[0001] 本发明属于合成生物学技术领域，涉及一种瓦伦烯合酶突变体及其应用。

[0002] 瓦伦烯(valencene)是一种天然的倍半萜，伴有柑橘香味，是柑橘属的特征香气成分，常作为调味剂广泛应用于食品和饮料生产中，具有很高的经济价值。更重要的是，瓦伦烯可以作为前体生产另一种更高附加值的功能性倍半萜诺卡酮。诺卡酮不仅具有独特的葡萄柚香气，而且还具有杀虫、抗氧化、抗菌、抗炎、抗肿瘤等功效，广泛应用于食品、化妆品、医药等领域。充足的瓦伦烯供应对于维持诺卡酮的生产至关重要。

[0003] 目前，商业化的瓦伦烯是通过蒸馏柑橘油获得的，由于其在柑橘类水果中的含量少，导致瓦伦烯得率较低，并且瓦伦烯的质量、可用性和价格也容易受到土地利用和气候变化等环境因素的影响。近年来，随着合成生物学的快速发展，加速了微生物细胞工厂构建，为高附加值产品的合成提供了一种替代方法。已有报道在微生物中表达瓦伦烯合酶可以实现利用微生物细胞工厂异源生物合成瓦伦烯，但是所能达到的产量水平还很低。2014年，Beek wilder等人从北美金柏Callitropsis nootkatensi中发现瓦伦烯合酶CnVS，在野生型酵母中表达仅可合成瓦伦烯1.4mg/L。

[0004] 目前微生物工程菌株合成瓦伦烯的产量还比较低，难以满足市场需求，这其中主要的限制因素为瓦伦烯合酶活性不高，因此获得高活性的瓦伦烯合酶是高效生物合成瓦伦烯的主要瓶颈和研究热点，开发高活性的瓦伦烯合酶突变体对于瓦伦烯的生产和应用具有重要意义。

[0005] 针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种瓦伦烯合酶突变体及其应用，开发高活性的瓦伦烯合酶突变体。

[0006] 为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

[0007] 第一方面，本发明提供一种瓦伦烯合酶突变体，所述瓦伦烯合酶突变体的氨基酸序列包括以下序列中任意一种：

[0008] (1)在SEQ ID NO.3所示序列基础上发生如下突变：G435R、E496D、I443C、L561F、E489V、E306S、L550S、E306D、S471C、L550S、W310F、M445L、Y549F、S471V、K486C、L477I、L336I、T343F、R442N、R442K、F335Y、F335V、I420C、I340F、I420F、V485I、R572N、Y413F、R572S或Q472I中任意一种或至少两种组合的序列；或，

[0009] (2)由如(1)所述序列经取代、缺失或添加一个或至少两个氨基酸残基获得，且与(1)所述序列功能相同或相似的序列；或，

[0010] (3)与(1)或(2)所述序列具有至少90％序列同源性，且与(1)所述序列功能相同或相似的序列。

[0011] 本发明中，对来源北美金柏(Callitropsis nootkatensis)来源的瓦伦烯合酶CnVS进行改造，引入特定突变，能够显著提高其活性，为瓦伦烯的制备提供新型、有效的工具酶。

[0012] 本发明中，在野生型瓦伦烯合酶中引入特定突变，能够提高其聚合活性，最高可提高241％，可以理解，在所述瓦伦烯合酶突变体基础上，本领域技术人员能够利用本领域通用技术手段进行取代、缺失或添加一个或至少两个氨基酸残基获得功能相同或相似的其他序列。

[0013] SEQ ID NO.3：

[0014] MAEMFNGNSSNDGSSCMPVKDALRRTGNHHPNLWTDDFIQSLNSPYSDSSYHKHREILIDEIRDMFSNGEGDEFGVLENIWFVDVVQRLGIDRHFQEEIKTALDYIYKFWNHDSIFGDLNMVALGFRILRLNRYVASSDVFKKFKGEEGQFSGFESSDQDAKLEMMLNLYKASELDFPDEDILKEARAFASMYLKHVIKEYGDIQESKNPLLMEIEYTFKYPWRCRLPRLEAWNFIHIMRQQDCNISLANNLYKIPKIYMKKILELAILDFNILQSQHQHEMKLISTWWKNSSAIQLDFFRHRHIESYFWWASPLFEPEFSTCRINCTKLSTKMFLLDDIYDTYGTVEELKPFTTTLTRWDVSTVDNHPDYMKIAFNFSYEIYKEIASEAERKHGPFVYKYLQSCWKSYIEAYMQEAEWIASNHIPGFDEYLMNGVKSSGMRILMIHALILMDTPLSDEILEQLDIPSSKSQALLSLITRLVDDVKDFEDEQAHGEMASSIECYMKDNHGSTREDALNYLKIRIESCVQELNKELLEPSNMHGSFRNLYLNVGMRVIFFMLNDGDLFTHSNRKEIQDAITKFFVEPIIP。

[0015] 本发明中，术语“同源性”可以用肉眼或本领域通用计算机软件进行评价。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同一的。两个或多个序列之间的同源性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同源性。多聚核苷酸序列或氨基酸序列与另一序列有具有一定百分比(例如90％、95％、98％或者99％)的“序列同源性”是指当序列比对时，所比较的两个序列中该百分比的碱基或氨基酸相同。

[0016] 本发明中验证了30种单一位点突变、其中双位点组合突变以及三位点组合突变均能有效提高酶活性，可以理解，这30种单一位点突变中任意的至少两种的组合突变均能提高酶活性，均应在本发明保护范围内。

[0017] 优选地，(1)中所述组合包括G435R和E496D组合、E489V和E306D组合、L550S和I443C组合、L561F和Y549F组合、G435R、I443C和E496D组合或G435R、E496D和L561F组合中任意一种。

[0018] 第二方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的瓦伦烯合酶突变体。

[0019] 第三方面，本发明提供一种重组载体，所述重组载体含有第二方面所述的核酸分子。

[0020] 第四方面，本发明提供一种重组细胞，所述重组细胞含有第三方面所述的重组载体或基因组中整合有第二方面所述核酸分子。

[0021] 优选地，所述重组细胞的出发细胞包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

[0022] 优选地，所述酿酒酵母包括酿酒酵母CEN.PK2‑1C。

[0023] 优选地，所述重组细胞还过表达法尼基焦磷酸合酶和3‑羟基‑3‑甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶。

[0024] 第五方面，本发明提供第一方面所述的瓦伦烯合酶突变体的制备方法，所述制备方法包括：

[0025] 将编码第一方面所述的瓦伦烯合酶突变体的核酸分子插入表达载体，得到重组载体，将所述重组载体导入宿主细胞，或，直接将所述核酸分子整合在宿主细胞的基因组上，获得基因工程菌，进行培养和酶分离纯化，得到所述瓦伦烯合酶突变体。

[0026] 优选地，所述宿主细胞包括酿酒酵母。

[0027] 优选地，所述酿酒酵母包括酿酒酵母CEN.PK2‑1C。

[0028] 第六方面，本发明提供第一方面所述的瓦伦烯合酶突变体、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的重组载体或第四方面所述的重组细胞在制备瓦伦烯中的应用。

[0029] 第七方面，本发明提供一种制备瓦伦烯的方法，所述方法包括：

[0030] 将编码第一方面所述的瓦伦烯合酶突变体的核酸分子插入表达载体，得到重组载体，将所述重组载体导入宿主细胞，或，直接将所述核酸分子整合在宿主细胞的基因组上，获得基因工程菌，进行培养和瓦伦烯分离纯化，得到所述瓦伦烯。

[0031] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0032] 本发明通过酶的定向进化来源于北美金柏Callitropsis nootkatensis的野生型瓦伦烯合酶，获得了酶性能提升的瓦伦烯合酶突变体，利用合酶突变体获得的菌株瓦伦烯产量最高达到使用野生型合酶菌株产量的3.41倍，为瓦伦烯的制备提供新型、有效的工具酶。附图说明

[0033] 图1为瓦伦烯标准品气相色谱图；

[0034] 图2为菌株YC3产物的气相色谱图。

[0035] 为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

[0036] 实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买获得的常规产品。

[0037] 实施例1

[0038] 本实施例构建生产瓦伦烯背景酵母菌株。

[0039] 本发明在野生型酵母菌株CEN.PK2‑1C(购自Euroscarf)的基础上，作为生产瓦伦烯的出发菌株，在基因组上的dpp1位点插入1个拷贝的法尼基焦磷酸合酶基因ERG20(SEQ ID NO.1)以及1个拷贝截短的3‑羟基‑3‑甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶tHMG1(SEQ ID NO.2)，所用的gRNA序列为ATGTAAAACTGACGTTCGAA，构建相应的gRNA‑1质粒。又继续在lpp1位点插入1个拷贝的ERG20以及1个拷贝的tHMG1，所用的gRNA序列为CCAGGGATATCTCCGAATAG，构建相应的gRNA‑2质粒。同时构建两个含有ERG20和tHMG1完整表达框和整合位点上下游同源臂的供体质粒pYC1和pYC2。以CEN.PK2‑1C作为模板，使用引物扩增出所需片段，经胶回收后，通过诺唯赞公司同源重组试剂盒，采用同源重组的方法连接到HindШ酶切后的表达载体pUC19中，经过测序确认无误后，获得两个含有ERG20和tHMG1的供体质粒，命名为pYC1和pYC2，所需引物和片段见表1。

[0040] 表1实施例1载体构建所需片段和引物及引物序列

[0041]

[0042]

[0043] 使用引物P‑F1/P‑R7，以质粒pYC1为模板，扩增出Donor 1片段，分别和含有Cas9的质粒和gRNA‑1质粒通过PEG/LiAC方法转化到酵母菌株CEN.PK2‑1C感受态中，获得菌株YC1。继续使用引物P‑F8/P‑R11，以质粒pYC2为模板，扩增出Donor2片段，分别和含有Cas9的质粒和gRNA‑2质粒通过PEG/LiAC方法转化到酵母菌株YC1感受态中，获得菌株YC2。

[0044] SEQ ID NO.1

[0045] atggcttcagaaaaagaaattaggagagagagattcttgaacgttttccctaaattagtagaggaattgaacgcatcgcttttggcttacggtatgcctaaggaagcatgtgactggtatgcccactcattgaactacaacactccaggcggtaagctaaatagaggtttgtccgttgtggacacgtatgctattctctccaacaagaccgttgaacaattggggcaagaagaatacgaaaaggttgccattctaggttggtgcattgagttgttgcaggcttacttcttggtcgccgatgatatgatggacaagtccattaccagaagaggccaaccatgttggtacaaggttcctgaagttggggaaattgccatcaatgacgcattcatgttagaggctgctatctacaagcttttgaaatctcacttcagaaacgaaaaatactacatagatatcaccgaattgttccatgaggtcaccttccaaaccgaattgggccaattgatggacttaatcactgcacctgaagacaaagtcgacttgagtaagttctccctaaagaagcactccttcatagttactttcaagactgcttactattctttctacttgcctgtcgcattggccatgtacgttgccggtatcacggatgaaaaggatttgaaacaagccagagatgtcttgattccattgggtgaatacttccaaattcaagatgactacttagactgcttcggtaccccagaacagatcggtaagatcggtacagatatccaagataacaaatgttcttgggtaatcaacaaggcattggaacttgcttccgcagaacaaagaaagactttagacgaaaattacggtaagaaggactcagtcgcagaagccaaatgcaaaaagattttcaatgacttgaaaattgaacagctataccacgaatatgaagagtctattgccaaggatttgaaggccaaaatttctcaggtcgatgagtctcgtggcttcaaagctgatgtcttaactgcgttcttgaacaaagtttacaagagaagcaaatag。

[0046] SEQ ID NO.2

[0047] ctgcagaccaattggtgaaaactgaagtcaccaagaagtcttttactgctcctgtacaaaaggcttctacaccagttttaaccaataaaacagtcatttctggatcgaaagtcaaaagtttatcatctgcgcaatcgagctcatcaggaccttcatcatctagtgaggaagatgattcccgcgatattgaaagcttggataagaaaatacgtcctttagaagaattagaagcattattaagtagtggaaatacaaaacaattgaagaacaaagaggtcgctgccttggttattcacggtaagttacctttgtacgctttggagaaaaaattaggtgatactacgagagcggttgcggtacgtaggaaggctctttcaattttggcagaagctcctgtattagcatctgatcgtttaccatataaaaattatgactacgaccgcgtatttggcgcttgttgtgaaaatgttataggttacatgcctttgcccgttggtgttataggccccttggttatcgatggtacatcttatcatataccaatggcaactacagagggttgtttggtagcttctgccatgcgtggctgtaaggcaatcaatgctggcggtggtgcaacaactgttttaactaaggatggtatgacaagaggcccagtagtccgtttcccaactttgaaaagatctggtgcctgtaagatatggttagactcagaagagggacaaaacgcaattaaaaaagcttttaactctacatcaagatttgcacgtctgcaacatattcaaacttgtctagcaggagatttactcttcatgagatttagaacaactactggtgacgcaatgggtatgaatatgatttctaagggtgtcgaatactcattaaagcaaatggtagaagagtatggctgggaagatatggaggttgtctccgtttctggtaactactgtaccgacaaaaaaccagctgccatcaactggatcgaaggtcgtggtaagagtgtcgtcgcagaagctactattcctggtgatgttgtcagaaaagtgttaaaaagtgatgtttccgcattggttgagttgaacattgctaagaatttggttggatctgcaatggctgggtctgttggtggatttaacgcacatgcagctaatttagtgacagctgttttcttggcattaggacaagatcctgcacaaaatgtcgaaagttccaactgtataacattgatgaaagaagtggacggtgatttgagaatttccgtatccatgccatccatcgaagtaggtaccatcggtggtggtactgttctagaaccacaaggtgccatgttggacttattaggtgtaagaggcccacatgctaccgctcctggtaccaacgcacgtcaattagcaagaatagttgcctgtgccgtcttggcaggtgaattatccttatgtgctgccctagcagccggccatttggttcaaagtcatatgacccacaacaggaaacctgctgaaccaacaaaacctaacaatttggacgccactgatataaatcgtttgaaagatgggtccgtcacctgcattaaatcctaa。

[0048] 实施例2

[0049] 本实施例构建瓦伦烯合成载体。

[0050] 选用北美金柏Callitropsis nootkatensis来源的瓦伦烯合酶CnVS(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)，将CnVS的编码序列按照酿酒酵母密码子优化后，选用金唯智公司进行基因合成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4。CRISPR‑Cas9介导的基因组编辑是酿酒酵母中常用的合成生物学工具，使用CRISPR‑Cas9方法将野生型瓦伦烯合酶CnVS整合到基因组ho位点上，所用的gRNA序列为ACGACTATTCTGATGGCTAA，构建相应的gRNA‑3质粒。设计特异基因引物对P‑F14/P‑R14，以合成的基因CnVS(SEQ ID NO.4)为模板，利用诺唯赞公司高保真酶phanta通过PCR扩增获得CnVS基因片段，同时以酿酒酵母CEN.PK2‑1C作为模板，选用引物P‑F13/P‑R13和P‑F15/P‑R15，进行PCR扩增获得启动子pGAL1和终止子tCYC1片段，继续以酿酒酵母CEN.PK2‑1C作为模板，使用引物P‑F12/P‑R12和P‑F16/P‑R16扩增出整合位点的上下游同源臂UH1和DH1片段。利用天根胶回收试剂盒将上述这些片段进行胶回收后，通过诺唯赞公司无缝组装试剂盒，连接到HindIII酶切后的表达载体pUC19中，经过测序确认无误后，获得含有野生型CnVS完整表达框和整合位点上下游同源臂的供体质粒，命名为pYC3。

[0051] 表2实施例2所需的引物及其序列

[0052]

[0053]

[0054] SEQ ID NO.4：

[0055] atggccgaaatgtttaacggtaactcctctaatgatggttcttcttgtatgccagttaaagatgccttgagaagaactggtaaccaccacccaaacttgtggactgatgacttcatccaatctttaaactccccatactccgactcctcttaccataagcacagagaaattttgatcgatgaaattagagacatgttttccaacggtgaaggtgatgaatttggtgttttagaaaacatttggtttgttgacgtcgttcaaagattgggtatcgacagacacttccaagaagaaattaagaccgctttggactacatttacaagttttggaaccacgactctatttttggtgatttgaacatggtcgctttaggtttcagaattttgagattgaatagatacgttgcttcctctgatgtttttaagaaattcaaaggtgaagaaggtcaattttccggtttcgaatcttccgatcaagacgccaagttggaaatgatgttaaacttgtacaaagcctccgaattggacttcccagacgaagatatcttgaaggaggctagagccttcgcttctatgtacttgaagcatgttattaaggaatatggtgacattcaagaatccaagaaccctttgttgatggaaatcgaatatactttcaagtacccatggagatgcagattgccacgtttggaggcttggaacttcattcatatcatgagacaacaagactgtaacatttctttggccaacaacttgtacaagatcccaaagatctacatgaagaaaatcttggaattggctatcttagatttcaacatcttacaatcccaacaccaacacgaaatgaagttgatttccacttggtggaagaactcttctgctattcaattggacttcttcagacatcgtcacatcgaatcttatttctggtgggcctccccattattcgaacctgaattttctacttgtagaattaactgcaccaagttgtctactaagatgttcttattggatgacatttacgacacttacggtactgtcgaagaattaaagccatttactaccactttgactagatgggatgtttccaccgtcgacaaccatcctgactatatgaaaattgctttcaacttctcctacgaaatctacaaggagatcgcttccgaagctgaacgtaagcacggtccattcgtttacaagtacttgcaatcttgttggaagtcctacattgaagcttacatgcaagaagctgaatggattgcctccaaccacattcctggttttgacgaatacttgatgaatggtgttaaatcttccggtatgagaatcttgatgatccatgccttgattttgatggataccccattgtctgacgaaatcttggaacaattggatattccatcttccaagtcccaagctttgttgtctttgatcaccagattggttgacgatgtcaaagatttcgaagacgaacaagctcatggtgaaatggcctcctctattgaatgctacatgaaggacaaccatggttctactcgtgaagatgctttgaattacttgaagatcagaattgaatcttgtgttcaagagttgaacaaagaattattggagccatctaacatgcacggttccttcagaaatttgtacttgaatgtcggtatgagagttatttttttcatgttgaacgacggtgacttgttcactcactccaacagaaaagaaatccaagatgctatcactaagtttttcgtcgaacctattattccttaa。

[0056] 实施例3

[0057] 本实施例构建瓦伦烯合成菌株和孔板发酵。

[0058] 使用引物P‑F12/P‑R16，以质粒pYC3为模板，扩增出Donor3片段UH1‑pGAL1‑CnVS‑tCYC1‑DH1，分别和含有Cas9的质粒和gRNA‑3质粒通过PEG/LiAC方法转化到酵母菌株YC2感受态中，获得菌株YC3。

[0059] 将菌株YC2和YC3分别接种于含有YPD种子培养基的96孔板中(种子培养基，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L)，在30℃、1000rpm条件下培养48h，随后转接至含有发酵培养基的孔板中。发酵培养基(蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖40g/L，覆盖发酵液体积
20％的有机相正十二烷或肉豆蔻酸异丙酯)，置于30℃、1000rpm条件下培养48h。向孔板中的样品添加适量甲醇和正庚烷，剧烈振摇20min后离心，取适量油相进行气相色谱检测。在配备Agilent HP‑5毛细管柱(30.0m×0.32mm×0.25μm)的Agilent GC8890气相色谱仪器上进行分析。进样器和FID检测器温度分别设定至280℃和300℃。经过柱的气体流速前3min设定在2mL/min，后1.675min设定在3mL/min。初始柱温维持在150℃持续1.5min，以速率16℃/min增加至180℃，随后以速率120℃/min增加至300℃持续0.3min，随后冷却至150℃直至下一次进样。样品进样体积是1μL，分流比是50:1，空气流速是300mL/min，氢气流速是30mL/min，载气流速是25mL/min。基于气相建立标准曲线进行定量分析，确定完整培养液中瓦伦烯的浓度。经GC检测后，菌株YC2的瓦伦烯产量为0mg/L，菌株YC3的瓦伦烯产量为45mg/L。其中，瓦伦烯标准品的气相色谱图如图1所示，菌株YC3产物的色谱图如图2所示，瓦伦烯出峰时间在3.587min。

[0060] 实施例4

[0061] 本实施例构建瓦伦烯合酶突变体。

[0062] 实施例1‑3实验已然证明了瓦伦烯合酶CnVS能够在酿酒酵母CEN.PK2‑1C中异源合成瓦伦烯，但是瓦伦烯产量仍然不到50mg/L的水平。萜类合酶活性和稳定性的提高有利于竞争前体FPP，使碳流流向目标萜类化合物。因此，需要继续提升瓦伦烯合酶的性能，有效克服代谢通量节点，进一步提高瓦伦烯的产量。本实施例使用酶工程改造，筛选出具有更高生产性能的合酶CnVS突变体。首先我们利用Swiss‑model对合酶CnVS进行三维结构模拟，使用的模板为3LZ9，两个蛋白序列比对后，将CnVS活性位点外4A距离内的61个氨基酸作为主要的改造位点(表3)。

[0063] 表3实施例4CnVS酶工程改造位点

[0064]

[0065] 通过引入NDT简并引物，将突变氨基酸的三个碱基设计为NDT，即合成的引物中含有12种对应氨基酸的密码子，对这61个氨基酸位点进行饱和突变，来筛选具有更高酶活性的突变体。以质粒pYC3为模板，设计NDT引物扩增出含有CnVS突变体的供体片段，将这些供体片段分为两段扩增，上游片段以同源臂上游引物P‑F13和突变位点反向引物PM‑R1～PM‑R61进行扩增，共获得61个上游片段CnVS_u1～CnVS_u61，下游片段以突变位点正向引物PM‑F1～PM‑F66和同源臂下游引物P‑R15进行扩增，共获得61个下游片段CnVS_d1～CnVS_d61，所需引物及其序列见下表4。

[0066] 表4实施例4CnVS酶工程改造所需引物及其序列

[0067]

[0068]

[0069]

[0070]

[0071] 利用天根胶回收试剂盒将上述片段进行胶回收后，将对应的上下游片段CnVS_u1、CnVS_d1、含有Cas9的质粒和gRNA‑3质粒，通过PEG/LiAC方法转化到酵母菌株YC2感受态中，获得含有CnVS_m1的12种突变体的酵母菌株库YCm1。以此类推，最终可获得分别含有不同突变体的酵母菌株库YCm1～YCm61。从酵母菌株库YCm1～YCm61，挑选适量的单克隆，参照实施例3中使用的孔板培养方式培养，经气相色谱检测突变体的瓦伦烯产量，以此来筛选高活性的CnVS突变体。将瓦伦烯产量相比于野生型合酶菌株YC3，提高40％的单克隆菌株，选用引物P‑F13和P‑R15，扩增CnVS突变体表达框，经胶回收后，送至金唯智进行测序，确定突变位点的基因型，最终筛选30种CnVS突变体，其中产量最高提升1.52倍，如下表5所示。

[0072] 表5实施例4CnVS酶工程改造的有效单位点突变体活性

[0073]

[0074]

[0075] 实施例5

[0076] 本实施例构建瓦伦烯合酶双位点突变体。

[0077] 在实施例4的基础上，本发明进一步构建瓦伦烯合酶双位点突变体。首先以单位点突变体完整表达框为模板，设计引物引入第二个突变位点，构建双位点突变体。以构建G435R,E496D G435RCnVS 双位点突变体为例，以含有CnVS 的菌株为模板，使用引物PD‑F/P‑E496D‑R，进行PCR扩增获得上游片段U1，使用引物P‑E496D‑F/PD‑R，进行PCR扩增获得下游片段D1。
利用天根胶回收试剂盒将上述片段进行胶回收后，将对应的上下游片段U1和D1、含有Cas9G435R
的质粒和gRNA‑3质粒，通过PEG/LiAC方法转化到酵母菌株YC2感受态中，获得含有CnVS,E496D G435R,E496D
突变体的酵母菌株YC‑CnVS 。以此类推，最终可构建含有不同双位点突变体的
酵母菌株，见表6。

[0078] 表6实施例5中CnVS双位点突变体构建

[0079]

[0080]

[0081] 将双位点突变体菌株挑选适量的单克隆，参照实施例3中使用的孔板培养方式培养，经GC检测突变体的瓦伦烯产量，以此来筛选高活性的CnVS双位点突变体。瓦伦烯产量相比于菌株YC3，产量都有明显的提高，最高可达到野生型的3.18倍，见下表7。

[0082] 表7实施例5中CnVS双位点突变体菌株产量

[0083]双位点突变体 瓦伦烯产量(g/L) 活性提升幅度
野生型 0.045 0％
G435R,E496D 0.143 218％
E489V,E306D 0.126 181％
L550S,I443C 0.122 170％
L561F,Y549F 0.116 158％

[0084] 实施例6

[0085] 本实施例构建瓦伦烯合酶三位点突变体。

[0086] 在实施例5的基础上，本发明进一步构建瓦伦烯合酶三位点突变体。首先以双位点突变体完整表达框为模板，设计引物引入第三个突变位点，构建三位点突变体。以构建G435R,I443C,E496D G435R,E496DCnVS 三位点突变体为例，以含有CnVS 的菌株为模板，使用引物PD‑F/
P‑I443C‑G435R‑R，进行PCR扩增获得上游片段U1，使用引物P‑I443C‑G435R‑F/PD‑R，进行PCR扩增获得下游片段D1。利用天根胶回收试剂盒将上述片段进行胶回收后，将对应的上下游片段U5和D5、含有Cas9的质粒和gRNA‑3质粒，通过PEG/LiAC方法转化到酵母菌株YC2感受G435R,I443C,E496D G435R,I443C,E496D
态中，获得含有CnVS 突变体的酵母菌株YC‑CnVS 。同样的，最终可
构建含有不同三位点突变体的酵母菌株，见表8。

[0087] 表8实施例6中CnVS三位点突变体构建

[0088]

[0089]

[0090] 将三位点突变体菌株挑选适量的单克隆，参照实施例3中使用的孔板培养方式培养，经GC检测突变体的瓦伦烯产量，以此来筛选高活性的CnVS三位点突变体。瓦伦烯产量相比于菌株YC3，产量都有明显的提高，最高可达到野生型的3.41倍，见下表9。

[0091] 表9实施例6中CnVS三位点突变体菌株产量

[0092]双位点突变体 瓦伦烯产量(g/L) 活性提升幅度
野生型 0.045 0％
G435R,I443C,E496D 0.156 241％
G435R,E496D,L561F 0.146 225％

[0093] 综上所述，本发明对来源北美金柏(Callitropsis nootkatensis)来源的瓦伦烯合酶CnVS进行改造，引入特定突变，能够显著提高其活性，为瓦伦烯的制备提供新型、有效的工具酶。

[0094] 申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。