[0001] 本发明属于代谢工程技术领域，具体涉及一种瓦伦烯合酶的氨基酸序列及其编码基因与应用。

[0002] 生产瓦伦烯的前体是法尼基焦磷酸。瓦伦烯是一种具有柑橘气味的倍半萜类化合物，主要存在于柑橘属植物中，是柑橘类水果和柑橘类香精的主要香气成分，常被用于化妆品和食品添加剂。瓦伦烯也是诺卡酮的前体，诺卡酮被广泛用于化妆品、食品、芳香治疗、驱蚊杀虫等领域，其应用前景十分广阔。

[0003] 目前，市场上的瓦伦烯主要来源于植物提取。由于植物生长周期长、供给不稳定，且提取工艺复杂，提取的产品纯度低，同时，随着经济高速增长带来物质需求增长，仅靠植物提取并不能满足人们对其日益增长的需求，又因为瓦伦烯的场景运用往往与人接触密切，经化学方法合成的瓦伦烯在运用上受到极大限制。微生物发酵也是瓦伦烯的一个来源，微生物发酵法生产的瓦伦烯相对安全，而且生产具有条件温和、不受地理和气候影响、容易进行大规模生产等优势，构建微生物细胞工厂实现天然产物的生物合成一直是合成生物学的研究热点。目前，已报道了多个瓦伦烯合酶的基因序列，并用酿酒酵母和谷氨酸棒状杆菌等微生物成功表达了瓦伦烯合酶基因，但瓦伦烯产量，收到宿主、代谢途径等综合因素的影响(1)相同途径在不同宿主中的生产效率具有不确定性，如在酵母中高产瓦伦烯的瓦伦烯合酶，在大肠杆菌中产量不一定高；(2)相同的瓦伦烯合酶搭配不同的FPP合成途径，生产效率也具有不确定性。需要确定宿主、瓦伦烯合酶及FPP合成途径的合理搭配方式，以达到提高瓦伦烯产量的目的。目前在酿酒酵母中瓦伦烯的最高产量为16.6g/L(Ye Z,Huang Y,Shi B,et al.Coupling  cell growth  and  biochemical pathway induction in Saccharomyces cerevisiae for production of(+)‑valencene and its chemical conversion to(+)‑nootkatone[J].Metabolic Engineering,2022,72:107‑115.)，谷氨酸棒状杆菌中瓦伦烯的最高产量仅为2.41±0.26mg/L(Jonas Frohwitter,Sabine A.E.Heider,Petra Peters‑Wendisch,Jules Beekwilder,Volker F.Wendisch,Production of the sesquiterpene(+)‑valencene by metabolically engineered Corynebacterium glutamicum,Journal of Biotechnology,Volume 191,2014,Pages 
205‑213.)。但是目前已经公开的生产瓦伦烯的微生物，瓦伦烯产量都很低，限制了瓦伦烯的微生物合成。

[0004] 本发明的目的是为了提高瓦伦烯产量。

[0005] 本发明提供一种瓦伦烯合酶的氨基酸序列，所述瓦伦烯合酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。

[0006] 本发明提供编码上述的编码瓦伦烯合酶基因序列。

[0007] 进一步地限定，编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的基因序列如SEQ ID NO.2所示；编码SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的基因序列如SEQ ID NO.4所示。

[0008] 本发明提供含有上述的基因序列的重组载体。

[0009] 进一步地限定，所述重组载体的出发载体为pET‑28a。

[0010] 本发明提供携带上述的瓦伦烯合酶或过表达上述的基因序列的重组微生物细胞。

[0011] 进一步地限定，所述重组微生物细胞为真核微生物细胞或者原核微生物细胞。

[0012] 本发明提供一种生产瓦伦烯的方法，所述方法是将上述的重组微生物细胞，在可使重组微生物细胞产生法尼基焦磷酸的发酵培养基中，发酵获得瓦伦烯。

[0013] 进一步地限定，产法尼基焦磷酸的重组菌的构建方法：构建过表达乙酰CoA酰基转移酶/HMG‑CoA还原酶mvaE基因、HMG‑CoA合成酶mvaS基因、甲羟戊酸激酶ERG12基因、甲羟戊酸‑5‑磷酸激酶ERG8基因、甲羟戊酸‑5‑二磷酸脱羧酶ERG19基因、异戊烯基二磷酸异构酶IDI基因及法尼基焦磷酸合成酶ispA基因的大肠杆菌重组菌。

[0014] 本发明提供上述的瓦伦烯合酶氨基酸序列、上述的基因序列、上述的重组载体或上述的重组微生物细胞在产瓦伦烯的应用。

[0015] 本发明提供上述的瓦伦烯合酶氨基酸序列、上述的基因序列、上述的重组载体或上述的重组微生物细胞的不同组合方式在产瓦伦烯的应用。

[0016] 有益效果：

[0017] 1)本发明所述瓦伦烯合酶在大肠杆菌中表达，在发酵罐中获得25g/L的瓦伦烯，超过目前所有技术水平。

[0018] 2)本发明所述瓦伦烯合酶在可高效积累法尼基焦磷酸的大肠杆菌底盘中表达，发酵周期在96h左右，远远小于酵母细胞中其他合酶表达的发酵周期(＞300h)，合成瓦伦烯的效率及生产强调高。

[0019] 3)本发明所述表达瓦伦烯合酶的大肠杆菌，发酵时可耐受高达20％的萃取剂浓度，对于后续的工业化推进具有更大潜力及更好实践的意义。附图说明

[0020] 图1法尼基焦磷酸生成瓦伦烯。

[0021] 图2瓦伦烯GC‑MS图。

[0022] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0023] 实施例所用试剂与培养基配方：EcoRI、BglII、NotI、SacI和SfiI内切酶购于TaKaRa；DNA聚合酶预混液PrimeSATR Max Premix购于TaKaRa；T4DNA连接酶购于NEB；NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix试剂盒购于NEB；质粒小提试剂盒及胶回收试剂盒购于Omega；上述分子生物学试剂用于基因克隆实验。

[0024] 瓦伦烯标准品购自上海源叶公司，其他未做特殊说明的试剂和药品均为国产分析纯。

[0025] LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L；固体LB培养基添加1.5‑2％的琼脂粉。

[0026] 发酵培养基：20g/L葡萄糖、9.8g/L K2HPO4、5g/L牛肉提取物、0.3g/L柠檬酸铁铵、2.1g/L一水合柠檬酸、0.06g/L MgSO4、1mL/L微量元素溶液，所述微量元素溶液含有(NH4)
6Mo7O24·4H2O 0.37g/L、ZnSO4·7H2O 0.29g/L、H3BO3 2.47g/L、CuSO4·5H2O 0.25g/L和MnCl2·4H2O 1.58g/L，所述浓度为各成分在微量元素溶液中的终浓度(CN 111607546A)。

[0027] 使用的初始菌株是过表达乙酰CoA酰基转移酶/HMG‑CoA还原酶mvaE基因、HMG‑CoA合成酶mvaS基因、甲羟戊酸激酶ERG12基因、甲羟戊酸‑5‑磷酸激酶ERG8基因、甲羟戊酸‑5‑二磷酸脱羧酶ERG19基因、异戊烯基二磷酸异构酶IDI基因、法尼基焦磷酸合成酶ispA基因的重组菌，表达这些基因的大肠杆菌和酿酒酵母工程菌可产生法尼基焦磷酸。

[0028] CoA酰基转移酶/HMG‑CoA还原酶mvaE基因、HMG‑CoA合成酶mvaS基因、甲羟戊酸激酶ERG12基因、甲羟戊酸‑5‑磷酸激酶ERG8基因、甲羟戊酸‑5‑二磷酸脱羧酶ERG19基因、异戊烯基二磷酸异构酶IDI基因、法尼基焦磷酸合成酶ispA基因序列记载在公开号为CN 111607546A的专利中，其中IDI基因是CN 111607546A中来自青蒿的AaIDI基因。在表达上述MVA途径基因的工程菌中，表达瓦伦烯合成酶编码基因EgVS或SmVS(CN202111275680.4)得到的大肠杆菌工程菌可产生瓦伦烯。pET‑28a‑EgVS和pET‑28a‑SmVS重组载体的构建交由测序公司合成。

[0029] 在表达MVA途径的大肠杆菌重组菌中导入载体pET‑28a‑EgVS或pET‑28a‑SmVS，获得可产生瓦伦烯的大肠杆菌重组菌，于5L发酵罐中发酵生产瓦伦烯。

[0030] 实施例所得产物采用以下检测方法进行表征：

[0031] 400M核磁共振：仪器型号：布鲁克ASCEND 400兆核磁。

[0032] 液相色谱质谱联用(LC‑MS)条件：液相色谱‑Q‑TOF高分辨质谱，Bruke Maxis UHR TOF

[0033] 对反应体系中的原料、中间体、产物进行定性和定量分析，产物通过反向色谱ZORBAX SB‑C18(粒径为1.8μm；2.1×50mm)进行分离，流速为0.2mL/min，进样体积1μL，柱温箱40℃，检测模式正离子模式，检测电压1.56kV，雾化气(N2)流速1.5L/min，干燥气(N2)压力100kPa，离子收集时间30ms，碰撞能量50％，MS扫描范围100‑600m/z，通过外标法对样品进行定量分析。

[0034] 法尼基焦磷酸生成瓦伦烯的原理如图1所示。

[0035] 实施例1.获得瓦伦烯酶的编码基因

[0036] 1.分别以在酿酒酵母(Ye Z,Huang Y,Shi B,et al.Coupling cell growth and biochemical pathway induction in Saccharomyces cerevisiae for production of(+)‑valencene and its chemical conversion to(+)‑nootkatone[J].Metabolic Engineering,2022,72:107‑115.)和谷氨酸棒杆菌(Jonas  Frohwitter,Sabine A.E.Heider,Petra Peters‑Wendisch,Jules Beekwilder,Volker F.Wendisch,Production of the sesquiterpene(+)‑valencene by metabolically engineered Corynebacterium glutamicum,Journal of Biotechnology,Volume 191,2014,Pages 205‑213.)中产瓦伦烯的瓦伦烯合酶序列为模板，用Amber软件设计适合在大肠杆菌中合成瓦伦烯的酶，获得如序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所述的氨基酸序列。

[0037] 2.利用在线服务器(http://www.jcat.de/)设计适合在大肠杆菌中分别表达序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3的氨基酸的编码基因，基因序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示。

[0038] 实施例2.利用大肠杆菌重组菌生产瓦伦烯

[0039] 一、制备法尼基焦磷酸工程菌

[0040] 1.制备一种高产瓦伦烯的基因工程菌：为过表达乙酰CoA酰基转移酶/HMG‑CoA还原酶mvaE基因、HMG‑CoA合成酶mvaS基因、甲羟戊酸激酶ERG12基因、甲羟戊酸‑5‑磷酸激酶ERG8基因、甲羟戊酸‑5‑二磷酸脱羧酶ERG19基因、异戊烯基二磷酸异构酶IDI基因、法尼基二磷酸合成酶ispA基因、MVA途径基因、瓦伦烯合成酶编码基因(EgVS或SmVS)的重组微生物细胞，出发菌株为大肠杆菌。

[0041] 1)质粒pACYC‑mvaE‑mvaS‑ispA构建：

[0042] 将质粒pACYC‑mvaE‑mvaS‑ispA‑AaFS中的β‑法尼烯合成酶AaFS基因去掉。质粒pACYC‑mvaE‑mvaS‑ispA的构建采取Gibson Assembly的方法。首先以pACYC‑mvaE‑mvaS‑ispA‑AaFS质粒为模板扩增不含AaFS的载体部分即pACYC‑mvaE‑mvaS‑ispA，上游引物pA‑F(atatggcagatctcaattggatatc，SEQ ID NO.5)，下游引物pA‑F(atccagcgtaataaataattatttattacgctggatgatgt，SEQ ID NO.6)。

[0043] PCR扩增体系如下：模版1μL，PrimeSTAR Max Premix 25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，水20μL。PCR反应程序：98℃2min；98℃10s，55℃15s，72℃1kb/15s，共35个循环；72℃5min。

[0044] PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，割胶回收pACYC‑mvaE‑mvaS‑ispA载体片段，用NEBuilder试剂盒进行自连接反应，根据说明书计算片段的比例和各成分的量，连接反应50℃，60min，产物加等体积无菌水稀释，取5μL热激转化DH5α感受态细胞并涂布添加抗生素Cm的LB平板，37℃培养过夜。第二天观察板子上的菌落情况，挑取单菌落到液体培养基，37℃培养至较浓，进行菌落PCR鉴定或提取质粒酶切鉴定，并送交测序，获得质粒pACYC‑mvaE‑mvaS‑ispA。

[0045] 2)质粒pTrcLower‑IDI构建：

[0046] 将异戊烯基二磷酸异构酶IDI基因序列经大肠杆菌密码子偏好性优化后，由华大基因进行序列合成，合成后的序列如SEQ ID No:1所示，并克隆到pUC57‑simple载体上得到质粒pUC57‑IDI，质粒pTrcLower‑IDI的构建采取酶切‑连接的方法。首先以质粒pUC57‑IDI和pTrcLower为模板，用带有SacI和PstI的引物分别扩增IDI基因片段和pTrc‑ERG12‑ERG8‑ERG‑19载体片段.。

[0047] PCR扩增体系如下：模版1μL，PrimeSTAR Max Premix 25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，水20μL。PCR反应程序：98℃2min；98℃10s，55℃15s，72℃1kb/15s，共35个循环；72℃5min。

[0048] 所述pTrc‑ERG12‑ERG8‑ERG‑19载体序列扩增用的上游引物low‑Pst‑F序列(aaaggaataactgcagctggtaccatatgg，SEQ ID NO.7)，下游引物low‑Sac‑R序列(taggagctcttattcctttggtagaccagtctttg，SEQ ID NO.8)；IDI基因扩增用的上游引物IDI‑Sac‑F序列(taggagctcgtaaggaggtatcaatatgaccattctgaccgatgc，SEQ ID NO.9)，下游引物IDI‑Pst‑R序列(aactgcagttacagattatgaatggttttcatatcac，SEQ ID NO.10)。

[0049] PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，分别割胶回收IDI基因片段和pTrc‑ERG12‑ERG8‑ERG19载体片段，用SacI和PstI进行双酶切。

[0050] 酶切体系：胶回收产物20μL，10×限制性内切酶缓冲液5μL，SacⅠ2μL，PstⅠ2μL，水21μL，37℃反应30min。

[0051] 酶切后产物进行琼脂糖凝胶电泳，分别割胶回收IDI基因片段和pTrc‑ERG12‑ERG8‑ERG19载体片段，回收产物进行连接反应：

[0052] 连接体系：载体4.5μL，插入片段4μL，10×连接酶缓冲液1μL，T4连接酶0.5μL。16℃连接过夜。

[0053] 连接产物10μL热激转化E.coli DH5α感受态细胞并涂布带有抗生素Amp的LB平板，37℃培养过夜。第二天观察板子上的菌落情况，挑取单菌落到液体培养基，37℃培养至较浓，进行菌落PCR鉴定或提取质粒酶切鉴定，并送交测序，获得质粒pTrc‑ERG12‑ERG8‑ERG19‑IDI即pTrcLower‑IDI。

[0054] 3)积累法尼基焦磷酸工程菌的构建：

[0055] 将步骤1)制备得到的pACYC‑mvaE‑mvaS‑ispA和步骤2)制备得到的pTrcLower‑IDI共同转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布带有抗生素Cm和Amp的LB培养基平板，其中Cm在LB培养基中的终浓度为34mg/L，Amp在LB培养基中的终浓度为100mg/L，37℃培养至有单菌落长出，获得可积累法尼基焦磷酸的大肠杆菌基因工程菌。

[0056] 二、表达EgVS的产瓦伦烯大肠杆菌重组菌的构建

[0057] 1)质粒pET‑28a‑EgVS构建：(根据文献所述序列优化(Ye Z,Huang Y,Shi B,et al.Coupling cell growth and biochemical pathway induction in Saccharomyces cerevisiae for production of(+)‑valencene and its chemical conversion to(+)‑nootkatone[J].Metabolic Engineering,2022,72:107‑115.)

[0058] 将瓦伦烯合酶EgVS基因序列经大肠杆菌密码子偏好性优化后，两段分别加限制性NdeI、XhoI酶切位点，由华大基因进行序列合成，合成后的序列如SEQ ID NO:2所示，并克隆到pET‑28a载体上得到质粒pET‑28a‑EgVS。

[0059] 同时连接未经序列优化的EgVS(Ye Z,Huang Y,Shi B,et al.Coupling cell growth and biochemical pathway induction in Saccharomyces cerevisiae for production of(+)‑valencene and its chemical conversion to(+)‑nootkatone[J].Metabolic Engineering,2022,72:107‑115.)，得到质粒pET‑28a‑EgVS‑WT。

[0060] 2)质粒转化：

[0061] 将测序正确的质粒pET‑28a‑EgVS转化步骤3)中获得的可积累法尼基焦磷酸的大肠杆菌工程菌的感受态细胞中，涂布带有抗生素Cm、Amp和Kan的LB培养基平板，其中Cm在LB培养基中的终浓度为34mg/L，Amp在LB培养基中的终浓度为100mg/L，Kan在LB培养基中的终浓度为50mg/L，37℃培养至有单菌落长出，获得合成瓦伦烯的大肠杆菌基因工程菌E.coli BL21(DE3)+pET‑28a‑EgVS+pACYC‑mvaE‑mvaS‑ispA+pTrcLower‑IDI。

[0062] 实施例2.表达EgVS的大肠杆菌重组菌合成瓦伦烯的应用

[0063] 挑取实施例1中获得的瓦伦烯的大肠杆菌重组菌E.coli BL21(DE3)+pET‑28a‑EgVS+pACYC‑mvaE‑mvaS‑ispA+pTrcLower‑IDI在5L发酵罐中进行两相发酵：本实施例中所述一级种子培养基为LB培养基，其成分为：10g/L NaCl、10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物，其余为水。

[0064] 所述摇瓶发酵培养基成分为：20g/L葡萄糖、9.8g/L K2HPO4、5g/L牛肉提取物、0.3g/L柠檬酸铁铵、2.1g/L一水合柠檬酸、0.06g/L MgSO4、1mL/L微量元素溶液，所述微量元素溶液含有(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.37g/L、ZnSO4·7H2O 0.29g/L、H3BO3 2.47g/L、CuSO4·
5H2O0.25g/L和MnCl2·4H2O 1.58g/L，所述浓度为各成分在微量元素溶液中的终浓度。

[0065] 挑取获得基因工程菌的单菌落到5mL含有相应抗生素(Cm、Amp和Kan)的LB培养基中，37℃200rpm摇床培养8～12h，获得一级种子液。用体积250mL的锥形瓶进行摇瓶发酵，转接1mL一级种子液到100mL含有相应抗生素(Cm、Amp和Kan)的LB培养基中，37℃200rpm摇床培养8～12h，获得二级种子液。最后经火焰接种环，将200mL种子液加入含2L发酵培养基的5L发酵罐中(保兴生物，BIOTECH‑5JG‑7000A)。当OD600达到25左右时，加入IPTG至终浓度为
0.1mM和400mL的正十二烷30℃发酵培养120h后结束培养。

[0066] 发酵过程中参数设定值分别为：温度30℃，pH 5.0，溶氧30％，空气流量3‑20L/min，搅拌转速300‑1000rpm，溶氧与搅拌转速、通气级联。当溶氧大于60％时，向发酵罐中加入补料培养基至发酵液中葡萄糖浓度为5g/L。

[0067] 收集有机层，纯化后用GC‑MS鉴定，结果如图2所示，大肠杆菌重组菌E.coli BL21(DE3)+pET‑28a‑EgVS+pACYC‑mvaE‑mvaS‑ispA+pTrcLower‑IDI发酵产物为瓦伦烯，用液相色谱质谱联用检测摇瓶产量为560mg/L，发酵罐中获得瓦伦烯产量为21g/L，纯度为97％。表达未优化EgVS的工程菌，瓦伦烯摇瓶产量为270mg/L，发酵罐中获得瓦伦烯产量为13g/L，纯度为97％。

[0068] 实施例3.表达SmVS的产瓦伦烯大肠杆菌重组菌的构建

[0069] 1)质粒pET‑28a‑SmVS构建：(根据文献所述序列优化(Jonas Frohwitter,Sabine A.E.Heider,Petra Peters‑Wendisch,Jules Beekwilder,Volker F.Wendisch,Production of the sesquiterpene(+)‑valencene by metabolically engineered Corynebacterium glutamicum,Journal of Biotechnology,Volume 191,2014,Pages 205‑213.)

[0070] 将瓦伦烯合酶SmVS基因序列经大肠杆菌密码子偏好性优化后，两段分别加限制性NdeI、XhoI酶切位点，由华大基因进行序列合成，合成后的序列如SEQ ID NO:4所示，并克隆到pET‑28a载体上得到质粒pET‑28a‑SmVS。

[0071] 同时连接未经序列优化的SmVS，得到质粒pET‑28a‑SmVS‑WT。

[0072] 2)质粒转化：

[0073] 将测序正确的质粒pET‑28a‑SmVS转化至实施例1的步骤3)获得的可积累法尼基焦磷酸的大肠杆菌工程菌的感受态细胞中，涂布带有抗生素Cm、Amp和Kan的LB培养基平板，其中Cm在LB培养基中的终浓度为34mg/L，Amp在LB培养基中的终浓度为100mg/L，Kan在LB培养基中的终浓度为50mg/L，37℃培养至有单菌落长出，获得合成瓦伦烯的大肠杆菌基因工程菌。

[0074] 实施例4.表达SmVS的大肠杆菌重组菌合成瓦伦烯的应用

[0075] 挑取实施例2中获得的瓦伦烯的大肠杆菌重组菌E.coli BL21(DE3)+pET‑28a‑SmVS+pACYC‑mvaE‑mvaS‑ispA+pTrcLower‑IDI在5L发酵罐中进行两相发酵：本实施例中所述一级种子培养基为LB培养基，其成分为：10g/L NaCl、10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物，其余为水。

[0076] 所述摇瓶发酵培养基成分为：20g/L葡萄糖、9.8g/L K2HPO4、5g/L牛肉提取物、0.3g/L柠檬酸铁铵、2.1g/L一水合柠檬酸、0.06g/L MgSO4、1mL/L微量元素溶液，所述微量元素溶液含有(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.37g/L、ZnSO4·7H2O 0.29g/L、H3BO3 2.47g/L、CuSO4·
5H2O0.25g/L和MnCl2·4H2O 1.58g/L，所述浓度为各成分在微量元素溶液中的终浓度。

[0077] 挑取实施例1获得基因工程菌的单菌落到5mL含有相应抗生素(Cm、Amp和Kan)的LB培养基中，37℃200rpm摇床培养8～12h，获得一级种子液。用体积250mL的锥形瓶进行摇瓶发酵，转接1mL一级种子液到100mL含有相应抗生素(Cm、Amp和Kan)的LB培养基中，37℃200rpm摇床培养8～12h,获得二级种子液。最后经火焰接种环，将200mL种子液加入含2L发酵培养基的5L发酵罐中(保兴生物，BIOTECH‑5JG‑7000A)。当OD600达到25左右时，加入IPTG至终浓度为0.1mM和400mL的正十二烷30℃发酵培养120h后结束培养。

[0078] 发酵过程中参数设定值分别为：温度30℃，pH 5.0，溶氧30％，空气流量3‑20L/min，搅拌转速300‑1000rpm，溶氧与搅拌转速、通气级联。当溶氧大于60％时，向发酵罐中加入补料培养基至发酵液中葡萄糖浓度为5g/L。

[0079] 收集有机层，纯化后用GC‑MS鉴定，大肠杆菌重组菌E.coli BL21(DE3)+pET‑28a‑SmVS+pACYC‑mvaE‑mvaS‑ispA+pTrcLower‑IDI发酵产物为瓦伦烯，用液相色谱质谱联用检测产量为25g/L。表达未优化SmVS的工程菌，瓦伦烯摇瓶产量为2760mg/L，发酵罐中获得瓦伦烯产量为14g/L，纯度为97％。

[0080] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

[0081] 瓦伦烯合酶EgVS(Artificial Sequence)氨基酸序列SEQ ID NO.1：MSLNVLSTSGSAPTTKSSEITRRSANYHPSLWGDKFLEYSSPDHLKNDSFTEKKHEQLKEEVKKMLVETVQKPQQQLNLINEIQRLGLSYLFEPEIEAALQEISVTYDEFCCSTDADDLHNVALSFRILREHGHNVSSDVFQKFMDSNGKLKDYLVNDARGLLSLYEATHFRVHNEDKLEELLSVTTSRLEHLKSRVKYPLEDEISRALKHPLHKELNRLGARYYISIYEKFDSHNKLLLEFAKLDFNRLQKMYQHELAHLTRWWKDLDFTNKLPFARDRIVEGYFWILGMYFEPERKDVREFLNKVFALITVVDDTYDVYGTFEELLLFTDAIEKWGTSDLDQLPGYMRIIYQALMDVYNQMEEKLSMKADCPTYRLEFAIETVKAMFRSYLEEARWSKEHYIPSMEEYMTVALVSVGYKTILTNSFVGMGDIATREVFEWVFNSPLIIRASDLIARLGDDIGGHEEEQKKGDAATAIECYIKENHVTKHEAYDEFQKQIDNAWKDLNKEALRPFPVPMTFITRVVHFTRAVHVIYADFSDGYTRSDKAIRGYITSLLVDPIPL；

[0082] 瓦伦烯合酶EgVS(Artificial Sequence)的编码基因SEQ ID NO.2：ATGTCTCTGAACGTTCTGTCTACCTCTGGTTCTGCTCCGACCACCAAATCTTCTGAAATCACCCGTCGTTCTGCTAACTACCACCCGTCTCTGTGGGGTGACAAATTCCTGGAATACTCTTCTCCGGACCACCTGAAAAACGACTCTTTCACCGAAAAAAAACACGAACAGCTGAAAGAAGAAGTTAAAAAAATGCTGGTTGAAACCGTTCAGAAACCGCAGCAGCAGCTGAACCTGATCAACGAAATCCAGCGTCTGGGTCTGTCTTACCTGTTCGAACCGGAAATCGAAGCTGCTCTGCAGGAAATCTCTGTTACCTACGACGAATTCTGCTGCTCTACCGACGCTGACGACCTGCACAACGTTGCTCTGTCTTTCCGTATCCTGCGTGAACATGGCCACAACGTAAGCTCTGACGTTTTCCAGAAATTCATGGACTCTAACGGTAAACTGAAAGACTACCTGGTTAACGACGCTCGTGGTCTGCTGTCTCTGTACGAAGCTACCCACTTCCGTGTTCACAACGAAGACAAACTGGAAGAACTGCTGTCTGTTACCACCTCTCGTCTGGAACACCTGAAATCTCGTGTTAAATACCCGCTGGAAGACGAAATCTCTCGTGCTCTGAAACACCCGCTGCACAAAGAACTGAACCGTCTGGGTGCTCGTTACTACATCTCTATCTACGAAAAATTC GACTCTCACAACAAACTGCTGCTGGAATTCGCTAAACTGGACTTCAACCGTCTGCAGAAAATGTACCAGCACGAACTGGCTCACCTGACCCGTTGGTGGAAAGACCTGGACTTCACCAACAAACTGCCGTTCGCTCGTGACCGTATCGTTGAAGGTTACTTCTGGATCCTGGGTATGTACTTCGAACCGGAACGTAAAGACGTTCGTGAATTCCTGAACAAAGTTTTCGCTCTGATCACCGTTGTTGACGACACCTACGACGTTTACGGTACCTTCGAAGAACTGCTGCTGTTCACCGACGCTATCGAAAAATGGGGTACCTCTGACCTGGACCAGCTGCCGGGTTACATGCGTATCATCTACCAGGCTCTCATGGACGTCTACAACCAGATGGAAGAAAAACTGTCTATGAAAGCTGACTGCCCGACCTACCGTCTGGAATTCGCTATCGAAACCGTTAAAGCTATGTTCCGTTCTTACCTGGAAGAAGCTCGTTGGTCTAAAGAACACTACATCCCGTCTATGGAAGAATACATGACCGTTGCTCTGGTTTCTGTTGGTTACAAAACCATCCTGACCAACTCTTTCGTTGGTATGGGTGACATCGCTACCCGTGAAGTTTTCGAATGGGTTTTCAACTCTCCGCTGATCATCCGTGCTTCTGACCTGATCGCTCGTCTGGGTGACGACATCGGTGGTCACGAAGAAGAACAGAAAAAAGGTGACGCTGCTACCGCTATCGAATGCTACATCAAAGAAAACCACGTTACCAAACACGAAGCTTACGACGAATTCCAGAAACAGATCGACAACGCTTGGAAAGACCTGAACAAAGAAGCTCTGCGTCCGTTCCCGGTTCCGATGACCTTCATCACCCGTGTTGTTCACTTCACCCGTGCTGTTCACGTTATCTACGCTGACTTCTCTGACGGTTACACCCGTTCTGACAAAGCTATCCGTGGTTACATCACCTCTCTGCTGGTTGACCCGATCCCGCTGTAA。

[0083] 瓦伦烯合酶SmVS(Artificial Sequence)氨基酸序列SEQ ID NO.3：MATTQVEIQRPIANFSPSLWGDQFIKNDSGAKAAEKHCKAVEELKKEVMNMITAAESNLVEAMNLIDTLERLGISYHFEKEIDQKLNHFFSLNTDYSDESYDLYTVSLHFRLFRQHGHRISSDIFGRWIDESGKFKEGLKTDGKGLLSLYEASYLRTRGETILDDALEFATATLNSIAPHLESPLSKQVVHALIQPLHYGNPRIEAHNFISIYEENQDKNEFLLKFAKLDYNLLQMLHKEELHEVSRWWKELDLVSKLPYARDRVVECFFWAMGVYHEPQYSRARIMLTKTITMTSIIDDTYDAYGVIEELDIFTEAIERWNIEEMDRLPEYVKPFYKALLELYEQFEEELAEEGRSYAAHYAIESLKELVRSYHVEAKWFIQGYLPPFEEYLKNALITCTYCYHTTTSLLGVESAVEEDFQWLAKKPKMLVAGLLICRVIDDIATYEVEKERGQSATGIESYMRDNNATIEEAVAKFFEIATDAWK DINEECLMPSPYSRDVLMRILNLERIIDVTYKGNEDGYTQPEKVLKPHIIALFVDPIKM；瓦伦烯合酶SmVS(Artificial Sequence)的编码基因SEQ ID NO.4：ATGGCTACCACCCAGGTTGAAATCCAGCGTCCGATCGCTAACTTCTCTCCGTCTCTGTGGGGTGACCAGTTCATCAAAAACGACTCTGGTGCTAAAGCTGCTGAAAAACACTGCAAAGCTGTTGAAGAACTGAAAAAAGAAGTTATGAACATGATCACCGCTGCTGAATCTAACCTGGTTGAAGCTATGAACCTGATCGACACCCTGGAACGTCTGGGTATCTCTTACCACTTCGAAAAAGAAATCGACCAGAAACTGAACCACTTCTTCTCTCTGAACACCGACTACTCTGACGAATCTTACGACCTGTACACCGTTTCTCTGCACTTCCGTCTGTTCCGTCAGCACGGTCACCGTATCTCTTCTGACATCTTCGGTCGTTGGATCGACGAATCTGGTAAATTCAAAGAAGGTCTGAAAACCGACGGTAAAGGTCTGCTGTCTCTGTACGAAGCTTCTTACCTGCGTACCCGTGGTGAAACCATCCTGGACGACGCTCTGGAATTCGCTACCGCTACCCTGAACTCTATCGCTCCGCACCTGGAATCTCCGCTGTCTAAACAGGTTGTTCACGCTCTGATCCAGCCGCTGCACTACGGTAACCCGCGTATCGAAGCTCACAACTTCATCTCTATCTACGAAGAAAACCAGGACAAAAACGAATTCCTGCTGAAATTCGCTAAACTGGACTACAACCTGCTGCAGATGCTGCACAAAGAAGAACTGCACGAAGTTTCTCGTTGGTGGAAAGAACTGGACCTGGTTTCTAAACTGCCGTACGCTCGTGACCGTGTTGTTGAATGCTTCTTCTGGGCTATGGGTGTTTACCACGAACCGCAGTACTCTCGTGCTCGTATCATGCTGACCAAAACCATCACCATGACCTCTATCATCGACGACACCTACGACGCTTACGGTGTTATCGAAGAACTGGACATCTTCACCGAAGCTATCGAACGTTGGAACATCGAAGAAATGGACCGTCTGCCGGAATACGTTAAACCGTTCTACAAAGCTCTGCTGGAACTGTACGAACAGTTCGAAGAAGAACTGGCTGAAGAAGGTCGTTCTTACGCTGCTCACTACGCTATCGAATCTCTGAAAGAACTGGTTCGTTCTTACCACGTTGAAGCTAAATGGTTCATCCAGGGTTACCTGCCGCCGTTCGAAGAATACCTGAAAAACGCTCTGATCACCTGCACCTACTGCTACCACACCACCACCTCTCTGCTGGGTGTTGAATCTGCTGTTGAAGAAGACTTCCAGTGGCTGGCTAAAAAACCGAAAATGCTGGTTGCTGGTCTGCTGATCTGCCGTGTTATCGACGACATCGCTACCTACGAAGTTGAAAAAGAACGTGGTCAGTCTGCTACCGGTATCGAATCTTACATGCGTGACAACAACGCTACCATCGAAGAAGCTGTTGCTAAATTCTTCGAAATCGCTACCG

[0084] ACGCTTGGAAAGACATCAACGAAGAATGCCTGATGCCGTCTCCGTACTCTCGTGACGT

[0085] TCTGATGCGTATCCTGAACCTGGAACGTATCATCGACGTTACCTACAAAGGTAACGAA

[0086] GACGGTTACACCCAGCCGGAAAAAGTTCTGAAACCGCACATCATCGCTCTGTTCGTTG

[0087] ACCCGATCAAAATG。