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一株富硒高产菌株KB2及其应用
申请号	CN202410100325.0	申请日	2024-01-24	公开(公告)号	CN117903992A	公开(公告)日	2024-04-19
申请人	广西大学;			发明人	余炼; 朱虎; 秦莹; 张梦菲; 刘小玲;
摘要	本发明属于微生物菌株及生物工程技术领域，公开了一株富硒高产菌株KB2。本申请提供的菌株是以广西巴马各类发酵食品以及新鲜瓜果蔬菜中分离得到的128株乳酸菌为对象，进行筛选培养后得到。本申请提供的肠膜明串珠菌KB2具有较好的耐酸和胆盐耐受性，同时该菌在胃液中的存活率高，对多种抗生素敏感，同时生物安全性高。富硒培养后，可提高对多种致病菌的抑制效果。此外，肠膜明串珠菌亚种KB2富硒之后的DPPH、超氧阴离子、ABTS自由基清除率相比未富硒前，均有显著的升高。即肠膜明串珠菌亚种KB2富硒之后的抗氧化能力得到明显提高。可以利用其将无机硒转化为有机硒，用于开发富硒产品。
权利要求	1.一株富硒高产菌株KB2，其特征在于，所述富硒高产菌株KB2为肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides subsp.jonggajibkimchii)，所述肠膜明串珠菌KB2于2023年12月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNO：64144。 2.权利要求1所述肠膜明串珠菌KB2在制备富硒产品中的应用。 3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肠膜明串珠菌KB2作为富硒发酵载体。 4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括如下步骤： S1、将肠膜明串珠菌KB2接种于MRS培养基中，经培养得到种子液； S2、将上述种子液接入装有MRS培养基的摇瓶中，经培养得到发酵液。 5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤S1中将肠膜明串珠菌KB2接种于MRS培养基中培养3小时后加入硒，加入硒后培养时间为18小时。 6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，最适硒浓度为10～20μg/ml。
说明书全文	一株富硒高产菌株KB2及其应用技术领域 [0001] 本发明属于微生物菌株及生物工程技术领域，更具体地，涉及一株富硒高产菌株KB2及其应用。背景技术 [0002] 硒是人体中重要的微量元素之一，具有多种生物活性，具有抗氧化、抗癌、增强人体免疫和骨骼健康等功能，有助于维持活生物体的正常生理功能。与其他必需微量元素不同，世界各地人类的硒摄入量差异很大，与地理位置密切相关。硒的摄入量取决于土壤中硒的含量、蔬菜积累硒的能力、种植和消费的作物类型、硒的形态、土壤pH值、有机物含量等。全世界大约10亿人受到硒的营养缺乏的影响，缺乏硒元素会引起神经退化、癌症、心血管疾病、甲状腺疾病和男性生育问题。此外，硒是导致病理发生率增加的原因，如克山病等。低硒水平还可能引起神经退行性疾病和心血管疾病，影响人类大脑的重要功能，从而导致认知能力下降。 [0003] 硒摄入过量也会引起硒中毒，可耐受摄入量和硒中毒之间的范围很窄，人体只能吸收和利用1‑2％的无机物。男性硒的平均推荐摄入量通常为60ug/d，女性为53ug/d。 [0004] 硒在自然界中以有机活性硒和无机硒两种形式存在。自然界中的硒大多以无机态存在，无机硒毒性高，生物活性低，不易被人体吸收利用。硒的毒性与其化学形态密切相关，提高硒生物利用率的一种方法是利用微生物将无机硒转化为毒性较低的有机硒。可以通过生物转化与氨基酸结合等方法将无机硒转化为有机的形式，如硒蛋氨酸、硒代半胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸和纳米颗粒(SeNPs)形式的元素硒。有机硒与无机硒相比，生物利用率更高，毒性更小，吸收更好，安全性更高。微生物富集硒是新兴硒产业中最有前景的技术之一。这种生物富集方法以无机硒为原料，生产高营养、低毒性的有机硒，以满足公众，特别是缺硒地区人民的需求。 [0005] 乳酸菌作为一种常用的微生态制剂菌种，能够通过细菌代谢将无机硒转化为有机硒。这种转化更有利于动物体吸收利用，因此在动物饲养方面具有广阔的研究前景。相较于富硒酵母菌，富硒乳酸菌具有以下优势：乳酸菌大量生长繁殖时会产生氨基酸、有机酸等营养代谢物质，这些物质有助于促进宿主的消化和营养吸收。另外，有机酸还能保持钙、铁、磷等元素处于离子状态，提高它们的吸收利用率。相比之下，酵母菌很难破壁，因此成本高且难以被消化吸收。乳酸菌与硒之间相互促进、协同，具有诸多优势，如安全性高、发酵周期短、合成效率高、工艺简单等，成为理想的富硒发酵载体。发明内容 [0006] 为解决上述现有技术中的问题，本发明一株富硒高产菌株KB2。 [0007] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案： [0008] 一株富硒高产菌株KB2，所述富硒高产菌株KB2为肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides subsp.jonggajibkimchii)，所述肠膜明串珠菌KB2于2023年12月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNO：64144。 [0009] 本发明同时提供所述肠膜明串珠菌KB2在制备富硒产品中的应用。 [0010] 进一步地，所述肠膜明串珠菌KB2作为富硒发酵载体。 [0011] 作为一种优选的方式，将所述肠膜明串珠菌KB2作为富硒发酵载体，包括如下步骤： [0012] S1、将肠膜明串珠菌KB2接种于MRS培养基中，经培养得到种子液； [0013] S2、将上述种子液接入装有MRS培养基的摇瓶中，经培养得到发酵液。 [0014] 优选地，所述步骤S1中将肠膜明串珠菌KB2接种于MRS培养基中培养3小时后加入硒，加入硒后培养时间为18小时。 [0015] 优选地，最适硒浓度为10～20μg/ml。 [0016] 与现有技术相比，本发明的有益效果是： [0017] 本申请提供的肠膜明串珠菌KB2具有较好的耐酸和胆盐耐受性，同时该菌在胃液中的存活率高，对多种抗生素敏感，同时生物安全性高。富硒培养后，可提高对多种致病菌的抑制效果。此外，肠膜明串珠菌亚种KB2富硒之后的DPPH、超氧阴离子、ABTS自由基清除率相比未富硒前，均有显著的升高。即肠膜明串珠菌亚种KB2富硒之后的抗氧化能力得到明显提高。可以利用其将无机硒转化为有机硒，用于开发富硒产品。附图说明 [0018] 图1为部分菌株硒耐受性初步筛选； [0019] 图2为菌株富硒量的比较； [0020] 图3为PCR产物凝胶电泳结果； [0021] 图4为肠膜明串珠菌亚种KB2生长曲线； [0022] 图5为肠膜明串珠菌亚种KB2在不同硒浓度时的颜色； [0023] 图6为不同pH值培养基中KB2活菌数； [0024] 图7为不同胆盐浓度培养基中KB2活菌数； [0025] 图8为肠膜明串珠菌亚种KB2富硒前后的抗氧化能力。具体实施方式 [0026] 下面将结合本发明实施例和附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行制备。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。 [0027] 实施例1：富硒肠膜明串珠菌亚种KB2的筛选 [0028] (1)菌株分离、纯化及保藏 [0029] 从广西巴马当地获得的各类发酵食品以及新鲜瓜果蔬菜，将新鲜的样品用清水洗净，再将各样品组织剪碎，用电动组织研磨器将小块组织进一步破碎，用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，取各梯度100μL稀释液均匀涂布于溴甲酚紫‑MRS固体培养基上，每个梯度做三个平行，置于37℃恒温箱中培养48h。选取有变色圈的单菌落，观察菌落形态并从平板上挑选形态、大小、颜色不同的菌落，在MRS固体平板上纯化直至单菌落。把筛选得到的单一菌株用20％甘油保存，存放于‑80℃备用。 [0030] MRS培养基，每升培养基包括如下成分：蛋白胨10g，牛肉浸粉8g，酵母浸粉5g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g，醋酸钠5g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，琼脂15g，吐温80 1g；pH值6.2±0.2。 [0031] 溴甲酚紫MRS培养基：在MRS培养基的基础上添加溴甲酚紫0.4g。 [0032] (2)通过比浊法初步筛选富硒乳酸菌 [0033] 将活化好的128株乳酸菌菌液以2％的接种量接种到硒添加量(以亚硒酸钠含量计)为40μg/mL MRS培养基中，37℃培养至对数后期，测定菌液的OD600，3次平行试验，去除OD值显著降低的菌株。128株乳酸菌在亚硒酸钠添加量为40ug/mL的MRS液体培养基上菌体生长情况如图1所示。富硒培养相比未加硒，大部分菌株的生长明显受到抑制，OD值下降显著，且有一部分的菌株完全不生长。有部分菌株的OD值变化不明显，说明在添加高浓度的亚硒酸钠后菌株的生长没有受到明显的影响，具有良好的硒耐受性。故选择OD值无明显变化的28株菌株进行复筛。 [0034] (3)通过生物量法复筛富硒乳酸菌 [0035] 将初筛得到的乳酸菌接种于含10μg/ml亚硒酸钠的培养基中，37℃培养18h后，4000r/min离心10min，去上清，用无菌水洗去培养基，洗涤三次，去上清，将菌体培养物置于 65℃烘干至恒重，计算每100mL培养基菌体干重。结果见表1，比较加硒与未加硒乳酸菌生物量的变化发现，加10ug/mL亚硒酸钠后，菌株R2、R3、I3、KC1、H6、M1、M4、Fb1、LP1、LL3、N3、N5、P1、LN4、Kb2、LS2、LS5、Ld4、D8的生物量略微增加，说明这19株菌具有相对较强耐硒能为，因此下文进一步测量他们的富硒量，从中挑选富硒优势菌。 [0036] 表1：未加硒与加硒的乳酸菌生物量变化 [0037] [0038] (4)通过富硒量的测定筛选富硒优势菌 [0039] 总硒：准确称取0.2g菌体，加入5mL浓硝酸后静置过夜进行预消解，加2mL H2O2并旋紧罐盖置于微波消解仪上，消解条件参照国标GB 5009.268‑2016，消解至混合液无色透明。冷却后用水定容至10m L，经0.22μm滤膜过滤后待测。 [0040] 无机硒：准确称取0.1g菌体，加入10mL盐酸(15％)提取无机硒，在电热板上加热煮沸并及时补加直到混合液澄清，冷却后，离心数次至完全去除沉淀，将上清液用盐酸(15％)定容至10m L，经0.22μm滤膜过滤后待测。 [0041] 结果如图2，通过图2能直观看到在这19株菌株中，菌株KB2的富硒量较高，为535.38ug/g。 [0042] 实施例2菌株(肠膜明串珠菌亚种KB2)的鉴定方法 [0043] (1)16S rDNA序列扩增 [0044] 纯化得到的单菌落进行16S rDNA鉴定，使用Chelex100法提取菌株DNA。用灭菌牙签从MRS固体平板上挑取单菌体到10％树脂溶液中，100℃金属浴10min，等待冷却，迷你离心机离心10min，作为PCR扩增模板备用，采用引物27F [0045] (5’‑AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3’)和1492R(5’‑TACGGYTACCTTGTTAYGACTT‑3’)对分离菌株PCR扩增，两条引物依次为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3显示，扩增体系20μL：2×Es Taq Master Mix 10μL、DNA模板0.5μL、27F 0.5μL、1492F 0.5μL、ddH2O8.5μL；扩增程序：94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，循环结束后，72℃延伸10min。 [0046] (2)琼脂糖凝胶电泳 [0047] 称取80mL琼脂糖加入锥形瓶中，加入80mL 1xTAE，微波间断式加热4min，至液体澄清透明，稍稍冷却，加入4μL核酸染料，摇匀，无气泡，倒入胶板槽中，冷却40min 凝固后，置于电泳槽中，排气泡，依次加入PCR扩增产物，每个孔中加入2μL PCR扩增产物，120V 15min跑胶结束后取出，置于凝胶电泳成像仪中拍照保存(图1)，记录PCR成功样品的编号，将成功的PCR产物置于‑20 冰箱中保藏。 [0048] (3)菌株序列送测与鉴定 [0049] PCR产物送至广州擎科生物技术有限公司进行测序，将测序结果提交至EZbiocloud(https://www.ezbiocloud.net/)进行BLAST同源性比对，选取匹配度最高的菌株信息进行结果记录。经分析鉴定，本发明提供的菌株为肠膜明串珠菌肠膜亚种 (Leuconostoc mesenteroides subsp.jonggajibkimchii)。 [0050] 肠膜明串珠菌亚种KB2的保藏信息如下： [0051] 保藏时间：2023年12月11日； [0052] 保藏单位名称：广东省微生物菌种保藏中心； [0053] 保藏编号：GDMCC No:64144； [0054] 保藏单位地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼； [0055] 分类命名：Leuconostoc mesenteroides subsp.jonggajibkimchii。 [0056] 实施例3肠膜明串珠菌亚种KB2的富硒方法 [0057] (1)培养时间和加硒时间的确定 [0058] 肠膜明串珠菌亚种KB2以2％的接种量接种到MRS培养基中，培养24h，每隔2h取一次样，测定菌液的OD600，3次平行试验。以时间为横坐标，OD600为纵坐标绘制生长曲线。如图4所示，肠膜明串珠菌亚种KB2在3h左右进入了生长对数期。如果过早的加入硒，对乳酸菌的毒性较强，导致菌株生长受到抑制。而乳酸菌在对数期代谢旺盛，生长迅速，此时加入硒能获得最大的转化率。故选择在3h加入硒以获得最大富硒量。在18h进入生长稳定期，确定18h为富硒培养时间。 [0059] (2)最适硒浓度的确定 [0060] 用亚硒酸钠配制不同硒浓度的MRS液体培养基：0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml序号分别为1‑5号。将肠膜明串珠菌亚种KB2接种于上述含硒的培养基中，37℃，培养至稳定期，4000r/min离心10min，倒掉培养基上清液再加入同体积的生理盐水，重悬菌体，观察菌体颜色变化。如图5所示，菌体均有不同程度的变红，且变红的程随着亚硒酸钠的浓度增加而加深。培养基中的菌体变红则说明有单质硒的转化，且红色越深单质硒含量越高，同时说明它的有机硒达到了最大转化量，因此在无机硒的添加量和转化量之间要有所平衡。选择菌体刚刚达到有机硒转化量，同时出现了红色单质硒时为最适硒浓度，即培养基里的菌体显示微红色时，此时的加硒量适中且单质硒转化量少，有机硒的转化量大，对菌体的伤害小。确定最适硒浓度为10μg/ml。 [0061] 实施例4肠膜明串珠菌亚种KB2的耐酸耐胆盐性 [0062] (1)耐酸性实验用0.1mol/L的盐酸将MRS液体培养基的pH调整至2、3和4，121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却备用。将活化后的肠膜明串珠菌亚种KB2以2％(v/v)的接种量分别接种到上述处理后的培养基中，37℃恒温培养，分别于0、2、4h取样，采用平板计数法测定活菌数。 [0063] 由图6可知，肠膜明串珠菌亚种KB2在pH 2条件下活菌数下降较快，培养至4h其活菌数对数值降为零。在pH为3和4的液体培养基中培养时，活化后的菌体产生应激反应消除了酸胁迫带来的不利影响，一定程度上保持了菌体细胞生长的稳定性，经过4h其活菌数对数值均在7以上。说明了肠膜明串珠菌亚种KB2具有较好的耐酸能力。 [0064] (2)耐胆盐实验在MRS液体培养基中加入牛胆盐，使胆盐的质量浓度分别为0.03、0.1、0.3g/100mL，以不添加胆盐的MRS液体培养基作为对照，121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却备用。将活化后的肠膜明串珠菌亚种KB2以2％(v/v)的接种量接种到上述处理后的培养基中，37℃恒温培养，分别于0、2、4h取样，采用平板计数法测定活菌数。 [0065] 由图7可知，胆盐浓度为0.03％时，肠膜明串珠菌亚种KB2的活菌数呈现增长趋势，说明0.03％的低胆盐浓度所产生的渗透压较小，对菌体细胞活性影响不大，该菌株仍能够保持较好的稳定性并呈增长趋势。菌株在胆盐质量浓度分别为0.1、0.3g/100mL条件下培养2h后，其活菌数均有所下降，说明高浓度胆盐对肠膜明串珠菌亚种KB2的生长有一定抑制作用，但作用4h后，菌株在胆盐质量浓度分别为0.1、0.3g/100mL的培养基中的活菌数对数值均在6.5以上。表明了肠膜明串珠菌亚种KB2具有较好的胆盐耐受性。 [0066] 实施例5肠膜明串珠菌亚种KB2的益生特性和安全性 [0067] (1)胃肠道耐受性人工模拟胃肠液需新鲜配制。125mmol/L NaCl、7mmol/L KCl、45mmol/L NaHCO3和3g/L胃蛋白酶(500U/mg)，用盐酸调节pH 2.5，经0.22μm滤膜过滤后制备成模拟胃液；45mmol/L NaCl、1g/L胰蛋白酶(75U/mg)、3g/L牛胆盐，用1mol/L NaOH调至pH 8.0，经0.22μm滤膜过滤后制备成模拟肠液； [0068] 菌株在37℃厌氧培养箱中培养过夜，离心菌液(8000r/min，5min，4℃)，弃上清液9 留菌体沉淀，重悬于MRS液体培养基中使其菌液密度调节为1×10CFU/mL，加入等体积人工胃液(3g/L胃蛋白酶)或人工肠液(1g/L胰蛋白酶、3g/L牛胆盐)，37℃恒温培养箱中培养0、 4h，培养后进行梯度稀释，取合适的稀释液涂布于MRS平板上，37℃静置培养48h，活菌计数。计算公式如下： [0069] 存活率％＝N1/N×100％ [0070] 式中：N1模拟胃液或肠液处理4h后的活菌数(CFU/mL)；N为模拟胃液或肠液处理。 [0071] 结果如表2所示，肠膜明串珠菌KB2在胃液中的存活率为104％左右，在肠液中的存活率未富硒和富硒的肠膜明串珠菌KB2分别达到了95.22％和91.96％。 [0072] 表2：肠膜明串珠菌KB2在胃肠道耐受性 [0073] [0074] (2)致病菌的抑制试验通过琼脂扩散试验测定肠膜明串珠菌亚种KB2的抑菌活性。选择金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌和巴氏杆菌为病原指示菌。肠膜明串珠菌亚种KB2以2％的接种量于MRS肉汤培养基中，培养24h后离心取上清，用NaoH调节成pH7.0。所有指示菌株均用新鲜培养菌液，在LB液体培养基中37℃需氧培养16h，然后用无菌PBS将其调 6 7 整成10–10CFU/mL，取100μL均匀涂布在LB固体培养基上，待充分吸收后，打孔。孔内分别加入100μL上述筛选菌株的新鲜培养上清液，无菌MRS液体培养基作为阴性对照。将平板静置于37℃恒温培养箱24h，测量抑菌圈直径。结果如表3所示： [0075] 表3：肠膜明串珠菌亚种KB2抑菌实验 [0076] [0077] “‑”表示无抑菌作用，“+”表示抑菌圈直径5～10mm；“++”表示抑菌圈直径11～17mm。 [0078] (4)抗生素敏感性试验 [0079] 采用药敏纸片琼脂扩散法测定分离的乳酸菌对抗生素的敏感性。将分离菌株过夜培养后，用灭菌涂布棒均匀涂抹在MRS琼脂平板上，待平板表面干燥后，用灭菌镊子夹取药敏纸片贴在琼脂板表面，轻压药敏纸片使纸片不易掉落，操作全程均在无菌操作台中。所使用的药敏纸片包括：之后，将MRS琼脂板倒置放入37℃培养箱中，培养24h后，用游标卡尺测量其抑菌圈直径。结果如表4所示，肠膜明串珠菌亚种KB2对头孢唑啉、头孢曲松、头孢他啶、万古霉素有耐药性；对链霉素、头孢氨苄、头孢呋辛钠、阿米卡星、卡那霉素为中度敏感；对米诺环素、氨苄西林、强力霉素、红霉素、四环素、头孢哌酮、哌拉西林、青霉素、林可霉素、多粘菌素B、庆大霉素具有敏感性。 [0080] 表4肠膜明串珠菌亚种KB2的耐药性 [0081] [0082] 注：R为耐药，I为中等敏感，S为敏感 [0083] 实施例6富硒肠膜明串珠菌亚种KB2抗氧化活性 [0084] (1)无细胞提取液(Cell‑free Extract，CFE)的制备：采用实施例3的富硒方法进行富硒，将富硒菌株和未富硒菌株以MRS培养基在37℃条件下培养24h，传3代后，培养液9 5000g离心15min，收集菌体。用无菌PBS缓冲液洗涤后重悬，调整菌数至10 mL‑1，将菌悬液冰浴超声波破碎(4s，5min)，破碎后12000r/min离心20min，收集上清液，即为无细胞提取物(CFE)。 [0085] (2)DPPH自由基清除能力 [0086] 1mL样品加入1mL DPPH甲醇溶液(0.2mmol/L)，放置室温下暗反应30min后，在517nm处测吸光度A，以磷酸缓冲液作为空白对照A0。 [0087] DPPH自由基清除率(％)＝[(A0‑A)/A0]100％ [0088] (3)超氧阴离子自由基清除能力 [0089] 将0.1mL样品加入4.5mL Tris‑HCl缓冲液(pH＝8.0)，25水浴预热20min后，加入0.4mL 25mmol/L的邻苯三酚，于25水浴反应5min，立即滴入2d 8mol/L的HCl终止反应，在 325nm处测定吸光度A，用蒸馏水调零。空白组用0.1mL H2O代替样品即为A0。 [0090] 超氧阴离子清除率(％)＝[(A0‑A)/A0]100％ [0091] (4)ABTS自由基清除能力 [0092] 取无细胞提取物10μL与ABTS工作液200μL充分混合，在室温避光条件下静置30min，在波长734nm处测定吸光值。根据下列公式计算ABTS自由基清除率。 [0093] ABTS自由基清除率(％)＝[1‑(A1‑A2)/A0]*100％ [0094] 式中：A1为200μL ABTS+10μL样品的吸光度；A2为200μL蒸馏水+10μL样品的吸光度；A0为200μL ABTS+l0μL蒸馏水的吸光度。 [0095] 结果如图8所示，肠膜明串珠菌亚种KB2富硒之后的DPPH、超氧阴离子、ABTS自由基清除率相比未富硒，均有显著的升高。可见，肠膜明串珠菌亚种KB2富硒之后的抗氧化能力得到明显提高。 [0096] 实施例7肠膜明串珠菌亚种KB2的表征平板性状 [0097] 在MRS培养基上菌落形态呈圆形或豆形，菌落直径小于1.0mm，表面光滑，乳白色，不产生任何色素；细胞形态呈球形、豆形或短秆形，有些成对或以短链排列、不运动、无芽孢。 [0098] 2、16S rRNA序列：如SEQ ID NO：1所示。 [0099] 3、生理生化性质：生理生化测定结果表明，菌株KB2为微好氧性，厌氧培养生长良好；生长温度范围2℃～53℃，最适生长温度3O℃～40℃；耐酸性强，生长最适pH为5.5～6.2，在pH≤5的环境中可以生长，而在中性或初始碱性条件下生长速率降低。革兰氏染色呈阳性。 [0100] 本发明的上述实施例仅仅是为了清楚地说明本发明技术方案的所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

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