202410317047.4 | 申请日 | 2024-03-20 | 公开(公告)号 | CN118048251A | 公开(公告)日 | 2024-05-17 |
申请人 | 天津科技大学; | 发明人 | 屠琳娜; 王敏; 喻雅琪; 杜娟; 张芮林; 申雁冰; | ||||
摘要 | 本 发明 属于 生物 技术领域,公开了一种高效产麦 角 甾醇的 酵母 工程菌株,其是在酵母宿主中敲除LAM1基因,敲除LAM2基因,敲除的LAM3基因,过表达脂质转运蛋白基因SEC14基因,敲除MNN10、MNN11、HOC1中的任意一个或任意两个或三个基因。本发明所构建的酵母工程菌株所含麦角甾醇为酵母菌干重的1%‑1.30%,比野生型酵母菌株提高了36%‑44%。本发明提供的工程菌不但具有产量高的优点,并且可以通过相对简单的方法条件进行 发酵 ,在工业上易于实现并控制,投资成本低,具有广阔的应用前景。 | ||||||
权利要求 | 1.一种高效产麦角甾醇的酵母工程菌株,其特征在于:所述酵母工程菌株是在酵母宿主中敲除SEQ ID NO.1所示的LAM1基因,敲除SEQ ID NO.2所示的LAM2基因,敲除SEQ ID NO.3所示的LAM3基因,过表达SEQ ID NO.4所示的脂质转运蛋白基因SEC14基因,敲除SEQ ID NO.5所示的MNN10、SEQ ID NO.6所示的MNN11、SEQ ID NO.7所示的HOC1中的任意一个或任意两个或三个基因得到的。 |
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说明书全文 | 一种高效产麦角甾醇的酵母工程菌株及其构建方法与应用技术领域背景技术[0002] 麦角甾醇,又称麦角固醇,是一种28碳甾族化合物,广泛存在于酵母中,是真菌细胞膜的重要组成成分,对确保细胞活力、膜的流动性、膜结合酶的活性、膜的完整性以及细胞物质运输等起着重要作用。麦角甾醇是一种重要的医药化工原料,用于生产“可的松”、"激素黄体酮等甾醇类药物。麦角甾醇也是维生素D2的前体,经紫外线照射后可得到维生素D2。在医药工业上,维生素D2是预防和治疗佝偻病、龋齿及老年骨质疏松症的重要药品。维生素D2还可以作为饲料添加剂添加在饲料中,增加畜禽的产蛋率和孵化率。 [0003] 目前,国内外用于生产麦角甾醇的酵母菌种主要采用以下四种选育方法获得:自然选育、常规选育、杂交法、原生质体融合法。上述四种技术均存在明显的不足之处。自然选育是从不同酵母菌种进行筛选。研究发现,对不同种、属的酵母菌的麦角甾醇的含量进行分析,不同种、属间差异很多,该方法工作量大且耗时长。常规选育是用诱变剂对菌株进行处理。这种方法可以直接获得高产麦角甾醇的菌株,但诱变选育的随机性大,结果具有不确定性。采用杂交法和原生质体融合法可以将不同菌株的优良性状结合起来,能获得生物量和麦角甾醇含量都较高的菌株。但研究发现,在这些酵母细胞中还含有2wt%左右的麦角甾醇前体物24(28)‑脱氢麦角甾醇存在。若24(28)‑脱氢麦角甾醇不能进一步转化为麦角甾醇,则酵母细胞内的麦角甾醇含量将不能被有效提升。 [0004] 我国麦角甾醇年产量不能满足消费者的需求,需要从国外进口,但从总体来看,我国对麦角甾醇的需求量呈逐年上升的趋势。因此,本领域迫切需要开发一种有效提升细胞内麦角甾醇含量的菌株。 [0006] 1、一种可动态调控7‑脱氧胆固醇及维生素D3的酿酒酵母菌的构建方法及应用(CN113025512A),所述构建方法包括以下步骤:S1、使用启动子GAL7控制酿酒酵母工程菌种mot3基因的表达,转化入原始酵母菌中构建第一酿酒酵母菌;S2、构建麦角甾醇动态调控的dCas9系统并提取构建的质粒;S3、人工合成融合基因片段gal80F‑loxT‑PTEF1‑DHCR24‑Tcyc1‑PGAP‑DIC‑TADH1‑gal80R,将其转化进入第一酿酒酵母菌,PCR验证后获得第二酿酒酵母菌;S4、将步骤S3中构建的质粒转化进入第二酿酒酵母菌中,经筛选后获得可动态调控生产7‑DHC的酿酒酵母菌。本发明所提供的构建方法构建的酿酒酵母菌,通过在不影响菌株生长状态的同时,利用酿酒酵母内源的甾醇调控系统,结合dCas9系统实现副产物的减少,7‑DHC的产量提升。 [0007] 2、一种产生菜籽甾醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用(CN110903993A),所述酿酒酵母工程菌含有甾醇Δ7‑还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因。本发明提供的酿酒酵母工程菌能够将麦角甾醇还原成菜籽甾醇。在本发明中,所述酿酒酵母工程菌中共表达甾醇Δ7‑还原酶和葡萄糖脱氢酶,就可以葡萄糖脱氢酶形成的NADPH作为辅因子,利用甾醇Δ7‑还原酶将酿酒酵母固有的麦角甾醇还原成菜籽甾醇,从而达到生物制备菜籽甾醇的目的。 [0008] 通过对比,本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。 发明内容[0009] 本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处,提供一种高效产麦角甾醇的酵母工程菌株及其构建方法与应用。 [0010] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是: [0011] 一种高效产麦角甾醇的酵母工程菌株,所述酵母工程菌株是在酵母宿主中敲除SEQ ID NO.1所示的LAM1基因,敲除SEQ ID NO.2所示的LAM2基因,敲除SEQ ID NO.3所示的LAM3基因,过表达SEQ ID NO.4所示的脂质转运蛋白基因SEC14基因,敲除SEQ ID NO.5所示的MNN10、SEQ ID NO.6所示的MNN11、SEQ ID NO.7所示的HOC1中的任意一个或任意两个或三个基因得到的。 [0012] 进一步地,所采用的宿主菌包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母(Pichia pastoris)。 [0013] 进一步地,所述工程菌株在构建时构建了包含HA‑tag的SEC14融合基因。 [0014] 如上所述的酵母工程菌株的构建方法,包括以下步骤: [0015] (1)在酵母宿主菌中将LAM1、LAM2和LAM3基因敲除; [0016] (2)将HA‑tag整合到SEC14基因3’端,将连有筛选标记基因的PTPI1启动子整合到SEC14基因5’端; [0017] (3)在酵母宿主菌中将MNN10、MNN11、HOC1基因中的任意一个或任意两个或三个基因敲除; [0018] (4)将所需的片段采用醋酸锂转化法或电转化法转入酵母宿主菌中进行基因组上的基因替换或基因插入表达; [0019] (5)分别通过组氨酸缺陷型固体酵母培养基、亮氨酸营养缺陷型固体酵母培养基、尿嘧啶营养缺陷型固体酵母培养基和添加了遗传霉素的固体酵母培养基的筛选,能够在营养缺陷型固体培养基及添加了遗传霉素的固体酵母培养基上生长出的单菌落,即得到单克隆重组菌株。 [0020] 进一步地,每1L尿嘧啶营养缺陷型固体培养基为:酵母氮源基础6.5‑7g/L,灭菌结束后加入尿嘧啶缺陷型氨基酸混合物0.72‑0.84g/L和葡萄糖1.7‑2.3%,琼脂2‑3%,用ddH2O定容至1L; [0021] 每1L亮氨酸营养缺陷型固体培养基为:酵母氮源基础6.5‑7g/L,灭菌结束后加入亮氨酸缺陷型氨基酸混合物1.17‑1.43g/L和葡萄糖1.7‑2.3%,琼脂2‑3%,用ddH2O定容至1L; [0022] 每1L组氨酸营养缺陷型固体培养基为:酵母氮源基础6.5‑7g/L,灭菌结束后加入组氨酸缺陷型氨基酸混合物1.17‑1.43g/L和葡萄糖1.7‑2.3%,琼脂2‑3%,用ddH2O定容至1L; [0023] 每1L添加了遗传霉素的固体酵母培养基为:遗传霉素0.18‑0.22g/L,酵母提取物9‑11g,蛋白胨18‑22g,硫酸腺嘌呤(Adenine sulphate)0.048‑0.062g,葡萄糖1.7‑2.3%,琼脂2‑3%,用ddH2O定容至1L; [0024] 其中,上述百分数均为质量浓度百分数。 [0025] 进一步地,具体包括以下步骤: [0026] (1)将SEC14基因与6HA即HA×6构建融合基因; [0027] (2)以质粒pYX212为模板,进行PCR扩增,得到PTPI1启动子;以酵母基因组为模板,进行PCR扩增,分别得到LAM1基因、LAM2基因、LAM3基因、MNN10基因、MNN11基因、HOC1基因的+上游500bp及下游500bp片段;以质粒pUG27为模板,进行PCR扩增,得到LAM1(up)‑Sphis5 ‑+ LAM1(dn)、MNN10(up)‑Sphis5‑MNN10(dn)和 [0028] MNN11(up)‑Sphis5+‑MNN11(dn)片段;以质粒pUG72为模板,进行PCR扩增,得到LAM2(up)‑SpURA3‑LAM2(dn)片段;以质粒pUG6为模板,进行PCR扩增,得到LAM3(up)‑kanMX‑LAM3(dn)片段;以质粒pUG73为模板,进行PCR扩增,得到HOC1(up)‑KlLEU2‑HOC1(dn)片段; [0029] (3)采用醋酸锂转化法或电转化法将LAM1基因上游500bp、500bp和LAM1(up)‑+Sphis5‑LAM1(dn)片段导入宿主菌株,在组氨酸缺陷型固体酵母培养基上得到LAM1基因敲除的菌株; [0030] (4)采用醋酸锂转化法或电转化法将LAM2基因上游500bp、500bp和LAM2(up)‑SpURA3‑LAM2(dn)片段导入步骤(3)的菌株,在尿嘧啶缺陷型固体酵母培养基上得到LAM1基因和LAM2基因敲除的菌株; [0031] (5)采用醋酸锂转化法或电转化法将LAM3基因上游500bp、500bp和 [0032] LAM3(up)‑kanMX‑LAM3(dn)片段导入步骤(4)的菌株,在添加了遗传霉素的固体酵母培养基上得到LAM1基因、LAM2和LAM3基因敲除的菌株; [0033] (6)将SpURA3与PTPI1启动子连接得到融合片段; [0034] (7)采用醋酸锂转化法或电转化法将SpURA3‑PTPI1片段插入步骤(5)菌株的SEC14基因5’端; [0035] (8)在尿嘧啶营养缺陷型固体培养基上得到高表达SEC14且LAM1基因、LAM2基因和LAM3基因敲除的菌株; [0036] (9)采用醋酸锂转化法或电转化法将以下片段中的任意一个或任意两个或三个导入步骤(8)的菌株,在氨基酸缺陷型固体酵母培养基上得到高表达SEC14且敲除LAM1基因、LAM2基因、LAM3基因和敲除MNN10、MNN11、HOC1基因中的任意一个或任意两个或三个基因的+酵母菌株:MNN10基因上游500bp、500bp和MNN10(up)‑Sphis5‑MNN10(dn)片段、MNN11基因+ 上游500bp、500bp和MNN11(up)‑Sphis5 ‑MNN11(dn)片段、HOC1基因上游500bp、500bp和HOC1(up)‑KlLEU2‑HOC1(dn)片段,即得。 [0037] 如上所述的酵母工程菌株在生产麦角甾醇中的应用。 [0039] 将酵母工程菌划线于YEPD固体培养基平板上,28~30℃培养48‑72h,将活化后的菌种,接1‑2环于装有3‑5mLYEPD液体培养基的试管中,28~30℃,180‑220rpm条件下培养12‑16h即为种子培养液,将种子培养液按2‑10%接种量接入到YEPD发酵培养基中,28~30℃,180‑220rpm条件下发酵24‑36h,即得。 [0040] 进一步地,每1LYEPD固体培养基为:酵母提取物9‑11g,蛋白胨18‑22g,硫酸腺嘌呤(Adenine sulphate)0.048‑0.062g,琼脂18‑22g,葡萄糖1.7‑2.3%,用ddH2O定容至1L; [0041] 每1LYEPD液体培养基为:酵母提取物9‑11g,蛋白胨18‑22g,硫酸腺嘌呤(Adenine sulphate)0.048‑0.062g,葡萄糖1.7‑2.3%,用ddH2O定容至1L; [0042] 每1LYEPD发酵培养基为:酵母提取物9‑11g,蛋白胨18‑22g,硫酸腺嘌呤(Adenine sulphate)0.048‑0.062g,葡萄糖1.7‑2.3%,用ddH2O定容至1L; [0043] 其中,上述百分数均为质量浓度百分数。 [0044] 一种如上所述的酵母工程菌株细胞内的麦角甾醇含量测定的方法,具体步骤如下: [0045] (1)酵母工程菌株发酵结束后,收集全部菌体; [0046] (2)将收集到的菌体进行冷冻干燥; [0047] (3)干菌体回流皂化; [0049] (5)蒸干有机溶剂层,复溶已提取物质; [0050] (6)使用高效液相色谱法测量283nm处的紫外吸收峰; [0051] (7)计算细胞内麦角甾醇含量。 [0052] 本发明取得的优点和积极效果为: [0053] 1、本发明酵母工程菌株是在酵母宿主中敲除SEQ ID NO.1所示的LAM1基因,敲除SEQ ID NO.2所示的LAM2基因,敲除SEQ ID NO.3所示的LAM3基因,过表达SEQ ID NO.4所示的脂质转运蛋白基因SEC14基因,敲除SEQ ID NO.5所示的MNN10、SEQ ID NO.6所示的MNN11、SEQ ID NO.7所示的HOC1中的任意一个或任意两个或三个基因。本发明所构建的酵母工程菌株所含麦角甾醇为酵母菌干重的1%‑1.30%,比野生型酵母菌株提高了36%‑44%。本发明提供的工程菌不但具有产量高的优点,并且可以通过相对简单的方法条件进行发酵,在工业上易于实现并控制,投资成本低,具有广阔的应用前景。 [0055] 图1为本发明中lam1Δlam2Δlam3Δ基因敲除菌验证图;其中,M:DNA分子量标准;+ 泳道1‑LAM1(up)‑Sphis5‑LAM1(dn)验证片段;泳道2‑LAM2(up)‑SpURA3‑LAM2(dn)验证片段;泳道3‑LAM3(up)‑kanMX‑LAM3(dn)验证片段; [0056] 图2为本发明中SEC14基因在基因组进行改造的验证图;其中,M:DNA分子量标准;+ 泳道1‑SpURA3‑PTPI1扩增片段;泳道2‑6HA‑CYC1‑Sphis5扩增片段; [0057] 图3为本发明中MNN10基因敲除的验证图;其中,M:DNA分子量标准;泳道1‑MNN10+(up)‑Sphis5‑MNN10(dn)验证片段; [0058] 图4为本发明中MNN11基因敲除的验证图;其中,M:DNA分子量标准;泳道1‑MNN11+(up)‑Sphis5‑MNN11(dn)验证片段; [0059] 图5为本发明中HOC1基因敲除的验证图;其中,M:DNA分子量标准;泳道1‑HOC1(up)‑KlLEU2‑HOC1(dn)验证片段; [0060] 图6为本发明中酵母工程菌株与野生型酵母菌株中麦角甾醇产量的比较图;其中,1:野生型酵母菌株,2:酵母工程菌株。 具体实施方式[0061] 下面结合实施例,对本发明进一步说明,下属实施例是叙述性的,不是限定性的,不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。 [0063] 一种高效产麦角甾醇的酵母工程菌株,所述酵母工程菌株是在酵母宿主中敲除SEQ ID NO.1所示的LAM1基因,敲除SEQ ID NO.2所示的LAM2基因,敲除SEQ ID NO.3所示的LAM3基因,过表达SEQ ID NO.4所示的脂质转运蛋白基因SEC14基因,敲除SEQ ID NO.5所示的MNN10、SEQ ID NO.6所示的MNN11、SEQ ID NO.7所示的HOC1中的任意一个或任意两个或三个基因得到的。 [0064] 较优地,所采用的宿主菌包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母(Pichia pastoris)。 [0065] 较优地,所述工程菌株在构建时构建了包含HA‑tag的SEC14融合基因。 [0066] 如上所述的酵母工程菌株的构建方法,包括以下步骤: [0067] (1)在酵母宿主菌中将LAM1、LAM2和LAM3基因敲除; [0068] (2)将HA‑tag整合到SEC14基因3’端,将连有筛选标记基因的PTPI1启动子整合到SEC14基因5’端; [0069] (3)在酵母宿主菌中将MNN10、MNN11、HOC1基因中的任意一个或任意两个或三个基因敲除; [0070] (4)将所需的片段采用醋酸锂转化法或电转化法转入酵母宿主菌中进行基因组上的基因替换或基因插入表达; [0071] (5)分别通过组氨酸缺陷型固体酵母培养基、亮氨酸营养缺陷型固体酵母培养基、尿嘧啶营养缺陷型固体酵母培养基和添加了遗传霉素的固体酵母培养基的筛选,能够在营养缺陷型固体培养基及添加了遗传霉素的固体酵母培养基上生长出的单菌落,即得到单克隆重组菌株。 [0072] 较优地,每1L尿嘧啶营养缺陷型固体培养基为:酵母氮源基础6.5‑7g/L,灭菌结束后加入尿嘧啶缺陷型氨基酸混合物0.72‑0.84g/L和葡萄糖1.7‑2.3%,琼脂2‑3%,用ddH2O定容至1L; [0073] 每1L亮氨酸营养缺陷型固体培养基为:酵母氮源基础6.5‑7g/L,灭菌结束后加入亮氨酸缺陷型氨基酸混合物1.17‑1.43g/L和葡萄糖1.7‑2.3%,琼脂2‑3%,用ddH2O定容至1L; [0074] 每1L组氨酸营养缺陷型固体培养基为:酵母氮源基础6.5‑7g/L,灭菌结束后加入组氨酸缺陷型氨基酸混合物1.17‑1.43g/L和葡萄糖1.7‑2.3%,琼脂2‑3%,用ddH2O定容至1L; [0075] 每1L添加了遗传霉素的固体酵母培养基为:遗传霉素0.18‑0.22g/L,酵母提取物9‑11g,蛋白胨18‑22g,硫酸腺嘌呤(Adenine sulphate)0.048‑0.062g,葡萄糖1.7‑2.3%,琼脂2‑3%,用ddH2O定容至1L; [0076] 其中,上述百分数均为质量浓度百分数。 [0077] 较优地,具体包括以下步骤: [0078] (1)将SEC14基因与6HA即HA×6构建融合基因; [0079] (2)以质粒pYX212为模板,进行PCR扩增,得到PTPI1启动子;以酵母基因组为模板,进行PCR扩增,分别得到LAM1基因、LAM2基因、LAM3基因、MNN10基因、MNN11基因、HOC1基因的+上游500bp及下游500bp片段;以质粒pUG27为模板,进行PCR扩增,得到LAM1(up)‑Sphis5 ‑+ LAM1(dn)、MNN10(up)‑Sphis5‑MNN10(dn)和 [0080] MNN11(up)‑Sphis5+‑MNN11(dn)片段;以质粒pUG72为模板,进行PCR扩增,得到LAM2(up)‑SpURA3‑LAM2(dn)片段;以质粒pUG6为模板,进行PCR扩增,得到LAM3(up)‑kanMX‑LAM3(dn)片段;以质粒pUG73为模板,进行PCR扩增,得到HOC1(up)‑KlLEU2‑HOC1(dn)片段; [0081] (3)采用醋酸锂转化法或电转化法将LAM1基因上游500bp、500bp和LAM1(up)‑+Sphis5‑LAM1(dn)片段导入宿主菌株,在组氨酸缺陷型固体酵母培养基上得到LAM1基因敲除的菌株; [0082] (4)采用醋酸锂转化法或电转化法将LAM2基因上游500bp、500bp和LAM2(up)‑SpURA3‑LAM2(dn)片段导入步骤(3)的菌株,在尿嘧啶缺陷型固体酵母培养基上得到LAM1基因和LAM2基因敲除的菌株; [0083] (5)采用醋酸锂转化法或电转化法将LAM3基因上游500bp、500bp和LAM3(up)‑kanMX‑LAM3(dn)片段导入步骤(4)的菌株,在添加了遗传霉素的固体酵母培养基上得到LAM1基因、LAM2和LAM3基因敲除的菌株; [0084] (6)将SpURA3与PTPI1启动子连接得到融合片段; [0085] (7)采用醋酸锂转化法或电转化法将SpURA3‑PTPI1片段插入步骤(5)菌株的SEC14基因5’端; [0086] (8)在尿嘧啶营养缺陷型固体培养基上得到高表达SEC14且LAM1基因、LAM2基因和LAM3基因敲除的菌株; [0087] (9)采用醋酸锂转化法或电转化法将以下片段中的任意一个或任意两个或三个导入步骤(8)的菌株,在氨基酸缺陷型固体酵母培养基上得到高表达SEC14且敲除LAM1基因、LAM2基因、LAM3基因和敲除MNN10、MNN11、HOC1基因中的任意一个或任意两个或三个基因的+酵母菌株:MNN10基因上游500bp、500bp和MNN10(up)‑Sphis5‑MNN10(dn)片段、MNN11基因+ 上游500bp、500bp和MNN11(up)‑Sphis5 ‑MNN11(dn)片段、HOC1基因上游500bp、500bp和HOC1(up)‑KlLEU2‑HOC1(dn)片段,即得。 [0088] 如上所述的酵母工程菌株在生产麦角甾醇中的应用。 [0089] 利用如上所述的酵母工程菌株发酵生产麦角甾醇的方法,步骤如下: [0090] 将酵母工程菌划线于YEPD固体培养基平板上,28~30℃培养48‑72h,将活化后的菌种,接1‑2环于装有3‑5mLYEPD液体培养基的试管中,28~30℃,180‑220rpm条件下培养12‑16h即为种子培养液,将种子培养液按2‑10%接种量接入到YEPD发酵培养基中,28~30℃,180‑220rpm条件下发酵24‑36h,即得。 [0091] 较优地,每1LYEPD固体培养基为:酵母提取物9‑11g,蛋白胨18‑22g,硫酸腺嘌呤(Adenine sulphate)0.048‑0.062g,琼脂18‑22g,葡萄糖1.7‑2.3%,用ddH2O定容至1L; [0092] 每1LYEPD液体培养基为:酵母提取物9‑11g,蛋白胨18‑22g,硫酸腺嘌呤(Adenine sulphate)0.048‑0.062g,葡萄糖1.7‑2.3%,用ddH2O定容至1L; [0093] 每1LYEPD发酵培养基为:酵母提取物9‑11g,蛋白胨18‑22g,硫酸腺嘌呤(Adenine sulphate)0.048‑0.062g,葡萄糖1.7‑2.3%,用ddH2O定容至1L; [0094] 其中,上述百分数均为质量浓度百分数。 [0095] 一种如上所述的酵母工程菌株细胞内的麦角甾醇含量测定的方法,具体步骤如下: [0096] (1)酵母工程菌株发酵结束后,收集全部菌体; [0097] (2)将收集到的菌体进行冷冻干燥; [0098] (3)干菌体回流皂化; [0099] (4)使用有机溶剂萃取多次,合并溶剂层; [0100] (5)蒸干有机溶剂层,复溶已提取物质; [0101] (6)使用高效液相色谱法测量283nm处的紫外吸收峰; [0102] (7)计算细胞内麦角甾醇含量。 [0103] 具体地,相关的制备及检测如下: [0104] 实施例1LAM1基因敲除酿酒酵母工程菌株的构建 [0105] 根据LAM1的核苷酸序列、质粒pUG27的核苷酸序列设计以下扩增引物: [0106] LAM1Δ‑500F1: [0107] 5’‑GTATATTATTACGAGAGTATCCGCAAT‑3’ [0108] LAM1Δ‑HIS5‑R1: [0109] 5’‑cctgcagcgtacgaagcttcagctgTATAAAATTGTTCTACAATGACCAA‑3’[0110] LAM1Δ‑HIS5‑F2: [0111] 5’‑TTGGTCATTGTAGAACAATTTTATAcagctgaagcttcgtacgctgcagg‑3’[0112] LAM1Δ‑HIS5‑R2: [0113] 5’‑AGAGTAGACATTCTGGGGCACTATgcataggccactagtggatctgatat‑3’[0114] LAM1Δ‑HIS5‑F3: [0115] 5’‑atatcagatccactagtggcctatgcATAGTGCCCCAGAATGTCTACTCT‑3’[0116] LAM1Δ+450R3: [0117] 5’‑TCATCATATAACAAATAAACAGGACTATATTATTGG‑3’ [0118] PCR反应体系: FastPfu Buffer 10μL,2.5mM dNTPs 4μL,模板DNA 1μL,上下游引物各0.5μL, FastPfu DNApolymerase 1μL,ddH2O补齐至总体积50μL; [0119] 以BY4741基因组DNA为模板,LAM1Δ‑500F1和LAM1Δ‑HIS5‑R1为引物进行PCR扩增获得LAM1基因上游500bp,以LAM1Δ‑HIS5‑F3和LAM1Δ+450R3为引物进行PCR扩增获得LAM1基因下游500bp。PCR反应条件为:95℃5min,95℃30s,56℃30s,72℃20s,循环35次,72℃5min,4℃保温。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析后,切胶回收目的片段。 [0120] 以质粒pUG27为模板,LAM1Δ‑HIS5‑F2和LAM1Δ‑HIS5‑R2为引物进行PCR扩增获得+LAM1(up)‑Sphis5 ‑LAM1(dn)片段。PCR反应条件为:95℃5min,95℃30s,55℃30s,72℃ 1min,循环35次,72℃5min,4℃保温。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析后,切胶回收目的片段。 [0121] 采用醋酸锂转化法将LAM1基因上游500bp、下游500bp、LAM1(up)‑Sphis5+‑LAM1(dn)片段导入宿主菌株中。 [0122] 通过组氨酸营养缺陷型固体培养基筛选得到lam1Δ菌株。 [0123] 实施例2LAM1、LAM2基因敲除酿酒酵母工程菌株的构建 [0124] 根据LAM2的核苷酸序列、质粒pUG72的核苷酸序列设计以下扩增引物: [0125] LAM2Δ‑500F1: [0126] 5’‑TCCTCTGATGACTGTGATCCT‑3’ [0127] LAM2Δ‑URA3‑R1: [0128] 5’‑cctgcagcgtacgaagcttcagctgTGGTTAGGGATATCTGTACAGCTGC‑3’[0129] LAM2Δ‑URA3‑F2: [0130] 5’‑GCAGCTGTACAGATATCCCTAACCAcagctgaagcttcgtacgctgcagg‑3’[0131] LAM2Δ‑URA3‑R2: [0132] 5’‑TATTAGAACGAAAAATGTTATTTTAgcataggccactagtggatctgata‑3’[0133] LAM2Δ‑URA3‑F3: [0134] 5’‑tatcagatccactagtggcctatgcTAAAATAACATTTTTCGTTCTAATA‑3’[0135] LAM2Δ+500R3: [0136] 5’‑GTATTCAAGACACGTCAACTGTAG‑3’ [0137] PCR反应体系: FastPfu Buffer 10μL,2.5mM dNTPs 4μL,模板DNA 1μL,上下游引物各0.5μL, FastPfu DNApolymerase 1μL,ddH2O补齐至总体积50μL; [0138] 以BY4741基因组DNA为模板,LAM2Δ‑500F1和LAM2Δ‑URA3‑R1为引物进行PCR扩增获得LAM2基因上游500bp,以LAM2Δ‑URA3‑F3和LAM2Δ+500R3为引物进行PCR扩增获得LAM2基因下游500bp。PCR反应条件为:95℃5min,95℃30s,56℃30s,72℃20s,循环35次,72℃5min,4℃保温。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析后,切胶回收目的片段。 [0139] 以质粒pUG72为模板,LAM2Δ‑URA3‑F2和LAM2Δ‑URA3‑R2为引物进行PCR扩增获得LAM2(up)‑SpURA3‑LAM2(dn)片段。PCR反应条件为:95℃5min,95℃30s,55℃30s,72℃1min,循环35次,72℃5min,4℃保温。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析后,切胶回收目的片段。 [0140] 采用醋酸锂转化法将LAM2基因上游500bp、下游500bp、LAM2(up)‑SpURA3‑LAM2(dn)片段导入lam1Δ菌株中。 [0141] 通过尿嘧啶营养缺陷型固体培养基筛选得到lam1Δlam2Δ菌株。 [0142] 实施例3LAM1、LAM2、LAM3基因敲除酿酒酵母工程菌株的构建 [0143] 根据LAM3的核苷酸序列、质粒pUG6的核苷酸序列设计以下扩增引物: [0144] LAM3Δ‑500F1: [0145] 5’‑ATCATCCGTAGCCGCAGA‑3’ [0146] LAM3Δ‑kanMX‑R1: [0147] 5’‑cctgcagcgtacgaagcttcagctgATTTCAAGTAATGATATATCTCTGC‑3’[0148] LAM3Δ‑kanMX‑F2: [0149] 5’‑GCAGAGATATATCATTACTTGAAATcagctgaagcttcgtacgctgcagg‑3’[0150] LAM3Δ‑kanMX‑R2: [0151] 5’‑ATAATTATATAATAGTTATATTCGCgcataggccactagtggatctgata‑3’[0152] LAM3Δ‑kanMX‑F3: [0153] 5’‑tatcagatccactagtggcctatgcGCGAATATAACTATTATATAATTAT‑3’[0154] LAM3Δ+500R3: [0155] 5’‑GCAGTTTTCTAGTTCTAGTATGTTCAAAT‑3’ [0156] PCR反应体系: FastPfu Buffer 10μL,2.5mM dNTPs 4μL,模板DNA 1μL,上下游引物各0.5μL, FastPfu DNApolymerase 1μL,ddH2O补齐至总体积50μL; [0157] 以BY4741基因组DNA为模板,LAM3Δ‑500F1和LAM3Δ‑kanMX‑R1为引物进行PCR扩增获得LAM3基因上游500bp,以LAM3Δ‑kanMX‑F3和LAM3Δ+500R3为引物进行PCR扩增获得LAM2基因下游500bp。PCR反应条件为:95℃5min,95℃30s,56℃30s,72℃20s,循环35次,72℃5min,4℃保温。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析后,切胶回收目的片段。 [0158] 以质粒pUG6为模板,LAM3Δ‑kanMX‑F2和LAM3Δ‑kanMX‑R2为引物进行PCR扩增获得LAM3(up)‑kanMX‑LAM3(dn)片段。PCR反应条件为:95℃5min,95℃30s,55℃30s,72℃1min,循环35次,72℃5min,4℃保温。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析后,切胶回收目的片段。 [0159] 采用醋酸锂转化法将LAM3基因上游500bp、下游500bp、LAM3(up)‑kanMX‑LAM3(dn)片段导入lam1Δlam2Δ菌株中。 [0160] 通过添加了遗传霉素的固体酵母培养基筛选得到lam1Δlam2Δlam3Δ菌株,其验证如图1所示。 [0161] 实施例4SEC14基因过表达且LAM1、LAM2、LAM3基因敲除的酿酒酵母工程菌株的构建 [0162] 根据SEC14的核苷酸序列、质粒pYX212的核苷酸序列和pUG72的核苷酸序列设计以下扩增引物: [0163] URA‑PTPI1‑SEC14‑500F1: [0164] 5’‑GCCGTACGTGTCGTCTGATCTCCAA‑3’ [0165] URA‑PTPI1‑SEC14‑500R1: [0166] 5’‑CCTGCAGCGTACGAAGCTTCAGCTGTGTGTTTTAGGGCGATGAAGGTTTG‑3’[0167] URA‑PTPI1‑SEC14‑F2: [0168] 5’‑CAAACCTTCATCGCCCTAAAACACACAGCTGAAGCTTCGTACGCTGCAGG‑3’[0169] URA‑PTPI1‑SEC14‑R2: [0170] 5’‑GAAGAAGAATGACCATACGTAGATCGCATAGGCCACTAGTGGATCTGATA‑3’[0171] URA‑PTPI1‑SEC14‑F3: [0172] 5’‑TATCAGATCCACTAGTGGCCTATGCGATCTACGTATGGTCATTCTTCTTC‑3’[0173] URA‑PTPI1‑SEC14‑R3: [0174] 5’‑AAAAGCAACAACATACTGTAACCATTGTATGTGTTTTTTGTAGTTATAGA‑3’[0175] URA‑PTPI1‑SEC14+500F4: [0176] 5’‑TCTATAACTACAAAAAACACATACAATGGTTACAGTATGTTGTTGCTTTT‑3’[0177] URA‑PTPI1‑SEC14+500R4:5’‑TCGGTTTTATGATAATATTGTGGGT‑3’ [0178] PCR反应体系: FastPfu Buffer 10μL,2.5mM dNTPs 4μL,模板DNA 1μL,上下游引物各0.5μL, FastPfu DNApolymerase 1μL,ddH2O补齐至总体积50μL; [0179] 以BY4741基因组DNA为模板,URA‑PTPI1‑SEC14‑500F1和URA‑PTPI1‑SEC14‑500R1为引物进行PCR扩增获得SEC14基因上游500bp,以URA‑PTPI1‑SEC14+500F4和URA‑PTPI1‑SEC14+500R4为引物进行PCR扩增获得SEC14基因下游500bp。PCR反应条件为:95℃5min,95℃30s, 56℃30s,72℃20s,循环35次,72℃5min,4℃保温。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析后,切胶回收目的片段。 [0180] 以质粒pYX212为模板,URA‑PTPI1‑SEC14‑F3和URA‑PTPI1‑SEC14‑R3为引物进行PCR扩增获得PTPI1启动子。PCR反应条件为:95℃5min,95℃30s,55℃30s,72℃1min,循环35次,72℃5min,4℃保温。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析后,切胶回收目的片段。 [0181] 以质粒pUG72为模板,URA‑PTPI1‑SEC14‑F2和URA‑PTPI1‑SEC14‑R2为引物进行PCR扩增获得SpURA3基因片段。PCR反应条件为:95℃5min,95℃30s,55℃30s,72℃1min,循环35次,72℃5min,4℃保温。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析后,切胶回收目的片段。 [0182] 将SpURA3与PTPI1连接成SpURA3‑PTPI1片段: [0183] PCR反应体系: FastPfu Buffer 10μL,2.5mM dNTPs 4μL,模板DNA 1μL,上下游引物各0.5μL, FastPfu DNApolymerase 1μL,ddH2O补齐至总体积50μL; [0184] 以SpURA3和PTPI1片段为模板,URA‑PTPI1‑SEC14‑F2和URA‑PTPI1‑SEC14‑R3为引物进行PCR扩增连接SpURA3‑PTPI1片段。PCR反应条件为:95℃5min,95℃30s,55℃30s,72℃1min 20s,循环35次,72℃5min,4℃保温。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析后,切胶回收目的片段。 [0185] 采用醋酸锂转化法将SEC14基因上游500bp、下游500bp、SpURA3‑PTPI1导入lam1Δlam2Δlam3Δ菌株中。 [0186] 通过尿嘧啶营养缺陷型固体培养基筛选得到过表达SEC14的lam1Δlam2Δlam3Δ菌株,其验证如图2所示。 [0187] 实施例5SEC14基因过表达且LAM1、LAM2、LAM3、MNN10基因敲除的酿酒酵母工程菌株的构建 [0188] 根据MNN10的核苷酸序列、质粒pUG27的核苷酸序列设计以下扩增引物: [0189] MNN10Δ‑500F1: [0190] 5’‑ACTTTGAAGAGAGTTTTTATAGCGATG‑3’ [0191] MNN10Δ‑HIS5‑R1: [0192] 5’‑cctgcagcgtacgaagcttcagctgATTGTATAGTTGTACATGCACAATTATTC‑3’[0193] MNN10Δ‑HIS5‑F2: [0194] 5’‑AATTGTGCATGTACAACTATACAATcagctgaagcttcgtacg‑3’ [0195] MNN10Δ‑HIS5‑R2: [0196] 5’‑CTTTACAATATTGATAACTTCCATTgcataggccactagtgga‑3’ [0197] MNN10Δ‑HIS5‑F3: [0198] 5’‑tatcagatccactagtggcctatgcAATGGAAGTTATCAATATTGTAAAGAGAAGC‑3’[0199] MNN10Δ+450R3: [0200] 5’‑TTTTCGATGTTCGTTTGTTGAGT‑3’ [0201] PCR反应体系: FastPfu Buffer 10μL,2.5mM dNTPs 4μL,模板DNA 1μL,上下游引物各0.5μL, FastPfu DNApolymerase 1μL,ddH2O补齐至总体积50μL; [0202] 以BY4741基因组DNA为模板,MNN10Δ‑500F1和MNN10Δ‑HIS5‑R1为引物进行PCR扩增获得MNN10基因上游500bp,以MNN10Δ‑HIS5‑F3和MNN10Δ+450R3为引物进行PCR扩增获得MNN10基因下游500bp。PCR反应条件为:95℃5min,95℃30s,56℃30s,72℃20s,循环35次,72℃5min,4℃保温。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析后,切胶回收目的片段。 [0203] 以质粒pUG27为模板,MNN10Δ‑HIS5‑F2和MNN10Δ‑HIS5‑R2为引物进行PCR扩增获+得MNN10(up)‑Sphis5‑MNN10(dn)片段。PCR反应条件为:95℃5min,95℃30s,55℃30s,72℃ 1min,循环35次,72℃5min,4℃保温。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析后,切胶回收目的片段。 [0204] 采用醋酸锂转化法将MNN10基因上游500bp、下游500bp、MNN10(up)‑Sphis5+‑MNN10(dn)片段导入过表达SEC14基因的lam1Δlam2Δlam3Δ菌株中。 [0205] 通过组氨酸营养缺陷型固体培养基筛选得到过表达SEC14的lam1Δlam2Δlam3Δmnn10Δ菌株。其验证如图3所示。 [0206] 实施例6SEC14基因过表达且LAM1、LAM2、LAM3、MNN10、MNN11基因敲除的酿酒酵母工程菌株的构建 [0207] 根据MNN11的核苷酸序列、质粒pUG27的核苷酸序列设计以下扩增引物: [0208] MNN11Δ‑500F1: [0209] 5’‑GTGCTAAACGCTGGCCAA‑3’ [0210] MNN11Δ‑HIS5‑R1: [0211] 5’‑cctgcagcgtacgaagcttcagctgTTTAACGAGTCCTAACACAGCTAAC‑3’[0212] MNN11Δ‑HIS5‑F2: [0213] 5’‑GTTAGCTGTGTTAGGACTCGTTAAAcagctgaagcttcgtacgctgcagg‑3’[0214] MNN11Δ‑HIS5‑R2: [0215] 5’‑AACTAAATTGCAAGATTACACACATgcataggccactagtggatctgata‑3’[0216] MNN11Δ‑HIS5‑F3: [0217] 5’‑tatcagatccactagtggcctatgcATGTGTGTAATCTTGCAATTTAGTT‑3’[0218] MNN11Δ+450R3: [0219] 5’‑GTTATTGAGTATTGTATAATATGAAAGATGCG‑3’ [0220] PCR反应体系: FastPfu Buffer 10μL,2.5mM dNTPs 4μL,模板DNA 1μL,上下游引物各0.5μL, FastPfu DNApolymerase 1μL,ddH2O补齐至总体积50μL; [0221] 以BY4741基因组DNA为模板,MNN11Δ‑500F1和MNN11Δ‑HIS5‑R1为引物进行PCR扩增获得MNN11基因上游500bp,以MNN11Δ‑HIS5‑F3和MNN11Δ+450R3为引物进行PCR扩增获得MNN11基因下游500bp。PCR反应条件为:95℃5min,95℃30s,56℃30s,72℃20s,循环35次,72℃5min,4℃保温。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析后,切胶回收目的片段。 [0222] 以质粒pUG27为模板,MNN11Δ‑HIS5‑F2和MNN11Δ‑HIS5‑R2为引物进行PCR扩增获+得MNN11(up)‑Sphis5‑MNN11(dn)片段。PCR反应条件为:95℃5min,95℃30s,55℃30s,72℃ 1min,循环35次,72℃5min,4℃保温。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析后,切胶回收目的片段。 [0223] 采用醋酸锂转化法将MNN11基因上游500bp、下游500bp、MNN11(up)‑Sphis5+‑MNN11(dn)片段导入过表达SEC14的lam1Δlam2Δlam3Δmnn10Δ菌株中。 [0224] 通过组氨酸营养缺陷型固体培养基筛选得到过表达SEC14的lam1Δlam2Δlam3Δmnn10Δmnn11Δ菌株。其验证如图4所示。 [0225] 实施例7SEC14基因过表达且LAM1、LAM2、LAM3、MNN10、MNN11、HOC1基因敲除的酿酒酵母工程菌株的构建 [0226] 根据HOC1的核苷酸序列、质粒pUG73的核苷酸序列设计以下扩增引物: [0227] HOC1Δ‑500F1: [0228] 5’‑GCAAGGAACCAAGTTCACC‑3’ [0229] HOC1Δ‑LEU2‑R1: [0230] 5’‑cctgcagcgtacgaagcttcagctgCGTTAACCGCTACAGTCTATATATC‑3’[0231] HOC1Δ‑LEU2‑F2: [0232] 5’‑GATATATAGACTGTAGCGGTTAACGcagctgaagcttcgtacgctgcagg‑3’[0233] HOC1Δ‑LEU2‑R2: [0234] 5’‑CCTTATTATATCTGCGTAGAAGTACgcataggccactagtggatctgata‑3’[0235] HOC1Δ‑LEU2‑F3: [0236] 5’‑tatcagatccactagtggcctatgcGTACTTCTACGCAGATATAATAAGG‑3’[0237] HOC1Δ+500R3: [0238] 5’‑GACAAAATTGAATGGTTCGTCG‑3’ [0239] PCR反应体系: FastPfu Buffer 10μL,2.5mM dNTPs 4μL,模板DNA 1μL,上下游引物各0.5μL, FastPfu DNApolymerase 1μL,ddH2O补齐至总体积50μL; [0240] 以BY4741基因组DNA为模板,HOC1Δ‑500F1和HOC1Δ‑LEU2‑R1为引物进行PCR扩增获得HOC1基因上游500bp,以HOC1Δ‑LEU2‑F3和MNN11Δ+500R3为引物进行PCR扩增获得HOC1基因下游500bp。PCR反应条件为:95℃5min,95℃30s,56℃30s,72℃20s,循环35次,72℃5min,4℃保温。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析后,切胶回收目的片段。 [0241] 以质粒pUG73为模板,HOC1Δ‑LEU2‑F2和HOC11Δ‑LEU2‑R2为引物进行PCR扩增获得HOC1(up)‑KlLEU2‑HOC1(dn)片段。PCR反应条件为:95℃5min,95℃30s,55℃30s,72℃1min,循环35次,72℃5min,4℃保温。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析后,切胶回收目的片段。 [0242] 采用醋酸锂转化法将MNN11基因上游500bp、下游500bp、HOC1(up)‑KlLEU2‑HOC1(dn)片段导入过表达SEC14的lam1Δlam2Δlam3Δmnn10Δmnn11Δ菌株中。其验证如图5所示。 [0243] 通过组氨酸营养缺陷型固体培养基筛选得到过表达SEC14的lam1Δlam2Δlam3Δmnn10Δmnn11Δhoc1Δ菌株。 [0244] 实施例8酿酒酵母工程菌株发酵生产麦角甾醇 [0245] (1)活化菌种 [0246] 将产麦角甾醇的酿酒酵母工程菌株划线于YEPD固体培养基平板,30℃培养48h; [0247] (2)种子培养 [0248] 将活化后的菌种,接1环于装有5mLYEPD液体培养基的试管中,30℃,220rpm条件下培养12h即为种子培养液; [0249] 种子培养基为:酵母提取物10g,蛋白胨20g,硫酸腺嘌呤(Adenine sulphate)0.055g,灭菌结束后加入葡萄糖2.0%; [0250] (3)发酵培养 [0251] 将种子培养液按2%接种量接入装有200mLYEPD液体培养基的三角瓶中,30℃,220rpm条件下发酵24h; [0252] 发酵培养基为:酵母提取物10g,蛋白胨20g,硫酸腺嘌呤(Adenine sulphate)0.055g,灭菌结束后加入葡萄糖2.0%。 [0253] 实施例9麦角甾醇酿酒酵母菌株中麦角甾醇含量测定 [0254] (1)发酵培养(如实施例8所述)结束后,收集全部菌体,并将菌体进行冷冻干燥; [0256] (3)待溶液冷却至室温,加入适量乙酸乙酯萃取4次,合并有机层; [0258] (5)加入5mL甲醇复溶提取到的麦角甾醇,超声溶解; [0259] (6)使用高效液相色谱法测量283nm处的紫外吸收峰; [0260] 麦角甾醇产率使用以下公式计算: [0261] 每克干酵母中麦角甾醇百分比(%)=[(c*5)/m]*100% [0262] c:麦角甾醇浓度; [0263] m:菌体干重; [0264] 发酵至24h后,经测定麦角甾醇产量结果如图6所示,从图中可以看出,所构建酿酒酵母工程菌株中麦角甾醇的产量达到1.1%,较野生型菌株提高了40%。 [0266] ATGCATGAACACAAAGCGGAGCTACGGCTAATAACCGTTGCACTTAACGAAGCATCCAC [0267] CGATTCCCCCTCTTTTAGAGCTTCTGTCAATTATTTCCATACCAGAATGGAATCTCTGAGT[0268] AGTTGGATGCACAGTACTGTGGATTATGTAGAAAATACGTACAAGCCTTCGTTCCAAGAC[0269] TTCCAAAGAATAAAGGAAACACTATTTTCACAGCTGCTCCCTTCTCCTATATTACTCTCCA[0270] ATGGATTTGTCAGTAACCAGCCATATACTCCCTTGCTTGTAAGAGACTTTACTAGAGATGT[0271] CAGTGACCTTTCAAATACGGTTATGAAAATAATTTTAGGTGATGAAAACTCACAATACAC[0272] TGCGGCATTGTCTGCTTTGAGCTCTGATGCTATTAACCCTTACTTCAACAAGAGAAAAAC[0273] TTTTGAATACTACCAAAGGAAGTATGATTCGTTTTTAACTGACTTTTTAGCGGCCACTAAT[0274] GATGGCAATACTTTAATTCCACAAAATCTGCAAAATGAAACATTCAAATTAGTCGATATTA[0275] AACACAAATATATAGAAGCTTCCTTGGATTTGACTGAGGCTATTTCGTTAATGAAAGTTAA[0276] TTTGGATAAATTCCTGATAGAGACAATAGACATTGTGCGCAAAAATAACGTTATTACTAC[0277] CAAGGACACCAAGGACGTTATCGACATTACTCCCGAACTTACGGAAACATTAAAGGATT [0278] GGACCGATTGGATAGAAAGTAACCTTCAGACTTTACAAGCATTGTCATCCAAGCTATCTG[0279] AAGCTAAGTATGCCATTCTGAAGCTCAGCTTGGCAAGAATGAAGCCATCTCGCCTGATAC[0280] AAGACTATGATTTGAAAAGCATACAAAATTTGAAGTTTAACCTTCCAAAATCGATAAGTA[0281] ACGGAAATAATTCTGAGGAAAAAGGGCTATCGGGTTGGTTGTACATGAAAACTACAGTT [0282] GGTCATGATCCGAAAAGAGTTGTGTGGGTAAGAAGATGGTGCTTTCTACAGAACAATGT [0283] TTTTGGAGTTTTTTCACTGTCGCCTAGCAAAACTTATGTCGAAGAAACCGATAAATTCGG[0284] TATATTATGGATAACTGTAGAATATCTGCCCAAAGAACCTAGAAATTTTTGTTTCAAATTG[0285] AGGATTCAAAATCCAAATTGCAAAACAGAAGAAGAAAATACATACATAGATATCATCCTG[0286] CAAGCTGAAAGTATTGACGAGTTAAAATCGTGGATAAACACCTTAACTTCTCACAAAAG [0287] AATCGCATTGTCGATAAAGGAGGAAAACGATCCTCGTTATCAATTGGCGAGAAAAAAAA [0288] TTGAACCTCAATTTTTCGAGTTTGCTTCAAGTAGCTCAACGTCAACAGATAAATTATTAA[0289] CTTCATTTTCCAGTAAAACTTTGACATTGGTAGAAGAGCTAAAAAAAAATTATATGTCAG[0290] AGGATGATATATACTCTATCATTGATAATAAGGCATACCATCTGAGAGTAATTTCTACACCG[0291] ATAGCCACGCAGTTGACTCATTTGGCTTTATTCTCTACATTTCTATCTGTATCAAATTATTA[0292] TCCGTGTGCTACCCAGGCAAACACCTGGGGTACGGCAAATTGGAATGATTTGTCCTATTT[0293] AGTCAATCCACTCAAAGGAAGTTCAGTACACAAGCCAGCCACAGTATCGAATTCTTCCA [0294] GGTTTTCCGTTAGCTACCCCGACTATTATCCATACAGCCTGAAAGTCGATGATATACAATT[0295] TAGATCAATTTTCTTTTCAGTGAATCATGATTTTTTACAAGTCCCAAAAGAACTTGTTCTT[0296] TTAAGATATTCATCGGTGTGGTGCCCGAACAATAAACAAAAATTTGCATCTATGGCTTTT[0297] GTTACCCTTAACCACATTTATGTCTATTTAAATATTTCAGGCTTTTCATATTTGAGAAGAAT[0298] AGATTTACTAGATATCGACTCAATCGAATATGATAAAAGCCCAAAACATGTTTCTTCAAG[0299] AATGCTGCACATGCAAAGAGGCGATGGACTCAGGTTTAATATGTCCGTCTTTTTTACAGA[0300] TCGAAGAGCAGTTGCCTCAAAGTTACAATTTCTGATAGAAAATAAGGCAATGCATATCCC[0301] AAAGGGCGAAAAAGAGGTTTTAGAAATTTTCCAGGAATTAGACGAAGAGATTGAGAAC [0302] GAAAAAAAAATCATCAAAGATAATTTGTCAGAATCAGAACATTATTCAAAAGATTATGAT[0303] TATCTATTGAAGAGCACGTATGACCATCATTTTGAGAATACTAACGAAACGCCTATGGAA[0304] TTAATGAGCAGGAAACTCCGTTTAGAAAGGGAAGCCTGGTGCTACTTTCAAGACAATTT [0305] TAAAGTCGGAAGCAAGACGCTATTCCACGTTCTTTTTGGAGACAAATCTCAAGTTTTTCC[0306] AAGTTCACTATTTCTTTGTAAGAAGGGCAGTAACTTGAATAACAATTCATACTGGGAGCG[0307] CATTAGGCGCGCGAAAGAAGATGCAAGTTGTCAATTTGAACTTTGCCGTAAGTTACAGT [0308] TTCAACTGAATCGAACTTCTAATTTTATCAAAGATCTATTATGGTTGAAGGATGACAATGA[0309] CAACTTCAAATTAGTTCTTCAGCAGCGTGTGACAAAAATAAAACAAGGTTATTATTTTGA[0310] GGTGGAAGAAGGTCCCATTATTGTGAAATTTCCGCTATGCCATCCCTTACTCCTTCGTGT[0311] GAGGTTCATAATTGCAGAATGTATCACCTCTCAAGGAGAGTCCCTCAAAAAATGTGACC [0312] TGGCAATACTATATGACTTCAACTATGTTGAATCTATTGATAAGTTGAATACCAAAGTTGA[0313] AAAACTATGGCTTTTTGAAAGAATACACCTCAACTGGGCATTGAGATATTGTAAACTTGA[0314] ACATTCTGAAATTAACAGAAAGACGAGGGAATATCTAAAAAAATTCAACGATAGAGAAA [0315] AAATGAGTGATGTTATTAAATTGTGTGGATTCCTTGGTGTTTTACCAAAGGAAAGAATAG[0316] AAAACGATGAAAAGGCCGGCGATTTCATGCAACCTGTATATATCAATTATGATTTTCTGTC[0317] TCTTTCAAAAATTTTTACAAAATTGACCGTGTTTTATTTAAGCAGTGTCATCATTAAGACC[0318] ATGAAAGTTTTACTGGCAATGGTAATGGTTATCTTCAAATGTTTTTCAAAAGTTAACAAA[0319] ACTTTATACTATTGTCTTTTGATATCTGCGGTAACCAATTTGTTCTTTGTTGGTAAATCTAT[0320] TCATTCATATTTCTCCGTAAAGTCAGCCGAAACCCTATTTCAGAACTATGCCAATGGTGAT[0321] CAGCGAGGACTTCAAATCATGCATCGGTCTTTGACAGTGCCTGATTTGAACCTACTTACA[0322] AGAAAAATGATGGATAATGACCAGGAAAATCCAGTATTCAAGAGATTTGACGAAGACAA [0323] AAATGCATACCAGTACAAAGGAACAAGGCAAGAAATTGCAATTAAACGAAACCAAGTG [0324] CTGACGGAATTAAAAATTCTACAAAATACGGAAAAGGAACTCGTACAGGGAAGTTACAG [0325] AAAATTCATAATAACAGAAAGAGACAAATGCATCACCACTCAGAATGAAATCTTTGATTT[0326] ATGGATAAACGATACCAAACTACAAGATTATTGTATGGCATGTTTTGCAGAGTACAACAG[0327] ATTATCTGCCATTCCAGTCTGA [0328] 本发明所涉及的LAM2基因如下(序列表SEQ ID NO.2): [0329] ATGAGGGATGAAGCTACTCGCAAAAAAAGGTCATTTAGTGATGGTCATTTTTTCAAGAA [0330] ACTGAAATTGATGTCAAGGAAAAAGCAACCTGTTATGGAAAGAAGTAAGACCACTCGT [0331] ACAAGGAAGGAATCTACCAATTCCGCAGCAAAATCATCCCTATCATTAAGAAGGGCCAA [0332] CAATGGCAGAAAGACCATCGCTAAGAGAAGAGTACTGACCGACATAGGCTCTACTAATG [0333] AAGGTGTTGCCGGTAACTCTGGTTCAAACTCTCCTGCTCAATATTCTCATACTCCTCATTT[0334] TAGTGATTCTATCCCACCACTGCCTTTAGAGCTACCAGATATCGTCTCAATAAGGAGTAGT[0335] AGAAGTCATATTAGTAATAAGAGTAATAAGAACAAACATGGTATAGACTTGACTTTCATA[0336] CCTCGAAGATCGCTACAAAATTCTAAGGCTGGCTTGAAGAAACCGAATACTTCTCCACA [0337] AGGTTATTTTAATATTCCAGTGACTATAGATAGAGCAAGTGAGAAAGTCAAACATACTGA[0338] TACTAAAAATACATTCAATTCTTCGTCTTCTGAGAATGAACGACCAGTTTTGAGCATCTT[0339] ACAGAAGGATGACTCTCAAAGTTCTTCGCACCCAGCTATCGATTCAATGTCAGCACCCA [0340] ATAATATTAACAACAATAACGACATTGAGAATTCTTCAAACAGTCTATTTGATACTATTCTA[0341] TCAATTGCTCATAGTGCCATATCTCATGTCCCTAAAATTTCAGCCTTAAATACTGAGATAC[0342] AACGTGAATTTTCGCATTCAGGTGAAAGTCATACAGGTTCAACTCGCCATCCTTATTTCC[0343] ATATCCACCACGCGCAGCAGCAACATCCCTTGTCACAGCAACAAGGGCCCTTACCTGTT [0344] TCCGAAAATGCTAACCAAAATCCCAATGACACAGTGCTCATTCATTCCCCCTCCGCTAAC[0345] ACAGCCCACCGCAGTTCATCATTTTTGCGTCATTTAGATTATTTACTATCCCCCACTTCTG[0346] GTCCAGCCTCTGATAAACATACTCAAGTAGAGGAAGGGGATGACGAGGAAGAGTTATCG [0347] CCTCTTTCCAAAGCATTTCTTTCACCATCAACTCAACTGGTACCTACAAATACATCGACT[0348] ACGCCCCTTTCAGGTTCTTTGACACCTAACAATAGAAACGTAAATGCAAACTCTAACTCT[0349] GAAACCGAGAACGACAATGATAGGGATGATAGATCAAATGTTGGCAAAGTGAAATTTCA [0350] GCCCTTGAAAGTACACGAGCCTGCAATCTCAACCTTTGGTAAAGGCAACTTAACTTTAG [0351] AGGCAGTGGCAGGATCCTCTGATATTGATAATACAACTATTGATCTGGACGAGAATAATA[0352] CCAATAATAATCCAAATGCAAGTTCAACAAACTTGAGTCATATTAGCAAAAGTAACGTAA[0353] ACAATAATCTCGGTCCAAAAGAATTAAACACAAGTTATCGTAATAGTACCTATATCGACAT[0354] GGCAAGGTTTGAAAATTCACAATCGAACCTTTCTAGCCATAGGGCAAGAAGTAAGACAC [0355] TGCCCGCGAACAAAGCATTAGAGAATGCCGTTGGTGATGAAGGTAATAGTAAAAGAAAT [0356] TCAAGATATTCTTCTTATTCAAACGATATGGCCTTTGATGATGCCGACGAAAGAAAATTC[0357] 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CTCCAACCACTGCTGATTTCAAACCTTCCAATAATGATCATTTGGTTATTGAAGCAAATAT[0372] TAATGCACCATTAGGAAAAGTAGTAAATCTTTTATACGGTGAAGACGTCTCTTACTATGA[0373] AAGGATCCTTAAAGCTCAGAAAAATTTTGAAATATCGCCAATCCCTAACAATTTCCTCAC[0374] AAAGAAAATTCGTGACTATGCATATACGAAACCGTTATCAGGCAGCATTGGTCCAAGTAA[0375] AACAAAATGTTTGATCACAGATACTTTAGAGCATTATGATTTGGAAGACTATGTTAAAGT[0376] GCTCAGTATTACCAAGAACCCGGATGTTCCTTCAGGGAATATCTTTTCAGTGAAAACTGT[0377] TTTCCTTTTCTCTTGGGATAAAAACAACTCCACCAAATTAACAGTTTACAATTCTGTTGAT[0378] TGGACTGGTAAAAGTTGGATCAAAAGTATGATTGAAAAGGGAACATTTGATGGTGTTGC [0379] GGACACCACAAAGATAATGATATCTGAAATTAAGAAAATCTTAAGTGATGAAGACTCAA [0380] ACATAAACTCAAAGCATCAAGCCAGCAATAATGAATCAGAAGAAGAAATTATTAATCTG [0381] CCAACTATTGGACCTCCAGTTCATGATCCGACGGAACCTGATTTTCAAAAAGGAAAAGA [0382] CGATACAGTTATCGATGAAAAAATTAATATACCAGTTCCTTTAGGAACAGTGTTTTCACTA[0383] TTGTATGGTGATGACACATCATATATTAAGAAAATCATCGAAAACCAGAATAACTTTAATG[0384] TTTGTGATATTCCAAAGTTTGTGAATAACGCAAGAGAGATCACCTATACCAAAAAATTGA[0385] ACAATTCATTCGGTCCGAAGCAAACTAAATGTATAGTCACAGAGACCATCGAGCATATGG[0386] ATTTGAACAGTTTTTTTATGGTAAAACAAATAGTCAGATCTCCGGATGTTCCTTACGGTAG[0387] TTCATTTTCAGTACATACGAGATTTTTCTATTCCTGGGGTGATCACAACACAACGAACAT[0388] GAAAGTTGTCACCAATGTTGTCTGGACAGGTAAATCAATGCTGAAAGGAACCATTGAGA [0389] AAGGTTCAATTGATGGACAAAGAAGTTCAACAAAGCAACTCGTAGATGATCTCAAAAA [0390] AATAATTTCTAATGCTAGTTCAACGAAGAAAAAATCGAGGAGAAGAGGAAAGACGGTA [0391] AATAAAAGGAAATCATCACCATCCACTATCAAGAATGAGAAGAATGAAGAAAACTTCGA [0392] AGATACAAGTACCAAAAATTCATTTTTTTCCGCTTTCTCAATGTTACAACAAGTAAACAT[0393] AACATCCGTTCAAGGAATTATGACAATTATCTCTTTTTTTATTTGCTTGATTTTCTTCTTTA[0394] GATTATTATTCCATTCTAAGAATACTTCGAACATCCAGATTATTACTCCAGGAACAATCTT[0395] AATTAATGGAAATGAATATAATTACGTTCCTAATTTTAAAACACTCTATCATGTTTACGAA[0396] GATAATATTATAAAAGATGCCCGCCGTAAAGACTCGAATAAAAATAACATAGTCACCGAT[0397] ACGGAGGGTCTCATATGGGACTGGTTGATAGATCGTGGAAATGGAACCGTTCAAAATAG [0398] TGTCTTGTCCAATCATATTAAGGAGAGTAATAACAAGAAGGTTAAGCTCGTAAATGGAGT[0399] TAGTGATCATAAAATACAGCAGCTAGTTGAATCTATAAAAATCACCGAATTGCAGCTGCA[0400] AGAAATGAAAGAATTATTGGCCCAAACGGATAACACGTCGGCTACTAACCAATTACTTT [0401] GA [0402] 本发明所涉及的LAM3基因如下(序列表SEQ ID NO.3): [0403] ATGTCCGTTCACGGGAGGGATCCCAAAAAGAGGCAGTTAAGGCTAATATCGGTTGCATT [0404] CAAAGAAGCATCAATTGACTCTCCTTCCTTTCGTGCATCCGTAAATTTCTTCCAAACAAG[0405] GGTGGATGCATTAGAGGATTGGATAGAGAAGACTGTCGACTTTTTCGATCAGAAATATAA[0406] GGTGTCATTTGAAGATTTTCGAAGAGCAAAGGAAACTCTCCTATCCCAATTGTTACCTCC[0407] TCCAGCCTTGCTGAGCAACGGTTTTGTCAGTAACCAATCGTTTACTCCCAGGCTGATTGA[0408] TAGTTTTAACAAGGACTATTATGACTTTTCTATGAAATTACTGCAAATTGTAAAGGGTGAT[0409] GACTCTAGCCACTCAACCGCGCTATTAGAACTTATGACTACTGCAATTGAACCCTACAGA[0410] AACGTGAGAAAAAATTTCGATTTTTACCAAGGTAAATATGACAGTATGCTGGCATCCTAC[0411] CAGGCTATAAGAATTTCAAAAACCAGTTTAGAGCCATCTTCTATCAAAAGTGATGCCTTA[0412] CAATTATTTGAAGTGCAAAAAAACTACCTTAAGGCCTCCCTAGACCTCATAAGTGCCATA[0413] TCAGCAGTAAAATTAAGCTTAGATAAATTCATACTAGAGTCAATGAAAGTATTAAAGTCA[0414] AGAAGCATTTTTATAACGAAAGATTCTGGAAGGAAAATAGATTTATCTCCTTGCATTAATG[0415] AGTATTTAGACAATTACGCAATATGGGTAGAAAATTCCATCGAAGGATCGAAAGTATTGG[0416] ATTCTGATATCAGTAATGCAAAAAAGCAAGCATATAGGTATACCTTGAAACGAATTACGC[0417] CGTCAAGTGACACAAGTGATTACAATATAAGATCAATACATTCCTCGAAGCTGCTATCAA[0418] AGGATACGCAAGTGCCTCCAAAATCGCCCGAAAAGTCTGGGTGGCTTTATATGAAAACA [0419] CAGGTTGGAAAGCCTACCAGGGAAATATGGGTGAGAAGATGGTGCTTTCTGAAAAATGC [0420] AGTTTTTGGTATGTTCCTTTTGTCGCCATCGAAGACCTACGTGGAGGAAACTGATAAGTT[0421] TGGTGTCTTCCTTACTAATGTGCGCTATGACCCAGAGGAAGATCGAAAATTTTGTTTTGA[0422] AGTAAAAATATTTGGTAATAAAGTAACAGAGGCACATGATAACATGTCAAAGGATATCAC[0423] GTTGGTCTTTCAAACTTCAAATTATCTAGATTTGAAATCATGGTTAATAGCTTTTGAAGCG[0424] ACAAAAAAGTATGTCATGAGTATACAACATGATAGTCTTGAATATGAGCTGGCGTTTAAA[0425] AGATTTTCTCCCAAGTTTTTTGAATTTGCCTCTAGTACAACCACCTCCATAGATCAATTAA[0426] TCACAACATTTGACAAAGAAACCGAGTCCTTGTATGAAACGCTGAACTGCTCAATCTCT [0427] GAATATGATATTTTGACTTTAGGAGAGGAGAAGGTGTTTCAGTTCCAAATGCCAACAAC [0428] ACCAATATCTACAAAAATGACACAACTGGCTATTCTGTCTAATTTCCTCACAAAAGGTAG[0429] CTGGTTCCCTAATGCTGTTCTTGCGAATATATGGGGCACGACCGATTGGAGTGAATATACT[0430] ATATTGCCAGGAAAGGGAAAGAAACCCTCCTCTTTATTAACGATCGATGGCAAAAGGCT [0431] TCCAATAAGAAACTCCACTATATATCCTCAATATTATTCTAATGAGTTGAAAGTGCTTGAT[0432] CTACAGTTCAAGTCATTAGTATTTTCTCCGGACCAAAGGTTGGAGAAGCTACCGGAAGA [0433] GCTTTTACTTTTCAAGTTTGAAGCATTGTGGTGTCCTAACAAAAAGCAGAAGTTCTCAG [0434] CTACCTGCTTTTGCACAAAAGACTACATTTATTGCTACATGAATTCTATGGAATTTATCTG[0435] TCTTACAAAGATCAGCTTGTCTGAAATCGTTTCTGTAGAAGCCGACAGATCATCAAAGA [0436] AGACCTTAAAACTTTACGATGCCAGCGGTCTACAAATGAAAGCAATCGTTTTATTTTCTG[0437] ACTATAAGCTTATTGCATCTAAGTTGCAATATCTGTTAGAAAACAAGGCTATAAAAAACC[0438] CAAATAGTAACGAAGAGATTTTAGTAAAGTTTGAACAGATGGAAAAAGAATCTCAAGAA [0439] AAAAAACAAGAAGAATTATATAAGATAGAACAAGAAAACTCCTTTGATCGTAAGGCCAC [0440] CAGCGTATCCAAAATCATCAAATCACGTGTGACATTTTGGGAGATGTCCGATGATGCATC[0441] TACTTTATTAAACAGACTCAAAAAACTTCAGACAGAGTACTCGATTACTTACAATCATGA[0442] ATATGAAATATCTAGTAAAGGACTAGCCCACATACTATTTGGAGATAAATCGAATGCTTTT[0443] CCAAAATGCCTGTTTTTAGCAAGAAAAGATGGGGAAGAACACGGGAAACGTTTTTGGTA [0444] TAAAAACAAAGACATCAACGGGAAATCACAATTAGTTCGAAAGATACCATTTCGATTGG [0445] ATATGACCGGTAATTTTTTAAATACTGGTAAATATCATAGAGATAAGGAATCTAAAATGAT[0446] TTTTGCTACACAGAGGATAGTCAAAATTGTTGATAACAAATATTATGAAGTCGATTTAGAT[0447] CCTTTTTTCGTTAAAGTGCCATTTTGTCATTTATTGAAGCTTTCAATTAAATTTGTCATAAC[0448] TGAGTCATATGATGTAGATAACCATCTTGAAATAAAGTTGAATATGACGGCGAGCAGTTC[0449] ATCGCTTCATGTCCTATACAAACTAGAATATATTGATAGTAGAACTGGCAAAACAATAGA[0450] AAAGCTATCTTTGGCTGAAATAATATGCCAAACATGGGCCTTGAAATTTGCTCATAGTGA[0451] ATTCCTACTGATAAGAAGGGTGTTACGGTACTACTTGGAAAAGATTGGCAAACACGGAA [0452] AAGTTATCAAAGCTATCAAACTATGTGGTATATTAGGTGTTCTCAGCAACAAAAGTGAAG[0453] AACCTGCTACTGAAAAAAATGGCAACTCCAAAGAGAGTGAAAGTATGCAATATGACATC [0454] AGGTATTCTTGTACTATCCTTTTCCTAGTGTTTATCAAACTAATGGTTTACAGAGTAACGA[0455] ATTTGACGTTTGTATTCTTCAGAATACTTATCGGTATTCTATTATTATGTGCTGAAAAGTTC[0456] TCACGGATTAATCGAATGATGGTGGTCGGATTATTAGCATCTATTATGATAAACATACTTTT[0457] ATCAGAAAAAGCATCAGTGCCCTACTGGTCAATAAAGAGAGCTGAAAAACTGTTCCAC [0458] GACCGTCTTGGATCAGATAAGTTCACAATGCAAAGAGCCATTTACATAAGTGATTCGGAC[0459] TTGCTAAGTAGTCAACTGTCAGTGCCGTCAAATAACCCCATTTTTGAGAAGTTCAGCGA [0460] GGACAATTTCAATAAGGACTATCAGTATAGCGAAACGAGAAAACAGTTGGCTATGAGGA [0461] GAAATGAATTGCTAATTGAACTTAGAATACTCCAAGACATGGAGAAACAATTAGTGCATG[0462] ACGACTACGAAAAATTCTTGCTGGAAGAAGTAAATAAATGCTCGATGGTGTCTATAGAGA[0463] TGACTGATCTTTGGTTTAATGACACTCAATTGCAAAATTACTGTTCTATTTGTAACGAAGA[0464] ACTCGAGAAGTTAAGACCACCAATAACTTGA [0465] 本发明所涉及的SEC14基因如下(序列表SEQ ID NO.4): [0466] ATGGTTACAGTATGTTGTTGCTTTTATTTACTTTTTCTTTTTTTGACATTCATTGTGACAATATTCACATTCTTCAGATAGTTCTGTCTATATGAAGCAAAAATGATATATCAATAAGTTTACTAACAAACACAAGTGGTATTACTATGACTTCACTTTAAATAGCAACAAGAAAAGGAATTTTTAGAATCCTACCCTCAAAACTGTCCTCCAGATGCCTTGCCTGGTACTCCAGGAAATTTAGACAGCGCTCAAGAGAAGGCATTGGCAGAACTAAGAAAACTTTTGGAAGACGCTGGTTTCATTGAACGTTTAGACGATTCAACTTTACTACGTTTTTTGAGAGCCAGAAAATTTGATGTTCAATTGGCTAAAGAAATGTTTGAAAACTGCGAAAAATGGAGGAAGGATTATGGTACCGACACTATCTTGCAAGATTTTCATTATGATGAAAAACCATTGATTGCCAAATTCTACCCACAATATTATCATAAAACCGATAAAGATGGCCGCCCAGTATATTTTGAAGAATTAGGTGCTGTTAACTTACATGAAATGAACAAGGTTACCTCTGAAGAGAGGATGTTGAAAAACTTGGTTTGGGAATACGAATCTGTCGTTCAATACAGATTACCTGCCTGTTCAAGAGCTGCTGGTCACCTAGTGGAAACTTCATGTACAATTATGGATTTGAAAGGTATCTCCATATCTAGTGCATACAGTGTTATGTCATATGTTAGGGAAGCCTCCTACATAAGTCAAAACTATTACCCCGAACGTATGGGTAAATTTTACATCATCAACGCGCCATTCGGTTTCTCTACCGCATTTAGGCTATTTAAACCTTTCTTGGATCCAGTCACTGTTTCAAAGATTTTTATCTTGGGTTCTTCTTACCAGAAGGAATTATTAAAGCAAATTCCAGCTGAAAACTTACCAGTCAAATTTGGCGGTAAGTCTGAAGTTGATGAATCCAAGGGTGGGTTATACCTATCCGATATCGGTCCATGGAGGGATCCAAAGTATATTGGACCGGAAGGTGAAGCTCCGGAAGCCTTTTCGATGAAATGA [0467] 本发明所涉及的MNN10基因如下(序列表SEQ ID NO.5):ATGTCTAGTGTACCTTATAATTCCCAACTTCCTATATCCAACCATCTAGAGTACGATGAAGATGAAAAGAAGAGCAGAGGCTCAAAACTAGGCCTGAAATATAAAATGATATACTGGAGGAAAACTTTATGCAGTTCGCTAGCGAGATGGAGAAAGCTAATACTATTAATATCTTTAGCTTTGTTTTTATTCATATGGATAAGCGATTCCACCATAAGCAGAAATCCATCTACCACAAGTTTTCAAGGCCAAAATAGTAACGATAATAAGTTGAGTAATACTGGTTCTAGCATCAACTCCAAAAGATATGTACCACCATATTCTAAGAGATCAAGATGGTCGTTTTGGAATCAAGATCCTAGGATTGTCATTATATTAGCGGCAAACGAAGGTGGTGGTGTATTGAGGTGGAAAAATGAGCAAGAATGGGCTATCGAAGGCATATCAATAGAAAATAAGAAGGCCTATGCGAAGAGACATGGATATGCGTTGACTATCAAGGATTTGACAACGTCCAAAAGATACTCTCACGAATACAGAGAGGGTTGGCAAAAAGTAGATATATTGAGACAGACGTTCAGGGAGTTTCCTAATGCAGAATGGTTCTGGTGGTTGGACCTGGATACTATGATAATGGAGCCTTCTAAATCATTAGAAGAACATATTTTCGACAGATTGGAAACTCTGGCTGACAGAGAATTGAAAAGTTTTAATCCCCTAAACCTAAGAGACGACATACCCTATGTCGATTATTCAGAGGAAATGGAGTTTCTAATAACACAAGATTGTGGAGGCTTCAATTTGGGCTCATTTCTGATAAAAAATAGCGAATGGTCTAAGCTGCTTCTAGATATGTGGTGGGACCCCGTTCTGTATGAACAAAAACATATGGTTTGGGAACATAGAGAACAAGATGCGTTAGAGGCATTATATGAAAACGAACCGTGGATTCGTTCGAGAATAGGATTTTTGCCCTTAAGAACGATCAATGCATTCCCACCGGGAGCATGCTCTGAATACAGTGGTGACTCAAGATACTTTTACAGTGAGAAAGACCATGATTTTGTTGTGAATATGGCCGGATGCAATTTTGGCAGAGATTGCTGGGGCGAGATGCAGTACTACACCACTTTAATGGAAAAACTGAATAGGAAATGGTACACGAGATTTTTCTTCCCATAA [0468] 本发明所涉及的MNN11基因如下(序列表SEQ ID NO.6):ATGGCAATCAAACCAAGAACGAAGGGCAAAACGTACTCCTCAAGATCGGTGGGTTCGCAGTGGTTCAACAGGCTTGGTTTCAAGCAGAACAAGTACGGAACTTGTAAATTTTTGTCGATAATAACGGCCTTTGTTTTTATCCTCTATTTCTTCTCCAATCGCTTCTATCCAATTTCTCGTTCCGCCGGTGCATCATATTCTCCATCCCATGGGCTGTATATTAACGAAATTCCTGCCTCCAGCCGGTTGATTTATCCACATGTAGAACATGTGCCTGTGTTAAAACAAATGACCGTTAGGGGCCTGTATATTACGAGGCTAGAAGTGGATGGCAGTAAAAGATTAATTTTGAAACCAGAAGAGAATGCTTTGACAGATGAAGAAAAAAAGAAGACTACTGATCAAATTCTATTAGTGAAGCACTCGTTCTTAGACCATGGTAAATTAGTGTATCGGAAGAGCAATGATGCACCTGAAGTGGTCGTAGTAACCCTGATAGATTTTGAAAACTACGAATTAGAAACAATTATTCAAATTGTTCAAAATAGGGTTGATTACGCTCAAAAGCACCAATATGGTGTATACATTCGTTGGATACAGGAGTTTTTGCCTGTTCTTGAAAATCAGAATTTGGCTGAAAGCTACGAATTCATTAAGCCATTGGTGATAAGAGCCGCCATGCATGCTTTCCCAACTGCCAAGTATATTCATTTTGTTGATCAAGATGCTTTATTGATGAATCTCGATCTTTCTTTACAAAAATACCTGTTAGATCCAAAGATTATGGATTTGGCTCTATTAAAGAACGTCCCTGTTGTGGCGAATTCAAACATCAAGACATACAATCATTTTGAATATAGTTCGGCAAAGATTATCATTCCACATGATGCGGATGGTAATATTGATGCGTCCTCATTTGTTATTGCCAATGACTTTTATGGTAAAGCTCTGATAGACTACTTGAATGATCCGTTACTGAGAAATTTCCCATGGGATAATACCGGTGATAAGTTGAGTGCTGCTATCGGTCATATTTTACAGTGGCATCCTACATTACTGGGTAAGACGGCAATCGTCATACCAAAAGTTTTGGCAAGTCAGTACGATGCATCCTTGGATCAAGAAGGTGAGTCTGGAAACGGTGCTTCTAATGGCGATGTTTACCATTATAATGAAGGGGACTTGGCTGCCTCCTTCAAGGGATGTAGATCAAGAGGTACGTGTGCTAGTGAAATAGGTCACATGTACCAGAAAATCAAGAAATCTTAG [0469] 本发明所涉及的HOC1基因如下(序列表SEQ ID NO.7): [0470] ATGGCCAAAACAACAAAAAGAGCCTCCAGTTTCAGGAGGTTGATGATATTCGCCATAATAGCCCTCATCTCATTAGCATTTGGAGTTAGATACCTATTTCACAATTCTAATGCTACTGATTTACAAAAAATTCTGCAGAACTTGCCCAAAGAGATTTCCCAAAGCATTAATAGTGCCAACAATATTCAGAGTTCGGATTCTGATCTAGTTCAACATTTTGAGAGTTTGGCTCAGGAGATCAGACACCAACAGGAAGTTCAAGCAAAGCAATTTGATAAACAACGTAAGATCCTGGAAAAAAAAATCCAAGACTTGAAACAAACACCTCCGGAGGCCACCCTAAGAGAACGCATAGCTATGACTTTCCCCTACGATTCCCATGTCAAGTTCCCAGCATTTATTTGGCAAACTTGGTCCAATGATGAAGGTCCCGAGCGTGTTCAAGATATAAAGGGCATGTGGGAAAGCAAGAATCCGGGCTTTGCGCACGAAGTGTTGAACCATGACGTGATAAACGCACTAGTACACCACTACTTCTACTCCATACCGGAAATCCTAGAGACTTACGAAGCTCTGCCCTCCATCATCCTAAAGATAGATTTTTTCAAATACTTAATACTGTTAGTTCATGGAGGTGTTTATGCTGACATCGACACGTTCCCTGTTCAGCCAATTCCAAACTGGATTCCTGAAGAGTTGTCGCCATCCGACATTGGGTTGATAGTTGGAGTTGAGGAAGACGCTCAAAGAGCTGACTGGAGAACCAAGTATATCAGAAGACTTCAGTTTGGTACTTGGATTATACAAGCAAAACCTGGTCACCCTGTTTTGAGGGAAATCATTTCTCGAATTATTGAGACCACTTTACAGAGAAAGAGGGACGACCAACTAAACGTCAATCTAAGGAATGATCTGAATATTATGAGTTGGACGGGTTCTGGGTTGTGGACTGACACTATTTTCACGTATTTCAATGACTTTATGAGAAGTGGTGTCAGGGAGAAGGTTACATGGAAATTATTCCATAACCTAAATCAACCAAAATTGCTAAGTGATGTTCTGGTCTTTCCAAAATTCTCCTTTAACTGTCCAAACCAAATCGATAATGACGATCCACACAAGAAATTCTATTTCATTACTCATTTGGCATCACAATTTTGGAAAAATACTCCAAAGGTGGAGCAGAAATAA 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