[0001] 本发明涉及微藻应用领域，具体涉及一株联产γ‑氨基丁酸和积雪草酸的克里藻及其用途。

[0002] γ‑氨基丁酸(GABA)又称4‑氨基丁酸，是一种非蛋白质组成的天然氨基酸，广泛存在脊椎动物、植物和微生物中。GABA是哺乳动物中一种重要的中枢神经系统抑制性神经递质，据报道具有激活脑内葡萄糖代谢、促进乙酰胆碱合成、抗惊厥、降血压、改善脑机能、促进生长激素分泌、改善脂质代谢、抗焦虑、预防癫痫、防止皮肤老化、延缓脑衰老、增强生殖功能等多种生理活性。基于上述的种种生理功能，GABA已被我国列为新资源食品。此外，GABA在植物的抗逆生理及其调控中也起重要作用。因此，GABA在药品、食品、保健品、饲料、化妆品、农林用生物制品等领域的开发应用具有广阔的前景。GABA的生产方法有3种，包括化学合成法、植物富集法和微生物代谢法。化学合成法因其反应条件比较苛刻，合成副产物比较多，产物安全性差，因此由该方法制备的产品在使用领域受到一定的限制。目前，大部分GABA产品都通过微生物代谢法和植物富集法来生产。微生物代谢法即是发酵法，利用生物安全性高的微生物中的谷氨酸脱羧酶催化脱羧反应生产GABA。微生物发酵过程是个异养过程，容易被其他微生物污染，因此该方法对环境和设备的要求比较高。植物富集法即是从GABA含量较高的植物进行分离提取GABA，然而大部分高等植物富集的GABA含量较低，有些微藻也能富集GABA，但种类非常有限，需要深入挖掘更多具有开发GABA应用价值的微藻。

[0003] 积雪草酸又称亚细亚酸，是一种五环三萜类化合物，具有如抗炎、促进伤口愈合、护肤、护肝、抗抑郁、降血糖、降血脂、神经保护、抗肿瘤等生物学活性。积雪草酸常用于抗氧、美白祛斑、皮肤调理为目的的化妆品中。积雪草酸是某些中药植物的活性成分，主要来源于伞形科的传统中草药积雪草，在枇杷叶、阔叶蒲桃、四季青、委陵菜等高等植物中也有发现，但在微藻中尚未见报道。目前尚未见有原料可联产GABA和积雪草酸的报道。

[0004] 微藻是一类可光合作用的微生物，与高等植物相比，具有繁殖速度快、生长周期短、对环境适应性强以及培养条件可控等优势。此外，微藻细胞含有丰富的生理活性物质，是开发天然产物的理想资源。微藻养殖可以不受环境、地域、季节等因素的影响，养殖周期短，是一种可持续的原料资源。微藻用于提取制备GABA和积雪草酸，对于推动微藻养殖业的发展以及微藻提取产物在食品、保健、化妆品等行业的广泛应用将具有极为重要的意义。

[0005] CN103930560A公开了从藻类中生产4‑氨基丁酸的方法，该方法中的红藻Cyanidium caldarium是嗜酸单细胞微藻，最适应生长pH为2‑3，在pH5以上不能生长。实际应用中，单细胞微藻培养存在着采收能耗高，原料高成本的问题。

[0006] CN110106210A公开了褪黑素在促进雨生红球藻生产γ‑氨基丁酸中的应用：通过在雨生红球藻种子液中加入褪黑素母液，在连续光照及褪黑素的复合胁迫下，诱导雨生红球藻细胞积累GABA。该方法通过两步法诱导雨生红球藻合成积累GABA。

[0007] CN109897873A公开了一种基于兼养雨生红球藻富集γ‑氨基丁酸的方法：通过兼养培养红球藻至对数培养期后期，以新鲜BBM培养基稀释重悬浮，在盐(NaCl)及高光照共同作用下实现GABA的富集。该方法通过两步法来实现从雨生红球藻的培养到GABA合成的诱导。

[0008] CN102578631B公开了绿藻中γ‑氨基丁酸的富集方法：先将绿藻浸泡于纯净水中，然后置于密封容器内，施加200～400MPa的高压处理5～15min，绿藻在无菌环境下室温晾干直至恒重，以此提高绿藻中GABA的含量。该方法条件要求较高，需要采用了高压技术处理和无菌的晾干环境。

[0009] CN106946971A公开了一种从积雪草中提取积雪草酸的工艺：该方法提取积雪草酸经过粉碎、一次脱色、结晶、二次脱色、重结晶、萃取分离提纯、浓缩结晶、干燥等步骤，只涉及到提取工艺，不涉及到公开新原料。

[0010] 综上所述，现有技术显示出以下问题：

[0011] (1)目前报道的可富集GABA的微藻正常培养条件下GABA含量并不高，需要通过二步法来提高GABA含量；

[0012] (2)积雪草酸来源单一，主要来源于中草药积雪草，目前尚未有微藻用于生产积雪草酸的报道；

[0013] (3)由于大多数微藻是单细胞藻类，在开放式的规模化培养过程中，面临容易遭受敌害生物入侵，采收成本高等问题；

[0014] (4)目前尚未见可用于联产GABA和积雪草酸相关原料的报道。

[0015] 为解决上述技术问题，本发明提供一株克里藻(Klebsormidium sp.)SCSIO‑46743藻株，可同时积累GABA和积雪草酸，可作为生产GABA和积雪草酸的原料。

[0016] 本发明的第一个目的是提供一株克里藻(Klebsormidium sp.)SCSIO‑46743藻株，其保藏编号为CCTCC NO：M 20211537。

[0017] 本发明克里藻SCSIO‑46743是由采自广州市区山上的岩石样本经分离纯化获得的。

[0018] 本发明克里藻SCSIO‑46743形态特征：不分枝的丝状体，由圆柱状的单列细胞构成，细胞宽5‑10μm，细胞长8‑20μm，色素体片状。该藻能在常见的淡水藻培养基中生长。

[0019] 本发明的第二个目的是提供一种制剂，其包含了上述克里藻SCSIO‑46743的培养物，具体地，所述制剂以克里藻SCSIO‑46743藻株的培养物或其代谢产物为活性成分。

[0020] 本发明的第三个目的是提供上述克里藻SCSIO‑46743或上述制剂在以下所述的一项或多项中的应用：

[0021] (1)制备γ‑氨基丁酸(GABA)；

[0022] (2)制备积雪草酸；

[0023] (3)制备藻粉；

[0024] (4)制备以克里藻SCSIO‑46743培养物和/或GABA和/或积雪草酸为活性成分的食品、饲料、药品、化妆品或护肤品；

[0025] (5)制备蛋白质。

[0026] 所述的食品包括但不限于功能性食品，具体地，所述食品可以激活脑内葡萄糖代谢、促进乙酰胆碱合成、抗惊厥、降血压、改善脑机能、促进生长激素分泌、改善脂质代谢、抗焦虑、预防癫痫、延缓脑衰老、增强生殖功能等等。

[0027] 所述的药品可以为人用药品和农林用生物制品，具体地，所述药品可以抗炎、促进伤口愈合、降血糖、降血脂、抗肿瘤、护肝、抗抑郁、神经保护、调控植物的抗逆生理等等。

[0028] 所述的化妆品或护肤品，可以防止皮肤老化、促进伤口愈合等等。

[0029] 本发明第四个目的是提供一种上述克里藻SCSIO‑46743的培养方法包括以下步骤：将培养到对数期的克里藻SCSIO‑46743培养物静置沉淀后，去掉上清，接种到新鲜培养基中培养。

[0030] 优选地，所述的培养，还包括将接种到新鲜培养基中获得的藻液倒入柱式光生物2 1
反应器中培养，其培养条件为：光照强度为180‑200μmol/m s，温度为25±2℃，连续通入CO2含量为1％的气体。

[0031] 优选地，所述培养基的成分如下：硝酸钠浓度为0.3～1.5g/L，磷酸氢二钾0.04g/L，七水硫酸镁0.075g/L，二水氯化钙0.036g/L，柠檬酸0.006g/L，柠檬酸铁铵0.006g/L，EDTA二钠0.001g/L，微量元素A51 ml/L，其余为去离子水；

[0032] 所述的微量元素A5成分为：硼酸2.86g/L，二水氯化锰1.81g/L，七水硫酸锌0.222g/L，无水硫酸铜0.079g/L，二水钼酸钠0.390g/L，六水硝酸钴0.049g/L。

[0033] 本发明第五个目的是提供微藻在合成积累积雪草酸中的应用。

[0034] 优选地，所述的微藻为克里藻属(Klebsormidium)。

[0035] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0036] (1)本发明克里藻SCSIO‑46743可同时积累GABA和积雪草酸，可作为生产GABA和积雪草酸的原料。在正常硝酸钠浓度(1.5g/L)的BG11培养基中采用管试反应器培养，GABA含量可达0.56％。在硝酸钠浓度为0.3，0.5，1.5g/L的BG11培养基中采用柱式反应器培养，积雪草酸相对含量分别占代谢物的提取物中可鉴定物质的6.60％，3.69％和1.15％。

[0037] (2)本发明克里藻SCSIO‑46743在非诱导条件下，GABA含量占细胞干重的0.56％，相对于现有的GABA原料，具有非常明显的含量优势。

[0038] (3)本专利克里藻SCSIO‑46743在正常硝酸钠浓度(1.5g/L)的BG11培养基中采用柱式反应器培养，生物量可达3.35g/L。

[0039] (4)本发明克里藻SCSIO‑46743细胞中，氨基酸总量为30.97g/100g，所含有必需氨基酸种类齐全，9种必需氨基酸占总氨基酸的40％，蛋白质优质。

[0040] (5)本发明克里藻SCSIO‑46743通过液体培养获得，能在常见的淡水藻培养基中生长，不占用肥沃的土地，且环境适应性强，易于室外放大培养，降低原料养殖成本。

[0041] (6)本发明克里藻SCSIO‑46743是一株丝状真核微藻，相比其他GABA和积雪草酸的生产原料，其生长周期短，不受环境、地域、季节性等因素的影响，可根据原料缺口或者市场的需求快速做出养殖调整。

[0042] 保藏说明

[0043] 本发明的克里藻(Klebsormidium sp.)SCSIO‑46743，于2021年12月03日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为中国.武汉.武汉大学，邮编为：430072，保藏编号为：CCTCC NO：M 20211537。附图说明

[0044] 图1为克里藻SCSIO‑46743藻丝和细胞形态的光学显微镜图。

[0045] 图2为克里藻SCSIO‑46743基于18S rDNA序列的系统进化树。

[0046] 图3为克里藻SCSIO‑46743在不同硝酸钠浓度培养下的生物质干重变化。

[0047] 图4为克里藻SCSIO‑46743在不同硝酸钠浓度培养下的积雪草酸相对含量。

[0048] 为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明，但不是对本发明的限制。

[0049] 实施例1藻株克里藻SCSIO‑46743的分离鉴定

[0050] 样品采自广州市区山上的岩石，带回实验室后加入BG11培养基，在倒置显微镜下挑单藻丝置于96孔板进行单藻丝培养，直至水样呈现肉眼可见的浅绿色后，在无菌条件下采用涂布法对单藻丝培养后的培养物进行固体培养基分离纯化，涂布后平板置于弱光常温下培养15‑30天，重复多次上述分离步骤，直到获得无菌的目标藻落。

[0051] BG11培养基：

[0052] 去离子水中添加以下成分：硝酸钠1.5g/L，磷酸氢二钾0.04g/L，七水硫酸镁0.075g/L，二水氯化钙0.036g/L，柠檬酸0.006g/L，柠檬酸铁铵0.006g/L，EDTA二钠0.001g/L，微量元素A51 ml/L。

[0053] 微量元素A5成分组成：硼酸2.86g/L，二水氯化锰1.81g/L，七水硫酸锌0.222g/L，无水硫酸铜0.079g/L，二水钼酸钠0.390g/L，六水硝酸钴0.049g/L。

[0054] 克里藻(Klebsormidium sp.)SCSIO‑46743形态特征：不分枝的丝状体，由圆柱状的单列细胞构成，细胞宽5‑10μm，细胞长8‑20μm，色素体片状(图1)。

[0055] 从固体平板上挑取单藻落到含有20‑30mL BG11培养基的三角瓶中，置于光照培养架上光照培养，待到藻丝长到一定的浓度，离心收集藻细胞，采用植物DNA提取试剂盒(CTAB法)提取藻株DNA，以18S rDNA通用引物PCR扩增相关DNA序列，PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min 20s，52℃退火1min，72℃延伸2min，36个循环；最后72℃延伸10min。将PCR产物送至广州天一辉远基因科技有限公司测序，获得藻株的18S rRNA基因部分序列(cttttatactgtgaaactgcgaatggctcattaaatcagttatagtttatttgatggtaccttactactcggataaccgtagtaattctagagctaatacgtgcaccaaatcccgacttctggaagggacgtatttattagataaaaggccaatgcgggcttgcccggtattgcggtgaatcatgataactcgtcgaatcgcacggcctttgcgctggcgatgtttcattcaaatttctgccctatcaactttcgatggtaggatagaggcctaccatggtggtaacgggtgacggagaattagggttcgattccggagagggagcctgagaaacggctaccacatccaaggaaggcagcaggcgcgcaaattacccaatcctgatacagggaggtagtgacaataaataacaatgctgggcttttcaaagtctggcaattggaatgagtgcaatctaaatccctcaacgaggatccattggagggcaagtctggtgccagcagccgcggtaattccagctccaatagcgtatatttaagttgttgcagttaaaaagctcgtagttggattttgggttggggcagccggtccgcctcacggtgtgcaccggctgacccatccttcttgccggggacgcgctcctggccttaactggtcgggacgtggagtcggcgatgttactttgaaaaaattagagtgttcaaagcaggcctacgctctgaatacattagcatggaataacgtgataggactctggtcctattgtgttggtcttcgggaccggagtaatgattaatagggacagttggggatattcgtatttcattgtcagaggtgaaattcttggatttatgaaagacgaacttctgcgaaagcatttatcaaggatgttttcattaatcaagaacgaaagttgggggctcgaagacgatcagataccgtcctagtctcaaccataaacgatgccgactagggattggcggatgttaatttgatgactccgccagcaccttatgagaaatcaaagtttttgggttccggggggagtatggtcgcaaggctgaaacttaaaggaattgacggaagggcaccaccaggagtggagcctgcggcttaatttgactcaacacggggaaacttaccaggtccagacatagtaaggattgacagattgagagctctttcttgattctatgggtggtggtgcatggccgttcttagttggtggagtgatttgtctggttaattccgataacgaacgagacctcagcctgctaactagttacacgaagattcttctccgtggccaacttcttagagggactatttggcgtctacagccaatggaagtttgaggcaataacaggtctgtgatgcccttagatgttctgggccgcacgcgcgctacactgatgaattcaacgagtttataacctgggccgaaaggtctgggtaatcttgtgaaatttcatcgtgatggggatagattattgcaattattaatcttcaacgaggaattcctagtaagcgcgagtcatcagctcgcgttgattacgtccctgccctttgtacacaccgcccgtcgctcctaccgattgaatgatccggtgaagttttcggattgcggctactccggcggtccgc，具体如SEQ ID NO.1所示)，与NCBI数据库进行同源性比对，结果显示该藻株与克里藻(Klebsormidium elegans)相似性为100％，根据18S rRNA基因序列构建系统发育进化树，如图2所示，可以确定该藻株为克里藻，拉丁名Klebsormidium  sp.，属Charophytes门、Klebsormidiophyceae纲、Klebsormidiales目、Klebsormidiaceae科、Klebsormidium属。

[0056] 18s rDNA通用引物序列：

[0057] 18S‑F：5'CCAACCTGGTTGATCCTGCCAGTA3'，

[0058] 18S‑R：5'CCTTGTTAACGACTTCACCTTCCTCT3'。

[0059] 经过形态学、分子分类学的鉴定结果，本发明筛选到的藻株为克里藻(Klebsormidium sp.)，将其命名为克里藻(Klebsormidium sp.)SCSIO‑46743，于2021年12月03日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为中国.武汉.武汉大学，邮编为：430072，保藏编号为：CCTCC NO：M 20211537。

[0060] 实施例2藻株克里藻SCSIO‑46743的GABA含量

[0061] 将培养到对数期的克里藻SCSIO‑46743培养物静置沉淀后，去掉上清培养基，重新接种到1.2LBG‑11培养基中(接种量为0.26g/L)，将藻液倒入光径为6cm的柱式光生物反应2 1
器中培养。培养条件：光照强度为180‑200μmol/ms (在管子旁边不同位置检测到的光强范围)，温度为25±2℃，连续通入CO2含量为1％的气体。经过18天培养可以获得3.35g/L的生物质浓度(图3)，藻体生物质浓度测定采用干重法。该培养条件下氨基酸总量为30.97％，具体氨基酸种类及含量如表1所示，其中GABA含量为0.56％，产量为18.76mg/L。除了胱氨酸和色氨酸含量测定采用GBT18246‑2000方法，其他氨基酸含量测定采用GB5009.124‑2016方法。BG‑11培养基成分同实施例1所述。

[0062] 表1克里藻SCSIO‑46743的产氨基酸种类及其含量

[0063]

[0064]

[0065] 实施例3藻株克里藻SCSIO‑46743的积雪草酸相对含量

[0066] 将培养到对数期的克里藻SCSIO‑46743培养物静置沉淀后，去掉上清培养基，重新接种到1.2LBG‑11培养基中(接种量为0.26g/L)，将藻液倒入直径为6cm柱式光生物反应器2 1
中培养。培养条件：光照强度为180–200μmol/m s，温度为25±2℃，连续通入CO2含量为1％的气体培养。经过18天连续光照培养，生物质浓度为3.35g/L(图3)，测定方法同实施例2。在该培养条件下，培养至18天，细胞中积雪草酸占代谢物的提取物中可鉴定物质的1.15％(图
4)。所获得的藻细胞甲醇提取物经过液质联用(LC‑MS)非靶向代谢组学物质全鉴定，最终鉴定出部分代谢物，其中积雪草酸的相对含量以峰面积占样品中可鉴定代谢物峰面积之和的比值来表示。BG‑11培养基成分同实施例1所述。

[0067] 实施例4藻株克里藻SCSIO‑46743的积雪草酸相对含量

[0068] 将培养到对数期的克里藻SCSIO‑46743培养物静置沉淀后，去掉上清培养基，重新接种到1.2L氮限制的BG‑11培养基中(接种量为0.26g/L)，将藻液倒入光径为6cm柱式光生2 1
物反应器中培养。培养条件：光照强度为180‑200μmol/ms ；温度为25±2℃，连续通入CO2含量为1％的气体培养。经过18天连续光照培养，生物质浓度为3.48g/L(图3)，测定方法同实施例2。在该培养条件下，培养至18天，细胞中积雪草酸占代谢物的提取物中可鉴定物质的
3.69％(图4)，测定方法同实施例3。

[0069] 氮限制的BG‑11培养基：硝酸钠浓度为0.5g/L，培养基其他成分同实施例1所述。

[0070] 实施例5藻株克里藻SCSIO‑46743的积雪草酸相对含量

[0071] 将培养到对数期的克里藻SCSIO‑46743培养物静置沉淀后，去掉上清培养基，重新接种到1.2L氮限制的BG‑11培养基中(接种量为0.26g/L)，将藻液倒入光径为6cm的柱式光2 1
生物反应器中培养。培养条件：光照强度为180‑200μmol/m s，温度为25±2℃，连续通入CO2含量为1％的气体培养。经过18天连续光照培养，生物质浓度为3.23g/L(图3)，测定方法同实施例2。在该培养条件下，培养至18天，细胞中积雪草酸占代谢物的提取物中可鉴定物质的6.60％(图4)，测定方法同实施例3。

[0072] 氮限制的BG‑11培养基：硝酸钠浓度为0.3g/L，培养基其他成分同实施例1所述。

[0073] 以上实施实例对本发明不同的实施过程进行了详细的阐述，但是本发明的实施方式并不仅限于此。所述技术领域的普通技术人员依据本发明中公开的内容，均可实现本发明的目的。

[0074] 对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。