一种烟草倍半萜合酶NtTPS143及其应用 |
|||||||
| 申请号 | CN202311583509.9 | 申请日 | 2023-11-24 | 公开(公告)号 | CN117683756A | 公开(公告)日 | 2024-03-12 |
| 申请人 | 山东瑞博斯烟草有限公司; | 发明人 | 张家树; 高颖; 刘鹏; 刘彦杰; 邢振雷; | ||||
| 摘要 | 本 发明 属于 植物 分子 生物 学和植物基因工程技术领域，具体涉及一种 烟草 倍半萜合酶NtTPS143及其应用。所述烟草倍半萜合酶NtTPS143的 氨 基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明发现NtTPS143可通过大肠杆菌大量表达，并且可以高效催化法尼基焦 磷酸 生成4种倍半萜化合物以及1种结构未知的化合物。本发明为烟草萜烯类次生代谢研究奠定 基础 ，为开展烟草基因工程研究、抗逆育种提供重要候选基因，对于应用基因工程技术生产倍半萜化合物具有重要意义。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种烟草倍半萜合酶NtTPS143，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。 |
||||||
| 说明书全文 | 一种烟草倍半萜合酶NtTPS143及其应用技术领域背景技术[0002] 萜类化合物是自然界中广泛存在、化学结构最为丰富多样的天然产物。挥发性萜烯类物质具有独特的气味和生物活性，并在植物生长发育、抗虫抗病等过程中具有重要生物学功能。根据其结构中异戊二烯单元(C5)数量不同，萜类化合物被分为单萜(C10)、倍半萜(C15)、二萜(C20)、三萜(C30)等。在植物细胞中，由胞质中的甲羟戊酸途径(MVA途径)和质体中的甲基赤藓醇‑4‑磷酸途径(MEP途径)合成的前体化合物香叶基焦磷酸(GPP，C10)、法尼基焦磷酸(FPS，C15)和香叶基香叶基焦磷酸(GGPP，C20)经萜烯合酶(Terpene synthase，TPS)催化生成结构各异的单萜、倍半萜、二萜类化合物，直接释放到环境中或储存在特定的器官、组织或细胞中，或由细胞色素P450、醇脱氢酶、糖苷转移酶等进行氧化、还原、糖苷化修饰形成结构多样的衍生物。MVA途径和MEP途径在高等植物中较为保守，而TPS则具有多样的催化活性和表达特征，决定了植物萜类化合物的结构多样性、分布特征和环境响应模式。大多数TPS仅合成一种或少数几种产物，如棉花的杜松烯合酶、青蒿的Amorpha‑4,11‑diene synthase(ADS)均合成单一化合物，而拟南芥、水稻、棉花、番茄的石竹烯合酶可同时合成石竹烯和蛇麻烯，但是以单一底物FPP同时合成多种倍半萜的TPS较为少见。 [0003] α‑Guaiene(分子式C15H24，分子量204.35，CAS号3691‑12‑1)存在于葡萄和广藿香，是广藿香精油的重要组成成分，在葡萄中被CYP71BE5氧化成(‑)‑rotundone，与葡萄酒的风味关系密切。化合物(3S,3aR,3bR,4S,7R,7aR)‑4‑Isopropyl‑3,7‑dimethyloctahydro‑1H‑cyclopenta[1,3]cyclopropa[1,2]benzen‑3‑ol(分子式C15H26O，分子量222.37，CAS号23445‑2‑5)、Naphthalene,1,2,3,5,6,7,8,8a‑octahydro‑1,8a‑dimethyl‑7‑(1‑methylethenyl)‑,[1S‑(1α,7α,8aα)]‑(分子式C15H24，分子量204.35，CAS号10219‑75‑7)和 2‑(4a,8‑Dimethyl‑1,2,3,4,4a,5,6,7‑octahydro‑naphthalen‑2‑yl)‑prop‑2‑en‑1‑ol(分子式C15H24O，分子量220.35)尚未在植物中报道过。由于这些化合物在植物界稀少且含量低，难以分离纯化，目前对这些化合物的化学性质和生理功能了解很少，限制了该化合物的开发利用。分离鉴定关键TPS基因并通过合成生物学方法高效生产这些化合物，对于研究其生理活性，以及在医药、香料、化妆品等领域中的产业化开发应用具有重要意义。 发明内容[0004] 本发明经研究发现了一种来源于烟草的倍半萜合酶，能够使用大肠杆菌基因工程菌进行大量表达，且该酶具有很好的催化合成倍半萜化合物的效果。 [0005] 本发明的第一个方面，提供一种烟草倍半萜合酶NtTPS143，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。 [0006] 本发明的第二个方面，提供所述烟草倍半萜合酶NtTPS143在催化底物合成倍半萜化合物中的应用。 [0007] 进一步的，所述底物为法尼基焦磷酸，所述倍半萜化合物包括(3S,3aR,3bR,4S,7R,7aR)‑4‑Isopropyl‑3,7‑dimethyloctahydro‑1H‑cyclopenta[1,3]cyclopropa[1,2]benzen‑3‑ol、α‑Guaiene、Naphthalene,1,2,3,5,6,7,8,8a‑octahydro‑1,8a‑dimethyl‑7‑(1‑methylethenyl)‑,[1S‑(1α,7α,8aα)]‑和2‑(4a,8‑Dimethyl‑1,2,3,4,4a,5,6,7‑octahydro‑naphthalen‑2‑yl)‑prop‑2‑en‑1‑ol。 [0008] 本发明的第三个方面，提供编所述烟草倍半萜合酶NtTPS143的基因。 [0009] 进一步的，所述基因具有a1‑a2任一项所示的核苷酸序列： [0010] a1、SEQ ID NO.2所示核苷酸序列； [0011] a2、编码所述烟草倍半萜合酶NtTPS143，但因遗传密码的简并性而与SEQ ID NO.2所示不同的核苷酸序列。 [0012] 本发明的第四个方面，提供包含所述基因的重组表达载体。 [0013] 进一步的，所述重组表达载体是将所述基因正向插入pET28a质粒的BamH I和Sac I位点之间获得。 [0014] 本发明的第五个方面，提供包含所述重组表达载体的基因工程菌。 [0015] 进一步的，所述基因工程菌使用的宿主菌为大肠杆菌。 [0016] 本发明的第五个方面，提供一种制备半萜化合物的方法，使用所述的烟草倍半萜合酶NtTPS143作为催化剂，以法尼基焦磷酸为底物，在二硫苏糖醇(DTT)和MgCl2的作用下催化合成倍半萜化合物；所述倍半萜化合物包括(3S,3aR,3bR,4S,7R,7aR)‑4‑Isopropyl‑3,7‑dimethyloctahydro‑1H‑cyclopenta[1,3]cyclopropa[1,2]benzen‑3‑ol、α‑Guaiene、Naphthalene,1,2,3,5,6,7,8,8a‑octahydro‑1,8a‑dimethyl‑7‑(1‑methylethenyl)‑,[1S‑(1α,7α,8aα)]‑和2‑(4a,8‑Dimethyl‑1,2,3,4,4a,5,6,7‑octahydro‑naphthalen‑2‑yl)‑prop‑2‑en‑1‑ol。 [0017] 本发明具有以下有益效果： [0018] 本发明对烟草来源的倍半萜合酶NtTPS143在大肠杆菌中进行表达，并对其进行了倍半萜化合物合成的功能验证，发现NtTPS143可通过大肠杆菌大量表达，并且可以高效催化法尼基焦磷酸生成倍半萜化合物(3S,3aR,3bR,4S,7R,7aR)‑4‑Isopropyl‑3,7‑dimethyloctahydro‑1H‑cyclopenta[1,3]cyclopropa[1,2]benzen‑3‑ol、α‑Guaiene、Naphthalene,1,2,3,5,6,7,8,8a‑octahydro‑1,8a‑dimethyl‑7‑(1‑methylethenyl)‑,[1S‑(1α,7α,8aα)]‑和2‑(4a,8‑Dimethyl‑1,2,3,4,4a,5,6,7‑octahydro‑naphthalen‑2‑yl)‑prop‑2‑en‑1‑ol，以及1种结构未知的化合物。 [0020] 图1为GC‑MS分析NtTPS143重组蛋白的体外催化活性的总离子色谱图(Total Ion Chromatography,TIC)。横坐标为保留时间(min)，纵坐标为色谱响应值峰高。1‑5为NtTPS143催化FPP生成的产物。 [0021] 图2为NtTPS143催化合成的倍半萜化合物1与(3S,3aR,3bR,4S,7R,7aR)‑4‑Isopropyl‑3,7‑dimethyloctahydro‑1H‑cyclopenta[1,3]cy clopropa[1,2]benzen‑3‑ol的质谱比较图。横坐标上为NtTPS143催化产物1的质谱图，横坐标下为(3S,3aR,3bR,4S,7R,7aR)‑4‑Isopropyl‑3,7‑dimethyloctahydro‑1H‑cyclopenta[1,3]cy clopropa[1,2]benzen‑3‑ol的质谱图。 [0022] 图3为倍半萜化合物(3S,3aR,3bR,4S,7R,7aR)‑4‑Isopropyl‑3,7‑dimethyloctahydro‑1H‑cyclopenta[1,3]cy clopropa[1,2]benzen‑3‑ol的质谱图和结构图。横坐标为离子荷质比，纵坐标为相对离子碎片强度。 [0023] 图4为NtTPS143催化合成的倍半萜化合物2与α‑Guaiene的质谱比较图。横坐标上为NtTPS143催化产物2的质谱图，横坐标下为α‑Guaiene的质谱图。 [0024] 图5为倍半萜化合物α‑Guaiene的质谱图和结构图。横坐标为离子荷质比，纵坐标为相对离子碎片强度。 [0025] 图6为NtTPS143催化合成的倍半萜化合物3与Naphthalene,1,2,3,5,6,7,8,8a‑octahydro‑1,8a‑dimethyl‑7‑(1‑methylethenyl)‑,[1S‑(1α,7α,8aα)]‑质谱比较图。横坐标上为NtTPS143催化产物3的质谱图，横坐标下为Naphthalene,1,2,3,5,6,7,8,8a‑octahydro‑1,8a‑dimethyl‑7‑(1‑methylethenyl)‑,[1S‑(1α,7α,8aα)]‑的质谱图。 [0026] 图7为倍半萜化合物Naphthalene,1,2,3,5,6,7,8,8a‑octahydro‑1,8a‑dimethyl‑7‑(1‑methylethenyl)‑,[1S‑(1α,7α,8aα)]‑的质谱图和结构图。横坐标为离子荷质比，纵坐标为相对离子碎片强度。 [0027] 图8为NtTPS143催化合成的倍半萜化合物4与2‑(4a,8‑Dimethyl‑1,2,3,4,4a,5,6,7‑octahydro‑naphthalen‑2‑yl)‑prop‑2‑en‑1‑ol的质谱比较图。横坐标上为NtTPS143催化产物4的质谱图，横坐标下为2‑(4a,8‑Dimethyl‑1,2,3,4,4a,5,6,7‑octahydro‑naphthalen‑2‑yl)‑prop‑2‑en‑1‑ol的质谱图。 [0028] 图9为倍半萜化合物2‑(4a,8‑Dimethyl‑1,2,3,4,4a,5,6,7‑octahydro‑naphthalen‑2‑yl)‑prop‑2‑en‑1‑ol的质谱图和结构图。横坐标为离子荷质比，纵坐标为相对离子碎片强度。 [0029] 图10为NtTPS143在烟草各组织中的表达模式。 具体实施方式[0030] 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 [0031] 实施例1：烟草NtTPS143基因克隆 [0032] 取烟草材料(100mg)于液氮中充分研磨，转移至1.5ml离心管中，加入1mL Trizol(Invitrogen，Cat.15596‑018)，混匀，室温放置5min，12000rpm离心10min，弃沉淀。上清中加入0.2mL三氯甲烷，混匀，12000rpm离心10min，取上清加入0.5mL异丙醇沉淀RNA。12000rpm离心10min，沉淀溶于100μL水。 [0033] 使用RNAPCR体系(TaKaRa，Cat DRR019A)进行反转录，反应体系为：10×缓冲液1μL，dNTP 1μL，MgCl2 2μL，Oligo dT 1μL，RNAInhibitor 0.5μL，AMV RTase 0.5μL，RNA2μL。42℃反应30min后冰浴。 [0034] 以逆转录反应得到的cDNA为模板进行PCR扩增，正向引物为：NtTPS143‑F：5'‑ATGGCCTCAGCAGCAGCAGT‑3'(SEQ ID NO.3)，反向引物为：NtTPS143‑R：5'‑TCAAATTTTGATGGATTCCA‑3'(SEQ ID NO.4)。利用TakaRa公司PrimeSTAR Max DNA聚合酶进行PCR扩增。反应体系为：10×Buffer 5μL，10mM dNTP 2μL，正向引物2μL，反向引物2μL，DNA聚合酶1μL，cDNA1μL。PCR条件为：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃120s，35个循环；72℃延伸5min。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，NtTPS143基因片段大小为1653bp，符合预期的大小。 [0035] NtTPS143基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。序列同源比对分析结果表明该蛋白是典型的倍半萜合酶。 [0036] 实施例2：表达载体构建和大肠杆菌转化 [0037] 采用琼脂糖凝胶电泳胶回收试剂盒的方法回收目的基因片段，将目的片段连接到载体 克隆载体(全式金：CB101‑01)中，然后将其转化到大肠杆菌DH5α克隆菌株中，转化条件为：在100μL感受态细胞中加入5μL连接产物，轻轻混匀后冰浴30min；迅速放入42℃水浴中热激90s，立即置于冰上2‑3min；加入800μL LB液体培养基，37℃慢摇培养1h；将菌液6000rpm离心1min，弃700μL上清，悬浮菌体，涂布于含有氨苄抗生素(Amp， 100mg/L)的LB平板上，37℃倒置暗培养12～16h。采用菌落PCR进行阳性克隆筛选，挑选阳性单克隆菌落，提取质粒后送交测序。 [0038] 经测序分析，克隆得到烟草的倍半萜合成酶基因NtTPS143，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其含有1653个碱基，编码的蛋白命名为倍半萜合成酶NtTPS143，共550个氨基酸，具体氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。由此得到将倍半萜合成酶基因NtTPS143插入到克隆载体的重组质粒，命名为pEASY‑TPS143。 [0039] 以pEASY‑TPS143质粒为模板，利用TakaRa公司PrimeSTAR Max DNA聚合酶扩增NtTPS143基因，引物为：ORF‑NtTPS143‑F‑BamHI：5’‑GCGGATCCATGGCCTCAGCAGCAGCAGT‑3’(SEQ ID NO.5)和ORF‑NtTPS143‑R‑SacI：5’‑GCGAGCTCTCAAATTTTGATGGATTCCA‑3’(SEQ ID NO.6)。反应体系为：10×Buffer 5μL，10mM dNTP 2μL，正向引物2μL，反向引物2μL，DNA聚合酶1μL，cDNA 1μL。PCR条件为：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃120s，35个循环；72℃延伸5min。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，采用琼脂糖凝胶电泳胶回收试剂盒的方法回收目的基因片段，使用BamH I和Sac I进行双酶切，与BamH I和Sac I双酶切的pET28a(Novagen：69864‑3)质粒连接。连接产物转化大肠杆菌，挑取克隆培养，提取质粒测序。阳性质粒命名为pET28‑TPS143。 [0040] 实施例3：原核表达和活性测定 [0041] pET28‑TPS143转化大肠杆菌Rosetta(DE3)。挑取单克隆接种到含50mg/L卡那霉素的液体LB培养基中培养过夜。培养物扩大培养到50ml，直到OD600＝0.6，加入IPTG到终浓度1mM，继续在20℃诱导培养12小时。菌液1000rpm离心1min，沉淀重悬于裂解缓冲液(50mM Tris，pH7.5，5mM DTT，5mM MgCl2)，超声破碎细胞，10000rpm离心2min，收集上清用于活性测定。 [0042] 在100μL上述蛋白中加入2μL FPP(Sigma‑Aldrich，F6892)，37℃反应1小时，加1ml正己烷振荡，取1μL进行气相色谱‑质谱(GC‑MS)分析。气相色谱(GC)仪器型号：Thermo Trace1300(HP‑5ms：30m×0.25mm×0.25μm)。质谱仪器型号Thermo ITQ 900(EI离子源；离子阱检测器)。进样量：1μl。色谱条件：60℃保温3min，10℃/min升温至280℃，保持5min，氦气流速1ml/min。质谱条件：离子源温度250℃，接口温度250℃，scan模式采集m/z50‑500。 [0043] GC‑MS检测结果表明在15.12(1)、15.22(2)、15.94(3)、16.35(4)、16.58(5)分钟处共检测到5个产物(图1)。将其质谱与NIST库比对，结果表明化合物1是(3S,3aR,3bR,4S,7R,7aR)‑4‑Isopropyl‑3,7‑dimethyloctahydro‑1H‑cyclopenta[1,3]cy clopropa[1,2]benzen‑3‑ol(图2、图3)，化合物2是α‑Guaiene(图4、图5)，化合物3是Naphthalene,1,2,3, 5,6,7,8,8a‑octahydro‑1,8a‑dimethyl‑7‑(1‑methylethenyl)‑,[1S‑(1α,7α,8aα)]‑(图 6、图7)，化合物4是2‑(4a,8‑Dimethyl‑1,2,3,4,4a,5,6,7‑octahydro‑naphthalen‑2‑yl)‑prop‑2‑en‑1‑ol(图8、图9)，化合物5未匹配出准确结构。 [0044] 实施例4：NtTPS143基因的表达模式 [0045] 取烟草材料(100mg)于液氮中充分研磨，转移至1.5ml离心管中，加入1mL Trizol(Invitrogen，Cat.15596‑018)，混匀，室温放置5min，12000rpm离心10min，弃沉淀。上清中加入0.2mL三氯甲烷，混匀，12000rpm离心10min，取上清加入0.5mL异丙醇沉淀RNA。12000rpm离心10min，沉淀溶于100μL水。 [0046] 使用RNA PCR体系(TaKaRa，Cat DRR019A)进行反转录，反应体系为：10×缓冲液1μL，dNTP 1μL，MgCl2 2μL，Oligo dT 1μL，RNA Inhibitor 0.5μL，AMV RTase 0.5μL，RNA2μL。42℃反应30min后冰浴。 [0047] 以逆转录反应得到的cDNA为模板，使用Applied Biosystems 7500Real‑Time PCR System(Applied Biosystems,Waltham,MA,USA)检测NtTPS143的表达水平。正向引物为qRT‑NtTPS143‑F：5’‑CACATGTAAGGACTCATGCTGACG‑3’(SEQ ID NO.7)，反向引物为qRT‑NtTPS143‑R：5’‑GCACTCAACTGCTCTATCTCTAGC‑3’(SEQ ID NO.8)。烟草EF‑1a作为内参基因，引物为：qRT‑EF‑1a‑F：5’‑TGAGATGCACCACGAAGCTC‑3’(SEQ ID NO.9)和qRT‑EF‑1a‑R：5’‑CCAACATTGTCACCAGGAAGTG‑3’(SEQ ID NO.10)。使用ChamQ SYBR qPCR Master Mix(诺唯赞)试剂进行检测。PCR反应体系为：2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10μL，正向引物1μL，反向引物1μL，cDNA0.5μL。PCR条件为：95℃5min；95℃15s，58℃30s，72℃30s；40个循环。 [0048] 结果表明NtTPS143在根中表达水平较高，在衰老叶片中也有一定表达，在茎、嫩叶、花等器官中不表达(图10)。 [0049] 尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。 [0050] 显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。 |
||||||
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈