一种前列腺素E1的合成方法 |
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申请号 | CN201510823186.5 | 申请日 | 2015-11-23 | 公开(公告)号 | CN105316384A | 公开(公告)日 | 2016-02-10 |
申请人 | 哈药集团生物工程有限公司; | 发明人 | 葛存慧; 庞睿; 吴贵海; 王晴; 任仲辉; 季伟鑫; 秦玮莹; 孙海波; 李生翀; 宋春娜; 张凯; 白宇; | ||||
摘要 | 本 发明 涉及一种前列腺素E1的制备方法,所述方法步骤如下:步骤1、从羊精囊中提取前列腺素湿酶步骤2、前列腺素湿酶进行酶促反应得到前列腺素E1粗品步骤3、粗品过柱纯化步骤4、重结晶精制。 | ||||||
权利要求 | 1.一种用羊精囊提取前列腺素E1的制备方法,其特征在于,所述方法步骤如下: |
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说明书全文 | 一种前列腺素E1的合成方法技术领域[0001] 本发明属于药物化合物的制备方法,具体涉及一种前列腺素E1的制备方法。技术背景 [0002] 前列腺素E1,结构如下: [0003] [0005] 前列腺素E1来自于20碳脂肪酸,是人体内存在的广谱性物质。其直接作用于血管平滑肌,扩张血管和提高血流量,改善微循环的灌注;并具有抑制血小板聚集和血栓A2生成,抑制动脉粥样硬化脂质斑块形成及免疫复合物的形成;能扩张外周血管和冠状血管,降低外周血管阻力和血压,防止血栓形成和保护血小板细胞,保护缺血心肌,缩小心肌梗死面积,抗心力衰竭;并能扩张肾血管,增加肾血流量,清除非蛋白氮,调节水钠平衡,具有利尿和保护肝脏、肾脏、肺脏等脏器功能的作用。同时具有扩张阴茎动脉、松弛阴茎海绵体平滑肌,加速阴茎动脉血流速的作用。1982年,来自英国的范恩博士以及来自瑞典的塞缪尔森博士和伯格斯壮博士因发现并研究前列地尔而获得诺贝尔生理医学奖。 [0006] 近年来,由于前列腺素E1的广泛临床应用范围,市场上对其的需求量逐年增加。现在,国际上已有诸如日、德、美等国家实现前列腺素E1原料药的大规模工业化生产,但在产品纯度及市场价格、运输成本等方面很难满足国内药品生产企业的生产诉求。与此同时,国内对前列腺素E1原料药的生产大多停留在实验室规模生产阶段,只有少部分能够实现工业化生产,而其中一部分则是运用的纯化学合成手段,他们生产的原料药产品纯度高,但生产工艺复杂,生产周期长;再有就是在生产过程中会涉及到大量的有机溶剂的使用及废液的处理等环境诸多问题。剩下一部分生产企业则是利用大型生物反应器在金属镍及哺乳动物体内的精囊中提取的生物酶联合催化下进行连续生产,这种生产模式大大降低了该产品的工艺复杂程度,同时也降低了有机试剂的使用量,但在其生产过程中大量的金属镍的使用,增加了人体对该原料药的致敏性风险,同时也大大增加了生产成本。 发明内容[0007] 本发明的目的是,提供一种简单有效,且更为实用的前列腺素E1原料药生产工艺,以达到降低原料成本,简化生产工艺,缩短生产周期,降低外源致敏性物质出现的风险,减少有机试剂排放的目的。 [0008] 本发明提供一种用羊精囊提取前列腺素E1的制备方法,所述方法步骤如下: [0009] 步骤1、前列腺素湿酶的提取: [0010] (1)取新鲜的羊精囊,除去脂肪、肌肉及结缔组织; [0011] (2)加入氯化钾水溶液,浸泡; [0013] (4)离心得到清液,过滤,滤液调pH为4-6; [0014] (5)离心得到的沉淀再次匀浆,离心得到清液,过滤,滤液调pH为4-6。 [0015] (6)混合步骤(4)和(5)得到的产物即为前列腺素湿酶; [0016] 步骤2、酶促反应: [0017] (1)前列腺素湿酶中加入分散液,调pH至7-8,加入还原型谷胱甘肽、对苯二酚、二高-γ-亚麻酸混合溶液,反应; [0018] (2)反应液调pH至4-5,离心得到沉淀,沉淀加入有机溶剂; [0019] (3)过滤,得到滤液,滤液回收有机溶剂得到浓缩液,加入缓冲液,调pH至8-9,加入石油醚萃取,得到水层,调pH至3-4,用乙醚萃取,醚层干燥; [0020] (4)干燥后的醚层经过滤后,减压蒸除溶剂,得前列地尔粗品。 [0021] 步骤3、纯化: [0023] (2)将前列地尔粗品用三氯甲烷溶解后加入硅胶柱中,加入三氯甲烷平衡,洗涤液洗涤,洗脱液洗脱,收集流出液; [0024] (3)蒸除溶剂,得一次纯化品; [0025] (4)将得到的一次纯化品重复步(1)~(3)步骤的纯化操作,得二次纯化品。步骤4、精制: [0026] (1)将前列地尔二次纯化品溶于乙酸乙酯中,过滤后,滤液析晶,过滤干燥得一次重结晶产品; [0027] (2)在此用乙酸乙酯重结晶得到二次重结晶产品; [0028] (3)二次重结晶产品干燥后得前列地尔精制产品。 [0029] 优选的,本发明的前列腺素E1的制备方法,步骤如下: [0030] 步骤1、前列腺素湿酶的提取: [0031] (1)取新鲜的羊精囊,除去多余脂肪、肌肉及结缔组织,速冻冷藏保存。 [0032] (2)取冷冻的羊精囊置于浓度为0.154mol/L的氯化钾水溶液中(以完全没过羊精囊为准),浸泡30~60min。 [0033] (3)将浸泡解冻后的羊精囊加入胶体磨中粉碎成匀浆。粉碎粒度在0.8mm左右的匀浆。 [0035] (5)将匀浆液离心后的沉淀再次匀浆得二次湿酶。 [0036] (7)将两次所得湿酶混合、称重,记录湿酶质量。 [0037] 步骤2、酶促反应: [0038] (1)将湿酶用磷酸盐/EDTA-2Na混合液分散,用1mol/L氢氧化钾溶液调pH至7.5±0.5,加入磷酸盐缓冲液溶解的还原型谷胱甘肽、对苯二酚、二高-γ-亚麻酸混合溶液,通氧气35-40℃反应0.5-1小时,反应完毕冷却至室温。 [0040] (3)抽滤丙酮分散液,滤饼用丙酮洗涤,合并滤液及洗涤液。减压蒸除溶剂(可回收重复利用),向浓缩液中加入pH 8.2的磷酸盐缓冲液,并用氢氧化钾溶液调pH至8.2±0.5,再用石油醚脱脂。水层用枸橼酸溶液调pH至3.2±0.5后,无水乙醚萃取。合并醚层,用纯化水洗涤,无水硫酸钠干燥醚层8小时以上。 [0041] (4)干燥后的醚层经过滤后,减压蒸除溶剂,得前列地尔粗品。 [0042] 步骤3、纯化: [0043] (1)200-300目硅胶活化后湿法装柱。 [0044] (2)将前列地尔粗品用三氯甲烷溶解后加入硅胶柱中,依次加入1倍柱体积的三氯甲烷平衡,3倍柱体积的洗涤液洗涤和5倍柱体积洗脱液洗脱,待洗脱液走完1个柱体积后开始收集流出液。 [0045] (3)将收集液减压蒸除溶剂,得一次纯化品。 [0046] (4)将得到的一次纯化品重复步骤(1)~步骤(3)操作,得二次纯化品。 [0047] 步骤4、精制: [0048] (1)将前列地尔二次纯化品按1g∶20ml比例溶于乙酸乙酯中,过滤后密封,室温下放置2~4h析出结晶,过滤所得结晶抽干后得一次重结晶产品。 [0049] (2)将一次重结晶产品按1g∶30ml比例溶于乙酸乙酯中,过滤后密封,室温放置2~4h析出结晶。过滤所得结晶用乙酸乙酯洗涤后抽干,得二次重结晶产品。 [0050] (3)将二次重结晶产品放入真空干燥箱内,在室温、-0.09MPa下真空干燥4h,得前列地尔精制产品。 [0051] 在本发明的上述方法中, [0052] 其中,步骤2、酶促反应中,各组分重量百分组成如下: [0053] [0054] 其中pH8.2磷酸盐缓冲液的制备如下:分别称取磷酸氢二钾44.0g,磷酸二氢钾1.5g,定容至1000ml。 [0055] 其中磷酸盐/EDTA-2Na混合液的制备如下:pH8.2磷酸盐缓冲液:0.125mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液(体积比)=9:1。 [0056] 其中,步骤3的纯化中,各组分的组成如下: [0057] 洗涤液:三氯甲烷:甲醇(体积比)=98:2 [0058] 洗脱液:三氯甲烷:甲醇(体积比)=96:4 [0059] 本发明的方法是经过筛选获得的,筛选过程如下: [0060] 1、在羊精囊的粉碎过程中,我们分析了粉碎粒度与产品总收率的关系。在保持其他工艺参数不变的基础上,设定羊精囊的粉碎粒度为1.5mm、1.0mm、0.8mm,通过三组平行试验将相同质量的羊精囊进行粉碎所得的最终产品收率进行比较,优选出羊精囊的粉碎度参数。其分析结果如下: [0061] 表一、羊精囊粉碎粒度实验结果 [0062]粉碎粒度1.5mm 粉碎粒度1.0mm 粉碎粒度0.8mm 实验组1 18.1% 20.2% 20.9% 实验组2 17.5% 19.5% 20.2% 实验组3 18.4% 20.0% 20.5% [0063] 由上表结果可知,随着羊精囊粉碎度的提高,产品收率也相应提高,所以最终选择将羊精囊粉碎至0.8mm。 [0064] 2、在湿酶提取过程中,我们研究了不同离心条件对湿酶的提取收率的影响。 [0065] 表二、离心条件实验结果 [0066]离心转速(r/min) 离心时间(min) 湿酶收率 1 2000 10 8.6% 2 2000 20 12.9% 3 2000 30 14.2% 4 3000 10 17.8% 5 3000 20 19.0% 6 3000 30 19.7% 7 4000 10 20.1% 8 4000 20 20.6% 9 4000 30 20.7% [0067] 上表正交试验得出的结果表明,在转速为2000r/min及3000r/min时,羊精囊匀浆液中的悬浮物不能达到有效的分离效果;当转速为4000r/min时,离心20min时及30min时的湿酶收率相差仅为0.1%,在可接受范围之内。所以最终确定离心条件为转速4000r/min以上,离心20min。 [0068] 3、在产品纯化时,我们还考察了柱层析时的洗涤液及洗脱液不同配制比例的纯化洗脱效果。通过调整两次纯化过程中洗涤液及洗脱液中三氯甲烷与甲醇的配制比例,检测两次纯化后所得产品的收率及含量,进行最终比较得出结果如下: [0069] 表三、纯化过程洗涤液及洗脱液配制比例实验结果 [0070]洗涤液 洗脱液 纯化收率 含量 1 97:3 95:5 48.9% 93.1% 2 97:3 96:4 47.5% 93.6% 3 97:3 97:3 40.3% 94.2% 4 98:2 95:5 76.0% 90.2% 5 98:2 96:4 75.7% 94.4% 6 98:2 97:3 72.1% 94.7% 7 99:1 95:5 85.8% 72.9% 8 99:1 96:4 82.5% 79.4% 9 99:1 97:3 77.4% 80.7% [0071] 通过以上筛选结果,对两次纯化后的产品收率及含量进行综合分析考量后,选择洗涤液配制比例为98:2;洗脱液配制比例为96:4。 [0072] 以上通过实验数据说明本发明的有益效果。 [0073] 和现有技术相比,本发明的有关数据列表如下: [0074]收率a 含量 颜色 总杂 最大单种杂质 本发明实施例1方法 18.4% 99.7% 白色结晶 0.3% 0.1% 本发明实施例2方法 18.9% 99.8% 白色结晶 0.2% 0.1% 现有技术1文献 15.7% 96.0% 白色晶体 0.8% 0.4% 现有技术2文献 16.2% 97.5% 白色晶体 0.7% 0.2% 现有技术3文献 16.4% 99.0% 白色晶体 0.5% 0.3% [0075] a、本发明实例中涉及的收率均以二高-γ-亚麻酸用量计算 [0076] 从上表可知,本发明的方法优于现有技术。 [0077] 本发明的优点还在于: [0078] 1、本发明通过优化合成反应步骤,降低了合成操作的技术难度,利用生物酶催化合成前列腺素E1原料药,提高产品收率。 [0079] 2、本发明涉及的生产工艺均由简单设备仪器完成,全过程不涉及大型机械设备;操作方法简单,少量人员即可完成所有操作,进一步降低了产品的前期投入。 [0080] 3、本发明所述生产工艺过程中,不涉及重金属物质催化,并且化学试剂使用量较小,降低了外源致敏性物质出现的风险,减少有机试剂的排放。 具体实施方式[0081] 以下通过实施例进一步说明本发明。 [0082] 实施例1: [0083] 1、前列腺素酶的提取: [0084] (1)新鲜冷冻羊精囊用0.154mol/L氯化钾溶液浸泡60min。 [0085] (2)将羊精囊用胶体磨粉碎至0.8mm左右。 [0086] (3)匀浆液离心后,取上清液调pH=5.4,离心得一次湿酶。 [0087] (4)将匀浆液离心后的沉淀再次匀浆得二次湿酶。 [0088] (5)将两次所得湿酶混合、称重,记录湿酶质量。 [0089] 2、酶促反应: [0090] 前列腺素E1的原料配方,该配方按重量组成: [0091] [0092] (1)将湿酶用磷酸盐/EDTA-2Na混合液分散,调pH至7.8,加入磷酸盐缓冲液溶解的还原型谷胱甘肽、对苯二酚、二高-γ-亚麻酸混合溶液参与反应。 [0093] (2)调pH至4.3,离心后滤除上清液,沉淀用丙酮分散。 [0094] (3)抽滤分散液,滤饼用丙酮洗涤,合并滤液及洗涤液。减压蒸除溶剂,水层调pH至8.2,用石油醚脱脂后,调pH至3.2,用无水乙醚萃取。合并醚层,用纯化水洗涤,并干燥8小时以上。 [0095] (4)干燥后的醚层经过滤后,减压蒸除溶剂,得前列地尔粗品。 [0096] 3、纯化: [0097] (1)将前列地尔粗品加入硅胶柱中,待洗脱液走完1个柱体积后开始收集流出液。 [0098] (2)将收集液减压蒸除溶剂,得一次纯化品。 [0099] (3)将得到的一次纯化品重复上述步骤,得二次纯化品。 [0100] 4、精制: [0101] (1)将前列地尔二次纯化品溶于乙酸乙酯中,过滤后室温下放置,待析出结晶后过滤,所得结晶抽干后得一次重结晶产品。 |