酶突变体及其应用

申请号 CN202211180654.8 申请日 2022-09-27 公开(公告)号 CN115772508A 公开(公告)日 2023-03-10
申请人 浙江新安化工集团股份有限公司; 发明人 楼亿圆; 何军光; 刘明华; 吴艳青; 陈显辉; 刘志伟; 胡贝贝; 姜胜宝; 任不凡; 周曙光; 秦龙; 徐亚卿;
摘要 本 发明 涉及 生物 催化技术领域,特别涉及酶突变体及其应用。本发明提供了来源于鲑色 锁 掷 酵母 的D‑ 氨 基酸 氧 化酶 的突变体,突变位点包括N54V、C56N、F58H、M216S、R116V和/或K319T。该突变体具有高酶活、高转化率的特点,可高效制备2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸,产物收率高。
权利要求

1.D‑基酸化酶的突变体,其特征在于,包括:
所述D‑氨基酸氧化酶的第54位天冬酰胺被缬氨酸取代;和/或
所述D‑氨基酸氧化酶的第56位半胱氨酸被天冬酰胺取代;和/或
所述D‑氨基酸氧化酶的第58位苯丙氨酸被组氨酸取代;和/或
所述D‑氨基酸氧化酶的第216位蛋氨酸被丝氨酸取代。
2.如权利要求1所述的突变体,其特征在于,还包括:
所述D‑氨基酸氧化酶的第116位精氨酸被缬氨酸取代;和/或
所述D‑氨基酸氧化酶的第319位赖氨酸被苏氨酸取代。
3.如权利要求1或2所述的突变体,其特征在于,包括:
(a)、所述D‑氨基酸氧化酶来源于鲑色酵母;和/或
(b)、所述D‑氨基酸氧化酶具有特定氨基酸序列;和/或
(c)、所述D‑氨基酸氧化酶的基因具有特定核苷酸序列;
所述特定氨基酸序列包括:
(I)、如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列;或
(II)、如(I)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列,且功能与(I)的相同或相似;或
(III)、与如(I)或(II)所示的氨基酸序列至少有70%同源性的氨基酸序列;
所述多个为2个至110个;
所述特定核苷酸序列包括:
(IV)、如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列;或
(V)、如(IV)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个基获得的核苷酸序列,且功能与(IV)的相同或相似;或
(VI)、与如(IV)或(V)所示的核苷酸序列至少有70%同源性的核苷酸序列;
所述多个为2个至330个。
4.如权利要求1至3任一项所述的突变体,其特征在于,具有:
(1)、如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.10、任一所示的氨基酸序列;或
(2)、如(1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列,且功能与(1)的相同或相似;或
(3)、与如(1)或(2)所示的氨基酸序列至少有70%同源性的氨基酸序列;
所述多个为2个至110个。
5.编码如权利要求1至4任一项所述的突变体的核酸分子,其特征在于,具有:
(4)、如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.9、任一所示的核苷酸序列;或
(5)、如(5)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列,且功能与(5)的相同或相似;或
(6)、与如(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有70%同源性的核苷酸序列;
所述多个为2个至330个。
6.表达载体,其特征在于,包括如权利要求5所述的核酸分子,以及可接受的基因元件。
7.宿主细胞,其特征在于,包括如权利要求5所述的核酸分子或包括如权利要求6所述的表达载体。
8.如权利要求1至4任一项所述的突变体、如权利要求5所述的核酸分子、如权利要求6所述的表达载体和/或如权利要求7所述的宿主细胞在如下方面中的应用:
(i)、提高D‑草铵膦转化为2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的转化率;和/或(ii)、L‑草铵膦的合成。
9.2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的合成方法,其特征在于,包括将草铵膦与如下任意项混合,反应,获得所述2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸:
(A)、如权利要求1至4任一项所述的突变体;和/或
(B)、如权利要求7所述的宿主细胞。
10.如权利要求9所述的合成方法,其特征在于,所述反应的温度为20~37℃;和/或所述反应的时间为2~24h;和/或
所述反应在浓度为10~300mM的磷酸盐缓冲液中进行;和/或
所述磷酸盐缓冲液的pH为7.5~9.0;和/或
所述突变体的浓度为0.1~10g/L;和/或
所述突变体的酶活性为3.7~9.7U/mL;和/或
所述宿主细胞的湿重为100g/L。

说明书全文

酶突变体及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物催化技术领域,特别涉及酶突变体及其应用。

背景技术

[0002] D‑基酸化酶(DAAO)是一类含有黄素腺嘌呤二核苷酸的氧化还原酶,能够催化D‑氨基酸氧化脱氢,生成相应的α‑酸、过氧化氢和氨。该类酶在自然界中分布广泛,主要来源于真核生物和少数原核生物。作为一种经典的生物催化剂,D‑氨基酸氧化酶具有反应条件温和、底物谱广泛、对映体选择性好等特点,在合成医药、农药和精细化学品等方面具有重要的应用价值。
[0003] D‑氨基酸氧化酶目前已经广泛应用于L‑草铵膦(L‑PPT)的制备,L‑草铵膦是消旋体草铵膦发挥除草活性的主要活性物质,因此,L‑草铵膦替代消旋体草铵膦,可以节约一半的草铵膦用量,从而降低农药的使用量,减少农民的除草成本。Green等利用RgDAAO和大肠杆菌来源转氨酶EcgabT进行去消旋化反应,将DL‑草铵膦转化成了L‑草铵膦,转化率达85%,ee值>99%。薛亚平等利用RgDAAO和假单胞杆菌转氨酶进行去消旋化反应,将DL‑草铵膦转化成了L‑草铵膦,D‑草铵膦(D‑PPT)剩余0.8mM,转化率48.4%(其中,最大理论转化率为50%),2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸(PPO)的生成浓度为20mM。田振华等基于红酵母属来源的DAAO,利用定点突变技术,提高了DAAO酶活性、酶活稳定性提高和/或耐铵性增强。谢新开等利用基因突变和酶定向进化技术,对上述3个来源的DAAO进行了修饰,获得了具有更高的稳定性和/或对D‑草铵膦具有更高活性的DAAO。杨立荣等利用粗糙脉孢菌NcDAAO和假单胞菌GluDH进行去消旋化反应,将DL‑草铵膦转化成了L‑草铵膦,20mM底物浓度条件下,D‑草铵膦转化率99.4%,ee值=99.1%。程峰等利用天冬氨酸氧化酶CeDAAO和谷氨酸脱氢酶突变体,将DL‑草铵膦转化成了L‑草铵膦,底物D,L‑草铵膦转化率达到98.6%,产物ee值达99%。夏仕文等利用解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX‑2全细胞中的D‑氨基酸氧化酶催化D‑草铵膦氧化脱氨为2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸(PPO),L‑草铵膦保留,反应总收率>70%,光学纯度>99%。
[0004] 利用D‑氨基酸氧化酶进行D,L‑草铵膦拆分制备L‑草铵膦已经成为了目前的研究热点。因此,提高PPO收率具有重要意义。

发明内容

[0005] 有鉴于此,本发明提供酶突变体及其应用,具有高酶活、高转化率的特点,可高效制备2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸,产物收率高。
[0006] 为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
[0007] 本发明提供了D‑氨基酸氧化酶的突变体,包括:
[0008] 所述D‑氨基酸氧化酶的第54位天冬酰胺被缬氨酸取代;和/或
[0009] 所述D‑氨基酸氧化酶的第56位半胱氨酸被天冬酰胺取代;和/或
[0010] 所述D‑氨基酸氧化酶的第58位苯丙氨酸被组氨酸取代;和/或
[0011] 所述D‑氨基酸氧化酶的第216位蛋氨酸被丝氨酸取代。
[0012] 在本发明的一些具体实施方案中,上述突变体还包括:
[0013] 所述D‑氨基酸氧化酶的第116位精氨酸被缬氨酸取代;和/或
[0014] 所述D‑氨基酸氧化酶的第319位赖氨酸被苏氨酸取代。
[0015] 在本发明的一些具体实施方案中,上述突变体包括:
[0016] (a)、所述D‑氨基酸氧化酶来源于鲑色掷酵母;和/或
[0017] (b)、所述D‑氨基酸氧化酶具有特定氨基酸序列;和/或
[0018] (c)、所述D‑氨基酸氧化酶的基因具有特定核苷酸序列;
[0019] 所述特定氨基酸序列包括:
[0020] (I)、如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列;或
[0021] (II)、如(I)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列,且功能与(I)的相同或相似;或
[0022] (III)、与如(I)或(II)所示的氨基酸序列至少有70%同源性的氨基酸序列;
[0023] 所述多个为2个至110个;
[0024] 所述特定核苷酸序列包括:
[0025] (IV)、如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列;或
[0026] (V)、如(IV)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个基获得的核苷酸序列,且功能与(IV)的相同或相似;或
[0027] (VI)、与如(IV)或(V)所示的核苷酸序列至少有70%同源性的核苷酸序列;
[0028] 所述多个为2个至330个。
[0029] 在本发明的一些具体实施方案中,上述突变体具有:
[0030] (1)、如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.10、任一所示的氨基酸序列;或
[0031] (2)、如(1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列,且功能与(1)的相同或相似;或
[0032] (3)、与如(1)或(2)所示的氨基酸序列至少有70%同源性的氨基酸序列;
[0033] 所述多个为2个至110个。
[0034] 本发明还提供了编码上述突变体的核酸分子,其具有:
[0035] (4)、如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.9、任一所示的核苷酸序列;或
[0036] (5)、如(5)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列,且功能与(5)的相同或相似;或
[0037] (6)、与如(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有70%同源性的核苷酸序列;
[0038] 所述多个为2个至330个。
[0039] 本发明还提供了表达载体,包括上述核酸分子,以及可接受的基因元件。
[0040] 本发明还提供了宿主细胞,包括上述核酸分子或上述表达载体。
[0041] 本发明还提供了上述突变体、上述核酸分子、上述表达载体和/或上述宿主细胞在如下方面中的应用:
[0042] (i)、提高D‑草铵膦转化为2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的转化率;和/或[0043] (ii)、L‑草铵膦的合成。
[0044] 本发明还提供了2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的合成方法,包括将草铵膦与如下任一项混合,反应,获得所述2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸:
[0045] (A)、上述突变体;和/或
[0046] (B)、上述宿主细胞。
[0047] 在本发明的一些具体实施方案中,上述合成方法,所述反应的温度为20~37℃;和/或
[0048] 所述反应的时间为2~24h;和/或
[0049] 所述反应在浓度为10~300mM的磷酸盐缓冲液中进行;和/或
[0050] 所述磷酸盐缓冲液的pH为7.5~9.0;和/或
[0051] 所述突变体的浓度为0.1~10g/L;和/或
[0052] 所述突变体的酶活性为3.7~9.7U/mL;和/或
[0053] 所述宿主细胞的湿重为100g/L。
[0054] 本发明的突变体和应用有如下效果:
[0055] 本发明针对现有氨基酸氧化酶催化制备2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的工艺,提供了一种新型D‑氨基酸氧化酶突变体及其应用;该突变体具有高酶活、高转化率的特点,可高效制备2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸,催化获得的产物收率高,产物可作为底物直接一锅法继续生产L‑草铵膦。
[0056] 其中,高酶活是指突变体SS‑1酶活为3.7U/mL发酵液,通过引入不同的突变位点,突变体SS‑4的酶活提升至6.5U/mL发酵液。
[0057] 高转化率是指利用突变体SS‑4制备的酶催化液,进行了制备2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸实验,7h反应后转化率达到99.6%。附图说明
[0058] 为了更清楚地说明本发明实施例现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0059] 图1示DAAO‑SS‑4突变体催化试验液相图;其中,A为色谱图;B为液相色谱具体数据;
[0060] 图2示DAAO‑SS‑4突变体催化试验反应进行曲线。

具体实施方式

[0061] 本发明公开了酶突变体及其应用,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
[0062] 本发明利用来源于鲑色锁掷酵母(GenBank登录号CEQ39319.1)的野生型ssDAAO酶,通过增加优选的突变位点的基础上,然后构建用于蛋白表达的大肠杆菌工程菌株,该突变菌种破胞液具有催化D‑草铵膦生成2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸能。然后,发明人通过10L发酵罐的发酵试验,验证了酶活的提升。进一步地,开展了50g/L底物草铵膦的催化试验,结果显示D‑草铵膦剩余0.31mM,转化率99.6%。
[0063] 本发明提供了2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的合成方法,包括以下步骤:以草铵膦2‑氨基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸为底物,利用氨基酸氧化酶或所述的氨基酸氧化酶突变体进行催化反应,反应产物为2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸。
[0064] 在本发明的一些具体实施方案中,上述合成方法所述氨基酸氧化酶来源于来源于鲑色锁掷酵母(Sporidiobolus salmonicolor)。
[0065] 在本发明的一些具体实施方案中,上述合成方法所述来源于鲑色锁掷酵母的野生型氨基酸氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示;
[0066] 野生型ssDAAO酶突变体SS‑1的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示;
[0067] 野生型ssDAAO酶突变体SS‑2的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示;
[0068] 野生型ssDAAO酶突变体SS‑3的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示;
[0069] 野生型ssDAAO酶突变体SS‑4的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示;
[0070] 在本发明的一些具体实施方案中,上述合成方法所述氨基酸氧化酶的N端和/或C端连接标签。
[0071] 在本发明的一些具体实施方案中,上述合成方法所述氨基酸氧化酶的突变体包括:对SEQ ID No.2所示的氨基酸序列进行以下点突变:N54V和/或C56N和/或F58H和/或M216S;对SEQ ID No.4所示的氨基酸序列进行如下点突变中的至少一种:R116V、K319T。
[0072] 在本发明的一些具体实施方案中,上述合成方法所述氨基酸氧化酶或所述氨基酸氧化酶的突变体以粗酶液、粗酶液冻干粉、纯酶或全细胞的形式加入。
[0073] 在本发明的一些具体实施方案中,上述合成方法所述催化反应的温度为20~37℃,所述催化反应的时间为2~24h。
[0074] 在本发明的一些具体实施方案中,上述合成方法当所述醇脱氢酶是以粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶的形式加入时,所述氨基酸氧化酶在反应体系中的浓度为0.1g/L~10g/L;当所述醇脱氢酶以全细胞的形式加入时,所述全细胞的湿重为100g/L。
[0075] 在本发明的一些具体实施方案中,上述合成方法所述催化反应在浓度为10~300mM,pH值为7.5~9.0的磷酸盐缓冲液中进行。
[0076] 在本发明的一些具体实施方案中,上述合成方法当所述氨基酸氧化酶是以粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶的形式加入时,所述催化反应的反应体系中除了含有去除副产物的过氧化氢酶外,还需要通入氧气或者空气。
[0077] 本发明所涉及的核苷酸/氨基酸序列如表1所示:
[0078] 表1
[0079]
[0080]
[0081]
[0082] 如无特殊说明,本发明涉及的原料、试剂、耗材以及仪器皆为普通市售品,均可由市场购得。
[0083] 下面结合实施例,进一步阐述本发明:
[0084] 制备例
[0085] 1、野生型DAAO酶的制备过程:
[0086] NCBI检索到GenBank登录号CEQ39319.1为的来源于鲑色锁掷酵母(Sporidiobolus salmonicolor)的ssDAAO酶野生型的核苷酸序列为SEQ ID NO.1,氨基酸序列为SEQ ID NO.2,全基因合成野生型ssDAAO酶基因,基因合成杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成。
[0087] 根据SEQ ID NO.1,设计ssDAAO酶基因全长扩增引物,在5’端引入NdeI限制性内切酶位点,在3’端引入XhoI限制性内切酶位点。利用高保真PCR酶扩增ssDAAO全长片段。pET28a空载体质粒由杭州擎科梓熙生物技术有限公司提供。利用PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物。PCR产物纯化试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
[0088] 利用NdeI‑XhoI双酶切纯化后的PCR产物,同步地,利用NdeI‑XhoI双酶切纯化后的pET28a空载体质粒。利用浓度为0.7%琼脂糖凝胶电泳,验证酶切片段大小。利用T4 ligase进行片段连接,T4 ligase购自Takara公司。利用连接产物转化E coli.BL21(DE3)细胞,E coli.BL21(DE3)细胞购自北京全式金生物技术有限公司,将转化产物涂布含有50μg/L kan(硫酸卡那霉素)的LB固体培养基。利用菌落PCR方法,检测阳性转化子,阳性转化子将用于诱导产生DAAO酶。
[0089] 2、DAAO酶突变体的设计和筛选步骤
[0090] 在野生型ssDAAO酶氨基酸序列的基础上,进一步增加突变位点,安装突变体序列委托杭州擎科梓熙进行序列合成,氨基酸序列编号如表2所示,并依照前述方法进行菌株构建。
[0091] 表2
[0092] 编号 突变位点 核苷酸编号 氨基酸编号SS‑1 N54V‑C56N‑F58H‑M216S SEQ ID NO.3 SEQ ID NO.4
SS‑2 N54V‑C56N‑F58H‑R116V‑M216S SEQ ID NO.5 SEQ ID NO.6
SS‑3 N54V‑C56N‑F58H‑M216S‑K319T SEQ ID NO.7 SEQ ID NO.8
SS‑4 N54V‑C56N‑F58H‑R116V‑M216S‑K319T SEQ ID NO.9 SEQ ID NO.10[0093] 将各个单菌落分别接种至装有20mL含50μg/mL Kan LB液体培养基的50mL三瓶中,37℃150rpm振荡培养16h后,按2%的接种比例再加入20mL含50μg/mL Kan LB培养基,37℃150rpm振荡培养4h,添加100μL的100mM IPTG,28℃150rpm诱导表达6h后,离心去除发酵上清液,菌泥利用BugBuster蛋白提取液(购于Novagen公司)进行处理,进行D‑氨基酸氧化酶酶活检测。
[0094] 3、不同DAAO突变体酶活检测
[0095] 酶标仪检测方法:取100μL pH为8.0的100mM底物(消旋草铵膦,购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司),再加50μL的显色液(含60μg/mL的TBHBA(3‑羟基‑2,4,6‑三溴苯甲酸)和1mg/mL的4‑AAP(4‑氨基安替比林))和25μL HRP(辣根过氧化物酶,0.1mg/mL),最后加25μL的上述DAAO突变体酶液,得酶标板200μL反应体系,在30℃,pH 8.0的条件下对其进行分析。分别在0min和20min记录510nm处的吸光度,取差值,以野生型为参照系,筛选阳性克隆子。结果如表3所示。
[0096] 表3
[0097]
[0098] 4、发酵放大
[0099] 在10升发酵罐中分布进行大肠杆菌DAAO‑SS‑1和大肠杆菌DAAO‑SS‑4的发酵,加入发酵所需培养基配方为:动物蛋白胨10g/L,酵母浸粉5g/L,氯化钠10g/L,消泡剂0.05%。
[0100] 发酵过程大致分为3个阶段:
[0101] (1)培养阶段:1%种子液接种,37℃培养,前期搅拌从200rpm开始,每隔半小时调3
整一次,至500rpm时维持状态;通气量从0.2m/h开始,和搅拌同步每隔半小时调整一次,至
3
2m/h时维持状态,该阶段总共历时4h;
[0102] (2)补料阶段:待溶氧回升,pH升高时开始补料葡萄糖(500g/L),补料速度根据pH变化调节,过酸用氨调节,维持整个培养状态,该阶段总共历时1h;
[0103] (3)诱导阶段:测得发酵液OD600在6~10左右时,开始降温诱导,诱导剂选择IPTG浓度0.1%,温度28℃,转速500rpm,此间继续补加葡萄糖,诱导持续18h,下罐,离心收取湿菌体。
[0104] 通过测定不同时间发酵液中D‑氨基酸氧化酶活力,可得发酵进程曲线。发酵结果显示,出发菌种大肠杆菌DAAO‑SS‑1最终发酵液的D‑氨基酸氧化酶酶活为5.3U/mL,而突变菌株大肠杆菌DAAO‑SS‑4最终发酵液的D‑氨基酸氧化酶酶活为9.7U/mL,比出发菌提高了83.0%,取得了意料不到的技术效果。
[0105] 实施例1:DAAO突变体(DAAO‑SS‑1)催化反应试验
[0106] 将制备例所述突变菌株大肠杆菌DAAO‑SS‑1发酵液离心收集湿菌体,将湿菌体称重,按10%(wt%)将湿菌体重新悬浮于50mM pH 8.0磷酸缓冲液中,利用声波破碎仪(功率400W,开15s停15s脉冲处理30min)浴下进行破胞,4℃,8000rpm离心15min,弃沉淀,上清即为DAAO突变体粗酶液,备用。
[0107] 反应体系:将10g D,L‑草铵膦铵盐(自己实验室制备,纯度≥95%)溶解到一定量的水中,放入4口烧瓶中,加入20mL DAAO‑SS‑1突变体粗酶液,加入1mL过氧化氢酶(50000U/mL,外购),加水定容至200mL,通入氧气(1VVM),开启搅拌200rpm开始反应,过程中控制pH在7.0~8.0的范围,按每隔1小时取样,直至7h反应结束。经检测反应终点样品D‑草铵膦剩余
17.48mM,转化率91.3%。
[0108] 实施例2:DAAO突变体(DAAO‑SS‑2)催化反应试验
[0109] 将制备例所述突变菌株大肠杆菌DAAO‑SS‑2发酵液离心收集湿菌体,将湿菌体称重,按10%(wt%)将湿菌体重新悬浮于50mM pH 8.0磷酸缓冲液中,利用超声波破碎仪(功率400W,开15s停15s脉冲处理30min)冰浴下进行破胞,4℃8000rpm离心15min,弃沉淀,上清即为DAAO突变体粗酶液,备用。
[0110] 反应体系:将10g D,L‑草铵膦铵盐(自己实验室制备,纯度≥95%)溶解到一定量的水中,放入4口烧瓶中,加入20mL DAAO‑SS‑2突变体粗酶液,加入1mL过氧化氢酶(50000U/mL,外购),加水定容至200mL,通入氧气(1VVM),开启搅拌200rpm开始反应,过程中控制pH在7.0~8.0的范围,按每隔1小时取样,直至7h反应结束。经检测反应终点样品D‑草铵膦剩余
11.92mM,转化率94.1%。
[0111] 实施例3:DAAO突变体(DAAO‑SS‑3)催化反应试验
[0112] 将制备例所述突变菌株大肠杆菌DAAO‑SS‑3发酵液离心收集湿菌体,将湿菌体称重,按10%(wt%)将湿菌体重新悬浮于50mM pH 8.0磷酸缓冲液中,利用超声波破碎仪(功率400W,开15s停15s脉冲处理30min)冰浴下进行破胞,4℃,8000rpm离心15min,弃沉淀,上清即为DAAO突变体粗酶液,备用。
[0113] 反应体系:将10g D,L‑草铵膦铵盐(自己实验室制备,纯度≥95%)溶解到一定量的水中,放入4口烧瓶中,加入20mL DAAO‑SS‑3突变体粗酶液,加入1mL过氧化氢酶(50000U/mL,外购),加水定容至200mL,通入氧气(1VVM),开启搅拌200rpm开始反应,过程中控制pH在7.0~8.0的范围,按每隔1小时取样,直至7h反应结束。经检测反应终点样品D‑草铵膦剩余
3.87mM,转化率98.1%。
[0114] 实施例4:DAAO突变体(DAAO‑SS‑4)催化反应试验
[0115] 将制备例所述突变菌株大肠杆菌DAAO‑SS‑4发酵液离心收集湿菌体,将湿菌体称重,按10%(wt%)将湿菌体重新悬浮于50mM pH 8.0磷酸缓冲液中,利用超声波破碎仪(功率400W,开15s停15s脉冲处理30min)冰浴下进行破胞,4℃,8000rpm离心15min,弃沉淀,上清即为DAAO突变体粗酶液,备用。
[0116] 反应体系:将10g D,L‑草铵膦铵盐(自己实验室制备,纯度≥95%)溶解到一定量的水中,放入4口烧瓶中,加入20mL DAAO‑SS‑4突变体粗酶液,加入1mL过氧化氢酶(50000U/mL,外购),加水定容至200mL,通入氧气(1VVM),开启搅拌200rpm开始反应,过程中控制pH在7.0~8.0的范围,按每隔1小时取样,直至7h反应结束。经检测反应终点样品D‑草铵膦剩余
0.31mM,转化率99.6%。
[0117] 在DAAO‑SS‑4突变体催化试验中,通过高效液相色谱跟踪检测反应过程不同时间取样中各关键组分含量,并绘制成反应进行曲线,其中PPT出峰时间(3.315min),PPO出峰时间(6.780min)。图1示第7小时的液相图,反应进行曲线如图2所示,其数据如表4所示。
[0118] 表4
[0119]时间 L‑PPT(mM) D‑PPT(mM) PPO(mM)
0 124.15 124.11 0.0
1.0 125.37 102.25 23.51
2.0 124.58 77.92 46.37
3.0 125.47 41.23 84.72
4.0 125.73 16.23 109.07
5.0 125.33 7.41 117.31
6.0 125.61 0.58 124.83
7.0 125.49 0.31 125.36
[0120] 对比例:野生型DAAO(DAAO‑SS)催化反应试验
[0121] 将野生型菌株大肠杆菌DAAO‑SS发酵液离心收集湿菌体,将湿菌体称重,按10%(wt%)将湿菌体重新悬浮于50mM pH 8.0磷酸缓冲液中,利用超声波破碎仪(功率400W,开15s停15s脉冲处理30min)冰浴下进行破胞,4℃,8000rpm离心15min,弃沉淀,上清即为DAAO突变体粗酶液,备用。
[0122] 反应体系:将10g D,L‑草铵膦铵盐(自己实验室制备,纯度≥95%)溶解到一定量的水中,放入4口烧瓶中,加入20mL DAAO‑SS野生型菌株粗酶液,加入1mL过氧化氢酶(50000U/mL,外购),加水定容至200mL,通入氧气(1VVM),开启搅拌200rpm开始反应,过程中控制pH在7.0~8.0的范围,按每隔1小时取样,直至7h反应结束。经检测反应终点样品D‑草铵膦剩余237.43mM,转化率5.35%。
[0123] 以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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