产紫穗槐二烯酿酒酵母基因工程菌发酵的全自动补料控制方法专利检索-烃的制备专利检索查询-专利查询网

产紫穗槐二烯酿酒酵母基因工程菌发酵的全自动补料控制方法
申请号	CN202311450075.5	申请日	2023-11-02	公开(公告)号	CN117467806A	公开(公告)日	2024-01-30
申请人	北京化工大学;			发明人	方云明; 冯盼; 王萌;
摘要	本发明涉及一种产紫穗槐二烯酿酒酵母基因工程菌发酵的全自动补料控制方法，该方法通过DO值反馈调节补料起始及频率，实现产紫穗槐二烯酿酒酵母工程菌全自动发酵补料，与目前已有报道的补料控制方法相比，本发明所用全自动补料控制方法实现了自动判定补料起始点，安全冗余的溶氧控制发酵补料达到自动化限糖，自动判定发酵终点，终止补料，避免了因发酵结束时DO预设值大于DO设定值引起的误补，降低检测频次，减少发酵周期，提高酿酒酵母产紫穗槐二烯的产量。
权利要求	1.一种产紫穗槐二烯的酿酒酵母基因工程菌发酵的全自动补料控制方法，其包括：控制阶段1，发酵起始后，自动确定补料起始点；控制阶段2，含安全冗余的溶氧控制发酵补料；控制阶段3，自动判定发酵终点。 2.根据权利要求1所述的全自动补料控制方法，其特征在于，在控制阶段1，所述自动确定补料起始点包括根据测定的溶氧值依次自动判定发酵过程中溶氧值A点与溶氧值B点，判定经过溶氧值B点后，执行第一次补料操作，并记录为补料起始点。 3.根据权利要求2所述的全自动补料控制方法，其特征在于，在控制阶段1，溶氧值A点为发酵初始阶段溶氧值第一次出现5‑10秒短暂上升至50％‑60％的时间点，溶氧值B点为溶氧值第一次降至溶氧最低值后，首次出现溶氧上升至大于70％并保持30s的时间点。 4.根据权利要求3所述的全自动补料控制方法，其特征在于，所述溶氧最低值为0‑ 15％。 5.根据权利要求2‑4中任意一项所述的全自动补料控制方法，其特征在于，在控制阶段 2，含安全冗余的溶氧控制发酵补料包括，在控制阶段1判定溶氧值B点并完成第一次补料之后，根据预设溶氧值的含安全冗余自动判定方法判断溶氧值是否符合补料判定条件，如果出现溶氧测定值大于预设溶氧值，符合补料判定条件，进行一次补料操作。 6.根据权利要求5所述的全自动补料控制方法，其特征在于，根据预设溶氧值的含安全冗余自动判定方法包括：步骤S1，预设溶氧值，并标记为DO预设；步骤S2，每隔5毫秒进行一次发酵液溶氧测定，并标记实时溶氧值为DO测定，每次测定后将DO测定与DO预设进行比较判定；步骤S3，当DO测定＜DO预设，计数为0并返回步骤S2进行下一次测定；当DO测定≥DO预设，将计数增加1并返回步骤S2进行下一次测定，当计数为2000时执行一次补料操作，完成一次补料同时计数归0，返回到步骤S2进行下一次测定。 7.根据权利要求6所述的全自动补料控制方法，其特征在于，所述DO预设为20％‑80％，优选为20％、40％、60％、80％。 8.根据权利要求5‑7中任意一项所述的全自动补料控制方法，其特征在于，在控制阶段 3，在连续完成3‑5次补料操作后，自动溶氧仪检测到溶氧值下降返回步骤S2进行下一次测定，自动溶氧仪未检测到溶氧值下降，即自动判定为发酵终点，终止补料。
说明书全文	产紫穗槐二烯酿酒酵母基因工程菌发酵的全自动补料控制方法技术领域 [0001] 本发明属于发酵过程控制技术领域，涉及一种产紫穗槐二烯酿酒酵母基因工程菌发酵的全自动补料控制方法。背景技术 [0002] 萜类或称类异戊二烯是自然界中结构最多样的天然产物。迄今已鉴定出50,000多种萜类化合物，包括常见的化合物，如胆固醇、维生素A和天然橡胶。作为最大的一类次生代谢产物，许多类异戊二烯参与其天然宿主的基本生物过程。例如，类胡萝卜素是参与光合作用过程的四萜类化合物，同时保护宿主免受有害的紫外线辐射。角内酯是类胡萝卜素的一个亚类，是调节枝条和根结构的必需植物激素。由于生物功能的广谱性，萜类化合物作为药物、香水、食品香料和最近的生物燃料成分具有巨大的工业价值。疟疾每年造成150万至300万人死亡，由于抗药性和药物污染，对抗疟疾的斗争形成了一个日益严重的问题，倍半萜内酯青蒿素是一种著名的抗疟药，主要从药用植物青蒿中提取，可用于治疗疟疾，根据世界卫生组织的建议，疟疾的一线治疗是基于青蒿素的联合疗法。在过去的十年中，这种有价值的抗疟天然产品也因其抗癌特性而获得了广泛的关注。青蒿素对癌细胞具有细胞毒性，因为它的内过氧化物桥与铁相互作用产生自由基，破坏蛋白质并杀死细胞，这导致对青蒿素及其衍生物的需求不断增加。 [0003] 补料控制方法是整个发酵流程的核心操作，方法的成功与否关系到最终产物的浓度也关系到原料的转化率。在发酵补料过程中，要补充的营养剂主要是碳源氮源。氮源通过控制发酵液的pH值流加氨水补充，碳源则是采用流加基质糖的方法来控制。通过流加氨水来控制pH值的技术现在已比较成熟；然而，由于发酵过程是动态的非线性、时变性、不确定性的生化过程，发酵过程中的重要生物参数(如菌体浓度、产物浓度、基质浓度)因缺乏可靠的生物传感器而无法在线测量，缺乏精确的发酵状态预估模型，导致实现流加基质糖的在线优化控制难度比较大。补料分批发酵过程种补料流加速率的优化控制广为人们关注，补料优化已成为很多发酵过程的优化控制的关键问题。 [0004] Stefan Tippmann利用酶融合技术，使用人工蛋白亲和体支架来共定位法尼基二磷酸合酶和法尼烯合酶，进而减少底物损失和有毒中间体的积累来提高途径效率。随后通过间歇补料培养进行发酵，测量得到法尼烯的产量提高135％，达到16mg/L(Improved quantification of farnesene during microbial production from Saccharomyces cerevisiae in two‑liquid‑phase fermentations，Talanta,Volume，146卷，p100‑106页，2016年)。Jong Yun Han等将Tya与法尼烯和法尼醇的生物合成途径中包含的三种关键酶(tHMG1、IspA和α‑法尼烯合酶)融合，通过溶氧控制补料分批发酵7天最终得到的萜类产量为930±40mg/L(Ty1‑fused protein‑body formation for spatial organization of metabolic pathways in Saccharomyces cerevisiae，Biotechnology and Bioengineering，115卷3期，p 694‑704页，2018年)。上述现有技术存在容易出现葡萄糖累积过多或葡萄糖供应不足的情况，进而对生长与生产造成影响。发明内容 [0005] 为解决上述现有技术问题，本发明提供了一种产紫穗槐二烯酿酒酵母基因工程菌发酵的全自动补料控制方法，利用该全自动补料控制方法能够自动识别补料起始点，实现安全冗余的溶氧控制发酵补料，达到自动化限糖，自动判定发酵终点，终止补料，避免了因发酵结束时DO预设值大于DO设定值引起的误补，降低检测频次，减少发酵周期，提高酿酒酵母产紫穗槐二烯的产量。 [0006] 为此，本发明提供了一种产紫穗槐二烯的酿酒酵母基因工程菌发酵的全自动补料控制方法，其包括： [0007] 控制阶段1，发酵起始后，自动确定补料起始点； [0008] 控制阶段2，含安全冗余的溶氧控制发酵补料； [0009] 控制阶段3，自动判定发酵终点。 [0010] 根据本发明，在控制阶段1，所述自动确定补料起始点包括根据测定的溶氧值依次自动判定发酵过程中溶氧值A点与溶氧值B点，判定经过溶氧值B点后，执行第一次补料操作，并记录为补料起始点。 [0011] 在本发明的一些实施例中，在控制阶段1，溶氧值A点为发酵初始阶段溶氧出现的第一次5‑10秒短暂上升至50‑60％的时间点(初始培养基中葡萄糖浓度为0g/L，乙醇浓度不为0g/L时引起的溶氧测定值短暂上升至50％‑60％)，溶氧值B点为溶氧值第一次降至最低值0％‑15％后，首次出现溶氧上升至大于70％并保持30s的时间点(初始培养基中碳源浓度为0g/L引起溶氧测定值长时间维持在较高水平70％)。 [0012] 在本发明的一些实施例中，所述溶氧最低值为0‑15％。 [0013] 根据本发明，在控制阶段2，含安全冗余的溶氧控制发酵补料包括，在控制阶段1判定溶氧值B点并完成第一次补料之后，根据预设溶氧值的含安全冗余自动判定方法判断溶氧值是否符合补料判定条件，如果出现溶氧测定值大于预设溶氧值，符合补料判定条件，进行一次补料操作。 [0014] 在本发明的一些实施例中，根据预设溶氧值的含安全冗余自动判定方法包括，[0015] 步骤S1，预设溶氧值，并标记为DO预设； [0016] 步骤S2，每隔5毫秒进行一次发酵液溶氧测定，并标记实时溶氧值为DO测定，每次测定后将DO测定与DO预设进行比较判定； [0017] 步骤S3，当DO测定＜DO预设，计数为0并返回步骤S2进行下一次测定；当DO测定≥DO预设，将计数增加1并返回步骤S2进行下一次测定，当计数为2000时执行一次补料操作，完成一次补料同时计数归0，返回到步骤S2进行下一次测定。 [0018] 在本发明的一些实施例中，所述DO预设为20％‑80％，优选为20％、40％、60％、80％。 [0019] 根据本发明，在控制阶段3，在连续完成3‑5次补料操作后，自动溶氧仪未检测到溶氧值下降，即自动判定为发酵终点，终止补料。 [0020] 本发明提供了产紫穗槐二烯酿酒酵母基因工程菌发酵的全自动补料控制方法，与现有技术相比，本发明所提供的提供了一种产紫穗槐二烯酿酒酵母全自动发酵补料方法，实现了自动判定补料起始点，安全冗余的溶氧控制发酵补料可实现自动化限糖，自动判定发酵终点，终止补料，避免了因发酵结束时DO预设值大于DO设定值引起的误补，降低检测频次，减少发酵周期，提高酿酒酵母产紫穗槐二烯的产量。附图说明 [0021] 为使本发明容易理解，下面将结合附图来详细说明本发明。 [0022] 图1为产紫穗槐二烯的酿酒酵母基因工程菌发酵的全自动补料流程图。 [0023] 图2为实施例1中产紫穗槐二烯的酿酒酵母基因工程菌发酵的全自动控制补料过程发酵溶氧变化图。 [0024] 图3为对比例1中间歇式补料控制流程图。 [0025] 图4为对比例2中溶氧控制补料流程图。 [0026] 图5示出不同补料控制方式对产量的影响。 [0027] 图6示出实施例1中不同溶氧预设值对产量的影响。 [0028] 图7为酿酒酵母产紫穗槐二烯发酵装置示意图。具体实施方式 [0029] 为使本发明容易理解，下面将结合附图和具体实施方式来详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。 [0030] 在提供了数值范围的情况下，应当理解所述范围的上限和下限和所述规定范围中的任何其他规定或居间数值之间的每个居间数值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立包括在较小的范围中，并且也涵盖在本发明内，服从规定范围中任何明确排除的限度。在规定的范围包含一个或两个限度的情况下，排除那些包括的限度之任一或两者的范围也包含在本发明中。 [0031] Ⅰ、术语 [0032] 本发明所述用语“安全冗余”是指溶氧测定值经过首次补料之后出现上升至大于70％并维持到计数2000结束，避免了偶然误差对溶氧测定值波动对流加补料的影响。 [0033] Ⅱ、实施方案 [0034] 如前所述，现有萜类补料控制过程容易出现葡萄糖累积过多或葡萄糖供应不足的情况，进而对生长与生产造成影响。有鉴于此，本发明人研究设计了一种产紫穗槐二烯酿酒酵母基因工程菌发酵的全自动补料控制方法。 [0035] 本发明中所述产紫穗槐二烯的酿酒酵母基因工程菌发酵的全自动补料流程图如图1所示，从图1可以看出，本发明中所述产紫穗槐二烯的酿酒酵母基因工程菌发酵的全自动补料控制方法具体包括如下三个控制阶段(步骤)： [0036] 控制阶段1，发酵起始后，自动确定补料起始点： [0037] 在该阶段，自动判定酿酒酵母产紫穗槐二烯补料起始控制点，溶氧值A点为发酵初始阶段溶氧出现的第一次5‑10秒短暂上升至50‑60％的时间点(初始培养基中葡萄糖浓度为0g/L，乙醇浓度不为0g/L时引起的溶氧测定值短暂上升至50％‑60％)，如果溶氧在经过第一次5‑10秒短暂上升至50‑60％后，继续出现溶氧值下降，则判断已经过A点。下一步开始对溶氧值B点的识别，溶氧值B点为溶氧值第一次降至最低值0％‑15％后，首次出现溶氧上升至大于70％并保持30s的时间点(初始培养基中碳源浓度为0g/L引起溶氧测定值长时间维持在较高水平70％)，则判断已经过B点，开始进行首次补料，并记录为补料起始点。 [0038] 控制阶段2，含安全冗余的溶氧控制发酵补料： [0039] 在该阶段，建立安全冗余的溶氧控制发酵补料方法，控制阶段1判定经过溶氧值B点并完成第一次补料之后，根据预设溶氧值的含安全冗余自动判定方法判断溶氧值是否符合补料判定条件。方法执行过程中，每隔5毫秒进行一次发酵液溶氧测定，并标记实时溶氧值为DO测定，每次测定后与预设溶氧值(DO预设)进行比较判定，当DO测定＜DO预设，计数为0并转入下一次测定对比；当DO测定≥DO预设，将计数增加1并转入下一次测定对比，当计数为2000时执行1次补料操作，同时计数归0，转入下一次测定对比。 [0040] 控制阶段3，自动判定发酵终点： [0041] 在该阶段，判定酿酒酵母产紫穗槐二烯补料批次发酵程序，在连续完成3‑5次补料操作后，自动溶氧仪未检测到溶氧值下降，即自动判定为发酵终点，终止补料。避免了因发酵结束时DO预设值大于DO设定值引起的误补，降低检测频次，减少发酵周期，提高酿酒酵母产紫穗槐二烯的产量。 [0042] 本发明中对于产紫穗槐二烯的酿酒酵母基因工程菌的发酵控制装置没有特别的限制，只要能够实现产紫穗槐二烯的酿酒酵母基因工程菌发酵及自动控制即可。在一些实施例中，可以采用如图7所示的产紫穗槐二烯的酿酒酵母基因工程菌的发酵控制装置进行产紫穗槐二烯的酿酒酵母基因工程菌发酵的全自动补料控制，该发酵控制装置包括发酵罐、通过碱泵与发酵罐相连的氨水罐、通过加料泵与发酵罐相连的流加糖补料罐，发酵罐内设置有搅拌器。 [0043] 所述发酵控制装置还包括设置在发酵罐内的温度监测构件(图中未示出)、pH值检测构件和溶氧检测构件。 [0044] 所述发酵控制装置还包括采集溶氧值监测数据并产生测量信号、补料控制信号和记数信号等的伺服控制器；其中，所述伺服控制器配置有用于设置DO预设值，并显示DO测定值、补料记数等的溶氧设置显示屏，所述溶氧设置显示屏设置在发酵控制柜上。 [0045] 本发明具有如下优点： [0046] 经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种产紫穗槐二烯酿酒酵母发酵的全自动补料的方法。实现了自动判定补料起始点，安全冗余的溶氧控制发酵补料实现了自动化限糖，自动判定发酵终点，终止补料，避免了因发酵结束时DO预设值大于DO设定值引起的误补，降低检测频次，减少发酵周期，提高酿酒酵母产紫穗槐二烯的产量。紫穗槐二烯产量达11.9g/L，发酵时间为150小时。 [0047] Ⅲ、实施例 [0048] 为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本发明，这些对比例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。 [0049] 对比例1： [0050] 图3示出一种酿酒酵母186194(北京北纳创联生物技术研究院)产紫穗槐二烯发酵的间歇控制补料方法，具体步骤如下： [0051] (1)酿酒酵母产紫穗槐二烯菌种活化，一个YPD固体培养基平板恒温培养箱28‑30℃培养。 [0052] (2)一级种子罐50mL试管，四个5mL/50mL酵母浸粉0.2g，葡萄糖0.4g，蛋白胨0.4g，加水至20mL，116℃灭菌25分钟，分装至4个50ml无菌离心管，无菌离心管菌液OD600值为0.8‑1.2左右时，接种到灭菌降温后的一级种子罐中扩大培养，获得一级种子液；一级种子液培养条件为一级种子罐的培养条件为摇床28℃，200rpm。 [0053] (3)二级种子罐2个50ml/250ml摇瓶(总体积为100mL)，(NH4)2SO4 1.5g，KH2PO4 0.8g，MgSO4·7H2O 0.625g加水定容至85ml，20g葡萄糖加水定容至100ml，116℃灭菌25分钟，取10ml葡萄糖溶液及1mL过滤除菌的维生素及微量元素分装到无机盐无菌摇瓶中。取 3ml一级种子液分装到摇瓶中，无菌离心管菌液OD600值为0.8‑1.2左右时，接种到灭菌降温后的二级种子罐中扩大培养，获得二级种子液；二级种子液培养条件为摇床温度为28℃，转速为200rpm。 [0054] (4)发酵罐1L，(NH4)2SO4 15g，KH2PO4 8g，MgSO4·7H2O 6.25g加水定容至850ml，20g葡萄糖加水定容至30ml，116℃单独灭菌25分钟。各取10ml过滤除菌的维生素及微量元素加入发酵罐，二级种子液的OD600值为0.8‑1.2左右时，接种到发酵罐中扩大培养，接种量为接种后发酵液总体积的10％；控制发酵罐的培养条件为：发酵起始补料前固定转速 450rpm，补料后固定转速600rpm，通气量1VVM，温度为28‑30℃，pH为4.8‑5.0； [0055] (5)间歇控制方案主要就是通过人为经验确定发酵起始点及补料频率，发酵起始大约35小时左右，人工判定补料起始点，当发酵罐中碳源浓度为0g/L，开始进行补料发酵，补料开始设定一个补料间隔，60min开泵流加补料2s，后续持续检测碳源浓度，如果出现碳源含量较高的情况，则将补料间隔时间延长至70min‑100min；如果碳源含量较少，则需要将补料间隔时间缩短至30‑50min，如果碳源浓度保持稳定则继续做检测与观察，根据检测结果来调节补料间隔。 [0056] (6)当发酵罐中碳源浓度在停止补料之后碳源浓度仍维持在1g/L以上时发酵结束。 [0057] 最终酿酒酵母产紫穗槐二烯高产量7.1g/L，发酵时间150小时。 [0058] 对比例2： [0059] 图4示出一种酿酒酵母产紫穗槐二烯发酵溶氧控补料策略，具体步骤如下： [0060] (1)酿酒酵母产紫穗槐二烯菌种活化，一个YPD固体培养基平板恒温培养箱28‑30℃培养。 [0061] (2)一级种子罐50mL试管，四个5mL/50mL酵母浸粉0.2g，葡萄糖0.4g，蛋白胨0.4g，加水至20mL，116℃灭菌25分钟，分装至4个50ml无菌离心管，无菌离心管菌液OD600值为0.8‑1.2左右时，接种到灭菌降温后的一级种子罐中扩大培养，获得一级种子液；一级种子液培养条件为一级种子罐的培养条件为摇床28℃，200rpm。 [0062] (3)二级种子罐2个50ml/250ml摇瓶(总体积为100mL)，(NH4)2SO4 1.5g，KH2PO4 0.8g，MgSO4·7H2O 0.625g加水定容至85ml，20g葡萄糖加水定容至100ml，116℃灭菌25分钟，取10ml葡萄糖溶液及1mL过滤除菌的维生素及微量元素分装到无机盐无菌摇瓶中。取 3ml一级种子液分装到摇瓶中，无菌离心管菌液OD600值为0.8‑1.2左右时，接种到灭菌降温后的二级种子罐中扩大培养，获得二级种子液；二级种子液培养条件为摇床温度为28℃，转速为200rpm。 [0063] (4)发酵罐1L，(NH4)2SO4 15g，KH2PO4 8g，MgSO4·7H2O 6.25g加水定容至850ml，20g葡萄糖加水定容至30ml，116℃单独灭菌25分钟。各取10ml过滤除菌的维生素及微量元素加入发酵罐，二级种子液的OD600值为0.8‑1.2左右时，接种到发酵罐中扩大培养，接种量为接种后发酵液总体积的10％；控制发酵罐的培养条件为：发酵起始补料前固定转速 450rpm，补料后固定转速600rpm，通气量1VVM，温度为28‑30℃，pH为4.8‑5.0； [0064] (5)传统溶氧控制补料方法主要就是通过人为经验确定发酵起始点及补料频率，发酵起始大约35小时左右，人工判定补料起始点，当发酵罐中碳源浓度为0g/L，且溶氧值持续2min维持在大于70％，开始进行补料发酵，随后设定60％溶氧值作为判定程序的设定溶氧值，当测量溶氧值大于溶氧设定值60％时，开泵进行补料，直至测量值小于设定值60％后停止补料，并继续进入溶氧设定值与溶氧测定值比较，以此循环流加补料。 [0065] (6)当发酵罐中检测到的碳源浓度大于1g/L时，溶氧测定值长时间维持大于70％时发酵结束。 [0066] 最终酿酒酵母产紫穗槐二烯产量为7.3g/L，发酵时间150小时。 [0067] 实施例1： [0068] 图1示出一种产紫穗槐二烯酿酒酵母186194(北京北纳创联生物技术研究院)全自动发酵补料方法，具体步骤如下： [0069] (1)酿酒酵母产紫穗槐二烯菌种活化，一个YPD固体培养基平板恒温培养箱28‑30℃培养。 [0070] (2)一级种子罐50mL试管，四个5mL/50mL酵母浸粉0.2g，葡萄糖0.4g，蛋白胨0.4g，加水至20mL，116℃灭菌25分钟，分装至4个50ml无菌离心管，无菌离心管菌液OD600值为0.8‑1.2左右时，接种到灭菌降温后的一级种子罐中扩大培养，获得一级种子液；一级种子液培养条件为一级种子罐的培养条件为摇床28℃，200rpm。 [0071] (3)二级种子罐2个50ml/250ml摇瓶(总体积为100mL)，(NH4)2SO4 1.5g，KH2PO4 0.8g，MgSO4·7H2O 0.625g加水定容至85ml，20g葡萄糖加水定容至100ml，116℃灭菌25分钟，取10ml葡萄糖溶液及1mL过滤除菌的维生素及微量元素分装到无机盐无菌摇瓶中。取 3ml一级种子液分装到摇瓶中，无菌离心管菌液OD600值为0.8‑1.2左右时，接种到灭菌降温后的二级种子罐中扩大培养，获得二级种子液；二级种子液培养条件为摇床温度为28℃，转速为200rpm。 [0072] (4)发酵罐1L，(NH4)2SO4 15g，KH2PO4 8g，MgSO4·7H2O 6.25g加水定容至850ml，20g葡萄糖加水定容至30ml，116℃单独灭菌25分钟。各取10ml过滤除菌的维生素及微量元素加入发酵罐，二级种子液的OD600值为0.8‑1.2左右时，接种到发酵罐中扩大培养，接种量为接种后发酵液总体积的10％；控制发酵罐的培养条件为：发酵起始补料前固定转速 450rpm，补料后固定转速600rpm，通气量1VVM，温度为28‑30℃，pH为4.8‑5.0； [0073] (5)全自动补料方法主要就是在发酵起始后，溶氧值依次自动判定发酵过程溶氧值A点与溶氧值B点，判定到溶氧值B点后，执行第一次补料操作，并记录为补料起始点。 [0074] (6)溶氧值A点为发酵初始阶段溶氧值第一次出现短暂5‑10秒上升至50％‑60％的时间点，溶氧值B点为溶氧值第一次降至最低值0％‑15％后，首次出现溶氧上升至大于70％并保持30s的时间点。每隔5毫秒进行一次发酵液溶氧测定，并标记实时溶氧值为DO测定，每次测定后将DO测定与DO预设(分别设定了20％、40％、60％、80％)进行比较判定；当DO测定＜DO预设，计数为0并返回步骤S2进行下一次测定；当DO测定≥DO预设，将计数增加1并返回步骤S2进行下一次测定，当计数为2000时执行一次补料操作，完成一次补料同时计数归0，返回到步骤S2进行下一次测定。 [0075] (7)在连续完成5次补料操作后，自动溶氧仪未检测到溶氧值下降，即自动判断为发酵终点，终止补料，全自动补料溶氧补料过程变化趋势见附图2。 [0076] DO设定值为60％时，最终酿酒酵母产紫穗槐二烯产量为11.5g/L，明显高于对比案例1，2中紫穗槐二烯的产量(见附图5)，发酵时间150小时(见附图6)。DO设定值为80％时，发酵结束时乳化现象较为严重，不利于紫穗槐二烯产量积累。DO设定值为20％和40％时，发酵结束时乳化现象轻微，但是发酵液12000rpm离心后，采用高效液相色谱检测时发现乙醇积累量高于溶氧设定值为60％时，也不利于菌体积累，从而影响紫穗槐二烯产量。 [0077] 实施例2： [0078] 建立一种产紫穗槐二烯酿酒酵母全自动发酵补料方法，连续3次补料判断发酵终止，具体步骤如下： [0079] (1)‑(4)步骤与实施例1步骤(1)‑(4)相同 [0080] (5)全自动补料方法主要就是在发酵起始后，溶氧值依次自动判定发酵过程溶氧值A点与溶氧值B点，判定到溶氧值B点后，执行第一次补料操作，并记录为补料起始点。溶氧值A点为发酵初始阶段溶氧值第一次出现短暂5‑10秒上升至50％‑60％的时间点，溶氧值B点为溶氧值第一次降至最低值0％‑15％后，首次出现溶氧上升至大于70％并保持30s的时间点。每隔5毫秒进行一次发酵液溶氧测定，并标记实时溶氧值为DO测定，每次测定后将DO测定与DO预设(设定了溶氧值为60％)进行比较判定；当DO测定＜DO预设，计数为0并返回步骤S2进行下一次测定；当DO测定≥DO预设，将计数增加1并返回步骤S2进行下一次测定，当计数为2000时执行一次补料操作，完成一次补料同时计数归0，返回到步骤S2进行下一次测定。 [0081] (6)在连续完成3次补料操作后，自动溶氧仪未检测到溶氧值下降，即自动判断为发酵终点，终止补料。 [0082] 在连续完成3次补料操作后，最终酿酒酵母产紫穗槐二烯产量为11.9g/L，发酵时间150小时。 [0083] 实施例3： [0084] 建立一种产紫穗槐二烯酿酒酵母全自动发酵补料方法，连续4次补料判断发酵终止，具体步骤如下： [0085] (1)‑(4)步骤与实施例1步骤(1)‑(4)相同 [0086] (5)全自动补料方法主要就是在发酵起始后，溶氧值依次自动判定发酵过程溶氧值A点与溶氧值B点，判定到溶氧值B点后，执行第一次补料操作，并记录为补料起始点。溶氧值A点为发酵初始阶段溶氧值第一次出现短暂5‑10秒上升至50％‑60％的时间点，溶氧值B点为溶氧值第一次降至最低值1％‑15％后，首次出现溶氧上升至大于70％并保持30s的时间点。每隔5毫秒进行一次发酵液溶氧测定，并标记实时溶氧值为DO测定，每次测定后将DO测定与DO预设(设定了溶氧值为60％)进行比较判定；当DO测定＜DO预设，计数为0并返回步骤S2进行下一次测定；当DO测定≥DO预设，将计数增加1并返回步骤S2进行下一次测定，当计数为2000时执行一次补料操作，完成一次补料同时计数归0，返回到步骤S2进行下一次测定。 [0087] (6)在连续完成4次补料操作后，自动溶氧仪(OrionTMVersa Star ProTMDO台式测量仪，杭州联测自动化技术有限公司)未检测到溶氧值下降，即自动判断为发酵终点，终止补料。 [0088] 在连续完成4次补料操作后，最终酿酒酵母产紫穗槐二烯产量为11.7g/L，发酵时间150小时。 [0089] 实施例4： [0090] 建立一种产紫穗槐二烯酿酒酵母全自动发酵补料方法，连续2次补料判断发酵终止，具体步骤如下： [0091] 具体步骤如下： [0092] (1)‑(4)步骤与实施例1步骤(1)‑(4)相同 [0093] (5)全自动补料方法主要就是在发酵起始后，溶氧值依次自动判定发酵过程溶氧值A点与溶氧值B点，判定到溶氧值B点后，执行第一次补料操作，并记录为补料起始点。溶氧值A点为发酵初始阶段溶氧值第一次出现短暂5‑10秒上升至50％‑60％的时间点，溶氧值B点为溶氧值第一次降至最低值1％‑15％后，首次出现溶氧上升至大于70％并保持30s的时间点。每隔5毫秒进行一次发酵液溶氧测定，并标记实时溶氧值为DO测定，每次测定后将DO测定与DO预设(设定了溶氧值为60％)进行比较判定；当DO测定＜DO预设，计数为0并返回步骤S2进行下一次测定；当DO测定≥DO预设，将计数增加1并返回步骤S2进行下一次测定，当计数为2000时执行一次补料操作，完成一次补料同时计数归0，返回到步骤S2进行下一次测定。 [0094] (6)在连续完成2次补料操作后，自动溶氧仪未检测到溶氧值下降，即自动判断为发酵终点，终止补料。 [0095] 在连续完成2次补料操作后，最终酿酒酵母产紫穗槐二烯产量为9.2g/L，发酵时间150小时。在连续进行2次补料之后，发酵液12000rpm离心后，采用高效液相色谱检测时发现单位体积葡萄糖浓度太低，导致菌体处于饥饿状态，从而不利于紫穗槐二烯积累。 [0096] 实施例5： [0097] 建立一种产紫穗槐二烯酿酒酵母全自动发酵补料方法，连续6次补料判断发酵终止，具体步骤如下： [0098] 具体步骤如下： [0099] (1)‑(4)步骤与实施例1步骤(1)‑(4)相同 [0100] (5)全自动补料方法主要就是在发酵起始后，溶氧值依次自动判定发酵过程溶氧值A点与溶氧值B点，判定到溶氧值B点后，执行第一次补料操作，并记录为补料起始点。溶氧值A点为发酵初始阶段溶氧值第一次出现短暂5‑10秒上升至50％‑60％的时间点，溶氧值B点为溶氧值第一次降至最低值1％‑15％后，首次出现溶氧上升至大于70％并保持30s的时间点。每隔5毫秒进行一次发酵液溶氧测定，并标记实时溶氧值为DO测定，每次测定后将DO测定与DO预设(设定了溶氧值为60％)进行比较判定；当DO测定＜DO预设，计数为0并返回步骤S2进行下一次测定；当DO测定≥DO预设，将计数增加1并返回步骤S2进行下一次测定，当计数为2000时执行一次补料操作，完成一次补料同时计数归0，返回到步骤S2进行下一次测定。 [0101] (6)在连续完成6次补料操作后，自动溶氧仪未检测到溶氧值下降，即自动判断为发酵终点，终止补料。 [0102] 在连续完成6次补料操作后，最终酿酒酵母产紫穗槐二烯产量为9.8g/L，发酵时间150小时，在连续进行6次补料之后，发酵液12000rpm离心后，采用高效液相色谱检测时发现单位体积葡萄糖浓度太高，导致乙醇浓度提升，不利于碳源流向酿酒酵母产紫穗槐二烯代谢过程。 [0103] 从上述实施例可以看出，相较于间歇控制补料和传统溶氧控制补料方法，全自动控制补料方法自动化水平更高，能够避免补料较少碳源供应不足的情况。这样的结果建立在正确判断了补料起始点的基础上，提高了酿酒酵母产紫穗槐二烯的产量，如果人工判断错过补料起始点，产量则会出现下降。选择全自动控制补料方法，实现了自动识别补料起始点，实现了自动化限糖补料，避免菌株发酵结束引起的过多补料，降低了实验检测频次。以及对溶氧采用溶氧值设定进行验证，减少葡萄糖效应，降低菌体由于长时间饥饿死亡，减少乳化现象。全自动补料控制是一种高产的酿酒酵母产紫穗槐二烯的补料控制方法(策略)。 [0104] 应当注意的是，以上所述的实施例仅为本发明较佳实施例，用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

意见反馈