[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及重组微生物的构建方法、相关生物材料及其应用。

[0002] 天然化合物及其衍生物在药疗、保健方面有着重要的应用，伴随着越来越多的天然化合物分子的药理作用得到表征，其市场需求量也在日益增多。而传统的植物提取法或化学合成法都存在着诸多局限性。植物提取造成植物资源的极大浪费且获得的活性成分极低。化学合成一方面带来环境压力，另一方面在处理结构复杂的天然化合物时存在合成路线长、产率低等问题。合成生物学是近年来兴起的对生命系统和过程进行重新设计和工程化构建与应用的科学，为天然化合物的规模化生产及新结构的小分子化合物的设计与合成提供了强有力的技术和平台支撑。近年来也不断有利用合成生物学方法制备其他活性植物天然产物的报道，涉及的天然产物包括萜类、黄酮类、多酚类、生物碱等，这些新技术形成的绿色、高效的生产链正在被科学及工业界认可。

[0003] 萜类是一类具有多种功能且应用广泛的最大疏水性物质之一，可用作香料和香精，药物，溶剂，化妆品，食品添加剂和潜在的高级生物燃料。酵母由于其遗传背景清晰遗传操作简单等特点而被认为是生产类异戊二烯的理想宿主。然而，真核细胞被分为几个亚细胞器，它们具有复杂的结构，具有自己的膜。特别地，细胞代谢被划分成专门的亚细胞器。例如，氧化磷酸化发生在线粒体中，脂肪酸的β‑氧化位于过氧化物酶体中，这导致辅因子和前体的分散。这种亚细胞区室化可能在供应前体和辅因子时给底物通道带来一些障碍。利用酿酒酵母异源合成萜类天然产物所面临的问题之一是其脂溶性中间体大部分存储在酵母细胞的亚细胞空间——脂滴内部。

[0004] 尽管已经进行了广泛的代谢工程，但是酵母中大多数类异戊二烯的生产仍远远落后于工业应用，这可能部分归因于复杂的代谢区室化。因此，对细胞亚室和利用亚细胞器的系统研究可能为进一步增强酵母甚至其他真核细胞中类异戊二烯的生物合成提供一种可行的方法。

[0005] 本发明提供构建重组微生物的方法，包括将重组融合蛋白的编码基因导入出发微生物，得到重组微生物；所述重组融合蛋白含有Pln1蛋白和萜合成相关蛋白。

[0006] 可选地，根据上述的方法，所述萜合成相关蛋白选自原人参二醇合酶PPDS01和/或细胞色素P450还原酶ATR1。

[0007] 所述萜合成相关蛋白可包括PPDS01和ATR1，则PPDS01和ATR1可经连接肽连接。ATR1可为N端截短46个氨基酸的细胞色素P450还原酶46tATR1，例如46tATR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2中第780位‑第1425位所示。

[0008] 可选地，根据上述的方法，所述重组融合蛋白中，所述Pln1蛋白和所述萜合成相关蛋白经连接肽连接。

[0009] 上文中，所述连接肽可为GGGS或GSTSSG。

[0010] 可选地，根据上述的方法，所述重组融合蛋白为含有所述Pln1蛋白、PPDS01和ATR1的重组蛋白。

[0011] 可选地，根据上述的方法，所述Pln1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2中第1位‑第283位所示；所述PPDS01的氨基酸序列如SEQ ID No.2中第288位‑第773位所示；所述ATR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2中第780位‑第1425位所示。

[0012] 可选地，根据上述的方法，所述重组融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2中的所示。在SEQ ID No.2中，第1位‑第283位为Pln1蛋白的氨基酸序列，第284位‑第287位为连接肽GGGS的氨基酸序列，第288位‑第773位为PPDS01的氨基酸序列，第774位‑第779位为连接肽GSTSSG的氨基酸序列，第780位‑第1425位为ATR1的氨基酸序列。

[0013] 该方法还可包括使上述重组融合蛋白的编码基因得到表达。该编码基因具体序列可如SEQ ID No.1中第431位‑第4708位所示。

[0014] 可选地，根据上述的方法，所述重组微生物中，所述重组融合蛋白的编码基因整合入所述出发微生物的YPL062W位点。

[0015] 可选地，根据上述的方法，所述重组融合蛋白的编码基因通过表达所述重组融合蛋白的表达盒导入所述出发微生物，获得所述重组微生物。表达所述重组融合蛋白的表达盒序列可如SEQ ID No.1所示，其中启动子PTEF1为第1‑430位，Pln1蛋白的编码基因为第431‑1279位，连接肽GGGS的编码基因为第1280‑1291位，蛋白PPDS01的编码基因为第1292‑
2749位，连接肽GSTSSG的编码基因为第2750‑2767位，蛋白46tATR1的编码基因为第2768‑
4708位，终止子TCYC1为第4709‑5015位。

[0016] 可选地，根据上述的方法，所述出发微生物为酿酒酵母，所述酿酒酵母为对菌株BYT1进行如下A1‑A12改造得到的菌株，

[0017] A1、导入3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶基因tHMG1基因；A2、导入甲羟戊酸激酶基因ERG12基因；A3、导入乙醇脱氢酶I基因IDI1基因；A4、导入焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因ERG19基因；A5、导入羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因HMGR基因；A6、导入羟甲基戊二酰‑辅酶A合成酶基因ERG13基因；A7、导入磷酸甲戊酸激酶基因ERG8基因；A8、导入乙酰辅酶A乙酰转移酶基因ERG10基因；A9、导入角鲨烯合酶基因AtSQS2基因；A10、导入角鲨烯单加氧酶基因ERG1基因；A11、导入法尼基焦磷酸合成酶基因SmFPS基因；A12、导入达玛烯二醇合酶基因spgDDS基因。

[0018] 可选地，所述tHMG1基因编码的tHMG1蛋白质的序列为genbank登陆号：AJS96703.1的第530‑1054位所示；所述ERG12基因编码的ERG12蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_013935.1所示；所述IDI1基因编码的IDI1蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_015208.1所示；所述ERG19基因编码的ERG19蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_014441.1所示；所述HMGR基因编码的HMGR蛋白质的序列为genbank登陆号：WP_011241944.1所示；所述ERG13基因编码的ERG13蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_013580.1所示；所述ERG8基因编码的ERG8蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_013947.1所示；所述ERG10基因编码的ERG10蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_015297.1所示；所述AtSQS2基因编码的AtSQS2蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_195190.1所示；所述ERG1基因编码的ERG1蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_011691.1所示；所述SmFPS基因编码的SmFPS蛋白质的序列为genbank登陆号：
ABV08819.1所示；所述spgDDS基因编码的spgDDS蛋白质的序列为genbank登陆号：
ACZ71036.1所示。

[0019] 可选地，所述tHMG1基因的序列如SEQ ID No.3中第757位‑第2340位所示；所述ERG12基因的序列如SEQ ID No.4中第801位‑第2132位所示；所述IDI1基因的序列如SEQ ID No.5中第1001位‑第1867位所示；所述ERG19基因的序列如SEQ ID No.6中第1001位‑第2191位所示；所述HMGR基因的序列如SEQ ID No.7中第563位‑第1864位所示；所述ERG13基因的序列如SEQ ID No.8中第823位‑第2298位所示；所述ERG8基因的序列如SEQ ID No.9中第801位‑第2156位所示；所述ERG10基因的序列如SEQ ID No.10中第431位‑第1627位所示；所述AtSQS2基因的序列如SEQ ID No.11中第751位‑第1983位所示；所述ERG1基因的序列如SEQ ID No.12中第801位‑第2291位所示；所述SmFPS基因的序列如SEQ ID No.13中第431位‑第1480位所示；所述spgDDS基因的序列如SEQ ID No.15中的第431位‑第2740位所示。

[0020] 上述基因可通过表达上述蛋白的表达盒，也可通过表达上述蛋白的表达质粒导入菌株BYT1，获得所述出发微生物，例如，可将上述基因分别整合至菌株BYT1的LEU位点和NDT80位点。

[0021] 可选地，表达tHMG1蛋白质的表达盒序列如SEQ ID No.3所示；表达ERG12蛋白质的表达盒序列如SEQ ID No.4所示；表达IDI1蛋白质的表达盒序列如SEQ ID No.5所示；表达ERG19蛋白质的表达盒序列如SEQ ID No.6所示；表达HMGR蛋白质的表达盒序列如SEQ ID No.7所示；表达ERG13蛋白质的表达盒序列如SEQ D No.8所示；表达ERG8蛋白质的表达盒序列如SEQ ID No.9所示；表达ERG10蛋白质的表达盒序列如SEQ ID No.10所示；表达AtSQS2蛋白质的表达盒序列如SEQ ID No.11所示；表达ERG1蛋白质的表达盒序列如SEQ ID No.12所示；表达SmFPS蛋白质的表达盒序列如SEQ ID No.13所示；表达spgDDS蛋白质的表达盒序列如SEQ ID No.15所示。

[0022] 本发明还提供了如下B1)‑B6)中任一种生物材料：

[0023] B1)编码上述重组融合蛋白的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；B5)上述重组融合蛋白；B6)表达所述重组融合蛋白的重组微生物。

[0024] 本发明还提供了如下任一一种应用：

[0025] X1、上述构建重组微生物的方法在制备生产萜产品中的应用；X2、上述构建重组微生物的方法在生产萜中的应用；X3、上述生物材料在制备生产萜产品中的应用；X4、上述生物材料在生产萜中的应用；X5、上述的Pln1蛋白在制备生产萜产品中的应用；X6、上述的Pln1蛋白在生产萜中的应用；X7、上述的Pln1蛋白在提高萜合成效率(重组效率)中的应用；X8、上述的重组融合蛋白在提高萜合成效率(重组效率)中的应用。

[0026] 本发明还提供了提高生物合成萜效率的方法，包括在受体生物中表达上述的重组融合蛋白得到重组生物的步骤，所述重组生物的合成萜的效率高于所述受体生物。

[0027] 上文中，所述生物可为微生物、植物或非人动物。

[0028] 上文中，所述生产萜产品可为表达萜的重组菌。所述萜可为原人参二醇、葫芦二烯醇。

[0029] 酵母脂滴作为一种特殊的细胞器具有储存多余的疏水性物质的能力，不仅以三酰甘油(Triacylglycerol，简称TAG)的形式储存脂肪酸(Fatty acid，简称FA)，而且将角鲨烯，甾醇酯和视黄酯都隔离在脂滴中，以避免对膜完整性的破坏作用。Pln1蛋白(过去也叫Pet10p)，其在脂滴形成早期就特异性结合含有TAG的脂滴，从而维持脂滴形态及稳定并促进脂滴从内质网形成。本发明通过Pln1蛋白对三萜生物合成路径中的部分关键酶进行重新定位，以促使酶从空间上接近底物，以促进储存在脂滴中的天然产物脂溶性中间体的转化。附图说明

[0030] 图1为实施例2HPLC检测菌株PTA及LPTA中DD和PPD含量。

[0031] 图2为实施例2菌株PTA和LPTA的HPLC图。

[0032] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

[0033] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0034] 采用SPSS11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One‑way ANOVA检验。

[0035] 下述实施例所使用的酿酒酵母BY4742(Saccharomyces cerevisiae BY4742)，记载于Zhubo Dai et al.，Producing aglycons of ginsenosides in bakers’yeast.Sci Rep.2014Jan 15；4：3698.。

[0036] 下述实施例所涉及的基因片段以及蛋白质序列相关信息参见下表。

[0037] 基因片段的相关信息

[0038]

[0039]

[0040] 蛋白质序列的相关信息

[0041]  genbank登陆号 更新时间
tHMG1蛋白质 AJS96703.1第530‑1054位 2016/5/23
ERG12蛋白质 NP_013935.1 2020/10/2
IDI1蛋白质 NP_015208.1 2020/10/2
ERG19蛋白质 NP_014441.1 2020/10/2
HMGR蛋白质 WP_011241944.1 2019/6/19
ERG13蛋白质 NP_013580.1 2020/10/2
ERG8蛋白质 NP_013947.1 2020/10/2
ERG10蛋白质 NP_015297.1 2020/10/2
AtSQS2蛋白质 NP_195190.1 2019/2/14
ERG1蛋白质 NP_011691.1 2020/10/2
SmFPS蛋白质 ABV08819.1 2011/4/11
spgDDS蛋白质 ACZ71036.1 2009/12/12

[0042] 实施例1

[0043] 一、基因原件的克隆

[0044] 1、PCR扩增获取基因片段

[0045] 以酿酒酵母BY4742的基因组DNA为模板，分别采用表1中引物，扩增得到完整ORF的Pln1基因和N端截短了46个氨基酸的ATR1基因(46tATR1)。

[0046] 以含有pgPPDS基因的质粒pM13‑pgPPDS(记载于文献：Dai ZB et al.，Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for production of ginsenosides.Metabolic Engineering.2013，20：145‑156中，公众可从天津工业生物技术研究所所获得)为模板，采用表1中引物，扩增得到原人参二醇合酶基因PPDS01。

[0047] 扩增体系如下： GXL DNA Polymerase PrimeSTAR GXL Buffer(Mg2+plus)x 10μl，dNTPMix 4μl，引物各1.5μl，DNA模板1μl，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(1.25U/μl)1μl，补加ddH2O至总体积50μl。

[0048] 扩增条件如下：95℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、60℃退火15秒、68℃延伸3分钟(35个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。产物经胶回收保存。

[0049] 2、融合PCR获取融合片段

[0050] (1)将与46tATR1基因含有20bp同源区域的PPDS01基因做融合PCR，引物如表1所示。

[0051] 融合PCR体系如下：PrimeSTARGXLBuffer(Mg2+plus)x 10μl，dNTPMix 4μl，引物SexA1‑PPDS01‑F和Asc1‑46tATR1‑R各1.5μl，DNA模板为片段46tATR1和片段PPDS01各1.5μl，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(1.25U/μl)1μl，补加ddH2O至总体积50μl。

[0052] 扩增条件如下：95℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、60℃退火15秒、68℃延伸3分钟(35个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。获得融合基因片段PPDS01‑GSTSSG‑46tATR1。

[0053] 同样依据上述方法获得与Pln1基因含有14bp同源区域的融合基因片段14bp‑PPDS01‑GSTSSG‑46tATR1，引物如表1所示。该片段经胶回收处理。

[0054] (2)将与Pln1基因含有14bp同源区域的14bp‑PPDS01‑GSTSSG‑46tATR1基因做融合PCR，引物如表1所示。

[0055] 融合PCR体系如下：PrimeSTAR GXL Buffer(Mg2+plus)x 10μl，dNTPMix 4μl，引物Pac1‑Pln1‑F和Asc1‑46tATR1‑R各1.5μl，DNA模板为片段Pln1和片段14bp‑PPDS01‑GSTSSG‑46tATR1各1.5μl，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(1.25U/μl)1μl，补加ddH2O至总体积50μl。

[0056] 扩增条件如下：95℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、60℃退火15秒、68℃延伸3分钟(35个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。获得融合基因片段Pln1‑GGGS‑PPDS01‑GSTSSG‑46tATR1。

[0057] 表1引物序列

[0058]

[0059]

[0060] 二、重组质粒的构建

[0061] 1、pM3‑PPDS01‑GSTSSG‑46tATR1

[0062] 用限制性内切酶SexAI和AscI分别双酶切质粒pM3‑ERG9(记载在中国专利申请201210453416.X中)和基因PPDS01‑GSTSSG‑46tATR1进行双酶切，割胶回收目的片段：
pEASY‑Blunt‑PTEF1‑//‑TCYC1(62ng)和PPDS01‑GSTSSG‑46tATR1(3420bp，130ng)，将目的片段与载体进行连接，连接体系如下：5μl 2×Quick Ligation Buffer(NEB公司)、0.5μl Quick T4 DNA Ligase(NEB公司，400,000cohesive end units/ml)，补充ddH2O至10μl，25℃反应
13min，得到连接产物，转入Trans1 T1感受态细胞并进行测序验证，得到重组载体。经过测序，该重组载体为将PPDS01‑GSTSSG‑46tATR1基因的表达盒PTEF1‑PPDS01‑GSTSSG‑46tATR1‑TCYC1插入pEASY‑BluntSimple克隆载体(pEASY克隆载体，北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司)的克隆位点间得到的载体，并将其命名为pM3‑PPDS01‑GSTSSG‑
46tATR1。

[0063] 2、pM13‑Pln1‑GGGS‑PPDS01‑GSTSSG‑46tATR1

[0064] 用限制性内切酶PacI和AscI分别双酶切质粒pM13‑pgPPDS(记载于文献：Dai ZB et al.，2013，Metabolic Engineering 20：145‑156中，公众可从天津工业生物技术研究所所获得)和基因片段Pln1‑GGGS‑PPDS01‑GSTSSG‑46tATR1，割胶回收目的片段：pEASY‑Blunt‑PTEF1‑//‑TCYC1(50ng)和pac1‑Pln1‑GGGS‑PPDS01‑GSTSSG‑46tATR1‑Asc1(4278bp，104ng)，将目的片段与载体进行连接，连接体系如下：5μl 2×Quick Ligation Buffer(NEB公司)、0.5μl Quick T4 DNA Ligase(NEB公司，400,000cohesive end units/ml)，补充ddH2O至10μl，25℃反应13min，得到连接产物，转入Trans1 T1感受态细胞并进行测序验证，得到重组载体。经过测序，该重组载体为将Pln1‑GGGS‑PPDS01‑GSTSSG‑46tATR1基因的表达盒PTEF1‑Pln1‑GGGS‑PPDS01‑GSTSSG‑46tATR1‑TCYC1插入pEASY‑Blunt Simple克隆载体(pEASY克隆载体，北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司)的克隆位点间得到的载体，并将其命名为pM13‑Pln1‑GGGS‑PPDS01‑GSTSSG‑46tATR1。

[0065] 3、Leu gRNA、NDT80gRNA和YPL062W gRNA

[0066] 以购自addgene公司的p426‑SNR52p‑gRNA.CAN1.Y‑SUP4t质粒为模板，分别用以下引物进行扩增：gRNA反向/Leu gRNA正向、gRNA反向/NDT80 gRNA正向、gRNA反向/YPL062W gRNA正向

[0067] gRNA反向：GATCATTTATCTTTCACTGC

[0068] LeugRNA正向：

[0069] cgcagtgaaagataaatgatcCGATGGTGATGGTGTCGCTTgttttagagctagaaatagcaag

[0070] NDT80 gRNA正向：

[0071] cgcagtgaaagataaatgatcCTGCTTCAGGTGCGGCTTGGgttttagagctagaaatagcaag

[0072] YPL062W gRNA正向：

[0073] cgcagtgaaagataaatgatcGCACGTCGCCGTGGCTGATGgttttagagctagaaatagcaag

[0074] 扩增分别获得三个线性片段Linearized Leu gRNA、Linearized NDT80 gRNA、Linearized YPL062W gRNA，将该三个片段分别转入Transl T1感受态细胞并进行测序验证，得到重组质粒Leu gRNA、NDT80 gRNA和YPL062W gRNA。

[0075] 4、pM7‑HMGR的质粒构建

[0076] 以酿酒酵母BY4742的基因组DNA为模板，采用引物Pac1‑TEF2‑F和SexA1‑TEF2‑R扩增获得启动子pTEF2(562bp)，采用引物Asc1‑ENO2‑F和Pme1‑ENO2‑R扩增获得终止子tENO22+
(400bp)。扩增体系如下：PrimeSTAR GXL Buffer(Mg plus)×10μl，dNTPMix×4μl，引物Pac1‑TEF2‑F和SexA1‑TEF2‑R(Asc1‑ENO2‑F和Pme1‑ENO2‑R)各1.5μl，基因组DNA模板为1.5μl，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(1.25U/μl)1μl，补加ddH2O至总体积50μl。

[0077] Pac1‑TEF2‑F：5’‑GCTTAATTAAATGGGGCCGTATACTTACATATAGTAGA‑3’

[0078] SexA1‑TEF2‑R：5’‑GCACCAGGTGTTTAGTTAATTATAGTTCGTTGACCGTATATTCTAAAAAC‑3’[0079] Asc1‑ENO2‑F：5’‑GCGGCGCGCCAGTGCTTTTAACTAAGAATTATTAGTCTTTTCTGCT‑3’[0080] Pme1‑ENO2‑R：5’‑GCGTTTAAACAGGTATCATCTCCATCTCCCATATGC‑3’

[0081] 用限制性内切酶SexAI和AscI分别双酶切质粒pUC57‑synHMGR(该基因的全合成委托金斯瑞生物科技有限公司对synHMGR基因进行全合成，并将其插入pUC57载体(金斯瑞生物科技有限公司提供)的克隆位点间，得到含synHMGR基因的克隆型质粒pUC57‑synHMGR)，割胶回收目的片段获得片段SexAI‑synHMGR‑AscI；用限制性内切酶SexAI和pacI分别双酶切片段pTEF2，割胶回收目的片段获得SexAI‑pTEF2‑pacI；用限制性内切酶Ascl和Pme1分别双酶切片段tENO2，割胶回收目的片段获得Asc1‑tENO2‑Pme1，将三个片段各50ng加入连接体系：2ul 10XT4 ligation Buffer(NEB公司)、1ul T4 ligase(NEB公司，400,000cohesive end units/ml)，补充蒸馏水至20ul，室温反应2小时得到连接产物，取1ul连接产物加入，PCR体系：PrimeSTAR GXL Buffer(Mg2+plus)x 10μl，dNTPMix 4μl，引物Pac1‑TEF2‑F和Pme1‑ENO2‑R各1.5μl，连接产物为1μl，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(1.25U/μl)1μl，补加ddH2O至总体积50μl，得到表达盒PTEF2‑HMGR‑TENO2。将表达盒克隆到pEASY‑Blunt Simple克隆载体(购自北京全式金生物技术有限公司)，得到重组载体pM7‑HMGR，测序，该载体中为将HMGR的表达盒PTEF2‑HMGR‑TENO2(序列如SEQ ID No.7所示)插入pEASY‑Blunt Simple的克隆位点间得到的载体。

[0082] 上述制备的重组质粒pM3‑PPDS01‑GSTSSG‑46tATR1、pM13‑Pln1‑GGGS‑PPDS01‑GSTSSG‑46tATR1、Leu gRNA、NDT80 gRNA和YPL062W gRNA、pM7‑HMGR相关信息参见表2。

[0083] 表2质粒信息

[0084]

[0085]

[0086] 三、重组菌的构建

[0087] (一)、YSBYT5菌株的构建

[0088] 1、基因模块的构建

[0089] 分别用表2描述的质粒为PCR模板(pδ‑tHMG1、pM9‑ERG12、pM16‑IDI1、pM5‑ERG19、pM8‑ERG13、pM11‑ERG8、pM3‑ERG10记载于文献：创建酿酒酵母细胞工厂发酵生产羽扇豆醇.中国中药杂志，林庭庭，王冬，戴住波，张学礼，黄璐琦，2016，41(6)：1008‑1015中)和表3的相应引物进行PCR扩增，分别获得功能模块片段：M1(包含PPGK1‑tHMG1‑TADH1表达盒)、M2(包含PPDC1‑ERG12‑TADH2表达盒)、M3(包含PENO2‑IDI1‑T‑PDC1表达盒)、M4(包含PPYK1‑ERG19‑TPGI1表达盒)、M5(包含PTEF2‑HMGR‑N‑TENO2表达盒)、M6(包含PFBA1‑ERG13‑TTDH2表达盒)和M7(包含PTDH3‑ERG8‑TTPI1表达盒)、M8(包含PTEF1‑ERG10‑TCYC1表达盒)。

[0090] 扩增体系如下： GXL DNA Polymerase PrimeSTAR GXL Buffer(Mg2+plus)x 10μl，dNTPMix 4μl，引物各1.5μl，DNA模板1μl，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(1.25U/μl)1μl，补加ddH2O至总体积50μl。

[0091] 扩增条件如下：95℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、60℃退火15秒、68℃延伸3分钟(35个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。产物经胶回收保存。

[0092] 表3模板、引物及其序列

[0093]

[0094]

[0095]

[0096] 2、酵母感受态的制备

[0097] 隔夜培养新鲜酵母菌液BYT1(来源于实验室保存菌株，记载于Zhubo Dai et al.，Producing aglycons of ginsenosides in bakers’yeast.Sci Rep.2014Jan 15；4：3698.)(预先转入购自addgene公司的p414‑PTEF1‑Cas9‑TCYC1质粒)制做感受态(1％接种量，
30ul种子液接3ml SD‑Trp液体培养基中(0.8％全合成四缺培养基(购自北京泛基诺科技有限公司)+2％葡萄糖+0.005％His+0.01％Ura+0.01％Leu))。

[0098] 操作步骤如下：

[0099] ①收集菌体：取1ml酵母菌液分装到1.5mlEP管。12000rpm离心1min，弃上清，用枪吸净。沉淀用1ml无菌水洗涤，吹打离心，弃上清，洗涤两次。

[0100] ②菌体处理：加入1ml处理液(处理液的配制：1M山梨醇+10mM LiAc+10mM Tris‑HCl(pH 7.5))(4℃冰箱保存)+10ulDTT(购自北京兰博利德商贸有限公司，货号：1758‑9030‑25g)(‑20℃冰箱保存)，25℃金属加热20min。

[0101] ③20min后离心，弃上清，用枪吸尽，加入1ml预冷的1M sob(D‑山梨醇，购自北京索莱宝科技有限公司)(4℃冰箱)，吹打，离心，弃上清。用1M sob再次洗涤二次，吸弃上清，再加入50ul Sob悬浮。

[0102] ④加入2μl M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7和M8模块及2μl Leu gRNA质粒吹打混匀后转入预冷的电转杯，冰浴5min。

[0103] ⑤将电转杯水擦净，2.7kv电击。加入先吸好的1ml sob放入电转杯，混匀后吸入新的1.5mlEP管。30℃、250rpm摇床培养60min。

[0104] ⑥60min后，菌液离心去部分上清混匀涂在营养缺陷SD‑UraTrp(0.8％全合成四缺培养基+2％葡萄糖+0.005％His+0.01％Leu+2％Ager)的平板上，30℃培养箱培养36h。

[0105] 经过大约两天的培养箱培养，挑取单克隆进行PCR菌落验证，获得酵母工程菌YSBYT5，丢弃Leu gRNA质粒后，进行下一步遗传改造。

[0106] 酵母工程菌YSBYT5的构建原理具体为菌株BYT1中预先转入可以表达Cas9蛋白的重组质粒p414‑PTEF1‑Cas9‑TCYC1，而后，表达gRNA的重组质粒(Leu gRNA)与重组片段(M1‑M8)一同转化进菌株中，Leu gRNA识别并结合Leu位点特定PAM区，同时激活并指导Cas9蛋白行使剪切功能，使Leu位点的双链DNA断裂开，此时含有同源区的重组片段M1‑M8通过同源重组修复被整合进入菌株DNA中。

[0107] PCR菌落验证验证方法具体如下：

[0108] 利用酵母基因组DNA提取试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司，货号：DP307‑02)提取酵母菌株YSBYT5的基因组。以提取的基因组为模板，用SacII‑PGK1/Asc1‑tHMG1‑R进行PCR扩增，得到2400bp左右的片段，说明含有M1；Pac‑pPDC1/Asc1‑Erg12‑R进行PCR扩增，得到2200bp左右的片段，说明含有M2；pac‑pENO2/IDI1‑Asc1‑R进行PCR扩增，得到
2200bp左右的片段，说明含有M3；Pac‑PYK1p/Asc1‑Erg19‑R进行PCR扩增，得到2200bp左右的片段，说明含有M4；pac1‑pTEF2/Asc1‑HMGR‑N‑R进行PCR扩增，得到1900bp左右的片段，说明含有M5；pFBA1‑YZ‑F/Asc1‑Erg13‑R进行PCR扩增，得到2300bp左右的片段，说明含有M6；
Pac‑pTDH3/Asc1‑Erg8‑R进行PCR扩增，得到2200bp左右的片段，说明含有M7；SacII‑pTEF1/Asc1‑Erg10‑R进行PCR扩增，得到1700bp左右的片段，说明含有M8。上述引物具体如表4所示。

[0109] 表4菌落验证引物及其序列

[0110] 引物名字 序列(5′‑3′)SacII‑PGK1 GCGCCGCGGACGCACAGATATTATAACATC
Asc1‑tHMG1‑R GGCGCGCCTTAGGATTTAATGCAGGTGACGGA
Pac‑pPDC1 GCGTTAATTAACATGCGACTGGGTGAGCATATGTTC
Asc1‑Erg12‑R GGCGCGCCTTATGAAGTCCATGGTAAATTCGT
Pac‑pENO2 GCGTTAATTAAAATCCTACTCTTGCCGTTGCCATCC
IDI1‑Asc1‑R GCGGCGCGCCTTATAGCATTCTATGAATTTGCCTGTCATTTT
Pac‑PYK1p GCGTTAATTAAAATGCTACTATTTTGGAGATTAATC
Asc1‑Erg19‑R GGCGCGCCTTATTCCTTTGGTAGACCAGTCTT
pac‑pTEF2 GCTTAATTAAATGGGGCCGTATACTTACATATAGTAGA
Asc1‑HMGR‑N‑R GGCGCGCCTTATGTGTTTTCCAAAACTTGCT
pFBA1‑YZ‑F TGGCTTGAACAACAATACCAGCC
Asc1‑Erg13‑R GGCGCGCCTTATTTTTTAACATCGTAAGATCTTCTAAA
Pac‑pTDH3 GCGTTAATTAAATACTAGCGTTGAATGTTAGCGTCA
Asc1‑Erg8‑R GGCGCGCCTTATTTATCAAGATAAGTTTCCGGATCTTT
SacII‑pTEF1 GCGCCGCGGAGTGATCCCCCACACACCATAGCTT
Asc1‑Erg10‑R GGCGCGCCTCATATCTTTTCAATGACAATAGAGGAAGCAC
SmFPS‑Asc1 GCGGCGCGCCTTATTTCTGCCTCTTGTATATCTTGCC
AtSQS2‑Asc1 GCGGCGCGCCTCAGTTTGCTCTGAGATATGCAAAGAC
ERG1‑Asc1 GCGGCGCGCCTTAACCAATCAACTCACCAAACAAAAATGG
spgDDS‑Asc1‑R GCGGCGCGCCTCATATCTTTAATTGTTGATGCTTAGGTAACCAAAC
ypl062w‑up‑256 GGAATTATTCGTAACGTCATACGA
PPDS01‑EGPP‑R GTTGTGTGGGTGTAAGTGGATAG
ATR1‑Ce1805‑F TAAGGGCATGGCGAGGGAC
yp1062w‑down‑249 GTGTAGCTTAGTCATTGTATTCTGAT

[0111] (二)YSBYT30菌株的构建

[0112] 1、基因模块的构建

[0113] 分别用表2描述的质粒为PCR模板(pM3‑SmFPS和pM2‑AtSQS2记载于文献：王冬，刘怡，许骄阳，王金鹤，戴住波，张学礼，黄璐琦.创建酿酒酵母细胞工厂高效生产人参皂苷前体达玛烯二醇II[J].药学学报，2018，53(08)：1233‑1241中，pM11‑ERG1记载在中国专利申请201210453416.X中，公众可从天津工业生物技术研究所获得)和相应引物进行PCR扩增，分别获得功能模块：M9(包含PPGK1‑AtSQS2‑TADH1表达盒)、M10(包含PTDH3‑ERG1‑TTPI1表达盒)、M11(包含PTEF1‑SmFPS‑TCYC1表达盒)。2+

[0114] 扩增体系如下： GXL DNA Polymerase PrimeSTAR GXL Buffer(Mgplus)x 10μl，dNTPMix 4μl，引物各1.5μl，DNA模板1μl，PrimesTAR GXL DNA Polymerase(1.25U/μl)1μl，补加ddH2O至总体积50μl。

[0115] 扩增条件如下：95℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、60℃退火15秒、68℃延伸3分钟(35个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。产物经胶回收保存。

[0116] 2、酵母感受态的制备

[0117] 隔夜培养新鲜酵母菌液YSBYT5制做感受态(1％接种量，30ul种子液接3ml培养基)，操作步骤如下：

[0118] ①收集菌体：取1ml酵母菌液分装到1.5mlEP管。12000rpm离心1min，弃上清，用枪吸净。沉淀用1ml无菌水洗涤，吹打离心，弃上清，洗涤两次。

[0119] ②菌体处理：加入1ml处理液(4℃冰箱保存)+10ulDTT(‑20℃冰箱保存)，25℃金属加热20min。

[0120] ③20min后离心，弃上清，用枪吸尽，加入1ml预冷的1M sob(4℃冰箱)，吹打，离心，弃上清。用1M sob再次洗涤二次，吸弃上清，再加入50ul Sob悬浮。

[0121] ④加入2μl M9、M10和M11模块及2μl NDT80 gRNA质粒吹打混匀后转入预冷的电转杯，冰浴5min。

[0122] ⑤将电转杯水擦净，2.7kv电击。加入先吸好的1ml sob放入电转杯，混匀后吸入新的1.5mlEP管。30℃、250rpm摇床培养60min。

[0123] ⑥60min后，菌液离心去部分上清混匀涂在营养缺陷Sd‑UraTrp(0.8％全合成四缺培养基+2％葡萄糖+0.005％His+0.01％Leu+2％Ager)的平板上，30℃培养箱培养36h。

[0124] 经过大约两天的培养箱培养，挑取单克隆进行PCR菌落验证，获得酵母工程菌YSBYT30，丢弃NDT80 gRNA质粒，进行下一步遗传改造

[0125] 酵母工程菌YSBYT30构建原理具体为菌株YSBYT5中有可以表达Cas9蛋白的重组质粒p414‑PTEF1‑Cas9‑TCYC1，表达NDT80 gRNA的重组质粒(NDT80gRNA)与重组片段(M9‑M11)一同转化进菌株YSBYT5中，gRNA识别并结合NDT80位点特定PAM区，同时激活并指导Cas9蛋白行使剪切功能，使NDT80位点的双链DNA断裂开，此时含有同源区的重组片段M9‑M11通过同源重组修复被整合进入酵母DNA中。

[0126] PCR菌落验证方法具体如下：

[0127] 利用酵母基因组DNA提取试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司，货号：DP307‑02)提取酵母菌株YSBYT30的基因组。以提取的基因组为模板，用SacII‑pTEF1/SmFPS‑Asc1进行PCR扩增，得到1500bp左右的片段，说明含有M11；用SacII‑PGK1/AtSQS2‑Asc1进行PCR扩增，得到2000bp左右的片段，说明含有M9；用Pac‑pTDH3/ERG1‑Asc1进行PCR扩增，得到
2300bp左右的片段，说明含有M10。引物序列见表4。

[0128] (三)T30‑DD菌株的构建

[0129] 1、酵母感受态的制备

[0130] 隔夜培养新鲜酵母菌液YSBYT30制做感受态(1％接种量，30ul种子液接3ml培养基)，操作步骤如下：

[0131] ①收集菌体：取1ml酵母菌液分装到1.5mlEP管。12000rpm离心1min，弃上清，用枪吸净。沉淀用1ml无菌水洗涤，吹打离心，弃上清，洗涤两次。

[0132] ②菌体处理：加入1ml处理液(4℃冰箱保存)+10ulDTT(‑20℃冰箱保存)，25℃金属加热20min。

[0133] ③20min后离心，弃上清，用枪吸尽，加入1ml预冷的1M sob(4℃冰箱)，吹打，离心，弃上清。用1M sob再次洗涤二次，吸弃上清，再加入50ul Sob悬浮。

[0134] ④加入2μl pRS425‑SpgDDS质粒(记载于文献：王冬，刘怡，许骄阳，王金鹤，戴住波，张学礼，黄璐琦.创建酿酒酵母细胞工厂高效生产人参皂苷前体达玛烯二醇II[J].药学学报，2018，53(08)：1233‑1241中，文献中该质粒记载为pRS425‑DDS)吹打混匀后转入预冷的电转杯，冰浴5min。

[0135] ⑤将电转杯水擦净，2.7kv电击。加入先吸好的1ml sob放入电转杯，混匀后吸入新的1.5mlEP管。30℃、250rpm摇床培养60min。

[0136] ⑥60min后，菌液离心去部分上清混匀涂在营养缺陷SD‑TrpLeu(0.8％全合成四缺培养基+2％葡萄糖+0.005％His+0.01％Ura+2％Ager)的平板上，30℃培养箱培养36h。

[0137] 经过大约两天的培养箱培养，挑取单克隆进行PCR菌落验证，获得酵母工程菌T30‑DD，进行下一步遗传改造。

[0138] PCR菌落验证方法具体包括利用酵母基因组DNA提取试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司，货号：DP307‑02)提取酵母菌株T30‑DD的基因组。以提取的基因组为模板，用引物SacII‑pTEF1/spgDDS‑Asc1‑R对菌株进行PCR验证，得到2800bp左右的片段，说明成功转入pRS425‑SpgDDS质粒。引物序列见表4。

[0139] (四)PTA菌株和LPTA的构建

[0140] 1、基因模块的构建

[0141] 分别用表2质粒信息描述的质粒(公众可从天津工业生物技术研究所获得)为PCR模板和表3的相应引物进行PCR扩增，分别获得功能模块：M12(包含PTEF1‑PPDS01‑GSTSSG‑46tATR1‑TCYC1表达盒)和M13(包含PTEF1‑Pln1‑GGGS‑PPDS01‑GSTSSG‑46tATR1‑TCYC1表达盒)。
2+

[0142] 扩增体系如下： GXL DNA Polymerase PrimeSTAR GXL Buffer(Mgplus)x 10μl，dNTPMix 4μl，引物各1.5μl，DNA模板1μl，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(1.25U/μl)1μl，补加ddH2O至总体积50μl。

[0143] 扩增条件如下：95℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、60℃退火15秒、68℃延伸4分钟(35个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。产物经胶回收保存。

[0144] 2、酵母感受态的制备

[0145] 隔夜培养新鲜酵母菌液T30‑DD制做感受态(1％接种量，30ul种子液接3ml培养基)，操作步骤如下：

[0146] ①收集菌体：取1ml酵母菌液分装到1.5mlEP管。12000rpm离心1min，弃上清，用枪吸净。沉淀用1ml无菌水洗涤，吹打离心，弃上清，洗涤两次。

[0147] ②菌体处理：加入1ml处理液(4℃冰箱保存)+10ulDTT(‑20℃冰箱保存)，25℃金属加热20min。

[0148] ③20min后离心，弃上清，用枪吸尽，加入1ml预冷的1M sob(4℃冰箱)，吹打，离心，弃上清。用1M sob再次洗涤二次，吸弃上清，再加入50ul Sob悬浮。

[0149] ④分成两组，一组加入2μl M12模块及2μlYPL062W gRNA质粒，另外一组加入2μl M13模块及2μl YPL062W gRNA质粒吹打混匀后转入预冷的电转杯，冰浴5min。

[0150] ⑤将电转杯水擦净，2.7kv电击。加入先吸好的1ml sob放入电转杯，混匀后吸入新的1.5mlEP管。30℃、250rpm摇床培养60min。

[0151] ⑥60min后，菌液离心去部分上清混匀涂在营养缺陷SD‑UraTrpLeu(0.8％全合成四缺培养基+2％葡萄糖+0.005％His+2％Ager)的平板上，30℃培养箱培养36h。经过大约两天的培养箱培养，挑取单克隆进行PCR菌落验证，获得酵母工程菌PTA和LPTA。

[0152] PTA菌株的验证：

[0153] 利用酵母基因组DNA提取试剂盒提取酵母菌株PTA的基因组。以提取的基因组为模板，用引物yp1062w‑up‑256/yp1062w‑down‑249对菌株进行PCR验证，得到4700bp左右的片段，说明成功转入M12片段。引物序列具体参见表4。

[0154] LPTA菌株的验证：

[0155] 利用酵母基因组DNA提取试剂盒提取酵母菌株LPTA的基因组。以提取的基因组为模板，用引物yp1062w‑up‑256/PPDS01‑EGPP‑R进行PCR验证，得到3000bp左右的片段，用引物ATR1‑Ce1805‑F/yp1062w‑down‑249对菌株进行PCR验证，得到1000bp左右的片段，说明成功转入M13(PTEF1‑Pln1‑GGGS‑PPDS01‑GSTSSG‑46tATR1‑TCYC1)片段。引物序列具体参见表4。

[0156] 上述制备的菌株YSBYT5、YSBYT30、T30‑DD、PTA、LPTA相关信息参见表5。

[0157] 表5工程菌株信息

[0158]

[0159]

[0160] 实施例2、微生物脂滴技术在生产原人参二醇(PPD)方面的应用

[0161] 1、摇瓶发酵

[0162] ①工程菌PTA和LPTA培养

[0163] 在相应固体选择培养基SD‑UraTrpLeu中活化酵母工程菌株PTA和LPTA，每个基因型工程菌株转接一个单克隆，于相应液体选择培养基SD‑UraTrpLeu中制备种子液(30℃，250rpm，16h)，以1％的接种量接种于含15ml相应液体选择培养基的100ml三角瓶中，每个单克隆平行转接三组，30℃，250rpm振荡培养6天。

[0164] ②工程菌PTA和LPTA产物提取

[0165] 摇瓶发酵后6天的菌液，吸取2ml菌液，12000rpm离心1min，弃上清，用枪吸净。沉淀用ddH2O清洗两次后转移至破碎管中，12000rpm离心1min，弃上清液；向沉淀中加入玻璃珠(直径0.5mm)和lml萃取液(萃取液由甲醇和丙酮组成，甲醇与丙酮的体积比为1∶1)，震荡破碎5min，2次，超声破碎30min；12000rpm离心2min，弃沉淀，将上清液过0.22μm有机滤膜至液相瓶中得到溶液，分别命名为PTA溶液和LPTA溶液。

[0166] 2、HPLC定性定量分析

[0167] ①HPLC定性分析

[0168] 标准品为原人参二醇PPD、达码烯二醇DD，均购买于上海源叶生物科技有限公司。样品为PTA溶液和LPTA溶液。

[0169] 仪器：安捷伦高效液相色谱1260

[0170] HPLC检测条件：DAD监测器，监测波长203nm，Waters 色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相A为10％甲醇，流动相B为乙腈，等度洗脱20min，10％A+90％B[0171] ②HPLC定量分析

[0172] 各工程菌发酵6天时产量如下：

[0173] 在T30‑DD的基础上在酵母基因组敲除YPL062W位点，分别整合没有进行酵母脂滴区室化定位的PPD模块和进行酵母脂滴区室化定位的PPD模块，通过HPLC检测结果表明PTA工程菌的PPD产量5.39mg/L/OD，DD的产量为13.88mg/L/OD，DD到PPD的转化率为27.97％，相应的LPTA程菌的PPD产量19.30mg/L/OD，DD的产量为3.03mg/L/OD，DD到PPD的转化率为86.43％。

[0174] 结果如图1和图2所示，图1为HPLC检测菌株PTA及LPTA中DD和PPD含量，图2为菌株PTA和LPTA的HPLC图。

[0175] 以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。