[0001] 本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及高活力高热稳定性褐藻胶裂解酶突变体及应用。

[0002] 褐藻胶裂解酶是一种多糖裂解酶，可通过β‑消除机制特异性裂解海洋多糖褐藻胶获得褐藻寡糖(Alginate oligosaccharides,AOS)。随着对褐藻胶裂解酶研究的深入，其开发利用也愈加广泛，褐藻胶裂解酶不仅可以高效降解褐藻胶，还可用于发酵生产乙醇、海藻废物处理、医疗等领域，是海洋资源开发利用过程中不可或缺的工具酶。褐藻胶裂解酶主要来源于海洋细菌、土壤细菌、真菌等微生物。已从自然界中筛选出多个产褐藻胶裂解酶的菌株，产酶量低、酶活性低下，限制了该酶的应用。因此，进一步挖掘性能优越的的褐藻胶裂解酶，提高其催化性能，是拓展该酶应用的重要途径。

[0003] 为了使已发掘的褐藻胶裂解酶更好的被运用于工业生产，满足工业生产所需的高催化效率和高耐热性，关于褐藻胶裂解酶的分子改造研究越来越多，如定点突变、定点饱和突变、多结构域酶的组装与截断以及计算机指导下的理性突变等，这些方法通过在蛋白质结构的适当位置引入有利的生物物理性质来稳定蛋白质，对其进行合理设计以克服其自身缺陷。计算机指导下的理性突变避免了残基突变的盲目性，具有简便、高效、适用性广等优势，可用于蛋白质等生物大分子的精准定向设计和优化。

[0004] 本发明的目的在于提供高活力高热稳定性褐藻胶裂解酶突变体，所述的褐藻胶裂解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.17所示。

[0005] 本发明的另一个目的在于提供高活力高热稳定性褐藻胶裂解酶突变体在制备褐藻寡糖中的应用。

[0006] 为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：

[0007] 来源于黄杆菌的褐藻胶裂解酶alyA(编码的蛋白为SEQ ID NO.1所示)，申请人将原始信号肽替换为在地衣芽胞杆菌中高效分泌蛋白的信号肽SPsacC(编码的蛋白为SEQ ID NO.2所示)，获得更换了信号肽的褐藻胶裂解酶，进一步的，将该褐藻胶裂解酶的第76、120、155、263位氨基酸分别替换为S、T、L、E，获得褐藻胶裂解酶四突变体T76S‑K120T‑Y155L‑Q263E(SEQ ID NO.17所示)。

[0008] 本发明的保护范围还包括：

[0009] 编码SEQ ID NO.17所示蛋白的基因；

[0010] 含有上述基因的表达载体；

[0011] 表达含有SEQ ID NO.17所示蛋白的重组微生物；

[0012] 上述物质在制备褐藻胶裂解酶中的应用；

[0013] 上述物质在制备褐藻寡糖中的应用。

[0014] 褐藻胶裂解酶四突变体的制备方法，包括：将编码SEQ ID NO.17所示蛋白的基因插入表达载体，转化进地衣芽胞杆菌BL10进行发酵表达。

[0015] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：

[0016] 野生型褐藻胶裂解酶热稳定性较差，尤其当温度超过60℃，酶分子会迅速失活，不利于在高温环境工艺下生产，难以大规模生产。本发明对褐藻胶裂解酶进行分子改造，通过预测褐藻胶裂解酶进化位点，将单个位点氨基酸替换为促使褐藻胶裂解酶结构更加稳定的氨基酸，对褐藻胶裂解酶的酶活有一定的提升作用。本发明构建的突变株有效促进了褐藻胶裂解酶的高效表达并获得一种耐高温的褐藻胶裂解酶突变体，为褐藻胶裂解酶的大规模生产及应用提供理论基础。

[0017] 下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明，但本发明不只限于这些实施例，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围，本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。本发明的高活力高热稳定性褐藻胶裂解酶突变体，可采用直接合成的方式获得，或是通过构建高活力高热稳定性褐藻胶裂解酶突变体的工程菌株并发酵获得。

[0018] 实施例1：

[0019] 褐藻胶裂解酶原始序列第76位氨基酸突变体的表达：

[0020] 以来源于黄杆菌的褐藻胶裂解酶alyA(编码的蛋白质为SEQ ID NO.1所示)为模板，将原始信号肽替换为适合地衣芽胞杆菌中高效分泌蛋白的信号肽SPsacC(编码的蛋白为SEQ ID NO.2)所示，将其原始氨基酸序列的第76位氨基酸由T变为S、Q或Y中任意一种氨基酸，获得3个褐藻胶裂解酶的突变体T76S(SEQ ID NO.3)、T76Q(SEQ ID NO.4)、T76Y(SEQ ID NO.5)。

[0021] 在本发明中，用以下方式获得上述三种突变体：

[0022] 在载体pHY300PLK的XbaⅠ和EcoRⅠ酶切位点中间插入以PPrbs6+ykza启动子介导、淀粉酶终止子TamyL终止的褐藻胶裂解酶基因alyA，基因alyA加上启动子和终止子的序列为SEQ ID NO.18所示，所得载体为pHY‑alyA，以质粒pHY‑alyA为模板使用设计的突变引物，扩增突变体骨架。

[0023] 突变载体pHY‑alyA‑T76S的引物如下：

[0024] T76S‑KF：GGAGTAACCACGGCTAATAGTCATTATTCTCGTTCCGAG

[0025] T76S‑KR：CTCGGAACGAGAATAATGACTATTAGCCGTGGTTACTCC

[0026] 突变载体pHY‑alyA‑T76Q的引物如下：

[0027] T76Q‑KF：GGAGTAACCACGGCTAATCAACATTATTCTCGTTCCGAG

[0028] T76Q‑KR：CTCGGAACGAGAATAATGTTGATTAGCCGTGGTTACTCC

[0029] 突变载体pHY‑alyA‑T76Y的引物如下：

[0030] T76Y‑KF：GGAGTAACCACGGCTAATTACCATTATTCTCGTTCCGAG

[0031] T76Y‑KR：CTCGGAACGAGAATAATGGTAATTAGCCGTGGTTACTCC

[0032] 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，将正确的条带通过胶回收试剂盒分别回收，用同源重组连接酶将线状质粒两头拼接起来并同步转化进入大肠杆菌内，经抗性平板和PCR验证筛选阳性菌株。再抽取质粒送测，将测序正确的质粒(pHY‑alyA‑T76S、pHY‑alyA‑T76Q和pHY‑alyA‑T76Y)和模板质粒(pHY‑alyA)通过电穿孔法分别转化进地衣芽胞杆菌BL10(CN104630123A，CCTCC NO：M2013400)中，再次经抗性平板和PCR筛选获得褐藻胶裂解酶突变体重组表达菌株BL10/alyA‑T76S、BL10/alyA‑T76Q、BL10/alyA‑T76Y和对照菌株BL10/alyA。

[0033] 将以上重组表达菌株和对照菌株接种于四环素抗性平板上，37℃培养12h，挑取单菌落接种于5mL的LB培养基中，37℃、230rpm/min培养12h，接1mL菌液至50mL的LB种子液中，37℃、230rpm/min培养12h左右至OD600达到4.0‑4.5，将种子液以3％的接种量接进30mL玉米浆培养基中，37℃、230rpm/min培养48h。取发酵液2mL，12000rpm/min、10min离心，取上清稀释到合适倍数，采用DNS法测酶活。

[0034] LB培养基：蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、酵母粉5g/L

[0035] 褐藻胶裂解酶发酵培养基：大豆蛋白胨10g/L、骨蛋白胨10g/L、玉米浆离心液10g/L、酵母粉15g/L、磷酸氢二钾3g/L、硫酸铵6g/L、葡萄糖20g/L、氯化钠10g/L、氯化钙0.66g/L，pH调至7.0，每瓶装液量30mL

[0036] 采用DNS法检测褐藻胶裂解酶酶活力，实验结果如下：

[0037]

[0038]

[0039] 由上表可以得，第76位氨基酸由T变为S、Q或Y中任意一种氨基酸，褐藻胶裂解酶酶活至少提高了45.39％。

[0040] 实施例2：

[0041] 褐藻胶裂解酶原始序列第120位氨基酸突变体的表达：

[0042] 以来源于黄杆菌的褐藻胶裂解酶alyA为模板，将原始信号肽替换为适合地衣芽胞杆菌中高效分泌蛋白的信号肽SPsacC(SEQ ID NO.2)所示，将其原始氨基酸序列的第120位氨基酸由K变为T、A或I中任意一种氨基酸，获得3个褐藻胶裂解酶的突变体K120T(SEQ ID NO.6)、K120A(SEQ ID NO.7)、K120I(SEQ ID NO.8)。本发明的具体制备方式如下：

[0043] 在载体pHY300PLK的XbaⅠ和EcoRⅠ酶切位点中间插入以PPrbs6+ykza启动子介导、淀粉酶终止子TamyL终止的褐藻胶裂解酶基因alyA，所得载体为pHY‑alyA，以质粒pHY‑alyA为模板使用设计的突变引物，扩增突变体骨架。

[0044] 突变载体pHY‑alyA‑K120T的引物如下：

[0045] K120T‑KF：TCAAAAGAGCCGGATGGCACCTACAGCCGCGTCATTATC

[0046] K120T‑KR：GATAATGACGCGGCTGTAGGTGCCATCCGGCTCTTTTGA

[0047] 突变载体pHY‑alyA‑K120A的引物如下：

[0048] K120A‑KF：TCAAAAGAGCCGGATGGCGCATACAGCCGCGTCATTATC

[0049] K120A‑KR：GATAATGACGCGGCTGTATGCGCCATCCGGCTCTTTTGA

[0050] 突变载体pHY‑alyA‑K120I的引物如下：

[0051] K120I‑KF：TCAAAAGAGCCGGATGGCATTTACAGCCGCGTCATTATC

[0052] K120I‑KR：GATAATGACGCGGCTGTAAATGCCATCCGGCTCTTTTGA

[0053] 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，将正确的条带通过胶回收试剂盒分别回收，用同源重组连接酶将线状质粒两头拼接起来并同步转化进入大肠杆菌内，经抗性平板和PCR验证筛选阳性菌株。再抽取质粒送测，将测序正确的质粒(pHY‑alyA‑K120T、pHY‑alyA‑K120A和pHY‑alyA‑K120I)和模板质粒(pHY‑alyA)通过电穿孔法分别转化进地衣芽胞杆菌BL10(CN104630123A，CCTCC NO：M2013400)中，再次经抗性平板和PCR筛选获得褐藻胶裂解酶突变体重组表达菌株BL10/alyA‑K120T、BL10/alyA‑K120A、BL10/alyA‑K120I和对照菌株BL10/alyA。

[0054] 将以上重组表达菌株和对照菌株接种于四环素抗性平板上，37℃培养12h，挑取单菌落接种于5mL的LB培养基中，37℃、230rpm/min培养12h，接1mL菌液至50mL的LB种子液中，37℃、230rpm/min培养12h左右至OD600达到4.0‑4.5，将种子液以3％的接种量接进30mL玉米浆培养基中，37℃、230rpm/min培养48h。取发酵液2mL，12000rpm/min、10min离心，取上清稀释到合适倍数，采用DNS法测酶活。

[0055] LB培养基：蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、酵母粉5g/L；

[0056] 褐藻胶裂解酶发酵培养基：大豆蛋白胨10g/L、骨蛋白胨10g/L、玉米浆离心液10g/L、酵母粉15g/L、磷酸氢二钾3g/L、硫酸铵6g/L、葡萄糖20g/L、氯化钠10g/L、氯化钙0.66g/L，pH调至7.0，每瓶装液量30mL。

[0057] 采用DNS法检测褐藻胶裂解酶酶活力，实验结果如下：

[0058]

[0059] 由上表可以得，第120位氨基酸由K变为T、A或I中任意一种氨基酸，褐藻胶裂解酶酶活至少提高了47.51％。

[0060] 实施例3：

[0061] 褐藻胶裂解酶原始序列第155位氨基酸突变体的表达：

[0062] 以来源于枯草芽胞杆菌的褐藻胶裂解酶alyA为模板，将原始信号肽替换为适合地衣芽胞杆菌中高效分泌蛋白的信号肽SPsacC(SEQ ID NO.2)所示，将其原始氨基酸序列的第155位氨基酸由Y变为L、W或V中任意一种氨基酸，获得3个褐藻胶裂解酶的突变体Y155L(SEQ ID NO.9)、Y155W(SEQ ID NO.10)、Y155V(SEQ ID NO.11)。本发明的具体制备方式如下：

[0063] 在载体pHY300PLK的XbaⅠ和EcoRⅠ酶切位点中间插入以PPrbs6+ykza启动子介导、淀粉酶终止子TamyL终止的褐藻胶裂解酶基因alyA，所得载体为pHY‑alyA，以质粒pHY‑alyA为模板使用设计的突变引物，扩增突变体骨架。

[0064] 突变载体pHY‑alyA‑Y155L的引物如下：

[0065] Y155L‑KF：CCGCCTATTTTGAAAGTCCTTTGGGATAAAGGAAAGATT

[0066] Y155L‑KR：AATCTTTCCTTTATCCCAAAGGACTTTCAAAATAGGCGG

[0067] 突变载体pHY‑alyA‑Y155W的引物如下：

[0068] Y155W‑KF：CCGCCTATTTTGAAAGTCTGGTGGGATAAAGGAAAGATT

[0069] Y155W‑KR：AATCTTTCCTTTATCCCACCAGACTTTCAAAATAGGCGG

[0070] 突变载体pHY‑alyA‑Y155V的引物如下：

[0071] Y155V‑KF：CCGCCTATTTTGAAAGTCGTTTGGGATAAAGGAAAGATT

[0072] Y155V‑KR：AATCTTTCCTTTATCCCAAACGACTTTCAAAATAGGCGG

[0073] 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，将正确的条带通过胶回收试剂盒分别回收，用同源重组连接酶将线状质粒两头拼接起来并同步转化进入大肠杆菌内，经抗性平板和PCR验证筛选阳性菌株。再抽取质粒送测，将测序正确的质粒(pHY‑alyA‑Y155L、pHY‑alyA‑Y155W和pHY‑alyA‑Y155V)和模板质粒(pHY‑alyA)通过电穿孔法分别转化进地衣芽胞杆菌BL10(CN104630123A，CCTCC NO：M2013400)中，再次经抗性平板和PCR筛选获得褐藻胶裂解酶突变体重组表达菌株BL10/alyA‑Y155L、BL10/alyA‑Y155W、BL10/alyA‑Y155V和对照菌株BL10/alyA。

[0074] 将以上重组表达菌株和对照菌株接种于四环素抗性平板上，37℃培养12h，挑取单菌落接种于5mL的LB培养基中，37℃、230rpm/min培养12h，接1mL菌液至50mL的LB种子液中，37℃、230rpm/min培养12h左右至OD600达到4.0‑4.5，将种子液以3％的接种量接进30mL玉米浆培养基中，37℃、230rpm/min培养48h。取发酵液2mL，12000rpm/min、10min离心，取上清稀释到合适倍数，采用DNS法测酶活。

[0075] LB培养基：蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、酵母粉5g/L

[0076] 褐藻胶裂解酶发酵培养基：大豆蛋白胨10g/L、骨蛋白胨10g/L、玉米浆离心液10g/L、酵母粉15g/L、磷酸氢二钾3g/L、硫酸铵6g/L、葡萄糖20g/L、氯化钠10g/L、氯化钙0.66g/L，pH调至7.0，每瓶装液量30mL。采用DNS法检测褐藻胶裂解酶酶活力，实验结果如下：

[0077]

[0078]

[0079] 由上表可以得，将第155位氨基酸由Y变为L、W或V中任意一种氨基酸，褐藻胶裂解酶酶活至少提高了47.27％。

[0080] 实施例4：

[0081] 褐藻胶裂解酶原始序列第263位氨基酸突变体的表达：

[0082] 以来源于枯草芽胞杆菌的褐藻胶裂解酶alyA为模板，将原始信号肽替换为适合地衣芽胞杆菌中高效分泌蛋白的信号肽SPsacC(SEQ ID NO.2)所示，将其原始氨基酸序列的第263位氨基酸由Q变为E、D或C中任意一种氨基酸，获得3个褐藻胶裂解酶的突变体Q263E(SEQ ID NO.12)、Q263D(SEQ ID NO.13)、Q263C(SEQ ID NO.14)。本发明的具体制备方式如下：

[0083] 在载体pHY300PLK的XbaⅠ和EcoRⅠ酶切位点中间插入以PPrbs6+ykza启动子介导、淀粉酶终止子TamyL终止的褐藻胶裂解酶基因alyA，所得载体为pHY‑alyA，以质粒pHY‑alyA为模板使用设计的突变引物，扩增突变体骨架。

[0084] 突变载体pHY‑alyA‑Q263E的引物如下：

[0085] Q263E‑KF：GCAAAGGTAAAAATCTATTCTCTTGAAGTTACTCATTAA

[0086] Q263E‑KR：TTAATGAGTAACTTCAAGAGAATAGATTTTTACCTTTGC

[0087] 突变载体pHY‑alyA‑Q263D的引物如下：

[0088] Q263D‑KF：GCAAAGGTAAAAATCTATTCTCTTGACGTTACTCATTAA

[0089] Q263D‑KR：TTAATGAGTAACGTCAAGAGAATAGATTTTTACCTTTGC

[0090] 突变载体pHY‑alyA‑Q263C的引物如下：

[0091] Q263C‑KF：GCAAAGGTAAAAATCTATTCTCTTTGCGTTACTCATTAA

[0092] Q263C‑KR：TTAATGAGTAACGCAAAGAGAATAGATTTTTACCTTTGC

[0093] 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，将正确的条带通过胶回收试剂盒分别回收，用同源重组连接酶将线状质粒两头拼接起来并同步转化进入大肠杆菌内，经抗性平板和PCR验证筛选阳性菌株。再抽取质粒送测，将测序正确的质粒(pHY‑alyA‑Q263E、pHY‑alyA‑Q263D和pHY‑alyA‑Q263C)和模板质粒(pHY‑alyA)通过电穿孔法分别转化进地衣芽胞杆菌BL10(CN104630123A，CCTCC NO：M2013400)中，再次经抗性平板和PCR筛选获得褐藻胶裂解酶突变体重组表达菌株BL10/alyA‑Q263E、BL10/alyA‑Q263D、BL10/alyA‑Q263C和对照菌株BL10/alyA。

[0094] 将以上重组表达菌株和对照菌株接种于四环素抗性平板上，37℃培养12h，挑取单菌落接种于5mL的LB培养基中，37℃、230rpm/min培养12h，接1mL菌液至50mL的LB种子液中，37℃、230rpm/min培养12h左右至OD600达到4.0‑4.5，将种子液以3％的接种量接进30mL玉米浆培养基中，37℃、230rpm/min培养48h。取发酵液2mL，12000rpm/min、10min离心，取上清稀释到合适倍数，采用DNS法测酶活。

[0095] LB培养基：蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、酵母粉5g/L

[0096] 褐藻胶裂解酶发酵培养基：大豆蛋白胨10g/L、骨蛋白胨10g/L、玉米浆离心液10g/L、酵母粉15g/L、磷酸氢二钾3g/L、硫酸铵6g/L、葡萄糖20g/L、氯化钠10g/L、氯化钙0.66g/L，pH调至7.0，每瓶装液量30mL。采用DNS法检测褐藻胶裂解酶酶活力，实验结果如下：

[0097]

[0098] 由上表可以得，将第263位氨基酸由Q变为E、D或C中任意一种氨基酸，褐藻胶裂解酶酶活至少提高了42.28％。

[0099] 实施例5：

[0100] 褐藻胶裂解酶四位点突变体的表达：

[0101] 以T76S(SEQ ID NO.3)模板，将其原始氨基酸序列的第120位氨基酸由K变为T，构建褐藻胶裂解酶双位点突变载体T76S‑K120T(SEQ ID NO.15)。再以T76S‑K120T为模板，将其原始氨基酸的第155位氨基酸由Y变为L，获得褐藻胶裂解酶三位点突变体T76S‑K120T‑Y155L(SEQ ID NO.16)。再以T76S‑K120T‑Y155L为模板，将其原始氨基酸的第263位氨基酸由Q变为E，获得褐藻胶裂解酶四位点突变体T76S‑K120T‑Y155L‑Q263E(SEQ ID NO.17所示)。本发明的具体制备方式如下：

[0102] 在载体pHY300PLK的XbaⅠ和EcoRⅠ酶切位点中间插入以PPrbs6+ykza启动子介导、淀粉酶终止子TamyL终止的褐藻胶裂解酶基因alyA，所得载体为pHY‑alyA，以质粒pHY‑alyA为模板使用设计的突变引物，扩增突变体骨架。

[0103] 突变载体pHY‑alyA‑T76S的引物如下：

[0104] T76S‑KF：GGAGTAACCACGGCTAATAGTCATTATTCTCGTTCCGAG

[0105] T76S‑KR：CTCGGAACGAGAATAATGACTATTAGCCGTGGTTACTCC

[0106] 突变载体pHY‑alyA‑T76S‑K120T的引物如下：

[0107] T76S‑K120T‑KF：GGAGTAACCACGGCTAATAGTCATTATTCTCGTTCCGAG

[0108] T76S‑K120T‑KR：GATAATGACGCGGCTGTAGGTGCCATCCGGCTCTTTTGA

[0109] 突变载体pHY‑alyA‑T76S‑K120T‑Y155L的引物如下：

[0110] T76S‑K120T‑Y155L‑KF：GGAGTAACCACGGCTAATAGTCATTATTCTCGTTCCGAG T76S‑K120T‑Y155L‑KR：AATCTTTCCTTTATCCCAAAGGACTTTCAAAATAGGCGG突变载体pHY‑alyA‑T76S‑K120T‑Y155L‑Q263E的引物如下：

[0111] T76S‑K120T‑Y155L‑Q263E‑KF:GGAGTAACCACGGCTAATAGTCATTATTCTCGTTCC GAG[0112] T76S‑K120T‑Y155L‑Q263E‑KR:TTAATGAGTAACTTCAAGAGAATAGATTTTTACCTT TGC[0113] 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，将正确的条带通过胶回收试剂盒分别回收，用同源重组连接酶将线状质粒两头拼接起来并同步转化进入大肠杆菌内，经抗性平板和PCR验证筛选阳性菌株。再抽取质粒送测，将测序正确的质粒(pHY‑alyA‑T76S‑K120T‑Y155L‑Q263E)和模板质粒(pHY‑alyA)通过电穿孔法分别转化进地衣芽胞杆菌BL10(CN104630123A，CCTCC NO：M2013400)中，再次经抗性平板和PCR筛选获得褐藻胶裂解酶四位点突变重组菌株BL10/alyA‑T76S‑K120T‑Y155L‑Q263E和对照菌株BL10/alyA。将以上重组表达菌株和对照菌株接种于四环素抗性平板上，37℃培养12h，挑取单菌落接种于5mL的LB培养基中，37℃、230rpm/min培养12h，接1mL菌液至50mL的LB种子液中，37℃、230rpm/min培养12h左右至OD600达到4.0‑4.5，将种子液以3％的接种量接进30mL玉米浆培养基中，37℃、230rpm/min培养48h。取发酵液2mL，12000rpm/min、10min离心，取上清稀释到合适倍数，采用DNS法测酶活。

[0114] 为了检测该突变体的整体热稳定性，取适量上清于60℃水浴处理30min后立即取出置于冰上，将未处理和热处理的发酵液稀释至相应倍数，采用DNS法检测褐藻胶裂解酶酶活。

[0115] LB培养基：蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、酵母粉5g/L；

[0116] 褐藻胶裂解酶发酵培养基：大豆蛋白胨10g/L、骨蛋白胨10g/L、玉米浆离心液10g/L、酵母粉15g/L、磷酸氢二钾3g/L、硫酸铵6g/L、葡萄糖20g/L、氯化钠10g/L、氯化钙0.66g/L，pH调至7.0，每瓶装液量30mL。

[0117] 采用DNS法检测褐藻胶裂解酶酶活力，实验结果如下：

[0118]

[0119] 由上表可以得，将第76、120、155、263位氨基酸分别替换为S、T、L、E，所得的褐藻胶裂解酶突变体酶活提高了87.41％，在60℃下热处理30min，相对剩余酶活还有75.54％，褐藻胶裂解酶四位点突变体的的酶活、热稳定性以及半衰期都有明显提高。