[0001] 本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种提高衣藻半萜含量的转基因系统及其应用。

[0002] 萜类化合物是自然界中最大的一类化学物质，目前已知的萜类化合物超过8万种。由于其在医药、农业、香精、香料、化妆品、癌症治疗以及药物制备等领域中具有重要的应用价值，因此备受关注。

[0003] 所有天然产生的萜类化合物都是由两种C5萜类前体，即异戊烯基二磷酸(IPP)及其异构体二甲基丙烯基二磷酸(DMAPP)衍生而来。异戊二烯前体DMAPP和IPP通过以下两种途径之一自然合成：甲羟戊酸(MVA)途径包括从乙酰辅酶A生成IPP的6个反应，IPP再由异戊二烯焦磷酸异构酶(IDI)异构化产生DMAPP；非甲羟戊酸途径(MEP或DXP途径)由等摩尔量的丙酮酸和甘油醛3‑磷酸(G3P)为前体，通过7个反应，最终生成的DMAPP和IPP比例约为5:1。而异戊烯醇利用IUP途径(合成路径示意图如图1所示)，通过两步法即可合成C5类异戊二烯前体(IPP或DMAPP)，显著减少了通过代谢工程和酶工程进行优化合成半萜(IPP和DMAPP)所需的酶促步骤，允许通过简单的工程来提高萜类产量。

[0004] 莱茵衣藻是最具特征、拥有最多遗传工具和技术的藻类物种，具有生长速度快、基因组序列清晰、分子遗传学简单、可以利用光能作为能源等特点，使其成为了一种优秀的模式生物。衣藻被认为是生产高价值化学物质和高价值重组蛋白的合适宿主。近年来研究表明，在莱茵衣藻中可以合成广藿香醇和甜没药烯，表明其具有生产异源萜类物质的潜力。

[0005] 然而，现有技术中通过衣藻合成萜类物质的方法均具有效率低、产量少的不足。因此，如何提高萜类物质在衣藻中的合成产量及效率，已成为亟待解决的问题。

[0006] 针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种提高衣藻半萜含量的转基因系统及其应用，通过在衣藻中重构IUP途径，以异戊烯醇异构体3‑甲基‑3‑丁烯‑1‑醇(Isoprenol)或3‑甲基‑2‑丁烯‑1‑醇(Prenol)为底物，经过两步酶促反应，通过胆碱激酶(CK)和异戊烯基磷酸激酶(IPK)的催化合成IPP或DMAPP，提高了宿主中C5萜类前体的含量。

[0007] 为达此目的，本发明采用如下技术方案：

[0008] 第一方面，本发明提供了一种提高衣藻半萜含量的转基因系统，所述提高衣藻半萜含量的转基因系统包括：

[0009] 含有胆碱激酶基因的重组载体和/或含有异戊烯基磷酸激酶基因的重组载体；

[0010] 所述胆碱激酶基因包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

[0011] 所述异戊烯基磷酸激酶基因包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

[0012] SEQ ID NO.1：

[0013] ATGGTACAAGAGTCCCGCCCCGGCTCCGTCCGCTCCTACTCCGTCGGATACCAGGTGAGTCGACGAGCAAGCCCGGCGGATCAGGCAGCGTGCTTGCAGATTTGACTTGCAACGCCCGCATTGTGTCGACGAAGGCTTTTGGCTCCTCTGTCGCTGTCTCAAGCAGCATCTAACCCTGCGTCGCCGTTTCCATTTGCAGGCCCGCTCGCGCTCCTCCTCTCAACGAAGACACTCCCTGACCCGCCAGCGAAGCAGCCAGCGCCTGATCCGCACCATCAGCATCGAGAGCGACGTCAGCAACATCACCGACGACGACGACCTGCGCGCCGTGAACGAGGGCGTGGCCGGCGTGCAACTGGACGTCAGCGAGACCGCCAACAAGGGCCCCCGCCGCGCCAGCGCCACCGACGTGACCGATAGCCTGGGAAGCACCAGTAGCGAGTACATCGAGATCCCCTTCGTGAAGGAGACCCTGGACGCCAGCCTGCCAAGCGACTACCTGAAGCAAGACATCCTGAACCTGATCCAGAGCCTGAAGATCAGCAAGTGGTACAACAACAAGAAGATCCAGCCCGTGGCCCAAGACATGAACCTAGTGAAGATCAGCGGTGAGTCGACGAGCAAGCCCGGCGGATCAGGCAGCGTGCTTGCAGATTTGACTTGCAACGCCCGCATTGTGTCGACGAAGGCTTTTGGCTCCTCTGTCGCTGTCTCAAGCAGCATCTAACCCTGCGTCGCCGTTTCCATTTGCAGGCGCCATGACCAACGCCATCTTCAAGGTGGAGTACCCCAAGCTGCCAAGCCTGCTGCTGCGCATCTACGGCCCCAACATCGACAACATCATCGACCGCGAATACGAGCTGCAAATCCTGGCCCGCCTGAGCCTGAAGAACATCGGACCCAGCCTATACGGCTGCTTCGTGAACGGCCGCTTCGAACAGTTCCTGGAGAACAGCAAGACCCTGACCAAGGACGACATCCGCAACTGGAAGAACAGCCAGCGCATCGCCCGCCGCATGAAGGAGCTGCACGTCGGCGTGCCCCTGCTGAGTAGCGAGCGCAAGAACGGAAGCGCCTGCTGGCAAAAGATCAACCAGTGGCTGCGCACCATCGAGAAAGTGGACCAATGGGTTGGTGAGTCGACGAGCAAGCCCGGCGGATCAGGCAGCGTGCTTGCAGATTTGACTTGCAACGCCCGCATTGTGTCGACGAAGGCTTTTGGCTCCTCTGTCGCTGTCTCAAGCAGCATCTAACCCTGCGTCGCCGTTTCCATTTGCAGGCGACCCCAAGAACATCGAGAACAGCCTGCTATGCGAGAACTGGAGCAAGTTCATGGACATCGTGGACCGCTACCACAAGTGGCTGATAAGCCAGGAGCAAGGCATCGAGCAAGTGAACAAGAACCTGATCTTCTGCCACAACGACGCCCAATACGGCAACCTGCTGTTCACCGCCCCCGTGATGAACACCCCAAGCCTGTACACCGCCCCAAGTAGCACCAGCCTGACCAGCCAAAGCAGTAGCCTGTTCCCAAGTAGTAGCAACGTGATCGTGGACGACATCATCAACCCCCCCAAGCAAGAGCAGAGCCAGGACAGCAAGCTGGTAGTGATCGACTTCGAATACGCCGGCGCCAACCCCGCCGCCTACGACCTGGCCAACCACCTGAGCGAGTGGATGTACGACTACAACAACGCCAAGGTGAGTCGACGAGCAAGCCCGGCGGATCAGGCAGCGTGCTTGCAGATTTGACTTGCAACGCCCGCATTGTGTCGACGAAGGCTTTTGGCTCCTCTGTCGCTGTCTCAAGCAGCATCTAACCCTGCGTCGCCGTTTCCATTTGCAGGCCCCCCACCAGTGCCACGCCGACCGCTACCCCGACAAGGAGCAAGTGCTGAACTTCCTGTATAGCTACGTCAGCCACCTGCGCGGCGGCGCCAAGGAGCCCATCGACGAGGAAGTGCAACGCCTGTACAAGAGCATAATCCAGTGGCGCCCCACCGTGCAACTGTTCTGGAGCCTATGGGCCATCCTGCAAAGCGGAAAGCTGGAGAAGAAGGAGGCCAGCACCGCCATCACCCGCGAGGAGATCGGCCCCAACGGAAAGAAGTACATCATCAAGACCGAGCCCGAGAGCCCCGAGGAGGACTTCGTGGAGAACGACGACGAGCCCGAGGCCGGCGTCAGCATCGACACCTTCGACTACATGGCCTACGGCCGCGACAAGATCGCCGTGTTCTGGTGAGCTTGCGGGGTTGCGAGCAACACTCCAGCAACGAACAGTGCCCAAGTCAGGAATCTGCAGTCAGCCTGGGCTTTCGGCGGCTTTTTCTTGGGCAAACAGCTTGCACTCATGCCAGCGCGGCTTGTCCAGCCTCACTTGAGCTTTCCAGCTGCTACCAGCCGGGCTATACGACAGCGACAGAGCCATAGCGTGGAATCACTTATTTGGGTTGCCGAAGTAGCGGTCGGAGCGTGAGTTCTTGGTCAAGCCGCCCCTTATCCGGTTCCTGTCCGTGTCTTTGTCCCTCGTTCACCCTTCGCGGCACCCTTCATCCCCTTGCTTGCAGGGGCGACCTGATCGGCCTGGGCATCATCACCGAGGAGGAGTGCAAGAACTTCAGTAGCTTCAAGTTCCTGGACACCAGCTACCTGTAA；

[0014] SEQ ID NO.2：

[0015] ATGGAGCTTAACATCTCCGAGTCGCGTTCCCGAAGCATTCGCTGCATTGTCAAGCTGGGAGGCGCCGCCATCACCTGCAAGAACGAGCTGGTGAGTCGACGAGCAAGCCCGGCGGATCAGGCAGCGTGCTTGCAGATTTGACTTGCAACGCCCGCATTGTGTCGACGAAGGCTTTTGGCTCCTCTGTCGCTGTCTCAAGCAGCATCTAACCCTGCGTCGCCGTTTCCATTTGCAGGAGAAGATCCACGACGAGAACCTGGAGGTGGTGGCCTGCCAGCTGCGCCAGGCCATGCTGGAAGGCAGCGCCCCAAGCAAAGTGATCGGCATGGACTGGAGCAAGCGCCCCGGAAGCAGCGAGATCAGCTGCGACGTGGACGACATCGGCGACCAGAAAAGCAGCGAGTTCAGCAAGTTCGTGGTAGTGCACGGCGCCGGAAGCTTCGGCCACTTCCAAGCCAGCCGAAGCGGCGTGCACAAGGGCGGCCTGGAGAAGCCCATCGTGAAGGCCGGCTTCGTGGCCACCCGCATCAGCGTGACCAACCTGAACCTGGAGATCGTCCGCGCCCTGGCCCGCGAGGGCATCCCCACCATCGGCATGAGCCCCTTTAGCTGCGGCTGGAGCACCAGCAAGCGCGACGTGGTGAGTCGACGAGCAAGCCCGGCGGATCAGGCAGCGTGCTTGCAGATTTGACTTGCAACGCCCGCATTGTGTCGACGAAGGCTTTTGGCTCCTCTGTCGCTGTCTCAAGCAGCATCTAACCCTGCGTCGCCGTTTCCATTTGCAGGCCAGCGCCGACCTGGCCACCGTGGCCAAGACCATAGACAGCGGCTTCGTGCCCGTGCTGCACGGCGACGCCGTGCTGGACAACATCCTGGGCTGCACCATCCTGAGCGGCGACGTGATCATCCGCCACCTGGCCGACCACCTGAAGCCCGAATACGTGGTGTTCCTGACCGACGTGCTGGGCGTGTACGACCGCCCCCCAAGCCCAAGCGAGCCCGACGCCGTGCTGCTGAAGGAGATCGCCGTCGGAGAGGACGGAAGCTGGAAGGTAGTGAACCCCCTGCTGGAGCACACCGACAAGAAAGTGGACTATAGCGTGGCCGCCCACGACACCACCGGCGGCATGGAGACCAAGATCAGCGAGGCCGCCATGATCGCCAAGCTGGGCGTGGACGTGTACATCGTGAAGGTGAGCTTGCGGGGTTGCGAGCAACACTCCAGCAACGAACAGTGCCCAAGTCAGGAATCTGCAGTCAGCCTGGGCTTTCGGCGGCTTTTTCTTGGGCAAACAGCTTGCACTCATGCCAGCGCGGCTTGTCCAGCCTCACTTGAGCTTTCCAGCTGCTACCAGCCGGGCTATACGACAGCGACAGAGCCATAGCGTGGAATCACTTATTTGGGTTGCCGAAGTAGCGGTCGGAGCGTGAGTTCTTGGTCAAGCCGCCCCTTATCCGGTTCCTGTCCGTGTCTTTGTCCCTCGTTCACCCTTCGCGGCACCCTTCATCCCCTTGCTTGCAGGCCGCCACCACACATAGCCAGCGCGCCCTGAACGGCGACCTGCGCGACAGCGTGCCCGAGGACTGGCTGGGCACCATCATCCGATTCAGCAAGTAA。

[0016] 本发明中，所述胆碱激酶基因(CrCK)为根据莱茵衣藻密码子偏好性优化后的酿酒酵母胆碱激酶基因，所述异戊烯基磷酸激酶基因(CrIPK)为根据莱茵衣藻密码子偏好性优化后的拟南芥异戊烯基磷酸激酶基因。本发明将与半萜(IPP和DMAPP)合成相关的两个外源基因根据莱茵衣藻密码子偏好性进行优化改造，得到适用于莱茵衣藻表达的胆碱激酶基因和异戊烯基磷酸激酶基因，再转化入莱茵衣藻基因组中，可以获得半萜含量高的转基因衣藻。

[0017] 本发明中，所述半萜特指IPP和/或DMAPP。

[0018] 优选地，所述重组载体还包括叶绿体定位信号肽基因。

[0019] 优选地，所述重组载体还包括多克隆酶切位点。

[0020] 优选地，所述重组载体还包括筛选标记基因。

[0021] 第二方面，本发明提供了一种提高衣藻半萜含量的转基因衣藻的构建方法，所述提高衣藻半萜含量的转基因衣藻的构建方法包括：

[0022] 将第一方面所述的提高衣藻半萜含量的转基因系统转化至衣藻细胞中，筛选，并进行验证。

[0023] 在转基因衣藻中以3‑甲基‑3‑丁烯‑1‑醇(Isoprenol)或3‑甲基‑2‑丁烯‑1‑醇(Prenol)为底物，即可合成异戊烯基焦磷酸(IPP)或二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)。本发明克服了基因沉默技术或者其他物理化学技术中不稳定因素，通过使用含有外源基因的重组载体在莱茵衣藻中导入IUP路径的两个关键酶基因，以独立于天然IPP和DMAPP的合成路径。通过添加底物，用两步法合成C5萜类前体(IPP或DMAPP)，显著减少了通过代谢工程和酶工程进行优化合成半萜(IPP和DMAPP)所需的酶促反应步骤，允许通过简单的工程来、提高萜类产量，且外源基因未影响莱茵衣藻的生长。得到的转基因衣藻可用于生产柠檬烯等高价值的萜类化合物。

[0024] 优选地，所述提高衣藻半萜含量的转基因系统的构建方法包括：

[0025] 将叶绿体定位信号肽基因连接到表达载体中，再扩增胆碱激酶基因或异戊烯基磷酸激酶基因，分别连接到所述叶绿体定位信号肽基因的3’端；

[0026] 连接产物转化后进行筛选，验证后，得到所述的提高衣藻半萜含量的转基因系统。

[0027] 优选地，所述表达载体包括pOpt2。

[0028] 本发明中，所述pOpt2载体中含有Hsp70A‑RBCS2合成启动子和RBCS2终止子，荧光霉素基因mVenus或mCerulean，以及基因aph7或aphVIII，具有潮霉素抗性或巴龙霉素抗性。

[0029] 优选地，所述连接的方法包括无缝克隆。

[0030] 本发明中，所述无缝克隆前还包括对表达载体pOpt2通过双酶切进行线性化的步骤。

[0031] 优选地，所述转化的方法包括珠磨法或电转法。

[0032] 本发明中，所述含有胆碱激酶基因的重组载体与含有异戊烯基磷酸激酶基因的重组载体可以同时或单独转化。

[0033] 优选地，所述转化前还包括对提高衣藻半萜含量的转基因系统进行线性化的步骤。

[0034] 本发明中，所述对提高衣藻半萜含量的转基因系统进行线性化的方法包括单酶切。

[0035] 优选地，所述衣藻细胞包括CC4533藻株。

[0036] 本发明中，所述CC4533藻株为高效表达转基因的细胞壁缺陷型藻株，其转化效率高，且方便合成物质的提取，减少了因破碎细胞所需的生产成本。

[0037] 优选地，所述筛选的方法包括PCR测序、RT‑PCR分析或半萜含量测定中的任意一种或至少两种的组合。

[0038] 优选地，所述半萜含量测定的方法包括液相色谱‑质谱联用。

[0039] 优选地，进行所述半萜含量测定时，使用3‑甲基‑3‑丁烯‑1‑醇和/或3‑甲基‑2‑丁烯‑1‑醇饲喂筛选后的衣藻细胞。

[0040] 优选地，所述3‑甲基‑3‑丁烯‑1‑醇的使用浓度为1～30mM，例如可以是1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM或30mM等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述，优选为15～25mM。

[0041] 优选地，所述3‑甲基‑2‑丁烯‑1‑醇的使用浓度为1～25mM，例如可以是1mM、5mM、10mM、15mM、20mM或25mM等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述，优选为5～15mM。

[0042] 作为优选技术方案，本发明所述提高衣藻半萜含量的转基因衣藻的构建方法，包括以下步骤：

[0043] (1)根据莱茵衣藻表达系统密码子偏好性对胆碱激酶基因和异戊烯基磷酸激酶基因进行优化；

[0044] (2)将叶绿体定位信号肽基因通过无缝克隆连接到双酶切线性化后的表达载体pOpt2中，再扩增胆碱激酶基因或异戊烯基磷酸激酶基因，分别无缝克隆到所述叶绿体定位信号肽基因的3’端；

[0045] 将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞中，加入无抗生素的LB培养基中震荡培养复苏，复苏菌液涂布氨苄青霉素抗性平板，倒置培养过夜，得到转化子；对所述转化子用抗生素抗性平板二筛，二筛后的转化子菌落进行PCR扩增，验证正确后，得到所述的提高衣藻半萜含量的转基因系统；

[0046] (3)将经过单酶切线性化后的所述提高衣藻半萜含量的转基因系统通过珠磨法或电转法转化至衣藻CC4533藻株中，通过PCR测序、RT‑PCR分析和半萜含量测定进行筛选，并进行验证；

[0047] 其中，通过液相色谱‑质谱联用测定半萜含量；测定时，使用1～30mM 3‑甲基‑3‑丁烯‑1‑醇和1～25mM 3‑甲基‑2‑丁烯‑1‑醇饲喂筛选后的衣藻细胞。

[0048] 本发明中，共转CrCK和CrIPK基因的莱茵衣藻，命名为ML2。

[0049] 第三方面，本发明提供了一种提高衣藻半萜含量的转基因衣藻，所述提高衣藻半萜含量的转基因衣藻通过第二方面所述的提高衣藻半萜含量的转基因衣藻的构建方法构建得到。

[0050] 本发明中，所述提高衣藻半萜含量的转基因衣藻包含胆碱激酶基因或异戊烯基磷酸激酶基因，或同时包含胆碱激酶基因和异戊烯基磷酸激酶基因。

[0051] 第四方面，本发明提供了一种通过衣藻生产柠檬烯的方法，所述通过衣藻生产柠檬烯的方法包括：

[0052] 向第三方面中的提高衣藻半萜含量的转基因衣藻中转入异戊烯基焦磷酸异构酶基因(CrIDI)和柠檬烯合酶基因(CrLS)，筛选后进行培养。

[0053] 本发明中，所述异戊烯基焦磷酸异构酶基因和柠檬烯合酶基因根据莱茵衣藻表达系统密码子偏好性进行了优化。

[0054] 优选地，所述转入前还包括构分别建含有异戊烯基焦磷酸异构酶基因或柠檬烯合酶基因的重组载体的步骤。

[0055] 优选地，所述重组载体的骨架载体包括pOpt2。

[0056] 优选地，所述转入的方法包括珠磨法或电转法。

[0057] 优选地，还包括对所述含有异戊烯基焦磷酸异构酶基因和柠檬烯合酶基因的重组载体进行线性化的步骤。

[0058] 优选地，所述筛选的方法包括PCR测序、RT‑PCR分析或柠檬烯含量测定中的任意一种或至少两种的组合。

[0059] 优选地，所述柠檬烯含量测定的方法包括气相色谱‑质谱联用。

[0060] 优选地，进行所述柠檬烯含量测定时，使用3‑甲基‑3‑丁烯‑1‑醇、3‑甲基‑2‑丁烯‑1‑醇和十二烷饲喂筛选后的衣藻细胞。

[0061] 优选地，所述培养包括发酵培养。

[0062] 优选地，所述培养的过程中，使用3‑甲基‑3‑丁烯‑1‑醇、3‑甲基‑2‑丁烯‑1‑醇和十二烷饲喂筛选后的衣藻细胞。

[0063] 优选地，所述十二烷添加的时间为衣藻细胞生长至对数初期。

[0064] 作为优选技术方案，本发明所述通过衣藻生产柠檬烯的方法，包括以下步骤：

[0065] (1)根据莱茵衣藻表达系统密码子偏好性对异戊烯基焦磷酸异构酶基因和柠檬烯合酶基因进行优化；

[0066] (2)分别构建含有异戊烯基焦磷酸异构酶基因或柠檬烯合酶基因的重组载体：

[0067] 将叶绿体定位信号肽基因通过无缝克隆连接到双酶切线性化后的表达载体pOpt2中，再扩增异戊烯基焦磷酸异构酶基因或柠檬烯合酶基因，分别无缝克隆到所述叶绿体定位信号肽基因的3’端；

[0068] 将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞中，加入无抗生素的LB培养基中震荡培养复苏，复苏菌液涂布氨苄青霉素抗性平板，倒置培养过夜，得到转化子；对所述转化子用抗生素抗性平板二筛，二筛后的转化子菌落进行PCR扩增，验证正确后，分别得到含有异戊烯基焦磷酸异构酶基因或柠檬烯合酶基因的重组载体；

[0069] (3)将经过单酶切线性化后的含有异戊烯基焦磷酸异构酶基因和柠檬烯合酶基因的重组载体通过珠磨法或电转法转化至ML2转基因莱茵衣藻细胞中，通过PCR测序、RT‑PCR分析和柠檬烯含量测定进行筛选，并进行验证；

[0070] 其中，通过气相色谱‑质谱联用测定柠檬烯含量，测定时，使用1～30mM 3‑甲基‑3‑丁烯‑1‑醇和1～25mM 3‑甲基‑2‑丁烯‑1‑醇饲喂筛选后的衣藻细胞，生长至对数初期时再加入十二烷，进行测定；

[0071] (4)通过两相发酵培养筛选后的衣藻细胞，使用3‑甲基‑3‑丁烯‑1‑醇、3‑甲基‑2‑丁烯‑1‑醇进行饲喂，生长至对数初期时加入十二烷，萃取发酵液，得到衣藻生成的柠檬烯。

[0072] 本发明中，共转CrIDI和CrLS基因的莱茵衣藻，命名为ML4。

[0073] 第五方面，本发明提供了第三方面所述的提高衣藻半萜含量的转基因衣藻在制备萜类化合物中的应用。

[0074] 优选地，所述萜类化合物包括柠檬烯。

[0075] 相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：

[0076] (1)本发明确定了IUP路径在衣藻中的可用性，也为衣藻生产柠檬烯等高价值萜类物质奠定了基础；

[0077] (2)本发明以独立于天然IPP和DMAPP的合成路径，通过添加底物，两步法合成C5萜类前体，显著减少了通过代谢工程和酶工程进行优化合成半萜(IPP和DMAPP)所需的酶促步骤，允许通过简单的工程来提高萜类产量；

[0078] (3)本发明制备的功能藻株为生产萜类化合物提供了良好的合成模型；

[0079] (4)本发明选用细胞壁缺陷型莱茵衣藻CC4533进行转化，降低了转化难度，同时方便了半萜和柠檬烯的提取，减少了破碎细胞所需的生产成本。附图说明

[0080] 图1为IUP途径的合成路径示意图，以3‑甲基‑3‑丁烯‑1‑醇(Isoprenol)或3‑甲基‑2‑丁烯‑1‑醇(Prenol)为底物，依次被胆碱激酶(CK)和异戊烯基磷酸激酶(IPK)催化，转变为IPP或DMAPP。

[0081] 图2为实施例1中含有目的片段的重组载体的双酶切结果图片(泳道M‑标准DNA分子量Marker，泳道1‑含有CrCK目的片段的重组载体的酶切产物，泳道2‑含有CrIPK目的片段的重组载体的酶切产物)。

[0082] 图3为重组载体pOpt2‑CTP‑CrCK和pOpt2‑CTP‑CrIPK的结构示意图，两个载体均采用Hsp70‑RBCS启动子，其中，载体pOpt2‑CTP‑CrCK中CrCK基因(含叶绿体定位信号肽)与荧光蛋白基因mVenus融合，抗性为潮霉素；载体pOpt2‑CTP‑CrIPK中CrIPK基因(含叶绿体定位信号肽)与荧光蛋白基因mCerulean融合，抗性为巴龙霉素。

[0083] 图4为转基因衣藻与对照组衣藻的半萜含量的HPLC‑MS检测结果图片，图中2.5min左右的峰为IPP含量峰，ML2为共同转入CrCK和CrIPK基因的转基因藻，CC4533为细胞壁缺陷的莱茵衣藻CC4533。

[0084] 图5为转基因衣藻与对照组衣藻的生长曲线图片。

[0085] 图6为实施例5中含有目的片段的重组载体的双酶切结果图片(泳道M‑标准DNA分子量Marker，泳道3‑含有CrIDI目的片段的重组载体的酶切产物，泳道4‑含有CrLS目的片段的重组载体的酶切产物)。

[0086] 图7为重组载体pOpt2‑CTP‑CrIDI和pOpt2‑CTP‑CrLS的结构示意图，两个载体均采用Hsp70‑RBCS启动子，其中，载体pOpt2‑CTP‑CrIDI的CrIDI基因(含叶绿体定位信号肽)与荧光蛋白基因mRuby2融合，抗性为博来霉素；载体pOpt2‑CTP‑CrLS的CrLS基因(含叶绿体定位信号肽)单独表达，抗性为壮观霉素。

[0087] 图8为转基因衣藻的柠檬烯含量的GC‑MS检测结果图片，气相色谱中4.25min左右的峰为柠檬烯的特征峰，转基因衣藻与标准品一样在该处有特征峰出现，柠檬烯标准品和转基因衣藻也具有类似的质谱特征峰。

[0088] 为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

[0089] 实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

[0090] 实施例1CK和IPK基因相应外源基因的改造和表达载体的构建

[0091] 本实施例选用的莱茵衣藻CC4533(Chlamydomonas reinhardtii CC4533，来源于莱茵衣藻中心)作为转基因操作的受体，该藻株为细胞壁缺陷型莱茵衣藻品系，且可高效表达外源基因。

[0092] 莱茵衣藻培养时使用的培养基为TAP培养基，培养基的配方如下：2.42g Tris、25mL4×Beijerinck salts(16g NH4Cl2、2g CaCl2‑2H2O和4g MgSO4‑7H2O溶于水中，定容至
1L)、1M磷酸钾缓冲液和l mL Trace微量元素混合液(11.4g H3BO3、5.6g MnCl2‑4H2O、22g ZnSO4‑7H2O、4.99g FeSO4‑7H2O、1.61g CoCl2‑6H2O、1.57g CuSO4‑5H2O、1.1g(NH4)6Mo7O24‑
4H2O和50g Na2EDTA溶于水中，用KOH调至pH为6.5～6.8，定容至1L)溶解到975mL水中，使用冰醋酸调pH为6.95～7.05，定容至1L。

[0093] 莱茵衣藻培养条件如下：在温度为22～25℃、光照为90μE/m2/s条件下连续光照培6
养，生长周期为12天左右，最大藻细胞浓度为(6～7)×10cells/mL。

[0094] (1)外源基因的改造

[0095] 从GenBank中查找酿酒酵母ScCK(GenBank：J04454.1，见SEQ ID NO.3)和拟南芥AtIPK(GenBank：AY150412.1，见SEQ ID NO.4)基因，根据莱茵衣藻表达系统密码子偏好性，更改部分密码子，得到适合在莱茵衣藻中表达的CrCK和CrIPK片段，送交基因公司(通用生物系统(安徽)有限公司)合成。CrCK基因序列如SEQ ID NO.1所示，CrIPK基因序列如SEQ ID NO.2所示。

[0096] SEQ ID NO.3：

[0097] CTGCAGATATGAATTCCATAGGCCAGTCTTCTTCTAAGCGATTGGTAACCTCCTTCACTTTAGAACACCACCAACAGATCGTTCTCTTGTTCTTTGTTCTTTATGGTATAATATTCACATGGTGCTCTACCGTTTTTCTTGTCGGCCCAGCCGGTTAAATCTCGAAGAGACAGAATAGAAGCTCTGTGGCTGTAAGTAAGGATAAGCCAAATGGAAAAGTTATAGAATTAGGACAACAATATACAGTTTTTTTTTGTACTCTTATAGAATACACACACATAGATACGCACGTAAAATTAGAGCAAAAGATGGTACAAGAATCACGTCCAGGGAGTGTAAGAAGTTACTCGGTCGGTTACCAAGCAAGGTCCAGATCGAGTTCTCAAAGAAGACATTCGTTAACACGCCAACGTTCCTCGCAAAGACTGATTAGAACCATCAGTATCGAGTCTGATGTGTCTAATATTACTGACGATGACGATTTGAGAGCTGTCAATGAGGGAGTAGCGGGTGTGCAACTGGACGTCTCTGAAACCGCAAATAAGGGACCAAGAAGAGCATCAGCAACTGATGTCACAGATAGTTTGGGTTCGACTTCGTCGGAATATATTGAGATTCCCTTTGTTAAGGAAACATTGGATGCAAGTTTACCTTCGGATTATCTGAAGCAGGACATATTAAATCTCATTCAGAGTTTGAAGATATCCAAATGGTATAACAACAAGAAAATCCAACCGGTAGCACAAGATATGAACTTAGTCAAGATCTCTGGTGCGATGACAAACGCAATTTTCAAAGTTGAATACCCTAAGTTACCATCGTTGCTATTGAGAATATACGGACCGAATATTGATAATATCATTGACAGGGAATATGAATTGCAGATTTTGGCTAGGCTTTCATTGAAAAATATAGGTCCTTCCCTTTACGGCTGTTTTGTAAACGGTAGATTTGAGCAGTTTCTGGAGAATTCTAAGACTTTAACAAAAGACGACATTAGAAACTGGAAGAACTCTCAAAGGATTGCAAGGAGAATGAAGGAGTTACATGTAGGTGTTCCTCTCTTGAGTTCAGAAAGGAAGAACGGGTCGGCTTGTTGGCAAAAGATTAACCAGTGGTTGCGCACGATTGAGAAAGTCGACCAATGGGTGGGGGATCCTAAAAACATTGAAAACTCTTTATTATGTGAGAATTGGTCCAAGTTTATGGATATTGTCGATAGATATCACAAGTGGCTTATTTCTCAAGAACAGGGTATAGAGCAAGTCAACAAAAATCTTATATTCTGCCATAATGATGCCCAATACGGCAATTTACTTTTCACTGCTCCTGTGATGAACACACCGAGCCTATACACTGCACCTTCGTCTACATCATTGACTTCCCAATCAAGTTCCTTATTTCCTTCGAGCTCCAATGTCATTGTAGATGATATAATCAACCCGCCAAAGCAGGAGCAAAGCCAAGATTCCAAATTGGTCGTCATTGATTTTGAATATGCAGGTGCCAATCCCGCCGCATATGATTTAGCGAATCATCTTTCCGAGTGGATGTATGATTACAACAATGCTAAGGCCCCACATCAGTGCCACGCTGATAGATATCCCGATAAAGAACAGGTTTTGAATTTCTTATACTCTTATGTTTCGCATCTAAGGGGTGGTGCTAAGGAACCCATAGATGAAGAGGTTCAAAGACTCTATAAGTCAATCATTCAATGGAGACCCACTGTACAACTATTTTGGTCGCTCTGGGCCATCCTACAAAGTGGTAAATTAGAGAAAAAAGAAGCCTCCACTGCCATCACTAGAGAAGAAATTGGACCCAATGGAAAAAAATATATCATCAAGACTGAACCCGAATCCCCTGAAGAAGACTTTGTTGAAAATGACGACGAGCCTGAAGCTGGCGTCAGCATTGACACGTTCGATTATATGGCTTATGGTCGTGACAAGATTGCGGTCTTTTGGGGCGACCTCATTGGCTTAGGCATAATCACCGAAGAAGAATGCAAAAATTTCAGCTCTTTCAAGTTCCTCGATACTAGTTATTTGTAATACGTATACGAATTCCTTCAACAAAGGCCAAGGAAATAAAGCAAATAACAATAACACCATTATTTTAATTTTTTTTCTATTACTGTCGCTAACACCTGTATGGTTGCAACCAGGTGAGAATCCTTCTGATGCATACTTTATGCGTTTATGCGTTTTGCGCCCCTTGGAAAAAAATTGATTCTCATCGTAAATGCATACTACATGCGTTTATGGGAAAAGCCTCCATATCCAAAGGTCGCGTTTCTTTTAGAAAAACTAATACGTAAACCTGCATTAAGGTAAGATTATATCAGAAAATGTGTTGCAAGAAATGCATTATGCAATTTTTTGATTATGACAATCTCTCGAAAGAAATTTCATATGATGAGACTTGAATAATGCAGCGGCGCTTGCTAAAAGAACTTGTATATAAGAGCTGCCATTCTCGATCAATATACTGTAGTAAGTCCTTTCCTCTCTTTCTTATTACACTTATTTCACATAATCAATCTCAAAGAGAACAACACAATACAATAACAAGAAGAACAAAATGTCTGAAATAACCTTAGGTAAATATTTACTTTGAAAGATTGAGCCAAGTCAACTGTAACACCGTCTTCGGTTTGCCAGGTGACTTTAACTTGTCTCTTTTGGATAAGCTT；

[0098] SEQ ID NO.4：

[0099] ATGGAGCTGAATATTTCCGAGAGTCGAAGCAGATCAATTCGTTGCATTGTGAAACTTGGAGGTGCGGCAATTACTTGCAAAAACGAGCTGGAGAAGATTCACGATGAAAATCTGGAGGTCGTGGCGTGTCAGTTACGTCAAGCTATGTTGGAGGGTTCAGCTCCAAGCAAGGTTATTGGCATGGATTGGAGCAAGAGACCTGGAAGCTCTGAGATTTCTTGTGATGTGGATGACATAGGGGATCAAAAGTCTTCTGAGTTTAGTAAATTTGTTGTGGTTCATGGCGCTGGTTCCTTTGGGCACTTTCAGGCCAGTAGATCTGGGGTTCACAAAGGAGGACTTGAGAAACCTATTGTCAAAGCTGGTTTCGTTGCTACTCGTATATCTGTGACAAATCTTAATCTTGAAATTGTACGAGCACTAGCCCGAGAGGGCATTCCTACGATAGGCATGTCTCCATTTTCATGTGGTTGGTCAACCTCCAAAAGAGATGTGGCTTCTGCAGATCTAGCAACCGTAGCTAAAACCATAGACTCAGGATTTGTCCCTGTTCTCCATGGAGATGCAGTGCTGGACAATATACTGGGCTGCACCATATTGAGTGGTGATGTTATCATCCGTCATCTTGCAGATCATTTGAAGCCAGAATATGTTGTCTTTCTCACAGATGTACTAGGTGTCTACGATCGACCACCTTCACCTTCAGAGCCCGACGCTGTGCTCTTGAAAGAGATCGCTGTTGGAGAAGATGGAAGCTGGAAGGTTGTGAATCCACTGTTGGAGCACACAGACAAGAAAGTTGACTACTCTGTTGCGGCGCACGATACAACCGGTGGAATGGAAACGAAGATATCAGAAGCTGCTATGATTGCAAAACTTGGAGTCGATGTCTACATTGTGAAGGCTGCGACAACTCATTCACAGAGAGCACTAAACGGTGATTTGAGAGATAGTGTTCCTGAAGATTGGCTTGGTACTATCATCAGATTCTCAAAGTAGAATAATCTCCTGACAAATACACTAATTCCAG；

[0100] SEQ ID NO.1：

[0101] ATGGTACAAGAGTCCCGCCCCGGCTCCGTCCGCTCCTACTCCGTCGGATACCAGGTGAGTCGACGAGCAAGCCCGGCGGATCAGGCAGCGTGCTTGCAGATTTGACTTGCAACGCCCGCATTGTGTCGACGAAGGCTTTTGGCTCCTCTGTCGCTGTCTCAAGCAGCATCTAACCCTGCGTCGCCGTTTCCATTTGCAGGCCCGCTCGCGCTCCTCCTCTCAACGAAGACACTCCCTGACCCGCCAGCGAAGCAGCCAGCGCCTGATCCGCACCATCAGCATCGAGAGCGACGTCAGCAACATCACCGACGACGACGACCTGCGCGCCGTGAACGAGGGCGTGGCCGGCGTGCAACTGGACGTCAGCGAGACCGCCAACAAGGGCCCCCGCCGCGCCAGCGCCACCGACGTGACCGATAGCCTGGGAAGCACCAGTAGCGAGTACATCGAGATCCCCTTCGTGAAGGAGACCCTGGACGCCAGCCTGCCAAGCGACTACCTGAAGCAAGACATCCTGAACCTGATCCAGAGCCTGAAGATCAGCAAGTGGTACAACAACAAGAAGATCCAGCCCGTGGCCCAAGACATGAACCTAGTGAAGATCAGCGGTGAGTCGACGAGCAAGCCCGGCGGATCAGGCAGCGTGCTTGCAGATTTGACTTGCAACGCCCGCATTGTGTCGACGAAGGCTTTTGGCTCCTCTGTCGCTGTCTCAAGCAGCATCTAACCCTGCGTCGCCGTTTCCATTTGCAGGCGCCATGACCAACGCCATCTTCAAGGTGGAGTACCCCAAGCTGCCAAGCCTGCTGCTGCGCATCTACGGCCCCAACATCGACAACATCATCGACCGCGAATACGAGCTGCAAATCCTGGCCCGCCTGAGCCTGAAGAACATCGGACCCAGCCTATACGGCTGCTTCGTGAACGGCCGCTTCGAACAGTTCCTGGAGAACAGCAAGACCCTGACCAAGGACGACATCCGCAACTGGAAGAACAGCCAGCGCATCGCCCGCCGCATGAAGGAGCTGCACGTCGGCGTGCCCCTGCTGAGTAGCGAGCGCAAGAACGGAAGCGCCTGCTGGCAAAAGATCAACCAGTGGCTGCGCACCATCGAGAAAGTGGACCAATGGGTTGGTGAGTCGACGAGCAAGCCCGGCGGATCAGGCAGCGTGCTTGCAGATTTGACTTGCAACGCCCGCATTGTGTCGACGAAGGCTTTTGGCTCCTCTGTCGCTGTCTCAAGCAGCATCTAACCCTGCGTCGCCGTTTCCATTTGCAGGCGACCCCAAGAACATCGAGAACAGCCTGCTATGCGAGAACTGGAGCAAGTTCATGGACATCGTGGACCGCTACCACAAGTGGCTGATAAGCCAGGAGCAAGGCATCGAGCAAGTGAACAAGAACCTGATCTTCTGCCACAACGACGCCCAATACGGCAACCTGCTGTTCACCGCCCCCGTGATGAACACCCCAAGCCTGTACACCGCCCCAAGTAGCACCAGCCTGACCAGCCAAAGCAGTAGCCTGTTCCCAAGTAGTAGCAACGTGATCGTGGACGACATCATCAACCCCCCCAAGCAAGAGCAGAGCCAGGACAGCAAGCTGGTAGTGATCGACTTCGAATACGCCGGCGCCAACCCCGCCGCCTACGACCTGGCCAACCACCTGAGCGAGTGGATGTACGACTACAACAACGCCAAGGTGAGTCGACGAGCAAGCCCGGCGGATCAGGCAGCGTGCTTGCAGATTTGACTTGCAACGCCCGCATTGTGTCGACGAAGGCTTTTGGCTCCTCTGTCGCTGTCTCAAGCAGCATCTAACCCTGCGTCGCCGTTTCCATTTGCAGGCCCCCCACCAGTGCCACGCCGACCGCTACCCCGACAAGGAGCAAGTGCTGAACTTCCTGTATAGCTACGTCAGCCACCTGCGCGGCGGCGCCAAGGAGCCCATCGACGAGGAAGTGCAACGCCTGTACAAGAGCATAATCCAGTGGCGCCCCACCGTGCAACTGTTCTGGAGCCTATGGGCCATCCTGCAAAGCGGAAAGCTGGAGAAGAAGGAGGCCAGCACCGCCATCACCCGCGAGGAGATCGGCCCCAACGGAAAGAAGTACATCATCAAGACCGAGCCCGAGAGCCCCGAGGAGGACTTCGTGGAGAACGACGACGAGCCCGAGGCCGGCGTCAGCATCGACACCTTCGACTACATGGCCTACGGCCGCGACAAGATCGCCGTGTTCTGGTGAGCTTGCGGGGTTGCGAGCAACACTCCAGCAACGAACAGTGCCCAAGTCAGGAATCTGCAGTCAGCCTGGGCTTTCGGCGGCTTTTTCTTGGGCAAACAGCTTGCACTCATGCCAGCGCGGCTTGTCCAGCCTCACTTGAGCTTTCCAGCTGCTACCAGCCGGGCTATACGACAGCGACAGAGCCATAGCGTGGAATCACTTATTTGGGTTGCCGAAGTAGCGGTCGGAGCGTGAGTTCTTGGTCAAGCCGCCCCTTATCCGGTTCCTGTCCGTGTCTTTGTCCCTCGTTCACCCTTCGCGGCACCCTTCATCCCCTTGCTTGCAGGGGCGACCTGATCGGCCTGGGCATCATCACCGAGGAGGAGTGCAAGAACTTCAGTAGCTTCAAGTTCCTGGACACCAGCTACCTGTAA；

[0102] SEQ ID NO.2：

[0103] ATGGAGCTTAACATCTCCGAGTCGCGTTCCCGAAGCATTCGCTGCATTGTCAAGCTGGGAGGCGCCGCCATCACCTGCAAGAACGAGCTGGTGAGTCGACGAGCAAGCCCGGCGGATCAGGCAGCGTGCTTGCAGATTTGACTTGCAACGCCCGCATTGTGTCGACGAAGGCTTTTGGCTCCTCTGTCGCTGTCTCAAGCAGCATCTAACCCTGCGTCGCCGTTTCCATTTGCAGGAGAAGATCCACGACGAGAACCTGGAGGTGGTGGCCTGCCAGCTGCGCCAGGCCATGCTGGAAGGCAGCGCCCCAAGCAAAGTGATCGGCATGGACTGGAGCAAGCGCCCCGGAAGCAGCGAGATCAGCTGCGACGTGGACGACATCGGCGACCAGAAAAGCAGCGAGTTCAGCAAGTTCGTGGTAGTGCACGGCGCCGGAAGCTTCGGCCACTTCCAAGCCAGCCGAAGCGGCGTGCACAAGGGCGGCCTGGAGAAGCCCATCGTGAAGGCCGGCTTCGTGGCCACCCGCATCAGCGTGACCAACCTGAACCTGGAGATCGTCCGCGCCCTGGCCCGCGAGGGCATCCCCACCATCGGCATGAGCCCCTTTAGCTGCGGCTGGAGCACCAGCAAGCGCGACGTGGTGAGTCGACGAGCAAGCCCGGCGGATCAGGCAGCGTGCTTGCAGATTTGACTTGCAACGCCCGCATTGTGTCGACGAAGGCTTTTGGCTCCTCTGTCGCTGTCTCAAGCAGCATCTAACCCTGCGTCGCCGTTTCCATTTGCAGGCCAGCGCCGACCTGGCCACCGTGGCCAAGACCATAGACAGCGGCTTCGTGCCCGTGCTGCACGGCGACGCCGTGCTGGACAACATCCTGGGCTGCACCATCCTGAGCGGCGACGTGATCATCCGCCACCTGGCCGACCACCTGAAGCCCGAATACGTGGTGTTCCTGACCGACGTGCTGGGCGTGTACGACCGCCCCCCAAGCCCAAGCGAGCCCGACGCCGTGCTGCTGAAGGAGATCGCCGTCGGAGAGGACGGAAGCTGGAAGGTAGTGAACCCCCTGCTGGAGCACACCGACAAGAAAGTGGACTATAGCGTGGCCGCCCACGACACCACCGGCGGCATGGAGACCAAGATCAGCGAGGCCGCCATGATCGCCAAGCTGGGCGTGGACGTGTACATCGTGAAGGTGAGCTTGCGGGGTTGCGAGCAACACTCCAGCAACGAACAGTGCCCAAGTCAGGAATCTGCAGTCAGCCTGGGCTTTCGGCGGCTTTTTCTTGGGCAAACAGCTTGCACTCATGCCAGCGCGGCTTGTCCAGCCTCACTTGAGCTTTCCAGCTGCTACCAGCCGGGCTATACGACAGCGACAGAGCCATAGCGTGGAATCACTTATTTGGGTTGCCGAAGTAGCGGTCGGAGCGTGAGTTCTTGGTCAAGCCGCCCCTTATCCGGTTCCTGTCCGTGTCTTTGTCCCTCGTTCACCCTTCGCGGCACCCTTCATCCCCTTGCTTGCAGGCCGCCACCACACATAGCCAGCGCGCCCTGAACGGCGACCTGCGCGACAGCGTGCCCGAGGACTGGCTGGGCACCATCATCCGATTCAGCAAGTAA。

[0104] 根据CrCK序列，设计目的片段引物：

[0105] CrCK‑F：5’ATGGTACAAGAGTCCCGCCCC 3’(SEQ ID NO.5)；

[0106] CrCK‑R：5’TTACAGGTAGCTGGTGTCCAGGAAC 3’(SEQ ID NO.6)。

[0107] 根据CrIPK序列，设计目的片段引物：

[0108] CrIPK‑F：5’ATGGAGCTTAACATCTCCGAGTCGCG 3’(SEQ ID NO.7)；

[0109] CrIPK‑R：5’TTACTTGCTGAATCGGATGATGGTGC 3’(SEQ ID NO.8)。

[0110] PCR程序如下：

[0111] 98℃2min；

[0112] 98℃10s，62℃5s，68℃30s，30个循环；

[0113] 68℃10min。

[0114] 根据设计的引物对目的片段进行PCR扩增，得到片段大小分别为2658bp和1618bp左右的片段，送交测序(上海生工生物工程有限公司)，检测基因合成的准确性。测序结果表明合成准确。

[0115] (2)外源基因表达载体的构建

[0116] 莱茵衣藻表达载体pOpt2(Wichmann,J.,Baier,T.,Wentnagel,E.,Lauersen,K.,&Kruse,O.(2018).Tailored carbon partitioning for phototrophic production of(E)‑α‑bisabolene from the green microalga Chlamydomonas reinhardtii.Metabolic Engineering,45,211–222.)含有HSP70A‑RBCS2启动子序列(HSP70A‑RBCS2 promoter)和RBCS2终止子序列(RBCS2terminater)，中间携带有NdeI、BamHI、BglⅡ和ZraI等多克隆酶切位点，可以插入外源基因并在衣藻核基因组中表达。该载体分别含有潮霉素或巴龙霉素抗性基因表达盒，可使转化宿主获得潮霉素或巴龙霉素抗性，在本实施例中作为衣藻转化的筛选标记。

[0117] 使用DNA无缝克隆技术将叶绿体定位信号肽基因克隆至该载体，获得pOpt2‑CTP载体。再使用DNA无缝克隆技术将目的基因克隆至pOpt2‑CTP载体中。目的片段和载体以5:1的摩尔量比例通过DNA无缝克隆后转化到大肠杆菌中，用带有氨苄抗性的LB平板进行筛选，挑取单克隆菌落，提取质粒。

[0118] 使用BamHI和BglⅡ对载体进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示。用设计的载体引物(即SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8)进行PCR(同步骤(1))扩增，得到含有目的条带的序列送交测序(上海生工生物工程有限公司)进行验证，序列正确的即为含有目的片段的重组载体pOpt2‑CTP‑CrCK和pOpt2‑CTP‑CrIPK，其结构示意图如图3所示。

[0119] 实施例2:莱茵衣藻的遗传转化

[0120] (1)“珠磨法”遗传转化

[0121] 采用FastPure Plasmid Mini Kit(Vazyme，中国南京)分别提取重组质粒pOpt2‑CTP‑CrCK和pOpt2‑CTP‑CrIPK。

[0122] “珠磨法”具体步骤如下：

[0123] a.将细胞壁缺陷型莱茵衣藻CC4533在连续光照和TAP培养液中培养至对数期，细6
胞数约为(1～2)×10cells/mL。5000rpm室温离心5min，收集藻细胞，弃上清；

[0124] b.用灭过菌的新鲜TAP培养液重悬藻细胞沉淀，调整细胞浓度为2×108cells/mL；

[0125] c.吸取300μL藻细胞悬浮液到1.5mL EP管里(含有灭过菌的玻璃珠)，再将1～2μg(pOpt2‑CTP‑CrCK和pOpt2‑CTP‑CrIPK各分别加入0.5～1μg)单酶切成线状的pOpt2‑CTP‑CrCK和pOpt2‑CTP‑CrIPK载体加到EP管中；

[0126] d.把衣藻细胞/玻璃珠/外源DNA混合物在振荡器上以最高速振荡15～25s；把混合液转移到含有10mL新鲜TAP培养基的离心管中，在100rpm、22～25℃、弱光下过夜培养，使细胞恢复活性；

[0127] e.3000rpm室温离心5min，收集细胞，弃上清；用500μL新鲜TAP培养液小心重悬细胞，混匀后倒在含有10μg/mL的潮霉素和巴龙霉素的TAP固体平板上，置于22～25℃的光照培养箱里倒置培养约2周，待平板上长出绿色的单克隆。

[0128] (2)“电转法”遗传转化

[0129] a.莱茵衣藻CC4533在TAP培养液中培养至对数期，细胞数约为(1～2)×106cells/mL，5000rpm室温离心5min，收集藻细胞，弃上清；

[0130] b.用TAP‑Suc重悬藻细胞，调整细胞密度为2×108cells/mL，混匀后置于40℃、350rpm条件下热激30min；

[0131] c.吸取220μL藻细胞于4mm电转杯中，加入2μg线性化的含外源基因的质粒(pOpt2‑CTP‑CrCK和pOpt2‑CTP‑CrIPK)，电转仪电激时电压为600V，电容为50μF，电阻+∞；

[0132] d.电击结束后，转移250μL混合物至5mL离心管中，再加入750μL TAP(共1mL)，在22～25℃的光照培养箱中过夜孵育至少16h；

[0133] e.收集细胞涂布于含抗生素的TAP平板上，持续光照培养至衣藻转化子长出。

[0134] 实施例3转基因莱茵衣藻的筛选与鉴定

[0135] 莱茵衣藻表达载体上含有潮霉素或巴龙霉素基因，因此具有潮霉素或巴龙霉素抗性，双基因转化成功的藻株可以在含有潮霉素和巴龙霉素抗性的平板上生长。转基因藻的鉴定包括PCR测序、RT‑PCR分析和半萜(IPP和DMAPP)含量测定。

[0136] (1)RT‑PCR

[0137] 提取绿色单克隆的莱茵衣藻总RNA，取1μg进行反转录(条件为42℃60min，72℃15min)(TaKaRa反转试剂盒)获得cDNA，通过PCR从cDNA中扩增出目的基因片段(CrCK和CrIPK)和内参基因(Actin基因)，PCR扩增产物送交上海生工生物工程公司进行测序。

[0138] Actin基因扩增引物为：5’ACCCCGTGCTGCTGACTG 3’(SEQ ID NO.9)和5’ACGTTGAAGGTCTCGAACG 3’(SEQ ID NO.10)，目的基因CrCK扩增引物为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，CrIPK扩增引物为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8。扩增结束后进行电泳，根据Actin的条带亮度比较目的基因表达量。

[0139] (2)转基因衣藻产物提取和分析：液相色谱‑质谱(HPLC‑MS)

[0140] 莱茵衣藻CC4533(对照组)和转基因衣藻(即为实施例2长岀的绿色单克隆)，加入底物3‑甲基‑3‑丁烯‑1‑醇和3‑甲基‑2‑丁烯‑1‑醇饲喂，培养至对数后期或平台期，离心收集藻细胞，加入萃取溶剂重悬浮藻细胞，于‑80℃冷冻后于冰上或4℃冰箱解冻，反复冻融3次后，于4℃冰箱过夜萃取，8000rpm、4℃下离心6min，取上清液到新的玻璃试管中，用0.22μm的滤膜过滤至新的试管中，转移到色谱进样瓶中，‑20℃保存待检测。

[0141] 液相色谱柱型号为Agilent公司的 5μm NX‑C18，规格为2mm×150mm i.d，5μm；

[0142] 柱温35℃；

[0143] 流动相为：A：5mM NH4HCO3溶液，B：乙腈；流速：0.2mL/min；

[0144] 洗脱条件：0～8min时，流动相中A和B的比例从9:1逐渐降低到1:9，保持1:9的比例不变，直到13min。13～16min时，逐渐提升A:B的比例至9:1，保持9:1的比例不变，直到25min。进样量：2μL。

[0145] 利用HPLC‑MS液相质谱联用仪对提取的半萜(IPP和DMAPP)样品进行分析。首先需要对半萜的标准品进行检测，所使用的标准品是IPP和DMAPP标准品。检测半萜样品前，需要先设定合适的程序，从而准确地检测出IPP和DMAPP标准品。

[0146] 确定了检测流程与方法后，对对照组与转基因衣藻进行检测。检测莱茵衣藻CC4533中IPP和DMAPP含量。转基因衣藻与对照组衣藻的IPP和DMAPP出峰时间基本一致，如图4所示。其中ML2表示共同转入CrCK和CrIPK基因的转基因藻；CC4533为细胞壁缺陷的莱茵衣藻CC4533。

[0147] 从图4可以看出，转基因衣藻藻株的半萜含量得到了明显提高。

[0148] 本发明提高了莱茵衣藻中萜类C5底物的产量，为日后在衣藻中生产其他高价值萜类物质提供了良好的基础。

[0149] 实施例4生长测定

[0150] 在正常光照和温度下培养筛选得到半萜(IPP和DMAPP)含量较高的转基因莱茵衣藻和野生型莱茵衣藻(CC4533)，每株藻设三个平行，每天或每隔一天测定一次细胞的光密度值，制作生长曲线，结果如图5所示。

[0151] 结果表明，转入CrCK和CrIPK基因的转基因藻的生长曲线与野生型衣藻一致，说明导入外源基因未影响衣藻的正常生长。其中，ML2为共转CrCK和CrIPK基因的转基因藻；CC4533为细胞壁缺陷的莱茵衣藻CC4533，细胞数单位为cells/mL。

[0152] 实施例5以ML2转基因藻株合成柠檬烯

[0153] (1)IDI和LS外源基因的改造

[0154] 从GenBank中查找大肠杆菌(Escherichia coli)EcIDI(GenBank：AF119715.1，SEQ ID NO.11)和绿薄荷(Mentha spicata)MsLS(GenBank：L13459.1，SEQ ID NO.12)基因，根据莱茵衣藻表达系统密码子的偏好性，更改部分密码子，得到适合在莱茵衣藻中表达的CrIDI和CrLS片段，送交基因公司(通用生物系统(安徽)有限公司)合成。CrIDI基因序列如SEQ ID NO.13所示，CrLS基因序列如SEQ ID NO.14所示。

[0155] SEQ ID NO.11：

[0156] ATGCAAACGGAACACGTCATTTTATTGAATGCACAGGGAGTTCCCACGGGTACGCTGGAAAAGTATGCCGCACACACGGCAGACACCCGCTTACATCTCGCGTTCTCCAGTTGGCTGTTTAATGCCAAAGGACAATTATTAGTTACCCGCCGCGCACTGAGCAAAAAAGCATGGCCTGGCGTGTGGACTAACTCGGTTTGTGGGCACCCACAACTGGGAGAAAGCAACGAAGACGCAGTGATCCGCCGTTGCCGTTATGAGCTTGGCGTGGAAATTACGCCTCCTGAATCTATCTATCCTGACTTTCGCTACCGCGCCACCGATCCGAGTGGCATTGTGGAAAATGAAGTGTGTCCGGTATTTGCCGCACGCACCACTAGTGCGTTACAGATCAATGATGATGAAGTGATGGATTATCAATGGTGTGATTTAGCAGATGTATTACACGGTATTGATGCCACGCCGTGGGCGTTCAGTCCGTGGATGGTGATGCAGGCGACAAATCGCGAAGCCAGAAAACGATTATCTGCATTTACCCAGCTTAAATAA；

[0157] SEQ ID NO.12：

[0158] AGAGAGAGAGAGGAAGGAAAGATTAATCATGGCTCTCAAAGTGTTAAGTGTTGCAACTCAAATGGCGATTCCTAGCAACCTAACGACATGTCTTCAACCCTCACACTTCAAATCTTCTCCAAAACTGTTATCTAGCACTAACAGTAGTAGTCGGTCTCGCCTCCGTGTGTATTGCTCCTCCTCGCAACTCACTACTGAAAGACGATCCGGAAACTACAACCCTTCTCGTTGGGATGTCAACTTCATCCAATCGCTTCTCAGTGACTATAAGGAGGACAAACACGTGATTAGGGCTTCTGAGCTGGTCACTTTGGTGAAGATGGAACTGGAGAAAGAAACGGATCAAATTCGACAACTTGAGTTGATCGATGACTTGCAGAGGATGGGGCTGTCCGATCATTTCCAAAATGAGTTCAAAGAAATCTTGTCCTCTATATATCTCGACCATCACTATTACAAGAACCCTTTTCCAAAAGAAGAAAGGGATCTCTACTCCACATCTCTTGCATTTAGGCTCCTCAGAGAACATGGTTTTCAAGTCGCACAAGAGGTATTCGATAGTTTCAAGAACGAGGAGGGTGAGTTCAAAGAAAGCCTTAGCGACGACACCAGAGGATTGTTGCAACTGTATGAAGCTTCCTTTCTGTTGACGGAAGGCGAAACCACGCTCGAGTCAGCGAGGGAATTCGCCACCAAATTTTTGGAGGAAAAAGTGAACGAGGGTGGTGTTGATGGCGACCTTTTAACAAGAATCGCATATTCTTTGGACATCCCTCTTCATTGGAGGATTAAAAGGCCAAATGCACCTGTGTGGATCGAATGGTATAGGAAGAGGCCCGACATGAATCCAGTAGTGTTGGAGCTTGCCATACTCGACTTAAATATTGTTCAAGCACAATTTCAAGAAGAGCTCAAAGAATCCTTCAGGTGGTGGAGAAATACTGGGTTTGTTGAGAAGCTGCCCTTCGCAAGGGATAGACTGGTGGAATGCTACTTTTGGAATACTGGGATCATCGAGCCACGTCAGCATGCAAGTGCAAGGATAATGATGGGCAAAGTCAACGCTCTGATTACGGTGATCGATGATATTTATGATGTCTATGGCACCTTAGAAGAACTCGAACAATTCACTGACCTCATTCGAAGATGGGATATAAACTCAATCGACCAACTTCCCGATTACATGCAACTGTGCTTTCTTGCACTCAACAACTTCGTCGATGATACATCGTACGATGTTATGAAGGAGAAAGGCGTCAACGTTATACCCTACCTGCGGCAATCGTGGGTTGATTTGGCGGATAAGTATATGGTAGAGGCACGGTGGTTCTACGGCGGGCACAAACCAAGTTTGGAAGAGTATTTGGAGAACTCATGGCAGTCGATAAGTGGGCCCTGTATGTTAACGCACATATTCTTCCGAGTAACAGATTCGTTCACAAAGGAGACCGTCGACAGTTTGTACAAATACCACGATTTAGTTCGTTGGTCATCCTTCGTTCTGCGGCTTGCTGATGATTTGGGAACCTCGGTGGAAGAGGTGAGCAGAGGGGATGTGCCGAAATCACTTCAGTGCTACATGAGTGACTACAATGCATCGGAGGCGGAGGCGCGGAAGCACGTGAAATGGCTGATAGCGGAGGTGTGGAAGAAGATGAATGCGGAGAGGGTGTCGAAGGATTCTCCATTCGGCAAAGATTTTATAGGATGTGCAGTTGATTTAGGAAGGATGGCGCAGTTGATGTACCATAATGGAGATGGGCACGGCACACAACACCCTATTATACATCAACAAATGACCAGAACCTTATTCGAGCCCTTTGCATGAGAGATGATGACGAGCCATCGTTTACTTACTTAAATTCTACCAAAGTTTTTCGAAGGCATAGTTCGTAATTTTTCAAGCACCAATAAATAAGGAGAATCGGCTCAAACAAACGTGGCATTTGCCACCACGTGAGCACAAGGGAGAGTCTGTCGTCGTTTATGGATGAACTATTCAATTTTTATGCATGTAATAATTAAGTTCAAGTTCAAGAGCCTTCTGCATATTTAACTATGTATTTGAATTTATCGAGTGTGATTTTCTGTCTTTGGCAACATATATTTTTGTCATATGTGGCATCTTATTATGATATCATACAGTGTTTATGGATGATATGATACTATC；

[0159] SEQ ID NO.13：

[0160] ATGCAGACCGAGCACGTGATCCTGCTGAACGCCCAAGGAGTGCCCACCGGAACGTTGGAGAAATACGCCGCCCACACCGCGGACACCCGGCTGCACCTGgtgagtcgacgagcaagcccggcggatcaggcagcgtgcttgcagatttgacttgcaacgcccgcattgtgtcgacgaaggcttttggctcctctgtcgctgtctcaagcagcatctaaccctgcgtcgccgtttccatttgcagGCCTTTAGTAGCTGGCTGTTCAACGCCAAGGGCCAGCTGCTAGTGACCCGCCGCGCCCTGAGCAAGAAGGCCTGGCCCGGCGTGTGGACAAACAGCGTATGCGGCCACCCCCAACTGGGAGAGAGCAACGAGGACGCCGTGATCCGCCGCTGCCGCTACGAGCTGGGCGTGGAGATCACCCCCCCCGAGAGCATCTACCCCGACTTCCGCTACCGCGCCACCGACCCAAGCGGCATCGTGGAGAACGAGGTCTGCCCCGTGTTCGCCGCCCGCACCACCAGCGCCCTGCAAATCAACGACGACGAGGTGATGGACTACCAGTGGTGTGACCTGGCCGACGTGCTGCACGgtgagcttgcggggttgcgagcaacactccagcaacgaacagtgcccaagtcaggaatctgcagtcagcctgggctttcggcggctttttcttgggcaaacagcttgcactcatgccagcgcggcttgtccagcctcacttgagctttccagctgctaccagccgggctatacgacagcgacagagccatagcgtggaatcacttatttgggttgccgaagtagcggtcggagcgtgagttcttggtcaagccgccccttatccggttcctgtccgtgtctttgtccctcgttcacccttcgcggcacccttcatccccttgcttgcagGCATCGACGCCACCCCCTGGGCCTTTAGCCCCTGGATGGTGATGCAAGCCACCAACCGCGAGGCCCGCAAGCGCCTGAGCGCCTTCACCCAACTGAAGtaa；

[0161] SEQ ID NO.14：

[0162] ATGGAGTTCCGCGTGCACCTGCAGGCCGACAACGAGCAGAAGATTTTCCAGAACCAGATGAAGCCCGAGCCCGAGgtgagtcgacgagcaagcccggcggatcaggcagcgtgcttgcagatttgacttgcaacgcccgcattgtgtcgacgaaggcttttggctcctctgtcgctgtctcaagcagcatctaaccctgcgtcgccgtttccatttgcagGCCAGCTACCTGATCAACCAGCGCCGCAGCGCCAACTACAAGCCCAACATCTGGAAGAACGACTTCCTGGACCAGAGCCTGATCAGCAAGTACGACGGCGACGAGTACCGCAAGCTGAGCGAGAAGCTGATCGAGGAGGTGAAGATTTACATCAGCGCCGAGACGATGGACCTGGTGGCCAAGCTGGAGCTGATCGACAGCGTGCGCAAGCTGGGCCTGGCCAACCTGTTCGAGAAGGAGATCAAGGAGGCCCTGGACAGCATCGCCGCCATCGAGAGCGACAACCTGGGCACCCGCGACGACCTGTACGGCACCGCCCTGCACTTCAAGATCCTGCGCCAGCACGGCTACAAGGTGAGCCAGGACATCTTCGGCCGCTTCATGGACGAGAAGgtgagtcgacgagcaagcccggcggatcaggcagcgtgcttgcagatttgacttgcaacgcccgcattgtgtcgacgaaggcttttggctcctctgtcgctgtctcaagcagcatctaaccctgcgtcgccgtttccatttgcagGGCACCCTGGAGAACCACCACTTCGCCCACCTGAAGGGCATGCTGGAGCTGTTCGAGGCCAGCAACCTGGGCTTCGAGGGCGAGGACATCCTGGACGAGGCCAAGGCCAGCCTGACCCTGGCCCTGCGCGACAGCGGCCACATCTGCTACCCCGACAGCAACCTGAGCCGCGACGTGGTGCACAGCCTGGAGCTGCCCAGCCACCGCCGCGTGCAGTGGTTCGACGTGAAGTGGCAGATCAACGCCTACGAGAAGGACATCTGCCGCGTGAACGCCACCCTGCTGGAGCTGGCCAAGCTGAACTTCAACGTGGTGCAGGCCCAGCTGCAGAAGAACCTGCGCGAGGCCAGCCGCTGGTGGGCCAACCTGGgtgagtcgacgagcaagcccggcggatcaggcagcgtgcttgcagatttgacttgcaacgcccgcattgtgtcgacgaaggcttttggctcctctgtcgctgtctcaagcagcatctaaccctgcgtcgccgtttccatttgcagGCATCGCCGACAACCTGAAGTTCGCCCGCGACCGCCTGGTGGAGTGCTTCGCCTGCGCCGTGGGCGTGGCCTTCGAGCCCGAGCACAGCAGCTTCCGCATCTGCCTGACCAAGGTGATCAACCTGGTGCTGATCATCGACGACGTGTACGACATCTACGGCAGCGAGGAGGAGCTGAAGCACTTCACCAACGCCGTGGACCGCTGGGACAGCCGCGAGACGGAGCAGCTGCCCGAGTGCATGAAGATGTGCTTCCAGGTGCTGTACAACACCACCTGCGAGATCGCCCGCGAGATCGAGGAGGAGAACGGCTGGAACCAGGTGCTGCCCCAGCTGACCAAGGTGTGGGCCGACTTCTGCAAGGCCCTGCTGGTGGAGGCCGAGTGGTACAACAAGAGCCACATCCCCACCCTGgtgagtcgacgagcaagcccggcggatcaggcagcgtgcttgcagatttgacttgcaacgcccgcattgtgtcgacgaaggcttttggctcctctgtcgctgtctcaagcagcatctaaccctgcgtcgccgtttccatttgcagGAGGAGTACCTGCGCAACGGCTGCATCAGCAGCAGCGTGAGCGTGCTGCTGGTGCACAGCTTCTTCAGCATCACCCACGAGGGCACCAAGGAGATGGCCGACTTCCTGCACAAGAACGAGGACCTGCTGTACAACATCAGCCTGATCGTGCGCCTGAACAACGACCTGGGCACCAGCGCCGCCGAGCAGGAGCGCGGCGACAGCCCCAGCAGCATCGTGTGCTACATGCGCGAGGTGAACGCCAGCGAGGAGACGGCCCGCAAGAACATCAAGGGCATGATCGACAACGCCTGGAAGAAGGTGAACGGCAAGTGCTTCACCACCAACCAGGTGCCCTTCCTGAGCAGCTTCATGAACAACGCCACCAACATGGCCCGCGTGgtgagcttgcggggttgcgagcaacactccagcaacgaacagtgcccaagtcaggaatctgcagtcagcctgggctttcggcggctttttcttgggcaaacagcttgcactcatgccagcgcggcttgtccagcctcacttgagctttccagctgctaccagccgggctatacgacagcgacagagccatagcgtggaatcacttatttgggttgccgaagtagcggtcggagcgtgagttcttggtcaagccgccccttatccggttcctgtccgtgtctttgtccctcgttcacccttcgcggcacccttcatccccttgcttgcagGCCCACAGCCTGTACAAGGACGGCGACGGCTTCGGCGACCAGGAGAAGGGCCCCCGCACCCACATCCTGAGCCTGCTGTTCCAGCCCCTGGTGAACTAA。

[0163] 根据CrIDI序列，设计目的片段引物：

[0164] CrIDI‑F：5’ATGCAGACCGAGCACGTGATCCT 3’(SEQ ID NO.15)；

[0165] CrIDI‑R：5’GCTGCCGCTGCCCTTCAGTTG 3’(SEQ ID NO.16)。

[0166] 根据CrLS序列，设计目的片段引物：

[0167] CrLS‑F：5’ATGCGCCGCAGCGGCAACTACAAC 3’(SEQ ID NO.17)；

[0168] CrLS‑R：5’TGCCGCTGCCGGCGAAGGGC 3’(SEQ ID NO.18)。

[0169] PCR程序如下：

[0170] 98℃2min；

[0171] 98℃10s，62℃5s，68℃30s，30个循环；

[0172] 68℃10min。

[0173] 根据设计的引物对目的片段进行PCR扩增，得到大小分别为1023bp和2640bp左右的片段，送交测序(上海生工生物工程有限公司)，检测其合成准确性。测序结果表明合成准确。

[0174] (2)柠檬烯表达载体的构建

[0175] 莱茵衣藻表达载体pOpt2(Wichmann,J.,Baier,T.,Wentnagel,E.,Lauersen,K.,&Kruse,O.(2018).Tailored carbon partitioning for phototrophic production of(E)‑α‑bisabolene from the green microalga Chlamydomonas reinhardtii.Metabolic Engineering,45,211–222.)含有HSP70A‑RBCS2启动子序列(HSP70A‑RBCS2 promoter)和RBCS2终止子序列(RBCS2terminater)，中间携带有NdeI、BamHI、BglⅡ和ZraI等多克隆酶切位点，可以插入外源基因并在衣藻核基因组中表达。该载体分别含有博来霉素或壮观霉素抗性基因表达盒，可使转化宿主获得博来霉素或壮观霉素抗性，在本实施例中作为衣藻转化的筛选标记。

[0176] 使用DNA无缝克隆技术将叶绿体定位信号肽基因克隆至该载体，获得pOpt2‑CTP载体；再使用DNA无缝克隆技术将目的基因克隆至pOpt2‑CTP载体中。目的片段和载体以5:1的摩尔量比例通过DNA无缝克隆后转化到大肠杆菌中，用带有氨苄抗性的LB平板进行筛选，挑取单克隆菌落，提取质粒。

[0177] 使用BamHI和BglⅡ对载体进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳结果如图6所示。用设计的载体引物(即SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.18)进行PCR(同步骤(1))扩增，得到含有目的条带的序列送交测序(上海生工生物工程有限公司)进行验证，序列正确的即为含有目的片段的重组载体pOpt2‑CTP‑CrIDI和pOpt2‑CTP‑CrLS，其结构示意图如图7所示。

[0178] 通过“珠磨法”进行遗传转化，将实施例3中获得的转基因藻株，即共转CrCK和CrIPK基因的莱茵衣藻ML2作为转化藻株，再导入pOpt2‑CTP‑CrIDI和pOpt2‑CTP‑CrLS重组载体。具体操作参照实例2中的方法。

[0179] (3)转基因莱茵衣藻的筛选与鉴定

[0180] 莱茵衣藻表达载体上含有博来霉素或壮观霉素基因，因此具有博来霉素或壮观霉素抗性，双基因转化成功的藻株可以在含有博来霉素和壮观霉素抗性的平板上生长。转基因藻的检测包括PCR测序、RT‑PCR分析和柠檬烯含量测定。

[0181] a.RT‑PCR

[0182] 提取绿色单克隆的莱茵衣藻总RNA，取1μg进行反转录(条件为42℃60min，72℃15min)(TaKaRa反转试剂盒)获得cDNA，通过PCR从cDNA中扩增出目的基因片段(CrIDI和CrLS)和内参基因(Actin基因)，PCR扩增产物送交上海生工生物工程公司进行测序。

[0183] Actin基因扩增引物为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，目的基因CrIDI扩增引物为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16，CrLS扩增引物为SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18。扩增结束后进行电泳，根据Actin的条带亮度比较目的基因表达量。

[0184] b.柠檬烯的提取和分析：气相色谱‑质谱(GC‑MS)

[0185] 莱茵衣藻CC4533(对照组)和转基因衣藻(即为实施例5(2)长岀的绿色单克隆)，加入底物3‑甲基‑3‑丁烯‑1‑醇和3‑甲基‑2‑丁烯‑1‑醇饲喂，培养至对数期，在培养瓶中添加十二烷，进行两相萃取，至平台期时，取十二烷相到新的玻璃试管中，用0.22μm的滤膜过滤至新的试管中，转移到色谱进样瓶中，‑20℃保存待检测。

[0186] 使用安捷伦7890A‑5975C气相色谱‑质谱联用仪进行检测，采用HP5‑MS石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm，安捷伦)。高纯氦气作为载气，载气流速为1mL/min，温度设置为80℃。

[0187] 分析时，80℃保持2min，20℃/min升至200℃，保持2min。质谱采用EI源，扫描范围为30～300m/z，离子源和四极杆温度分别为230℃和150℃。化合物结构和名称通过NIST(National Institute of Standards and Technology)和wiley libraries两个数据库共同决定。

[0188] 结果如图8所示，其中ML4表示以ML2藻株为转化菌株，共同转入CrIDI和CrLS基因的转基因衣藻。由图可以看出，本实施例制备得到的转基因藻藻株成功合成了柠檬烯。

[0189] 综上所述，本发明根据莱茵衣藻密码子偏好性对ScCK和AtIPK基因进行密码子改造，将叶绿体定位信号肽基因和目的基因插入带有抗性基因和高效启动子的表达载体中，再转化入莱茵衣藻基因组中，通过批量筛选获得半萜(IPP或/和DMAPP)含量高的转基因衣藻，经过传代证明其具有遗传稳定性。筛选得到的转基因衣藻的半萜(IPP或/和DMAPP)含量得到大幅提高，并且可以进一步构建产柠檬烯的莱茵衣藻工程藻株，为在莱茵衣藻中合成其他高价值的萜类物质提供了参考。

[0190] 申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。