具有抗氧化活性的化合物、制备方法及其应用 |
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| 申请号 | CN202410018904.0 | 申请日 | 2024-01-05 | 公开(公告)号 | CN117903079A | 公开(公告)日 | 2024-04-19 |
| 申请人 | 湖北大学; | 发明人 | 胡琳珍; 孔璐琦; 黄月虹; 戴蓉蓉; 汪伊兰; 谢斯逵; 张志鹏; 王嘉豪; | ||||
| 摘要 | 本 申请 公开了具有抗 氧 化活性的化合物、制备方法及其应用。采取青霉菌和链格孢菌两株菌共培养的方式能够产生具有抗氧化活性的化合物，通过改变培养基、培养条件及混合培养比例，挖掘了 微 生物 合成次生代谢产物的能 力 ，在工艺可重复与可持续发展的 基础 上能进行放大培养。所述化合物具有抗氧化活性，可用于制备抗氧化药物， 治疗 氧化损伤所致的相关 疾病 。 | ||||||
| 权利要求 | 1.具 有 抗 氧 化 活 性 的 化 合 物 ，其 特 征 在 于 ，所 述 化 合 物 包 括 如所述化合物的立体异构体、互变异构体或其药学上可接受的 |
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| 说明书全文 | 具有抗氧化活性的化合物、制备方法及其应用技术领域[0001] 本申请涉及医药技术领域，尤其涉及具有抗氧化活性的化合物、制备方法及其应用。 背景技术[0002] 机体在遭受各种有害刺激时，往往导致体内高活性分子如活性氧自由基(ROS)和活性氮自由基(RNS)产生过多，被氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤。由于过量的ROS可以直接或间接氧化或损伤DNA、蛋白质和脂质，诱发基因的突变、蛋白质变性和脂质过氧化，引起的细胞和组织的生理和病理反应，导致各种疾病如神经退行性疾病、心脑血管疾病、糖尿病和恶性肿瘤疾病等的发生。 [0003] 抗氧化剂可以对抗氧化应激，调节体内的氧化还原平衡，在维持人类健康方面发挥着关键作用。内源性抗氧化防御系统如酶促作用、金属螯合作用和自由基清除等负责维持这种动态平衡。在遭受病原体入侵或其他各种有害刺激时，机体内源性抗氧化防御系统往往无法及时清除体内过多的ROS，则需要有效的外源性抗氧化剂进行ROS的及时清除。 [0004] 天然产物是小分子药物的重要资源库。然而，从传统植物中挖掘天然产物存在资源匮乏、量效甚微等诸多缺陷。而且，不同产地的同种植物，往往存在次生代谢产物成分及含量相差较大等问题，导致活性成分通常难以重现。自20世纪以来，科学家们对微生物进行了广泛的次生代谢产物研究，陆续发现了许多具有生物活性的代谢产物。在自然环境下，不同微生物间拮抗及协同作用的现象非常普遍，代谢产物也丰富多样。故此，采用微生物共培养方式，可还原或模拟微生物自然生长条件，刺激不同微生物代谢酶或代谢产物的相互作用，激活单一微生物沉默基因簇，从而极大限度地挖掘其丰富多样的生物活性物质。本申请采用真菌共培养的方法，优化培养条件，对共培养真菌的发酵产物进行代谢产物及生物活性挖掘，对于开发治疗氧化损伤所致疾病的新型药物具有重要意义。发明内容 [0005] 有鉴于此，本申请提供了具有抗氧化活性的化合物、制备方法及其应用技术，以在一定程度上解决上述技术缺陷。 [0006] 第一方面，本申请实施例公开了具有抗氧化活性的化合物，所述化合物包括如式I所示的化合物；或者所述化合物的立体异构体、互变异构体或其药学上可接受的盐。 [0007] 第二方面，本申请实施例公开了一种治疗氧化损伤所致疾病的制剂，其特征在于，所述制剂包括第一方面所述的化合物，以及药学上可接受的辅料。 [0008] 所述药学上接受的辅料包括稀释剂、载体和赋形剂中的至少一项。 [0009] “赋形剂”是指参与赋予药物组合物形式或稠度的药学上可接受的材料、组合物或媒介物。每种赋形剂在混合时必须与药物组合物的其他成分相容，从而避免了相互作用，这种相互作用在施用于患者时会大大降低本申请化合物的功效，并且避免了会导致药物组合物不被药学上可接受的相互作用。另外，每种赋形剂必须具有足够高的纯度以使其药学上可接受。 [0010] 合适的药学上可接受的赋形剂将根据所选的特定剂型而变化。另外，可以针对它们可以在组合物中使用的特定功能来选择合适的药学上可接受的赋形剂。例如，可以选择某些药学上可接受的赋形剂，因为它们具有促进产生均匀剂型的能力。可以选择某些药学上可接受的赋形剂，因为它们具有产生稳定剂型的能力。可以选择某些药学上可接受的赋形剂，因为它们一旦施用于患者从一个器官或身体的一部分到另一器官或身体的另一部分，便易于携带或运输本申请的一种或多种化合物。可以选择某些药学上可接受的赋形剂，因为它们具有增强患者依从性的能力。 [0011] 合适的药学上可接受的赋形剂包括以下类型的赋形剂:稀释剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、制粒剂、包衣剂、润湿剂、溶剂、助溶剂、助悬剂、乳化剂、甜味剂、调味剂、风味掩蔽剂、着色剂、抗结块剂、湿润剂、螯合剂、增塑剂、增粘剂、抗氧化剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂和缓冲剂。如本领域技术人员将理解的是，取决于制剂中存在多少赋形剂以及制剂中存在什么其他成分，某些药学上可接受的赋形剂可以起到多于一种功能并且可以起到替代的功能。 [0012] 本申请实施例提供的制剂可以为适于以下方式使用的形式:口服使用(例如作为片剂、胶囊剂、囊片、药丸、锭剂、散剂、糖浆剂、酏剂、混悬剂、溶液剂、乳剂，药袋和扁囊剂)，局部使用(例如作为霜剂、软膏剂、乳液、溶液、糊剂、喷雾剂、泡沫和凝胶)，经皮施用(例如通过透皮贴剂)，通过吸入施用(例如作为干粉、气雾剂、悬浮液和溶液)，通过吹入施用(例如作为细粉)或肠胃外施用(例如作为用于静脉内、皮下、肌肉内、腹膜内或肌肉内给药的无菌水性或油性溶液剂，或者作为用于直肠给药的栓剂)。 [0013] 第三方面，本申请实施例公开了第一方面所述化合物的制备方法。所述制备方法包括以下步骤：分别得到含有青霉菌和链格孢菌的活化菌落；将所述菌落接种至含有0.012mg/mL软木肟酸的PDB发酵培养基进行发酵，以获得发酵液；以及对所述发酵液进行提取分离，以得到所述化合物；其中，青霉菌，拉丁文名称Penicillium sp.HUBU0120，于2021年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号:CCTCC NO:M2021412；链格孢菌，拉丁文名称Alternaria sp.HUBU0122，于2021年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号:CCTCC NO:M 2021414。 [0014] 在本申请实施例中，含有青霉菌和链格孢菌的活化菌落是将菌株接种至PDA培养基中于25℃培养得到的。 [0015] 在本申请实施例中，所述发酵培养基为PDB。 [0016] 在本申请实施例中，所述提取分离的步骤包括：获得粗提浸膏，所述粗提浸膏是将所述发酵液由乙醇提取得到；获得精提浸膏，所述精提浸膏是将所述粗提浸膏依次经由乙酸乙酯、甲醇和石油醚萃取得到；以及获得所述化合物，所述化合物是将所述精提浸膏经由滤膜过滤及反相高效制备色谱纯化得到的，所述化合物为第一方面所述的化合物。 [0017] 在本申请实施例中，获得所述化合物的步骤具体包括：获得第一组分，所述第一组分是将所述精提浸膏由滤膜过滤得到；获得第二组分，所述第二组分是将所述第一组分上样至反相高效液相色谱柱，收集洗脱液得到的，所述第二组分包括如式I所示的化合物。 [0018] 第四方面，本申请实施例公开了第一方面所述的化合物、或第二方面所述的制备方法制得的化合物在制备抗氧化损伤所致疾病药物中的应用。 [0019] 与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果： [0020] 本申请中涉及具有抗氧化活性的化合物、制备方法及其应用。通过采取两株菌共培养的策略，改变培养基及培养条件、混合培养比例等研究方法，对其沉默的生物合成基因进行表观遗传调控，尽可能挖掘微生物合成次生代谢产物的能力，在工艺可重复与可持续发展的基础上能进行放大培养，不会造成资源浪费。 [0021] 其次，本申请提供的化合物均具有抗氧化活性，且呈浓度依赖性。所述化合物预期可以发展成为治疗由氧化损伤所致疾病如神经退行性和心血管疾病、糖尿病和恶性肿瘤等的药物。 [0022] 另外，本申请只需按照实验方案将冻存的菌种复苏传代，根据优化好的培养条件进行培养，即可无限放大发酵，并可通过调控发酵物的总量来目的性地调控化合物的产量，最终获得具有抗氧化活性的目标产物。附图说明 [0023] 图1为本申请实施例提供的各组分液相对比图。 [0024] 图2为本申请实施例提供的SPSS主成分因子图。 [0025] 图3为本申请实施例提供的式I所示化合物的X‑单晶结构图谱。 [0026] 图4为本申请实施例提供的式I所示化合物的结构图。 [0027] 图5为本申请实施例提供的PA.PDB.S组别提取物的自由基清除活性(DPPH法)。 [0028] 图6为本申请实施例提供的PA.PDB.S组别提取物的自由基清除活性(ABTS法)。 [0029] 图7为本申请实施例提供的PA.PDB.S组别提取物的总抗氧化能力(FRAP法)。 具体实施方式[0030] 为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。 [0031] 如式I所示化合物的制备 [0032] 1、菌株 [0033] 本申请实施例公开的如式I所示的化合物是通过真菌发酵培养，以提取分离其次级代谢产物而得到的。 [0034] 本申请实施例中涉及的菌种由以下来源: [0035] 青霉菌，拉丁文名称Penicillium sp.HUBU0120，于2021年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号:CCTCC NO:M2021412； [0036] 链格孢菌，拉丁文名称Alternaria sp.HUBU0122，于2021年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号:CCTCC NO:M2021414。 [0037] 2、培养基 [0038] PDA培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基的简称，即Potato Dextrose Agar(Medium)，依次对应马铃薯、葡萄糖、琼脂的英文。配方：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15～20g/L。 [0039] PDB培养基为液体PDA培养基，不加琼脂，用于真菌等的液体培养。 [0040] 3、菌株活化 [0041] 将配制好的PDA培养基倒入蓝盖瓶内，放入灭菌锅设置121℃、30min，照紫外30min灭菌，待冷却至约50℃，倒平板。 [0042] 4、发酵培养 [0043] 在一个实施例中(P.PDA)，将活化的青霉菌HUBU0120，以10％接种量接种至PDA平板上，于25℃恒温培养，培养时间为5‑7天。 [0044] 在一个实施例中(P.PDB)，将活化的青霉菌HUBU0120，以10％接种量接种至PDB培养液中，于25℃恒温培养振荡器培养，转速180rpm，培养时间为5‑7天。 [0045] 在一个实施例中(P.PDB.S)，将活化的青霉菌HUBU0120，以10％接种量接种至含有0.012mg/mL软木肟酸PDB培养液中，于25℃恒温培养振荡器培养，转速180rpm，培养时间为 5‑7天。 [0046] 在一个实施例中(P.PDB.5)，将活化的青霉菌HUBU0120，以10％接种量接种至含有0.012mg/mL 5‑氮杂‑2'‑脱氧胞苷的PDB培养液中，于25℃恒温培养振荡器培养，转速 180rpm，培养时间为5‑7天。 [0047] 在一个实施例中(A.PDA)，将活化的链格孢菌HUBU0122，以10％接种量接种至PDA平板上，于25℃恒温培养，培养时间为5‑7天。 [0048] 在一个实施例中(A.PDB)，将活化的链格孢菌HUBU0122，以10％接种量接种至PDB培养液中，于25℃恒温培养振荡器培养，转速180rpm，培养时间为5‑7天。 [0049] 在一个实施例中(A.PDB.S)，将活化的链格孢菌HUBU0122，以10％接种量接种至含有0.012mg/mL软木肟酸的PDB培养液中，于25℃恒温培养振荡器培养，转速180rpm，培养时间为5‑7天。 [0050] 在一个实施例中(A.PDB.5)，将活化的链格孢菌HUBU0122，以10％接种量接种至含有0.012mg/mL5‑氮杂‑2'‑脱氧胞苷的PDB培养液中，于25℃恒温培养振荡器培养，转速180rpm，培养时间为5‑7天。 [0051] 在一个实施例中(PA.PDA)，将活化的青霉菌HUBU0120和链格孢菌HUBU0122，以各5％的接种量接种至PDA平板上，于25℃恒温培养，培养时间为5‑7天。 [0052] 在一个实施例中(PA.PDB)，将活化的青霉菌HUBU0120和链格孢菌HUBU0122，以各5％的接种量接种至PDB培养液中，于25℃恒温培养振荡器培养，转速180rpm，培养时间为5‑ 7天。 [0053] 在一个实施例中(PA.PDB.S)，将活化的青霉菌HUBU0120和链格孢菌HUBU0122，以各5％的接种量接种至含0.012mg/mL软木肟酸PDB培养液中，于25℃恒温培养振荡器培养，转速180rpm，培养时间为5‑7天。 [0054] 在一个实施例中(PA.PDB.5)，将活化的青霉菌HUBU0120和链格孢菌HUBU0122，以各5％的接种量接种至含0.012mg/mL 5‑氮杂‑2'‑脱氧胞苷的PDB培养液中，于25℃恒温培养振荡器培养，转速180rpm，培养时间为5‑7天。 [0055] 表1不同组别培养方式及培养条件 [0056] 序号 组别名称 培养方式 菌株类别 培养基 添加剂 添加剂浓(mg/mL)1 P.PDA 单独培养 青霉菌 PDA 无 ‑ 2 P.PDB 单独培养 青霉菌 PDB 无 ‑ 3 P.PDB.S 单独培养 青霉菌 PDB 软木肟酸 0.012mg/mL 4 P.PDB.5 单独培养 青霉菌 PDB 5‑氮杂‑2'‑脱氧胞苷 0.012mg/mL 5 A.PDA 单独培养 链格孢菌 PDA 无 ‑ 6 A.PDB 单独培养 链格孢菌 PDB 无 ‑ 7 A.PDB.S 单独培养 链格孢菌 PDB 软木肟酸 0.012mg/mL 8 A.PDB.5 单独培养 链格孢菌 PDB 5‑氮杂‑2'‑脱氧胞苷 0.012mg/mL 9 PA.PDA 共同培养 青霉菌、链格孢菌 PDA 无 ‑ 10 PA.PDB 共同培养 青霉菌、链格孢菌 PDB 无 ‑ 11 PA.PDB.S 共同培养 青霉菌、链格孢菌 PDB 软木肟酸 0.012mg/mL 12 PA.PDB.5 共同培养 青霉菌、链格孢菌 PDB 5‑氮杂‑2'‑脱氧胞苷 0.012mg/mL[0057] 表注：组别名称含义为：P表示Penicillium sp.HUBU0120，A表示Alternaria sp.HUBU0122，PA表示Penicilliumsp.HUBU0120和Alternaria sp.HUBU0122共培养，PDA表示PDA培养基，PDB表示PDB培养基，S表示软木肟酸，5表示5‑氮杂‑2'‑脱氧胞苷[0058] 5、提取分离 [0059] 按照表1培养方式培养，各组培养结束后用乙醇浸提。每次浸泡12小时，共提取8次，提取液经减压浓缩后得到总浸膏。总浸膏进行萃取:先用乙酸乙酯和水1:1萃取7次，再将乙酸乙酯部位用95％甲醇和石油醚1:1萃取7次，获得95％甲醇部位。 [0060] 6、提取物分析 [0061] 不同培养条件下的粗体物经滤膜过滤后，通过液相反相高效色谱制备柱(COSMOSIL Packed Column，C18‑MS‑Ⅱ，4.6×250mm，5μm particle)，流动相甲醇:水＝80: 20，流速为1mL/min，各组分液相对比如图1所示。 [0062] 7、SPSS主成分因子分析 [0063] 两株菌在表1的12种培养方式下的精提物各称取1.00mg，甲醇稀释为浓度1.00×‑910 mg/mL进行质谱(MS)分析，分析条件为甲醇:水＝80:20，其质谱数据保存为txt格式，利用SPSS软件对质谱数据进行主成分因子分析。结果如图2所示。 [0064] 分析结果显示各个组别之间存在不同的组成成分，而其中占比最高的两个组分为主成分1和主成分2，其中主成分1，方差百分比98.44，积累量98.44％，主成分2方差百分比0.58，积累量99.02％，提取这2种主要成分进行后续分析得到含有两个成分最多的组别。结果表明，在PA.PDB.S组中，主成分1含量最多，含量为0.997。在A.PDA组中，主成分2含量最多，含量为0.217。故此，选择PA.PDB.S组别的培养方式及培养条件进行放大培养发酵。对发酵物进行提取、分离及纯化等步骤后，得到如式I所示化合物。 [0065] 式I所示化合物的结构鉴定 [0067] 1、核磁共振 [0068] 式I所示化合物：白色粉末；HRESIMS m/z 485.2477[M+H]+(calcd for C27H36N2O4S+ 2,485.2469)；[α] D0＝+61.9(c 0.14,CH3OH)；UV(CH3OH)λmax(logε)＝263(4.42),324–1 (4.09)nm；IR(KBr)νmax 3445,2967,2843,2378,1869,1645,1541,1055,1032,1015,419cm 1 13 ；H和 C NMR数据见表2。 [0069] 表2.式I所示化合物的1H NMR和13C NMR(CD3OD,δin ppm,J in Hz). [0070] [0071] 2、X‑单晶衍射(X‑Ray))分析 [0072] 通过对式I所示的化合物铜靶X Ray分析，确定了该化合物绝对构型，单晶结构图谱见图3，绝对构型见图4。 [0073] 真菌代谢物抗氧化活性测试 [0074] 1、各组别提取物的抗氧化活性测试 [0075] 将上述组别P.PDA、P.PDB、P.PDB.S、P.PDB.5、A.PDA、A.PDB、A.PDB.S、A.PDB.5、PA.PDA、PA.PDB、PA.PDB.S、PA.PDB.5的乙醇提取物用80％甲醇配制成100μg/mL的供试品溶液。采用DPPH自由基清除能力试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号A153‑1‑1)进行各组别提取物抗氧化活性测试。 [0076] 通过对照管、测定管和空白管在517nm波长下的吸光度值OD的测定，采用以下公式对DPPH自由基清除率进行计算：DPPH自由基清除率(％)＝[1‑(A测定‑A对照)/A空白]×100％。各组别提取物的DPPH自由基清除率如表3所示，其中，PA.PDB.S组别提取物对DPPH自由基的清除率最高。 [0077] 表3各组别提取物的DPPH自由基清除率 [0078]序号 组别名称 清除率(％) 1 P.PDA 44.54％ 2 P.PDB 49.00％ 3 P.PDB.S 55.41％ 4 P.PDB.5 38.18％ 5 C.PDA 40.02％ 6 C.PDB 34.17％ 7 C.PDB.S 34.78％ 8 C.PDB.5 34.78％ 9 PC.PDA 32.16％ 10 PC.PDB 52.62％ 11 PC.PDB.S 55.74％ 12 PC.PDB.5 47.83％ [0079] 2、PA.PDB.S组别提取物的抗氧化能力测试 [0080] 由于组别PA.PDB.S提取物对DPPH自由基的清除率最高，抗氧化效果最好，后续选择该组别的提取物进一步进行抗氧化能力测试。 [0081] (1)DPPH自由基清除率测试 [0082] 取该组分样品2.00mg，80％甲醇稀释至浓度为3.91、7.82、15.64、31.28、62.55μg/mL，采用上述步骤2得到DPPH自由基清除率。 [0083] 以1,1‑二苯基‑2‑三硝基苯肼自由基为对照，结果显示该样品随浓度的升高，抗氧化能力增强。如图5所示。通过SPSS软件拟合其自由基清除率的IC50值为1.54μg/mL。 [0084] (2)ABTS自由基清除率测试 [0085] 采用总抗氧化能力(T‑AOC)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号A015‑2‑1)进行测试，以标准品OD值为横坐标、各OD值对应的标准品浓度为纵坐标制成标准曲线，用excel制得标准曲线，把提取物测得的OD值代入标准曲线线性方程，求得提取物相当于标准品的浓度。采用Trolox作为标准品进行总抗氧化能力检测，提取物的抗氧化能力用Trolox‑Equivalent Anyioxidant Capacity(TEAC)来表示。 [0086] 取该组别的提取物4.00mg，用蒸馏水稀释至浓度为4.00、2.00、1.00、0.50、0.25、0.13、0.06mg/mL，检测在405nm波长下的OD值，采用前述计算方法得到该样品在不同浓度下的自由基清除率。 [0087] 以TEAC为阳性对照，结果显示该样品随浓度升高，抗氧化能力增强。如图6所示。通过SPSS软件拟合其自由基清除率的IC50值为1.69mg/mL。 [0088] (3)FRAP法抗氧化活性测试 [0089] 采用总抗氧化能力(T‑AOC)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号A015‑3‑1)进行测试，对空白孔、标准孔和测定孔在波长593nm下进行OD值读取，各孔扣除空白孔OD值。以标准品OD值为横坐标、各OD值对应的标准品浓度为纵坐标，制得标准曲线，得到标准曲线的线性方程；把提取物扣除空白后的OD值代入线性方程，计算出样本相当于标准品的浓度。 [0090] 取该组分样品4.00mg，蒸馏水稀释至浓度为4.00、2.00、1.00、0.50、0.25、0.13、0.06、0.03mg/mL，检测在405nm波长下的OD值，采用4.3计算方法得到该样品在不同浓度下抗氧化能力。 [0091] 以FeSO4‑7H2O为阳性对照，结果显示该样品随浓度升高，抗氧化能力增强。如图7所示。通过SPSS软件拟合其总抗氧化能力的IC50值为1.06mg/mL。 [0092] 不同化合物抗氧化活性测试比较 [0093] 采用上述三种试剂盒，对式I所示化合物进行抗氧化能力测试，通过SPSS分析软件计算得到其抗氧化活性的IC50值。表4示出了化合物(式I)、2,6‑二叔丁基‑4‑甲基苯酚(BHT)和奎诺二甲基丙烯酸酯(Trolox)分别的DPPH(IC50,μM)、ABTS(IC50,μM)和FRAP(FeSO4 value)，表中，“/”表示未检出。如表4所示，该化合物(式I)具有较好的抗氧化活性，而BHT未检出ABTS(IC50,μM)和FRAP(FeSO4 value)，Trolox未检出抗DPPH活性。 [0094] 表4化合物及标准品的抗氧化活性测试结果 [0095] 化合物 DPPH(IC50,μM) ABTS(IC50,μM) FRAP(FeSO4 value)化合物式I 37.74 49.64 1.77 2,6‑二叔丁基‑4‑甲基苯酚(BHT) 91.35 / / 奎诺二甲基丙烯酸酯(Trolox) / 101.23 1.80 [0096] 综上所述，本申请对青霉菌(Penicillium sp.HUBU0120)和链格孢菌(Alternaria sp.HUBU0122)进行共培养，并通过添加软木肟酸优化培养条件，从而产生具有抗氧化活性的粗提物和单体化合物。本申请可进行工艺重复，在可持续发展基础上能进行放大培养，不容易造成资源浪费。 |
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