一种从辅酶Q10发酵粉中高效提纯磷脂的方法专利检索-含有金属或除HNCOS或卤素之外的其他原子的有机化合物的制备专利检索查询-专利查询网

一种从辅酶Q10 发酵粉中高效提纯磷脂的方法
申请号	CN202211273269.8	申请日	2022-10-18	公开(公告)号	CN115449530A	公开(公告)日	2022-12-09
申请人	湖南祥民制药有限公司;			发明人	吴新明; 蒋奇;
摘要	本发明属于菌体磷脂提取领域，具体公开了一种从辅酶Q10 发酵粉中高效提纯磷脂的方法，包括以下步骤：1)母液培养、2) 种子罐培养、3) 发酵罐培养、4)发酵液离心、5)高压匀浆、6)菌体破碎液离心、7) 真空冷冻干燥、8)亚临界萃取、9)丙酮萃取、10)旋转蒸发；本发明通过调整培养基成分和优化培养工艺，能够实现对根癌农杆菌菌体的高密度培养，获得大量菌体，发酵液中，辅酶Q10含量可达5.1g/L发酵液,磷脂含量可达13.5g/L发酵液,并且本方法还公开了可以高效的从辅酶Q10发酵粉中提取出高纯度的磷脂的分离提纯方法，变废为宝，经济效益好，并且步骤简单温和，对设备要求低，绿色环保。
权利要求	1.一种从辅酶Q10 发酵粉中高效提纯磷脂的方法，其特征在于，包括以下步骤： 3 1)母液培养：将根癌农杆菌稀释至1‑5x10 个/mL后接种0.1‑1mL至斜面培养基上，将斜面培养基置于温度为30‑34℃，相对湿度为45％‑55％的培养箱中培养2‑6d后，挑取1个菌落接种于母瓶培养基中，将母瓶培养基置于30‑34℃，相对湿度为45％‑55％，转速为220‑ 350rpm的摇床中培养24‑48h，得到母液菌种； 2)种子罐培养：将母液菌种按1‑3‰的接种量接种至种子罐中的种子罐培养基中，在 30‑35℃，罐压0.03‑0.05MPa，通气比0.3‑0.6，搅拌转速200‑250rpm，培养24‑48h，得到葡萄糖残量0.5‑1.0g/L，菌体形状均一，无菌良好的一级种子液； 3)发酵罐培养：将种子液按5‑10％的接种量接种至发酵罐中的发酵培养基，在35‑38℃，罐压0.03‑0.06MPa，通气比0.6‑0.8，搅拌转速110‑140rpm，培养24‑36h； 4)发酵液离心：将发酵液8000‑15000rpm低温离心10‑20min，取沉淀获得菌体； 5)高压匀浆：将菌体沉淀按固液比质量1:10‑20的比例加入菌体裂解液溶解后，加入高压匀浆机进行菌体破碎，收集菌体破碎液； 6)菌体破碎液离心：将菌体破碎液12000‑15000rpm低温离心，弃去沉淀，取上清； 7)真空冷冻干燥：对上清进行真空冷冻干燥，真空度小于133pa，温度低于‑50℃，得到干燥的发酵粉； 8)亚临界萃取：取干燥的发酵粉投入萃取罐中，将萃取罐内抽至真空状态后，加入萃取剂进行亚临界萃取，萃取结束后，将萃取所得含脂溶性成分的亚临界流体从萃取罐倒入脱溶罐中，进行加热减压蒸发，待溶剂脱除完毕，得粗提物； 9)丙酮萃取：将粗提物加入到质量分数50‑60％丙酮溶液中，4‑10℃冷却结晶4‑8h，随后0.45μm过滤，得滤饼； 10)旋转蒸发：将滤饼用去离子水冲洗后旋转蒸发水分和有机溶剂，得到磷脂。 2.根据权利要求1所述的一种从辅酶Q10发酵粉中高效提纯磷脂的方法，其特征在于，所述步骤1)斜面培养基的组成如下：蛋白胨8g/L、酵母浸膏5g/L、氯化钠3g/L、琼脂18g/L,pH值7.2、阿特拉津0.05g/L，pH值7.4。 3.根据权利要求1所述的一种从辅酶Q10发酵粉中高效提纯磷脂的方法，其特征在于，所述步骤2)种子罐培养基的组成如下：蔗糖35g/L、玉米浆15g/L、酵母浸膏10g/L、NaCl 3g/L,阿特拉津0.03g/L，pH值7.4。 4.根据权利要求1所述的一种从辅酶Q10发酵粉中高效提纯磷脂的方法，其特征在于，所述步骤3)发酵培养基的组成如下：蔗糖45g/L、玉米浆30g/L、酵母浸膏10g/L、NaCl 3g/L、磷酸二氢钠0.5g/L、磷酸氢二钠0.5g/L、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.02g/L。 5.根据权利要求1所述的一种从辅酶Q10发酵粉中高效提纯磷脂的方法，其特征在于，所述步骤5)高压匀浆中，工作压力1200‑1500Bar,匀浆3‑6次。 6.根据权利要求1所述的一种从辅酶Q10发酵粉中高效提纯磷脂的方法，其特征在于，所述步骤5)中的菌体裂解液组成如下：50mmol/L Tris‑Cl pH6.8,100mmol/L DTT,2％SDS, 0.1％溴酚蓝,10％甘油。 7.根据权利要求1所述的一种从辅酶Q10发酵粉中高效提纯磷脂的方法，其特征在于，所述步骤8)亚临界萃取中，所述真空状态指压力小于133Pa，所述萃取剂为乙醇。 8.如权利要求1‑7任一项所述的方法制备的磷脂。
说明书全文	一种从辅酶Q10 发酵粉中高效提纯磷脂的方法技术领域 [0001] 本发明属于菌体磷脂提取领域，具体公开了一种从辅酶Q10发酵粉中高效提纯磷脂的方法。背景技术 [0002] 辅酶Q10是呼吸链中NADH脱氢酶、琥珀酸脱氢酶和BC复合物之间的脂溶性电子载体，是ATP生成要素，在细胞线粒体内呼吸链质子转移及电子传递中起重要作用，是细胞呼吸和细胞代谢的激活剂，也是重要的抗氧化剂和非特异性免疫增强剂。由于辅酶Q10能增强体能和精力、保护心血管、减少降脂药的副作用、保护皮肤等功能，因此对于提高免疫力、延缓衰老、保健美容等方面也具有重要的应用价值。目前，辅酶Q10的制备方法主要有3种：提取分离法、化学合成法、生物合成法。提取分离法提取分离法主要从动物肝脏、心肌等和植物含油种籽或嫩芽、嫩叶中提取。提取法是现代生物工程中较为传统的生产方法，它的生产成本较高，原料也不易得到。 [0003] 化学合成法辅酶Q10化学合成法可分为全化学合成法和半化学合成法2种。全化学合成法是指不以来自烟草等的茄尼醇为原料，完全通过化学方法获得辅酶Q10侧链的合成方法。该方法原料价廉易得，产物区域选择性和立体选择性高，但是侧链的构建需要多次耦合，总收率低，难以实现工业化。半化学合成法主要有侧链直接引入法和侧链延长法，该方法均需要以天然茄尼醇为关键原料合成辅酶Q10，由于精品及纯品茄尼醇的价格十分昂贵，造成化学合成辅酶Q10成本高昂，同时具有合成步骤多、副产品多、手性物质分离困难等缺点，因此，化学合成法在工业生产中受到一定限制。 [0004] 生物合成法生物合成法是利用微生物细胞、植物细胞或动物细胞的生命活动而获得人们所需物质的技术过程。目前，辅酶Q10的生物合成方法包括利用植物细胞培和微生物细胞发酵两种方式。植物细胞培养主要是以烟草组织为材料，通过愈伤诱导、悬浮培养，产生生长速度快、辅酶Q10含量高的烟草悬浮培养细胞。1977年，日本首次实现了微生物发酵法工业化生产辅酶Q10。应用于产辅酶Q10的主要菌种有光合细菌、土壤杆菌、红假胞菌、裂殖酵母等。该方法具有原料廉价丰富，产物分离过程相对简单，不存在手性问题等优点，目前也有很多利用发酵法生产辅酶Q10的报道，如CN200910093966.3一种发酵生产辅酶Q10的方法，包括以下步骤：先将根癌土壤杆菌以5～15％的接种量，进行高密度好氧发酵60～84小时，发酵培养基组分为葡萄糖12～20％，硫酸铵0.5～1.5％，磷酸二氢钾0.1～0.5％，硫酸镁0.01～0.05％，玉米浆0.5～2.5％，磷酸氢二铵0.2～1％，pH6～7.5，发酵温度为28～31℃；然后将获得的发酵液进行分离，得分离菌体；最后将所述分离菌体重悬后，经回流、萃取，得辅酶Q10。其工艺简单，发酵液菌体浓度低，生产成本低，适用于大规模生产。还有，CN202011030403.2一种辅酶Q10的发酵方法，方法中分周期控制铵离子浓度，发酵培养基中添加赖氨酸盐并且在发酵过程中再次补入赖氨酸盐，发酵过程中补加一次硫酸钠。该发酵控制工艺使辅酶Q10产生菌的生长和代谢能力明显增强，菌体量明显增加，辅酶Q10发酵单位增长快，辅酶Q10放罐效价达到4000mg/L以上，发酵周期明显延长，菌体容易过滤收集，辅酶Q10的批产量大幅增加，明显降低了辅酶Q10的发酵成本。但是上述方法中，对于菌粉中的其它有效成分，如磷脂等，则以菌渣的形式废弃，或在皂化过程中被破坏，造成了磷脂的浪费。 [0005] 磷脂对活化细胞，维持新陈代谢，基础代谢及荷尔蒙的均衡分泌，增强人体的免疫力和再生力，都能发挥重大的作用。另外，磷脂还具有促进脂肪代谢，防止脂肪肝，降低血清胆固醇、改善血液循环、预防心血管疾病的作用。在辅酶Q10发酵菌粉中，磷脂含量在10％以上，是辅酶Q10含量的3倍以上。然而辅酶Q10和磷脂分子均具备长碳链结构和可形成氢键的官能团，想要高效地将磷脂从辅酶Q10发酵菌粉中分离出来存在较大的技术难度。而现有技术中也鲜有关于辅酶Q10发酵菌粉中磷脂提取技术的报道。发明内容 [0006] 为了解决上述问题，本发明公开了一种从辅酶Q10发酵粉中高效提纯磷脂的方法。 [0007] 本发明的技术方案如下： [0008] 一种从辅酶Q10发酵粉中高效提纯磷脂的方法，包括以下步骤： [0009] 1)母液培养：将根癌农杆菌稀释至1‑5x103个/mL后接种0.1‑1mL至斜面培养基上，将斜面培养基置于温度为30‑34℃，相对湿度为45％‑55％的培养箱中培养2‑6d后，挑取1个菌落接种于母瓶培养基中，将母瓶培养基置于30‑34℃，相对湿度为45％‑55％，转速为220‑350rpm的摇床中培养24‑48h，得到母液菌种； [0010] 2)种子罐培养：将母液菌种按1‑3‰的接种量接种至种子罐中的种子罐培养基中，在30‑35℃，罐压0.03‑0.05MPa，通气比0.3‑0.6，搅拌转速200‑250rpm，培养24‑48h，得到葡萄糖残量0.5‑1.0g/L，菌体形状均一，无菌良好的一级种子液； [0011] 3)发酵罐培养：将种子液按5‑10％的接种量接种至发酵罐中的发酵培养基，在35‑38℃，罐压0.03‑0.06MPa，通气比0.6‑0.8，搅拌转速110‑140rpm，培养24‑36h； [0012] 4)发酵液离心：将发酵液8000‑15000rpm低温离心10‑20min，取沉淀获得菌体； [0013] 5)高压匀浆：将菌体沉淀按固液比质量1:10‑20的比例加入菌体裂解液溶解后，加入高压匀浆机进行菌体破碎，收集菌体破碎液； [0014] 6)菌体破碎液离心：将菌体破碎液12000‑15000rpm低温离心，弃去沉淀，取上清； [0015] 7)真空冷冻干燥：对上清进行真空冷冻干燥，真空度小于133pa，温度低于‑50℃，得到干燥的发酵粉； [0016] 8)亚临界萃取：取干燥的发酵粉投入萃取罐中，将萃取罐内抽至真空状态后，加入萃取剂进行亚临界萃取，萃取结束后，将萃取所得含脂溶性成分的亚临界流体从萃取罐倒入脱溶罐中，进行加热减压蒸发，待溶剂脱除完毕，得粗提物； [0017] 9)丙酮萃取：将粗提物加入到质量分数50‑60％丙酮溶液中，4‑10℃冷却结晶4‑8h，随后0.45μm过滤，得滤饼； [0018] 10)旋转蒸发：将滤饼用去离子水冲洗后旋转蒸发水分和有机溶剂，得到磷脂。 [0019] 进一步的，上述一种从辅酶Q10发酵粉中高效提纯磷脂的方法，其特征在于，所述步骤1)斜面培养基的组成如下：蛋白胨8g/L、酵母浸膏5g/L、氯化钠3g/L、琼脂18g/L,pH值7.2、阿特拉津0.05g/L，pH值7.4。 [0020] 进一步的，上述一种从辅酶Q10发酵粉中高效提纯磷脂的方法，所述步骤2)种子罐培养基的组成如下：蔗糖35g/L、玉米浆15g/L、酵母浸膏10g/L、NaCl3g/L,阿特拉津0.03g/L，pH值7.4。 [0021] 进一步的，上述一种从辅酶Q10发酵粉中高效提纯磷脂的方法，所述步骤3)发酵培养基的组成如下：蔗糖45g/L、玉米浆30g/L、酵母浸膏10g/L、NaCl 3g/L、磷酸二氢钠0.5g/L、磷酸氢二钠0.5g/L、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.02g/L。 [0022] 进一步的，上述一种从辅酶Q10发酵粉中高效提纯磷脂的方法，所述步骤5)高压匀浆中，工作压力1200‑1500Bar,匀浆3‑6次。 [0023] 进一步的，上述一种从辅酶Q10发酵粉中高效提纯磷脂的方法，所述步骤5)中的菌体裂解液组成如下：50mmol/L Tris‑Cl pH 6.8,100mmol/L DTT,2％ SDS,0.1％溴酚蓝,10％甘油。 [0024] 进一步的，上述一种从辅酶Q10发酵粉中高效提纯磷脂的方法，所述步骤8)亚临界萃取中，所述真空状态指压力小于133Pa，所述萃取剂为乙醇。 [0025] 进一步的，上述方法制备的磷脂。 [0026] 相比现有技术，本发明具有如下有益效果: [0027] 本发明公开了一种从辅酶Q10发酵粉中高效提纯磷脂的方法，通过在母液培养和种子罐培养过程中添加微量的阿特拉津(2‑氯‑4‑乙胺基‑6‑异丙胺基‑1,3,5‑三嗪)，发现其可以有效地抑制杂菌生长，提高根癌农杆菌的发酵密度，获得更高的菌体密度和更大量的辅酶Q10和磷脂，进一步的，通过在种子培养基和发酵培养基中中添加高浓度的玉米浆，可以进一步增加其发酵密度；进一步的，通过对发酵液的菌体的破碎进行工艺优化，通过菌体破碎，冷冻干燥获得了高纯度的发酵粉，在此基础上，对发酵粉进行亚临界萃取，联合丙酮萃取，将辅酶Q10和磷脂尽量的分开，获得高纯度的磷脂，本发明能够变废为宝，经济效益好，并且分离步骤简单温和，对设备要求低，绿色环保。附图说明 [0028] 图1为本发明的工艺流程示意图； [0029] 图2为实施例和对比例的每升发酵液获得的湿菌体重量的比较； [0030] 图3为实施例和对比例的每升发酵液获得的辅酶Q10和磷脂的比较； [0031] 图4为实施例2以及对比例4和5的磷脂收获量的比较； [0032] 图5为实施例2以及对比例4和5的磷脂的纯度的比较。具体实施方式 [0033] 如图1所示的一种从辅酶Q10发酵粉中高效提纯磷脂的方法，包括以下步骤： [0034] 1)母液培养：将根癌农杆菌稀释至1‑5x103个/mL后接种0.1‑1mL至斜面培养基上，将斜面培养基置于温度为30‑34℃，相对湿度为45％‑55％的培养箱中培养2‑6d后，挑取1个菌落接种于母瓶培养基中，将母瓶培养基置于30‑34℃，相对湿度为45％‑55％，转速为220‑350rpm的摇床中培养24‑48h，得到母液菌种； [0035] 2)种子罐培养：将母液菌种按1‑3‰的接种量接种至种子罐中的种子罐培养基中，在30‑35℃，罐压0.03‑0.05MPa，通气比0.3‑0.6，搅拌转速200‑250rpm，培养24‑48h，得到葡萄糖残量0.5‑1.0g/L，菌体形状均一，无菌良好的一级种子液； [0036] 3)发酵罐培养：将种子液按5‑10％的接种量接种至发酵罐中的发酵培养基，在35‑38℃，罐压0.03‑0.06MPa，通气比0.6‑0.8，搅拌转速110‑140rpm，培养24‑36h； [0037] 4)发酵液离心：将发酵液8000‑15000rpm低温离心10‑20min，取沉淀获得菌体； [0038] 5)高压匀浆：将菌体沉淀按固液比质量1:10‑20的比例加入菌体裂解液溶解后，加入高压匀浆机进行菌体破碎，收集菌体破碎液； [0039] 6)菌体破碎液离心：将菌体破碎液12000‑15000rpm低温离心，弃去沉淀，取上清； [0040] 7)真空冷冻干燥：对上清进行真空冷冻干燥，真空度小于133pa，温度低于‑50℃，得到干燥的发酵粉； [0041] 8)亚临界萃取：取干燥的发酵粉投入萃取罐中，将萃取罐内抽至真空状态后，加入萃取剂进行亚临界萃取，萃取结束后，将萃取所得含脂溶性成分的亚临界流体从萃取罐倒入脱溶罐中，进行加热减压蒸发，待溶剂脱除完毕，得粗提物； [0042] 9)丙酮萃取：将粗提物加入到质量分数50‑60％丙酮溶液中，4‑10℃冷却结晶4‑8h，随后0.45μm过滤，得滤饼；粗提物与丙酮溶液的质量比为1:5‑10 [0043] 10)旋转蒸发：将滤饼用去离子水冲洗后旋转蒸发水分和有机溶剂，得到磷脂； [0044] 所述步骤1)斜面培养基的组成如下：蛋白胨8g/L、酵母浸膏5g/L、氯化钠3g/L、琼脂18g/L,pH值7.2、阿特拉津0.05g/L，pH值7.4； [0045] 所述步骤2)种子罐培养基的组成如下：蔗糖35g/L、玉米浆15g/L、酵母浸膏10g/L、NaCl 3g/L,阿特拉津0.03g/L，pH值7.4； [0046] 所述步骤3)发酵培养基的组成如下：蔗糖45g/L、玉米浆30g/L、酵母浸膏10g/L、NaCl 3g/L、磷酸二氢钠0.5g/L、磷酸氢二钠0.5g/L、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.02g/L； [0047] 所述步骤5)高压匀浆中，工作压力1200‑1500Bar,匀浆3‑6次； [0048] 所述步骤5)中的菌体裂解液组成如下：50mmol/L Tris‑Cl pH 6.8,100mmol/L DTT,2％ SDS,0.1％溴酚蓝,10％甘油。 [0049] 所述步骤8)亚临界萃取中，所述真空状态指压力小于133Pa，所述萃取剂为乙醇。 [0050] 下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。 [0051] 本发明实施例中使用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。 [0052] 实施例1 [0053] 如图1所示的一种从辅酶Q10发酵粉中高效提纯磷脂的方法，包括以下步骤： [0054] 1)母液培养：将根癌农杆菌稀释至1x103个/mL后接种0.1mL至斜面培养基上，将斜面培养基置于温度为30℃，相对湿度为45％的培养箱中培养2d后，挑取1个菌落接种于母瓶培养基中，将母瓶培养基置于30℃，相对湿度为45％，转速为220rpm的摇床中培养24h，得到母液菌种； [0055] 2)种子罐培养：将母液菌种按1‰的接种量接种至种子罐中的种子罐培养基中，在30℃，罐压0.03MPa，通气比0.3，搅拌转速200rpm，培养24h，得到葡萄糖残量0.5‑1.0g/L，菌体形状均一，无菌良好的一级种子液； [0056] 3)发酵罐培养：将种子液按5％的接种量接种至发酵罐中的发酵培养基，在35℃，罐压0.03MPa，通气比0.6，搅拌转速110rpm，培养24h； [0057] 4)发酵液离心：将发酵液8000rpm低温离心20min，取沉淀获得菌体； [0058] 5)高压匀浆：将菌体沉淀按固液比质量1:10的比例加入菌体裂解液溶解后，加入高压匀浆机进行菌体破碎，收集菌体破碎液； [0059] 6)菌体破碎液离心：将菌体破碎液12000rpm低温离心，弃去沉淀，取上清； [0060] 7)真空冷冻干燥：对上清进行真空冷冻干燥，真空度小于133pa，温度低于‑50℃，得到干燥的发酵粉； [0061] 8)亚临界萃取：取干燥的发酵粉投入萃取罐中，将萃取罐内抽至真空状态后，加入萃取剂进行亚临界萃取，萃取结束后，将萃取所得含脂溶性成分的亚临界流体从萃取罐倒入脱溶罐中，进行加热减压蒸发，待溶剂脱除完毕，得粗提物； [0062] 9)丙酮萃取：将粗提物加入到质量分数50％丙酮溶液中，4℃冷却结晶4h，随后0.45μm过滤，得滤饼；优选的，粗提物与丙酮溶液的质量比为1:5； [0063] 10)旋转蒸发：将滤饼用去离子水冲洗后旋转蒸发水分和有机溶剂，得到磷脂； [0064] 所述步骤1)斜面培养基的组成如下：蛋白胨8g/L、酵母浸膏5g/L、氯化钠3g/L、琼脂18g/L,pH值7.2、阿特拉津0.05g/L，pH值7.4； [0065] 所述步骤2)种子罐培养基的组成如下：蔗糖35g/L、玉米浆15g/L、酵母浸膏10g/L、NaCl 3g/L,阿特拉津0.03g/L，pH值7.4； [0066] 所述步骤3)发酵培养基的组成如下：蔗糖45g/L、玉米浆30g/L、酵母浸膏10g/L、NaCl 3g/L、磷酸二氢钠0.5g/L、磷酸氢二钠0.5g/L、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.02g/L； [0067] 所述步骤5)高压匀浆中，工作压力1200Bar,匀浆3次； [0068] 所述步骤5)中的菌体裂解液组成如下：50mmol/L Tris‑Cl pH 6.8,100mmol/LDTT,2％ SDS,0.1％溴酚蓝,10％甘油。 [0069] 所述步骤8)亚临界萃取中，所述真空状态指压力小于133Pa，所述萃取剂为乙醇。 [0070] 实施例2 [0071] 如图1所示的一种从辅酶Q10发酵粉中高效提纯磷脂的方法，包括以下步骤： [0072] 1)母液培养：将根癌农杆菌稀释至2x103个/mL后接种0.5mL至斜面培养基上，将斜面培养基置于温度为32℃，相对湿度为50％的培养箱中培养4d后，挑取1个菌落接种于母瓶培养基中，将母瓶培养基置于32℃，相对湿度为50％，转速为300rpm的摇床中培养36h，得到母液菌种； [0073] 2)种子罐培养：将母液菌种按2‰的接种量接种至种子罐中的种子罐培养基中，在33℃，罐压0.04MPa，通气比0.5，搅拌转速220rpm，培养36h，得到葡萄糖残量0.5‑1.0g/L，菌体形状均一，无菌良好的一级种子液； [0074] 3)发酵罐培养：将种子液按8％的接种量接种至发酵罐中的发酵培养基，在36℃，罐压0.05MPa，通气比0.7，搅拌转速130rpm，培养32h； [0075] 4)发酵液离心：将发酵液12000rpm低温离心15min，取沉淀获得菌体； [0076] 5)高压匀浆：将菌体沉淀按固液比质量1:15的比例加入菌体裂解液溶解后，加入高压匀浆机进行菌体破碎，收集菌体破碎液； [0077] 6)菌体破碎液离心：将菌体破碎液13500rpm低温离心，弃去沉淀，取上清； [0078] 7)真空冷冻干燥：对上清进行真空冷冻干燥，真空度小于133pa，温度低于‑50℃，得到干燥的发酵粉； [0079] 8)亚临界萃取：取干燥的发酵粉投入萃取罐中，将萃取罐内抽至真空状态后，加入萃取剂进行亚临界萃取，萃取结束后，将萃取所得含脂溶性成分的亚临界流体从萃取罐倒入脱溶罐中，进行加热减压蒸发，待溶剂脱除完毕，得粗提物； [0080] 9)丙酮萃取：将粗提物加入到质量分数55％丙酮溶液中，8℃冷却结晶6h，随后0.45μm过滤，得滤饼；粗提物与丙酮溶液的质量比为1:8； [0081] 10)旋转蒸发：将滤饼用去离子水冲洗后旋转蒸发水分和有机溶剂，得到磷脂； [0082] 所述步骤1)斜面培养基的组成如下：蛋白胨8g/L、酵母浸膏5g/L、氯化钠3g/L、琼脂18g/L,pH值7.2、阿特拉津0.05g/L，pH值7.4； [0083] 所述步骤2)种子罐培养基的组成如下：蔗糖35g/L、玉米浆15g/L、酵母浸膏10g/L、NaCl 3g/L,阿特拉津0.03g/L，pH值7.4； [0084] 所述步骤3)发酵培养基的组成如下：蔗糖45g/L、玉米浆30g/L、酵母浸膏10g/L、NaCl 3g/L、磷酸二氢钠0.5g/L、磷酸氢二钠0.5g/L、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.02g/L； [0085] 所述步骤5)高压匀浆中，工作压力1400Bar,匀浆4次； [0086] 所述步骤5)中的菌体裂解液组成如下：50mmol/L Tris‑Cl pH 6.8,100mmol/L DTT,2％SDS,0.1％溴酚蓝,10％甘油。 [0087] 所述步骤8)亚临界萃取中，所述真空状态指压力小于133Pa，所述萃取剂为乙醇。 [0088] 实施例3 [0089] 如图1所示的一种从辅酶Q10发酵粉中高效提纯磷脂的方法，包括以下步骤： [0090] 1)母液培养：将根癌农杆菌稀释至5x103个/mL后接种1mL至斜面培养基上，将斜面培养基置于温度为34℃，相对湿度为55％的培养箱中培养6d后，挑取1个菌落接种于母瓶培养基中，将母瓶培养基置于34℃，相对湿度为55％，转速为350rpm的摇床中培养48h，得到母液菌种； [0091] 2)种子罐培养：将母液菌种按1‑3‰的接种量接种至种子罐中的种子罐培养基中，在35℃，罐压0.05MPa，通气比0.6，搅拌转速250rpm，培养48h，得到葡萄糖残量1.0g/L，菌体形状均一，无菌良好的一级种子液； [0092] 3)发酵罐培养：将种子液按10％的接种量接种至发酵罐中的发酵培养基，在38℃，罐压0.06MPa，通气比0.8，搅拌转速140rpm，培养36h； [0093] 4)发酵液离心：将发酵液15000rpm低温离心20min，取沉淀获得菌体； [0094] 5)高压匀浆：将菌体沉淀按固液比质量1:20的比例加入菌体裂解液溶解后，加入高压匀浆机进行菌体破碎，收集菌体破碎液； [0095] 6)菌体破碎液离心：将菌体破碎液15000rpm低温离心，弃去沉淀，取上清； [0096] 7)真空冷冻干燥：对上清进行真空冷冻干燥，真空度小于133pa，温度低于‑50℃，得到干燥的发酵粉； [0097] 8)亚临界萃取：取干燥的发酵粉投入萃取罐中，将萃取罐内抽至真空状态后，加入萃取剂进行亚临界萃取，萃取结束后，将萃取所得含脂溶性成分的亚临界流体从萃取罐倒入脱溶罐中，进行加热减压蒸发，待溶剂脱除完毕，得粗提物； [0098] 9)丙酮萃取：将粗提物加入到质量分数60％丙酮溶液中，10℃冷却结晶8h，随后0.45μm过滤，得滤饼；粗提物与丙酮溶液的质量比为1:10； [0099] 10)旋转蒸发：将滤饼用去离子水冲洗后旋转蒸发水分和有机溶剂，得到磷脂； [0100] 所述步骤1)斜面培养基的组成如下：蛋白胨8g/L、酵母浸膏5g/L、氯化钠3g/L、琼脂18g/L,pH值7.2、阿特拉津0.05g/L，pH值7.4； [0101] 所述步骤2)种子罐培养基的组成如下：蔗糖35g/L、玉米浆15g/L、酵母浸膏10g/L、NaCl 3g/L,阿特拉津0.03g/L，pH值7.4； [0102] 所述步骤3)发酵培养基的组成如下：蔗糖45g/L、玉米浆30g/L、酵母浸膏10g/L、NaCl 3g/L、磷酸二氢钠0.5g/L、磷酸氢二钠0.5g/L、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.02g/L； [0103] 所述步骤5)高压匀浆中，工作压力1500Bar,匀浆6次； [0104] 所述步骤5)中的菌体裂解液组成如下：50mmol/L Tris‑Cl pH 6.8,100mmol/L DTT,2％ SDS,0.1％溴酚蓝,10％甘油。 [0105] 所述步骤8)亚临界萃取中，所述真空状态指压力小于133Pa，所述萃取剂为乙醇。 [0106] 对比例1 [0107] 一种从辅酶Q10发酵粉中高效提纯磷脂的方法，1)母液培养和2)种子罐培养中不含有阿特拉津0.05g/L，其他同实施例2 [0108] 对比例2 [0109] 一种从辅酶Q10发酵粉中高效提纯磷脂的方法，种子罐培养基和发酵培养基中使用蛋白胨代替玉米浆，其他同实施例2 [0110] 对比例3 [0111] 一种从辅酶Q10发酵粉中高效提纯磷脂的方法，1)母液培养和2)种子罐培养中不含有阿特拉津0.05g/L，种子罐培养基和发酵培养基中使用蛋白胨代替玉米浆，其他同实施例2。 [0112] 测试例1 [0113] 发酵测试 [0114] 本测试例对实施例1‑3以及对比例1‑3的发酵过程进行比较，比较最终获得的没升发酵液获得的湿菌体量(15000rpm离心后弃去上清)和辅酶Q10含量和磷脂含量。结果见表1和图2‑3。 [0115] 表1不同发酵过程的湿菌体产量，辅酶Q10以及磷脂含量 [0116]湿菌体量(g) 辅酶Q10(g) 磷脂含量(g) 实施例1 354 4.8 12.3 实施例2 365 5.0 12.6 实施例3 375 5.1 14.5 对比例1 245 3.1 6.7 对比例2 235 2.8 5.9 对比例3 212 2.9 5.4 [0117] 从表1和图2‑3的测试数据可以看出，通过在母液培养和种子罐培养过程中添加微量的阿特拉津(2‑氯‑4‑乙胺基‑6‑异丙胺基‑1,3,5‑三嗪)，发现其可以有效地抑制杂菌生长，提高根癌农杆菌的发酵密度，获得更高的菌体密度和更大量的辅酶Q10和磷脂，进一步的，通过在种子培养基和发酵培养基中中添加高浓度的玉米浆，可以进一步增加其发酵密度，两者共同作用可以发挥出比单一因素相加更显著的增产效果。 [0118] 对比例4 [0119] 一种从辅酶Q10发酵粉中高效提纯磷脂的方法，不采用5)高压匀浆，而使用超声破碎法，其他同实施例2 [0120] 对比例5 [0121] 一种从辅酶Q10发酵粉中高效提纯磷脂的方法，不采用8)亚临界萃取，而使用常压下乙醇萃取，其他同实施例2. [0122] 测试例2 [0123] 磷脂分离测试 [0124] 本测试例对实施例2以及对比例4和5的磷脂提纯过程进行比较，最终比较每升发酵液的经过分离提纯之后的磷脂的获得量和纯度(HPLC)。 [0125] 所述磷脂纯度测定中，使用HPLC法 [0126] 固定性为Hypersil Si‑5μ，流动相正己烷‑异丙醇‑水＝6:8:1(V/V/V)。 [0127] 结果见表2和图4和5。 [0128] 表2磷脂的收获量和纯度 [0129] 磷脂收获量(g) 纯度(％)实施例2 12.6 99.31 对比例4 8.6 96.23 对比例5 8.4 85.17 [0130] 从表2和图4‑5的测试数据可以看出，分离过程中的高压匀浆和亚临界萃取对于磷脂最终的得率和纯度都有较大的影响，高压匀浆相比超声，更适合从根癌农杆菌菌体中获得磷脂，并且使用亚临界萃取能够大大提高磷脂的获得纯度。 [0131] 发明的有限几种优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

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