一种包载双氢青蒿素的PD-1修饰的细胞外囊泡及其制备方法 |
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| 申请号 | CN202410013881.4 | 申请日 | 2024-01-04 | 公开(公告)号 | CN118001416A | 公开(公告)日 | 2024-05-10 |
| 申请人 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院; | 发明人 | 金阳; 周娥; 郭梦菲; 李玉梅; 李明磊; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及一种包载双氢青蒿素的PD‑1修饰的细胞外囊泡及其制备方法，本发明将PD‑1 转染 到LLC上后，得到过表达PD‑1的LLC细胞，再通过紫外照射的方式得到过表达PD‑1的空载囊泡，并通过电穿孔后孵育的方法包载双氢青蒿素到 肿瘤 细胞微颗粒，最后得到包载双氢青蒿素的PD‑1修饰的细胞外囊泡，通过 纳米粒子 示踪技术、投射电镜、Western‑blot等多维度方法对合成的包载双氢青蒿素的PD‑1修饰的细胞外囊泡进行表征；并且使用高效液相色谱准确定量其中DHA的含量，在细胞 水 平检测 生物 相容性 ，在动物水平检测生物分布，证明所合成的包载双氢青蒿素的PD‑1修饰的细胞外囊泡优良的肿瘤靶向性。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种包载双氢青蒿素的PD‑1修饰的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种包载双氢青蒿素的PD‑1修饰的细胞外囊泡及其制备方法技术领域[0001] 本发明涉及靶向药物载体制备领域，具体涉及一种包载双氢青蒿素的PD‑1修饰的细胞外囊泡及其制备方法。 背景技术[0002] 免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors，ICIs)通过阻断免疫检查点与其配体的结合，解除免疫检查点引起的免疫功能抑制，从而重新激活免疫细胞发挥抗肿瘤作用。目前已有多个ICIs在抗肿瘤临床应用中取得显著成效，是肿瘤治疗领域的突破性进展。靶向细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte‑associated antigen‑4，CTLA‑4)、程序性死亡受体1(programmed death‑1，PD‑1)及程序性死亡受体配体1(programmed death‑ligand 1，PD‑L1)的抑制剂已成功用于黑色素瘤和非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤的临床治疗。但是，仅部分患者对治疗有应答，部分应答时间不理想，部分因免疫相关不良反应(irAEs)中断治疗等。有研究表明，过表达PD‑1的单一细胞膜囊泡可用于肿瘤的免疫治疗。但是这种方法只阻断PD‑L1/PD‑1信号通路，其治疗效果并不好。因此，我们迫切的需要其他方法与免疫检查点抑制剂进行联合治疗从而扩大癌症患者群体对PD‑1/PD‑L1阻断的反应。 [0003] 双氢青蒿素(DHA)为青蒿素的衍生物，对疟原虫红内期有强大且快速的杀灭作用，能迅速控制临床发作及症状。许多先前的研究已经证明了DHA通过诱导氧化应激反应、DNA损伤、细胞周期阻滞和程序性细胞死亡、抑制血管生成和肿瘤相关信号转导途径等发挥抗肿瘤作用。此外，有研究表明DHA能够促进免疫原性细胞死亡从而发挥免疫治疗协同作用(6)。但是，DHA在血液循环半衰期极短(<15min)，且在水中水解迅速，严重限制了DHA及相关抗疟疾药物作为抗肿瘤药物的潜在应用(7‑9)。目前已有一些研究探索了DHA的包载(10‑12)，但目前还没有用生物膜来包载DHA进行肿瘤的治疗。 [0004] 细胞外囊泡(Extracelluar vesicles,EVs)直径100‑1000nm，是机体各种细胞在生理、病理条件下包裹细胞内容物分泌至胞外的囊泡状结构体，携带有相关细胞的生物信息，其内包含各种信使分子(RNA、DNA、代谢物和蛋白质)，能够在细胞间通过内吞融合或配体‑受体等方式传递生物活性物质。前期我们团队国际首创肿瘤细胞微颗粒(TMPs)作为生物免疫载体包裹化疗药物这一新型个体化/一体化肿瘤靶向生物化疗理论和技术，相关成果发表在Science Translational Medicine(2019，5年IF:21.14)和Chemical Engineering Journal(2022，5年IF:14.69)。团队前期的研究表明，TMPs作为一种新型靶向生物化疗药物载体包裹化疗药物后具有靶向杀伤肿瘤和抗肿瘤免疫激活效应及其机制。因此，合成包载双氢青蒿素的载药囊泡(EVs‑DHA@PD‑1)是提高双氢青蒿素生物利用度、释放其体内有效抗肿瘤作用的有效策略。 发明内容[0005] 本发明要解决的技术问题是针对以上不足，提供一种包载双氢青蒿素的PD‑1修饰的细胞外囊泡及其制备方法。 [0006] 一种包载双氢青蒿素的PD‑1修饰的细胞外囊泡的制备方法，包括以下步骤： [0007] 步骤1、将PD‑1转染到LLC上，得到过表达PD‑1的LLC细胞； [0009] 步骤3、采用梯度离心法收取肿瘤细胞外囊泡； [0010] 步骤4、将肿瘤细胞外囊泡与双氢青蒿素按质量比1:4配制电穿孔体系，肿瘤细胞囊泡与双氢青蒿素混合后，用冷PBS定容后，用移液枪吹打混匀后移至电击杯，冰上预冷整个体系；电击一次后，将电击杯放在30‑40℃培养箱孵育30分钟以上以恢复囊泡膜完整性，用移液枪将体系溶液完全吸到EP管，采用离心法收集包载双氢青蒿素的PD‑1修饰的细胞外囊泡。 [0011] 进一步的，所述步骤1中，PD‑1在LLC的过表达采用慢病毒载体构建，转染后，选择浓度为5ug/ml嘌呤霉素筛选PD‑1过表达的LLC并通过l流式分选获得稳定转染的过表达PD‑1的LLC细胞。 [0012] 进一步的，所述步骤3中的梯度离心方法包括以下步骤： [0013] 步骤3.1、取细胞上清600xg,10min，弃去细胞沉淀，留下上清2000xg,30min，弃去细胞碎片沉淀； [0014] 步骤3.2、将获得的上清以16000xg,60min条件，离心后所得沉淀物即为肿瘤细胞外囊泡； [0015] 步骤3.3、将上一步得到的肿瘤细胞外囊泡经冷PBS清洗2遍后，用100‑300ul冷PBS重悬。 [0016] 进一步的，步骤4的肿瘤细胞外囊泡与双氢青蒿素混合前，用冷PBS稀释双氢青蒿素以防体系中过高浓度DMSO破坏囊泡的脂质层。 [0017] 包载双氢青蒿素的PD‑1修饰的细胞外囊泡，由上述的方法制备得到。 [0018] 本发明的有益效果为： [0019] 本发明将PD‑1转染到LLC上后，得到过表达PD‑1的LLC细胞，再通过紫外照射的方式得到过表达PD‑1的空载囊泡(EVs‑0@PD‑1)，并通过电穿孔后孵育的方法包载双氢青蒿素到肿瘤细胞微颗粒，最后得到包载双氢青蒿素的PD‑1修饰的细胞外囊泡(EVs‑DHA@PD‑1)，通过纳米粒子示踪技术、投射电镜、Western‑blot等多维度方法对合成的EVs‑DHA@PD‑1进行表征；并且使用高效液相色谱准确定量EVs‑DHA@PD‑1中DHA的含量，在细胞水平检测EVs‑DHA@PD‑1的生物相容性，在动物水平检测EVs‑DHA@PD‑1的生物分布，证明所合成EVs‑DHA@PD‑1优良的肿瘤靶向性。附图说明 [0020] 图1为PD‑1过表达的LLC细胞的构建图，其中A图为流式检测llc和llc‑pd1细胞的pd1的表达量图，B图为pcr检测llc和llc‑pd1细胞的pd1表达的统计分析图，C图为wb检测llc和llc‑pd1细胞的pd1表达图； [0021] 图2为EVs‑DHA@PD‑1合成流程图； [0022] 图3为经纳米颗粒跟踪系统(NTA)和透射电镜(TEM)技术鉴定细胞外囊泡的形状、尺寸图，其中A图为EV和EVs‑DHA@PD‑1的NTA检测结果；B图为EV和EVs‑DHA@PD‑1的TEM图； [0023] 图4为EVs‑DHA@PD‑1膜标记物检测结果示意图； [0024] 图5中A图为双氢青蒿素的HPLC标准曲线，B图为HPLC法检测不同配比下的双氢青蒿素浓度统计图； [0025] 图6为EVs‑DHA@PD‑1的生物相容性和生物分布图，其中A图为EVs‑DHA@PD‑1与细胞孵育24小时后荧光图；B图为EVs‑DHA@PD‑1与细胞孵育24小时后荧光图；C图为流式细胞术检测EVs‑DHA@PD‑1与细胞孵育1小时、6小时、24小时的摄取率；D图为腹腔注射100ug DiR标记的EVs‑DHA@PD‑11小时、6小时、24小时后的活体成像；E图为腹腔注射100ug DiR标记的EVs‑DHA@PD‑11小时、6小时、24小时后各内脏活体成像图。 具体实施方式[0026] 以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。 [0027] 1合成装载双氢青蒿素的肿瘤细胞外囊泡(EVs‑DHA@PD‑1) [0028] (1)PD‑1在LLC的过表达采用慢病毒载体构建。转染后，选择浓度为5ug/ml嘌呤霉素筛选PD‑1过表达的LLC并通过l流式分选获得稳定转染的细胞克隆，最后通过流式细胞术、qPCR和western blotting验证慢病毒转染效果(图1)。 [0029] (2)LLC细胞在150mm细胞培养皿生长至90％密度时，将上清换为无血清基础培养‑2基，紫外(300Jm )照射细胞30分钟，然后将细胞放置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养24小时。 [0030] (3)梯度离心法收取EVs‑0@PD‑1，具体来说，细胞上清600xg,10min，弃去细胞沉淀，留下上清2000g,30min，弃去细胞碎片沉淀。获得的上清以16000g,60min条件，离心后所得沉淀物即为EVs。最后EVs经冷PBS清洗2遍(20000xg,45min)后，用100‑300ul冷PBS重悬，尽量现提现用，或者在‑80℃保存不超过3天。 [0031] (4)将100ug的EVs‑0@PD‑1与不同浓度的双氢青蒿素(200ug/ml，400ug/ml)混合，混合体系的总体积为800ul，混合前，尽量用冷PBS稀释双氢青蒿素以防体系中过高浓度DMSO破坏囊泡的脂质层，用移液枪轻柔吹打后移至电击杯(2mm，BTX，45‑0135)，冰上预冷整个体系5分钟。电穿孔条件：衰减波模式，400V，150uF,4mm。电击一次后，将电击杯放在37℃培养箱30分钟以恢复囊泡膜完整性。用移液枪将体系溶液完全吸到1.5mlEP管，用PBS冲洗杯壁，清洗液也移到同一个EP管。20000xg，30min条件离心体系溶液，然后弃上清，用1ml PBS重悬沉淀，继续用相同条件离心一遍去掉游离药物，弃上清，得到沉淀即为EVs‑DHA@PD‑1。100ul冷PBS重悬沉淀备用，或者‑80℃保存不超过3天。EVs‑DHA@PD‑1的合成流程图如图2所示。 [0032] 2表征EVs‑DHA@PD‑1和检测包载率 [0033] 2.1EVs‑DHA@PD‑1尺寸 [0034] 上述提取的EVs‑DHA@PD‑1，经纳米颗粒跟踪系统(NTA)、透射电镜(TEM)技术鉴定细胞外囊泡的形状、尺寸。NTA结果显示，EVs‑0@PD‑1和EVs‑DHA@PD‑1的粒径峰值分别为183.9nm、130.5nm；TEM图像表示EVs‑0@PD‑1和EVs‑DHA@PD‑1的尺寸与NTA结果有些许差异，与EVs‑0@PD‑1相比，EVs‑DHA@PD‑1的粒子直径更大，但两者都在100‑200nm之间，外形呈茶托状或圆盘状(图3)。 [0035] 2.2EVs‑DHA@PD‑1膜标记物 [0036] 上皮细胞粘附分子(EPCAM)、肿瘤易感基因101蛋白(TSG101)、CD9及CD63均为经典的肿瘤细胞外囊泡标记蛋白，免疫印迹实验提示EVs‑0@PD‑1表达以上蛋白；并且与EVs‑0相比，EVs‑0@PD‑1还过表达PD‑1(图4)。 [0037] 2.3包载率研究 [0038] 接下来，使用高效液相色谱法(HPLC)检测EVs‑DHA@PD‑1中的双氢青蒿素含量，进行包载率研究。在此引入两个指标用来评估包载效率： [0039] 包封率(encapsulation efficiency，％)＝W/WDHA*100％ [0040] 载药率(loading efficiency，％)＝W/WEV*100％ [0041] W为载药囊泡中双氢青蒿素质量，WDHA为合成体系中双氢青蒿素原始质量，WEV为合成体系中囊泡原始质量，单位：ug。(合成体系中囊泡原始质量为100ug) [0042] HPLC结果表明，当双氢青蒿素包药时的浓度为400ug/ml时，包封率和载药率达到较高水平，此时100ug载药囊泡中平均含有1.8ug双氢青蒿素(图5)。这说明改良技术路线所合成的EVs‑DHA@PD‑1中含有相当可观的双氢青蒿素。 [0043] 3评估EVs‑DHA@PD‑1的生物相容性和生物分布 [0044] 接下来，我们研究了EVs‑DHA@PD‑1靶细胞递送药物的能力。用DAPI和PKH26标记LLC细胞，分别标记细胞核和细胞膜，然后与20ug DiR标记的EVs‑DHA@PD‑1孵育。孵育24h后，可看到大量的细胞膜呈现绿色荧光染色(图6A中B图)，表明LLC细胞能很好的摄取EVs‑DHA@PD‑1。采用流式细胞术检测DiR标记EVs‑DHA@PD‑1后的绿色荧光染色阳性细胞，准确测定摄取率。如图6中C图所示，1小时、6小时、12小时和24小时的平均阳性率分别为23.1％、86.7％、94.2％和97.5％。这些体外实验结果表明，EVs可以有效地与细胞膜结合并将药物递送到细胞内。 [0045] 将100ug DiR标记的EVs‑DHA@PD‑1腹腔注射至C57小鼠体内，利用小动物成像系统观察小鼠不同部位的荧光聚集情况。结果显示，1h时EVs‑DHA@PD‑1在体内有极少量的蓄积。12h后荧光广泛分布于包括皮下肿瘤在内的各个部位并持续至24h(图6中D图)。在不同时间点解剖小鼠心脏、肺、肝、脾、双肾和皮下肿瘤等主要器官，获得荧光图像。如图6中E图所示，最初，荧光主要聚集在肝脏，表明存在首过效应，正如在许多口服药物中观察到的那样。随后，肝脏内荧光减弱，而肿瘤内荧光在12h后逐渐增强，荧光在肿瘤内持续到注射后24小时。 [0046] 以上所述为本发明最佳实施方式的举例，其中未详细述及的部分均为本领域普通技术人员的公知常识。本发明的保护范围以权利要求的内容为准，任何基于本发明的技术启示而进行的等效变换，也在本发明的保护范围之内。 |
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