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白千层醇合成酶Agr5突变体及编码基因
申请号	CN202410284440.8	申请日	2024-03-13	公开(公告)号	CN118048350A	公开(公告)日	2024-05-17
申请人	天津大学浙江研究院(绍兴);			发明人	卢亚莉; 闫晓光; 乔建军;
摘要	本发明公开了白千层醇合成酶Agr5突变体及编码基因，白千层醇合成酶Agr5突变体为下列之一：SEQ ID NO.16所示氨基酸序列第149位丝氨酸突变为异亮氨酸；SEQ ID NO.16所示氨基酸序列第149位丝氨酸突变为缬氨酸；SEQ ID NO.16所示氨基酸序列第149位丝氨酸突变为苯丙氨酸；SEQ ID NO.16所示氨基酸序列第149位丝氨酸突变为亮氨酸；本发明利用基因工程和酶工程的手段，提供了白千层醇合酶Agr5突变体及其编码基因，通过改变羟化过程，在酿酒酵母中合成α‑古芸烯、香橙烯、γ‑古芸烯、双环吉玛烯、喇叭茶醇、白千层醇，为工业化生产创造了条件。
权利要求	1.白千层醇合成酶Agr5突变体，其特征在于所述白千层醇合成酶Agr5突变体为下列之一： SEQ ID NO.16所示氨基酸序列第149位丝氨酸突变为异亮氨酸； SEQ ID NO.16所示氨基酸序列第149位丝氨酸突变为缬氨酸； SEQ ID NO.16所示氨基酸序列第149位丝氨酸突变为苯丙氨酸； SEQ ID NO.16所示氨基酸序列第149位丝氨酸突变为亮氨酸。 2.权利要求1所述白千层醇合成酶突变体的编码基因。 3.包含权利要求2白千层醇合成酶突变体的编码基因的重组质粒。 4.包含权利要求3重组质粒的工程菌。 5.权利要求4的工程菌发酵制备倍半萜类化合物的应用。 6.根据权利要求5所述的应用，其特征是包括如下步骤：将权利要求4的工程菌接种到尿嘧啶缺陷型选择性培养基中，在发酵24h时添加终浓度为10g/L的半乳糖进行蛋白的诱导表达，同时添加终体积浓度10％的正十二烷，继续培养，在发酵30h时添加终浓度为10g/L的无水乙醇，在发酵54h时添加终浓度为10g/L的无水乙醇，共发酵120h，得到倍半萜类化合物。 7.根据权利要求6所述的应用，其特征是所述倍半萜类化合物为α‑古芸烯、香橙烯、γ‑古芸烯、双环吉玛烯、喇叭茶醇和/或白千层醇。
说明书全文	白千层醇合成酶Agr5突变体及编码基因技术领域 [0001] 本发明属于酶基因工程及酶工程领域，具体涉及一种来源于茶树菇(Agrocybe aegerita)的白千层醇合成酶Agr5突变体及编码基因与应用。背景技术 [0002] 萜类化合物是化学结构极为复杂的一类次级代谢天然产物，其中倍半萜类化合物具有C15骨架构型，已经被广泛用于生物制药和香料等行业的开发应用中。一些羟化倍半萜，如白千层醇、荜澄茄醇和广藿香醇等具有独特的香味，且具有消炎和抑菌活性，应用十分广泛，其中一些分子已经获批成为食品添加剂用于风味调配。 [0003] 目前萜类化合物依旧通过植物提取或者化学合成为主，有限的自然资源限制了萜类化合物的高效生产。植物提取或者化学合成所得的一些倍半萜化合物成本较高，而合成生物学应用于萜类天然产物的高效生物合成，可以有效降低生产成本，利润可观。目前国内外已经有报道一些萜类化合物如橙花叔醇、荜澄茄醇和瓦伦烯等的高效生物合成。 [0004] 通过实验筛选获得了一系列白千层醇合成相关酶，其中白千层醇合成酶Agr5可催化形成白千层醇。其他候选酶还可以催化形成白千层烯等非羟基化产物。针对与Agr5有差异的位点进行突变，已经获得一些可以影响产羟基化的重要残基位点。一些突变体提高了白千层醇的催化效率，一些则改变了羟基化过程，形成了构型各异的倍半萜产物，喇叭茶醇、α‑古芸烯、香橙烯、γ‑古芸烯和双环吉玛烯等。其中喇叭茶醇可用于用于医药行业。白千层烯可作为作溶剂、清洗剂、除胶剂、调香剂、生物燃料和杀虫剂等。双环吉玛烯，具有自由基清除，抑菌作用。α‑古芸烯、香橙烯和γ‑古芸烯多存在于天然植物精油中，具有抑菌效果。 [0005] 但目前的白千层醇合成酶Agr5催化形成白千层醇的产量低。发明内容 [0006] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供白千层醇合成酶Agr5突变体。 [0007] 本发明的第二个目的是提供上述白千层醇合成酶Agr5突变体的编码基因。 [0008] 本发明的第三个目的是提供包含上述编码基因的重组质粒。 [0009] 本发明的第四个目的是提供包含上述重组质粒的工程菌。 [0010] 本发明的第五个目的是提供上述工程菌发酵制备倍半萜类化合物的应用。 [0011] 本发明的技术方案概述如下： [0012] 白千层醇合成酶Agr5突变体，其特征在于所述白千层醇合成酶Agr5突变体为下列之一： [0013] SEQ ID NO.16所示氨基酸序列第149位丝氨酸突变为异亮氨酸； [0014] SEQ ID NO.16所示氨基酸序列第149位丝氨酸突变为缬氨酸； [0015] SEQ ID NO.16所示氨基酸序列第149位丝氨酸突变为苯丙氨酸； [0016] SEQ ID NO.16所示氨基酸序列第149位丝氨酸突变为亮氨酸。 [0017] 上述白千层醇合成酶突变体的编码基因。 [0018] 包含上述编码基因的重组质粒。 [0019] 包含上述重组质粒的工程菌。 [0020] 上述工程菌发酵制备倍半萜类化合物的应用。 [0021] 上述应用优选包括如下步骤：将上述工程菌接种到尿嘧啶缺陷型选择性培养基中，在发酵24h时添加终浓度为10g/L的半乳糖进行蛋白的诱导表达，同时添加终体积浓度10％的正十二烷，继续培养，在发酵30h时添加终浓度为10g/L的无水乙醇，在发酵54h时添加终浓度为10g/L的无水乙醇，共发酵120h，得到倍半萜类化合物。 [0022] 上述倍半萜类化合物为α‑古芸烯、香橙烯、γ‑古芸烯、双环吉玛烯、喇叭茶醇和/或白千层醇。 [0023] 本发明的优点：本发明利用基因工程和酶工程的手段，提供了白千层醇合酶Agr5突变体及其编码基因，通过改变羟化过程，在酿酒酵母中合成α‑古芸烯、香橙烯、γ‑古芸烯、双环吉玛烯、喇叭茶醇、白千层醇，为工业化生产创造了条件。附图说明 [0024] 图1为白千层醇合成酶Agr5及其突变体的表达盒示意图。 [0025] 图2为白千层醇合成酶及其突变体菌株产物GC图。 [0026] 图3为白千层醇合成酶及其突变体菌株产物质谱图。具体实施方式 [0027] 以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。 [0028] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。引物和序列为北京擎科生物科技股份有限公司合成。 [0029] 实施例1 [0030] 构建白千层醇合成酶Agr5突变体。 [0031] 委托北京擎科生物科技股份有限公司合成来源于茶树菇(Agrocybe aegerita)白千层醇合成酶Agr5基因(SEQ ID NO.1)，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。 [0032] 利用PCR技术，以合成的白千层醇合成酶Agr5基因的核苷酸序列(SEQ ID No.1)为模板，设计引物并引入突变位点：S149I，S149V，S149F，S149L。对白千层醇合成酶Agr5基因进行定点突变。 [0033] SEQ ID NO.16所示氨基酸序列第149位丝氨酸突变为异亮氨酸，形成突变体S149I，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示； [0034] SEQ ID NO.16所示氨基酸序列第149位丝氨酸突变为缬氨酸，形成突变体S149V，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3，氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示； [0035] SEQ ID NO.16所示氨基酸序列第149位丝氨酸突变为苯丙氨酸，形成突变体S149F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4，氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示； [0036] SEQ ID NO.16所示氨基酸序列第149位丝氨酸突变为亮氨酸，形成突变体S149L，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5，其氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示。 [0037] Agr5‑F(SEQ ID NO.6)、Agr5‑R(SEQ ID NO.7)、A5M29‑F(SEQ ID NO.8)和A5M29‑R(SEQ ID NO.9)用于构建S149I突变体(SEQ ID No.17)； [0038] Agr5‑F、Agr5‑R、A5M39‑F(SEQ ID NO.10)和A5M39‑R(SEQ ID NO.11)用于构建S149V突变体(SEQ ID No.18)； [0039] Agr5‑F、Agr5‑R、A5M40‑F(SEQ ID NO.12)和A5M40‑R(SEQ ID NO.13)用于构建S149F突变体(SEQ ID No.19)； [0040] Agr5‑F、Agr5‑R、A5M41‑F(SEQ ID NO.14)和A5M41‑R(SEQ ID NO.15)用于构建S149L突变体(SEQ ID No.20)。 [0041] 实施例2 [0042] 构建包含上述白千层醇合成酶Agr5突变体的编码基因的重组质粒 [0043] 选择表达载体pESC‑URA(市售)空载质粒，使用限制性核酸内切酶BamHI和Hind III对空载质粒进行双酶切后经琼脂糖凝胶电泳验证后进行回收纯化，得到线性化的pESC‑URA。本发明并不仅限于该载体质粒，还可以是其他任何适合的载体质粒。 [0044] 然后使用诺唯赞Vazyme的同源重组酶CloneExpressⅡ对实施例1中构建的白千层醇合成酶Agr5(Agr5野生型)及各个突变体基因和酶切后的pESC‑URA空载质粒分别进行连接。混合好的连接混合物于37℃反应30min并导入大肠杆菌DH5α感受态。使用Agr5‑F/Agr5‑R引物进行PCR验证，将阳性条带对应的菌株送去DNA测序，得到阳性Agr5野生型及各个突变体重组质粒，见图1。 [0045] 实施例3 [0046] 包含实施例2重组质粒的工程菌的构建 [0047] 分别以实施例2构建的野生型和突变体重组质粒利用醋酸锂转化法导入酿酒酵母菌株CEN.PK2‑1C(市售)后涂布于尿嘧啶缺陷型选择性固体培养基(SD‑URA)平板，30℃培养箱培养2～3天，分别得到包含上述重组质粒的工程菌S149I，S149V，S149F，S149L以及白千层醇合成酶野生型表达菌株。 [0048] 尿嘧啶缺陷型选择性培养基配方： [0049] A液：称取20g 葡萄糖，用约800mL的蒸馏水充分溶解，使用盐酸溶液调节pH值至6.5，最后定容至900mL，在0.1Mpa，115℃条件下灭菌30min。 [0050] B液：称取2.0g尿嘧啶缺省混合粉末，6.7g无氨基酵母氮源(YNB)，用约80mL的无菌水充分溶解，使用盐酸溶液调节pH值至6.5，最后定容至100mL，在0.1Mpa，115℃条件下灭菌30min。使用尿嘧啶缺陷型选择性培养基，按照A液:B液＝9:1(体积)的比例混合。尿嘧啶缺省混合粉末组分如表1所示。 [0051] 表1尿嘧啶缺省混合粉末组分表 [0052] [0053] 实施例4 [0054] 菌株发酵及产物检测 [0055] 挑取实施例3中构建的重组酿酒酵母菌株进行摇瓶发酵，白千层醇合成酶Agr5野生型表达菌株作为对照。 [0056] 接单菌落于10mL尿嘧啶缺陷型选择性培养基中，于30℃摇床中220rpm培养16h。按初始OD600为0.05转接于50mL尿嘧啶缺陷型选择性培养基中，进行摇瓶发酵培养。在24h时添加终浓度为10g/L的半乳糖进行蛋白的诱导表达，同时添加终体积浓度10％的正十二烷发酵培养(以减少白千层醇等产物的损失)，在发酵30h时添加终体积浓度为10g/L的无水乙醇，在发酵54h时添加终体积浓度为10g/L的无水乙醇，共发酵120h。 [0057] 结果发现，与野生型表达菌株相比，突变体菌株改变了羟化过程，表达菌株产生了羟化倍半萜α‑古芸烯、香橙烯、γ‑古芸烯、双环吉玛烯、喇叭茶醇、白千层醇等，见图2，图3。野生型菌株及突变体菌株发酵产物如表2所示。 [0058] 表2白千层醇合酶Agr5及其突变体菌株发酵产物 [0059] [0060] (表2中的A5M29、A5M39、A5M40、A5M41为菌株的实验编号，依次与S149I、S149V、S149F、S149L对应) [0061] 以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

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