一种通过解脂耶氏酵母体外催化合成PGF2α的方法 |
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| 申请号 | CN202211114723.5 | 申请日 | 2022-09-14 | 公开(公告)号 | CN116144620A | 公开(公告)日 | 2023-05-23 |
| 申请人 | 湖南农业大学; | 发明人 | 刘虎虎; 何国威; 范潇; 王翀; 田云; 卢向阳; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种通过解脂耶氏 酵母 体外催化合成PGF2α（前列腺素F2α）的方法，其步骤为构建前列腺素H合成酶（PGHS）编码基因和前列腺素F2α合酶（PGFS）编码基因的表达模 块 ，通过一步组装整合到解脂耶氏酵母基因组上，工程菌经 发酵 、离心，收集菌体， 破碎 获得混合粗酶液；在含有血红素和色 氨 酸的 磷酸 盐 缓冲液中加入底物花生四烯酸和混合粗酶液反应，再加入 盐酸 终止反应，用乙酸乙酯萃取产物PGF2α，产量为3.828 mg/L。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种通过解脂耶氏酵母体外催化合成PGF2α的方法，其特征在于，包括： |
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| 说明书全文 | 一种通过解脂耶氏酵母体外催化合成PGF2α的方法技术领域背景技术[0002] 前列腺素属于类二十烷酸，它们包含20个碳原子，是一类含氧环戊烷衍生物。在人体内，花生四烯酸通过环氧化酶或者前列腺素合成酶被转化为前列腺素，包括PGH2、PGE2、15‑酮‑PGE2、PGD2、PGF2α、PGI2和血栓素A2。PGF2α在医学上的用途是作为引产药物，其次还用于治疗产后出血和青光眼。前列腺素最早从人精液中发现，在羊精囊中证实，广泛分布于机体各组织和体液中，后来应用的产品是从猪、羊等动物的精液或羊水中提取的，但生物体合成PGF2α产量极低。目前使用的多为人工化学合成，但化学合成法仍存在合成反应路线复杂、环境不友好、目标产物拆分困难、成本高等问题。 发明内容[0005] 为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种体外合成前列腺素F2α（PGF2α）的方法，通过解脂耶氏酵母体外催化合成PGF2α，包括如下步骤： 步骤1、构建前列腺素H合成酶（PGHS）编码基因和前列腺素F2α合酶（PGFS）编码基因的表达模块，通过同源重组整合到解脂耶氏酵母基因组上，工程菌经发酵、离心，收集菌体，破碎获得PGHS和PGFS混合酶；或按照相同方法获得PGHS的同工酶和PGFS的同工酶的混合酶；或按照相同方法获得PGHS和PGFS的同工酶的混合酶；或按照相同方法获得PGHS的同工酶和PGFS的混合酶； 步骤2、在含有血红素和色氨酸的缓冲液中加入底物花生四烯酸和混合酶，构成反应体系进行反应；所述反应体系中血红素占比0.1%‑0.3%；色氨酸占比5%‑15%；混合酶占比 50%‑70%；底物占比1%‑3%，其余为缓冲液占比15%‑25%； 步骤3、完成步骤2后再向缓冲液中加入盐酸终止反应，用乙酸乙酯萃取产物PGF2α。 [0006] 优选地，所述宿主细胞为解脂耶氏酵母，如解脂耶氏酵母Po1f细胞。 [0007] 优选地，所述缓冲液为磷酸盐浓度为50‑200mM的磷酸盐缓冲液。 [0008] 优选地，所述缓冲液中血红素的浓度为0.5‑3 μM、色氨酸的浓度为3‑7 mM；更优选地，所述缓冲液中血红素的浓度为2 μM、色氨酸的浓度为5 mM 。 [0011] 在本发明具体实施方案中，根据本发明前期研究结果，采用来源于真江蓠的前列腺素H合成酶（GvPGHS）编码基因和来源于布氏锥虫的前列腺素F2α合酶（TbPGFS）编码基因来获得对应的蛋白酶，该蛋白酶对于花生四烯酸有更好的催化效率。为了适应解脂耶氏酵母细胞，本发明对PGHS编码基因和PGFS编码基因进行了密码子优化，序列如 SEQ ID NO. 1、NO. 2所示。 [0012] 在本发明发酵实验中，所述PGHS以及PGFS在反应体系中入量为100‑300 μL，但在实际使用中，酶的用量加大会加快反应速度，有利于合成，酶的用量根据发酵规格进行调整。 [0013] 在本发明具体实施方式中，利用解脂耶氏酵母体外催化花生四烯酸产生了3.828 mg/L的PGF2α。 [0014] 本发明公开了体外花生四烯酸到前列腺素F2α的反应过程，依据该反应过程通过优化体外合成条件，直接以花生四烯酸为底物，通过两步酶催化，实现花生四烯酸的高效转化，合成纯度较高的前列腺素F2α，弥补微生物合成的低效率缺陷。本发明表明，通过获取关键酶，以花生四烯酸为底物合成PGF2α具有良好的前景和应用价值。附图说明 [0015] 图1所示为两步酶催化合成PGF2α的反应过程；图2所示为解脂耶氏酵母体外双酶催化合成PGF2α的产量； 图3所示体外合成PGF2α的LC‑MS鉴定结果。 具体实施方式[0016] 本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明所述方法已通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。 [0017] 以下就本发明所提供的一种通过解脂耶氏酵母体外催化合成PGF2α（前列腺素F2α）的方法做进一步说明。 [0018] 实施例1 来源于真江蓠的GvPGHS编码基因和来源于布氏锥虫的TbPGFS编码基因表达模块的构建：1. 经过针对解脂耶氏酵母密码子优化的GvPGHS编码基因（SEQ ID NO.1）和 TbPGFS编码基因（SEQ ID NO.2）由金唯智合成。 [0019] 2. 经过引物设计和PCR扩增，获得带有同源臂序列的各片段：GvPGHS编码基因，28s rDNA上游、启动子FBAp、终止子XPR2t。将这些片段与线性化载体片段混合，加入一步组装重组酶2 μL，Buffer 4μL，总体系20 μL。37℃连接30 min，10 μL连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态。筛选阳性转化子提取质粒，测序后PCR回收获得GvPGHS表达模块。 [0020] 3. 经过引物设计和PCR扩增，获得带有同源臂序列的各片段：TbPGFS编码基因，同源臂片段XPR2t、启动子TEFp、终止子LIP2t。将这些片段与线性化载体片段混合，加入一步组装重组酶2 μL，Buffer 4μL，总体系20 μL。37℃连接30 min，10 μL连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态。筛选阳性转化子提取质粒，测序后PCR回收获得TbPGFS表达模块。 [0021] 实施例2 解脂耶氏酵母无细胞代谢工程合成PGF2α：1. GvPGHS表达模块、TbPGFS表达模块及URA筛选标记模块共同转化解脂耶氏酵母Po1f（∆Ku70），筛选鉴定阳性转化子酵母菌株作为表达底盘细胞进行GvPGHS蛋白和TbPGFS蛋白表达。 [0022] 2. 阳性解脂耶氏酵母菌株发酵：种子液按5%接种量接种于5 mL的YPD液体培养基中，30 ℃，200 rpm摇菌24小时，为一级种子液；一级种子液按5%接种量接种于15 mL的YPD液体培养基中，30 ℃，200 rpm摇菌48小时，为二级种子液；二级种子液按5%接种量接种于50 mL的YNB发酵液体培养基中，30 ℃，200 rpm摇菌发酵72小时。离心收集菌体，100 mM Tris‑HCl缓冲液洗涤菌体两次。 [0023] 3. 菌体中加入10 mL 100 mM Tris‑HCl（pH=7.5）悬浮菌体；利用超声波破碎仪破碎菌体，超声仪探头置于液面下1 cm，功率455 W，超声4 s，间隔4 s，总时间30 min。 [0024] 4. 破碎后10000 rpm离心10 min，取上清，即得裂解GvPGHS、TbPGFS混合粗酶液。 [0025] 5. 体外催化体系如下：在100 μL 500 mM 磷酸钠缓冲液中加入1 mM血红素1 μL，50 mM色氨酸50 μL，100 mM底物花生四烯酸5 μL，混合粗酶液300μL，无菌水44 μL，共500 μL体系。37 ℃反应30 min。反应结束后加入1 mL乙酸乙酯。 [0026] 6. 结果：经上述步骤进行催化反应后，测得生成PGF2α3.828 mg/L。 |
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