一种三萜类化合物及其制备方法和应用 |
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| 申请号 | CN202410116117.X | 申请日 | 2024-01-26 | 公开(公告)号 | CN118027125A | 公开(公告)日 | 2024-05-14 |
| 申请人 | 湖北天勤生物技术研究院有限公司; | 发明人 | 李佳; 张亚奇; 吴鹏; 胡大裕; 王建枝; 李高; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及医药技术领域，公开了一种三萜类化合物及其制备方法和应用。该三萜类化合物的结构式如式(1)所示。该该三萜类化合物可激活SIRT1，促进热休克因子‑1脱乙酰化，并上调热休克蛋白表达，减少心肌细胞凋亡。可以作为 治疗 MIRI药物开发的先导化合物，具有具有巨大潜在应用价值。#imgabs0# | ||||||
| 权利要求 | 1.一种三萜类化合物，其特征在于，该三萜类化合物的结构式如式(1)所示； |
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| 说明书全文 | 一种三萜类化合物及其制备方法和应用技术领域[0001] 本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种三萜类化合物及其制备方法和应用。 背景技术[0002] 缺血性心脏病(Ischemic heart disease，IHD)是全球造成死亡的主要原因，2019年登记的相关死亡人数约为900万。IHD经常发生在冠状动脉狭窄或堵塞后，再灌注可减少心肌损伤；然而，再灌注会引起进一步的损伤，称为心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury，MIRI)。MIRI可导致心肌细胞的不可逆损伤，造成心脏结构和功能受损，是心肌纤维化和心衰的重要原因之一。 [0003] SIRT1是一种高度保守的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖性组蛋白脱乙酰酶。它参与调节各种病理生理过程，包括细胞增殖、存活、分化、自噬和氧化应激。SIRT1的治疗性激活保护心脏和心肌细胞受病理相关应激，特别是MIRI。SIRT1通过调控FOXO3α抑制MIRI介导的细胞凋亡发挥心肌保护作用。NAD+可以恢复SIRT1活性、降低抑癌基因p53的乙酰化水平、减弱MIRI诱导的H9C2细胞凋亡。SIRT1激动剂白藜芦醇通过单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(adenosine monophosphate‑activated protein kinase，AMPK)依赖性机制恢复SIRTl活性和NAD+水平，激活热休克因子‑1脱乙酰化，并上调热休克蛋白表达，减少心肌细胞凋亡。SIRT1在心肌梗死发生发展中发挥了非常重要的作用，其可能是防治MIRI的一个关键靶点。 [0004] 天然产物是药物最常见的来源，微生物来源的化合物又占据了其中重要的一部分，曲霉属真菌表现出产生丰富的生物活性分子的能力，例如生物碱、丁烯内酯、酚烯酮、萜类化合物、细胞松弛素、ρ‑三联苯、氧杂蒽酮、甾醇、蒽醌和二苯醚衍生物等，这些分子在制药和各种工业领引起了极大的关注。因此，如果能够从曲霉的次生代谢产物中寻找并获得具有SIRT1激动活性及防治MIRI的化合物，具有十分重要的意义。 发明内容[0005] 本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述问题，提供一种三萜类化合物及其制备方法和应用。 [0006] 为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种三萜类化合物，该三萜类化合物的结构式如式(1)所示； [0007] [0008] 本发明第二方面提供一种制备前文所述的三萜类化合物的方法，包括以下步骤： [0011] (3)将步骤(2)得到的发酵产物经乙醇提取，减压浓缩，得到总浸膏； [0012] (4)将所述总浸膏与水混合，然后采用乙酸乙酯萃取，减压浓缩，得到乙酸乙酯浸膏； [0013] (5)将所述乙酸乙酯浸膏采用层析分离，得到式(1)所示的三萜类化合物。 [0014] 优选地，所述曲霉属真菌为Aspergillus sp.TJ507，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20231079。 [0015] 优选地，在步骤(1)中，所述恒温培养的条件包括：温度为25‑30℃，时间为30‑40天。 [0016] 优选地，在步骤(2)中，在步骤(2)中，所述发酵的条件包括：温度为25‑30℃，时间为30‑40天。 [0017] 优选地，乙醇提取的次数为5‑10次。 [0018] 优选地，在步骤(4)中，乙酸乙酯萃取的次数为4‑6次。 [0019] 优选地，步骤(5)的具体过程包括： [0020] S1：将乙酸乙酯浸膏进行柱层析，采用体积比为20:1‑0:1的石油醚‑乙酸乙酯进行梯度洗脱，得到6个组分； [0022] 优选地，凝胶色谱的条件为以体积比为1:1的二氯甲烷‑甲醇进行等度洗脱。 [0023] 优选地，反相硅胶柱色谱的条件为以体积比20:80‑100:0的甲醇‑水进行梯度洗脱。 [0024] 优选地，正相硅胶柱色谱的条件为以体积比20:1:0‑1:1:1的石油醚‑乙酸乙酯‑甲醇进行梯度洗脱。 [0025] 优选地，高效液相色谱的条件为以体积比88:12的乙腈‑水进行等度洗脱。 [0026] 本发明第三方面提供前文所述的三萜类化合物在制备用于治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用。 [0027] 本发明提供了一种式(1)所示的三萜类化合物以及一种从曲霉属真菌Aspergillus sp.TJ507中分离纯化得到该三萜类化合物的方法。该三萜类化合物可激活SIRT1，促进热休克因子‑1脱乙酰化，并上调热休克蛋白表达，减少心肌细胞凋亡。可以作为治疗MIRI药物开发的先导化合物，具有具有巨大潜在应用价值。 附图说明 [0028] 图1是实施例1制备的化合物的单晶衍射图； [0029] 图2是测试例1中运用SIRT1活性荧光定量检测测试曲霉酮素A对SIRT 1的激动活性的影响的结果图； [0030] 图3是测试例2中运用CCK8测试曲霉酮素A对心肌细胞的保护作用的结果图； [0031] 图4是测试例3中通过荧光探针染料对心肌细胞的线粒体膜电位进行特异性识别评估曲霉酮素A对心肌细胞的保护作用的结果图。 具体实施方式[0032] 以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。 [0033] 在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。 [0034] 本发明第一方面提供一种三萜类化合物，该三萜类化合物的结构式如式(1)所示； [0035] [0036] 在本发明中，将式(1)所示的三萜类化合物命名为曲霉酮素A，该化合物为曲霉属真菌的次生代谢产物。 [0037] 本发明第二方面提供一种制备前文所述的三萜类化合物的方法，包括以下步骤： [0038] (1)将曲霉属真菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，接着进行恒温培养，得到种子培养基； [0039] (2)将所述种子培养基切块接种于大米培养基中，进行发酵培养； [0040] (3)将步骤(2)得到的发酵产物经乙醇提取，减压浓缩，得到总浸膏； [0041] (4)将所述总浸膏与水混合，然后采用乙酸乙酯萃取，减压浓缩，得到乙酸乙酯浸膏； [0042] (5)将所述乙酸乙酯浸膏采用层析分离，得到式(1)所示的三萜类化合物。 [0043] 在本发明中，所述曲霉属真菌为Aspergillus sp.TJ507,该菌株来自金丝桃种植园区土壤，现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20231079，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2023年06月21日，分类命名为Aspergillus sp.TJ507。 [0044] 在优选的实施方式中，在步骤(1)中，所述恒温培养的条件包括：温度为25‑30℃，时间为30‑40天；具体的，恒温培养的温度可以为25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃，恒温培养的时间可以为30天、32天、35天、38天或40天。 [0045] 在优选的实施方式中，在步骤(2)中，在步骤(2)中，所述发酵的条件包括：温度为25‑30℃，时间为30‑40天；具体的，发酵的温度可以为25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃，发酵的时间可以为30天、32天、35天、38天或40天。 [0046] 在优选的实施方式中，乙醇提取的次数为5‑10次。 [0047] 在优选的实施方式中，乙酸乙酯萃取的次数为4‑6次。 [0049] 优选地，步骤(5)的具体过程包括： [0050] S1：将乙酸乙酯浸膏进行柱层析，采用体积比为20:1‑0:1的石油醚‑乙酸乙酯进行梯度洗脱，得到6个组分； [0051] S2：将组分3进行反相硅胶柱色谱纯化、正相硅胶柱色谱纯化、凝胶色谱纯化和高效液相色谱纯化，得到式(1)所示的三萜类化合物。 [0052] 进一步优选地，凝胶色谱的条件为以体积比为1:1的二氯甲烷‑甲醇进行等度洗脱。 [0053] 进一步优选地，反相硅胶柱色谱的条件为以体积比20:80‑100:0的甲醇‑水进行梯度洗脱。 [0054] 进一步优选地，正相硅胶柱色谱的条件为以体积比20:1:0‑1:1:1的石油醚‑乙酸乙酯‑甲醇进行梯度洗脱。 [0055] 进一步优选地，高效液相色谱的条件为以体积比88:12的乙腈‑水进行等度洗脱。 [0056] 本发明第三方面提供前文所述的三萜类化合物在制备用于治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用。 [0057] 以下将通过实施例对本发明进行详细描述，但本发明的保护范围不仅限于此。 [0058] 以下实施例中使用的曲霉属真菌为Aspergillus sp.TJ507，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20231079。 [0059] 实施例1 [0060] 曲霉酮素A的制备与鉴定 [0061] 1、曲霉酮素A的制备： [0062] (1)将曲霉属真菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，接着在28℃恒温培养35天，得到种子培养基； [0063] (2)将所述种子培养基切块接种于大米培养基中，在28℃下发酵培养35天； [0064] (3)将步骤(2)得到的发酵产物经工业酒精提取7次，在50℃下减压浓缩回收工业酒精，得到总浸膏； [0065] (4)将总浸膏用蒸馏水溶解，使用乙酸乙酯萃取5次，将乙酸乙酯层用旋转蒸发仪旋干，得到750g乙酸乙酯浸膏； [0066] (5)将乙酸乙酯浸膏进行柱层析，用200‑300目硅胶拌样，并用干法装柱，以石油醚‑乙酸乙酯梯度洗脱(20:1‑0:1)，TLC检测，合并相同组分，共得到极性从小至大的6个组分，记为组分1‑6； [0067] 将组分3进行反相硅胶柱色谱纯化，以体积比20:80‑100:0的甲醇‑水进行梯度洗脱，得到7个组分，记为组分3.1‑3.7； [0068] 将组分3.5进行凝胶色谱纯化，以体积比为1:1的二氯甲烷‑甲醇进行等度洗脱，得到4个组分，记为组分3.5.1‑3.5.4； [0069] 取组分3.5.2进行正向硅胶色谱纯化，以体积比20:1:0‑1:1:1的石油醚‑乙酸乙酯‑甲醇进行梯度洗脱，得到8个组分，记为3.5.2.1‑3.5.2.8； [0070] 取组分3.5.8.2进行高效液相色谱纯化，以体积比88:12的乙腈‑水进行等度洗脱，得到曲霉酮素A(3.2mg)。 [0071] 2、曲霉酮素A的结构鉴定 [0073] 曲霉酮素A：无色晶体，m.p.270.0‑271.3； (c 2.9,MeOH)；UV(MeOH)λmax‑1(logε)＝204(3.90)nm；IR(νmax)：3440、2969、2936、2854、1695、1631、1456cm ；ECD(MeOH)λmax(Δε)219(+6.7)；HRESIMS m/z463.3606[M+Na]+(calcd for C30H48O2Na,463.3522)；曲霉酮素A的绝对构型是通过X射线单晶衍射来确定。晶体结构(单晶衍射图)如图1所示，NMR数据如表1中所述。 [0074] 表1 [0075] [0076] [0077] 注：a表示测试溶剂为CDCl3，测试仪器为400M核磁共振波谱仪。 [0078] 测试例1 [0079] 基于荧光基团定量测定法测定SIRT1去乙酰化。 [0080] 将提取纯化得到的SIRT1蛋白以每孔200nM与不同浓度的化合物曲霉酮素A在室温下孵育30min，加入含有75μM NAD+和25μM肽段底物(Ac‑Arg‑His‑Lys‑Lys(Ac)‑AMC)的反应液中，在37℃反应1h，加入反应终止液(50mM Tris‑HCL、100mM NaCl、6000Unit Trypsin、4mM烟酰胺)终止反应，使用酶标仪在激发波长355nm，吸收波长460nm处检测AMC基团的荧光强度，结果如图2所示。 [0081] 由图2可知，在没有化合物的作用下，AMC的表达量为50左右，化合物曲霉酮素A能明显激动SIRT1的活性，在10μM的浓度下，AMC的表达高达170，说明化合物曲霉酮素A是很好的SIRT1激动剂。 [0082] 测试例2 [0084] 将100μL H9C2细胞(每孔5000个)在96孔板中培养，孵育24h后，给予不同浓度的化合物曲霉酮素A预保护24h后，将培养基换成无糖无血清的DMEM，放于缺氧小室，用95％N2，5％CO2的混合气置换小室内的气体保证氧气浓度低于0.3％，放于细胞培养箱缺氧5h后，将培养基换回完全的DMEM高糖，在细胞培养箱内复氧2h，结束后，每孔加入10μL的CCK8(TargetMol)，37℃孵育40min，使用酶标仪(Thermo scientific)在450nm处检测吸光度，结果如图3所示。 [0085] 由图3可知，模型组细胞损伤已经达到50％，在化合物曲霉酮素A的保护下，细胞存活率达到60％‑70％，可见化合物曲霉酮素A有一定的心肌细胞保护作用。 [0086] 测试例3 [0087] 采用荧光探针染料对心肌细胞的线粒体膜电位进行特异性识别。 [0088] 将H9C2细胞(每孔20万个)铺于6孔板，给予化合物曲霉酮素A预保护后进行缺氧复氧损伤后，使用JC‑1(Solarbio),TMRE(Beyotime)，对线粒体膜电位进行染色，结果如图4所示。 [0089] 由图4可知，在缺氧复氧的作用下，线粒体膜电位下降，JC‑1，TMRE的红色荧光下降，JC‑1的绿色荧光增强，化合物曲霉酮素A能改善线粒体膜电位的丢失。 [0090] 基于上述测试结果可知，从真菌曲霉属中分离得到的化合物曲霉酮素A具有较好的SIRT1激动活性，对MIRI具有较好的抑制作用，可以作为治疗抗MIRI药物开发的先导化合物。 [0091] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。 |
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