一种促进芽孢萌发的方法和应用 |
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| 申请号 | CN202410057546.4 | 申请日 | 2024-01-15 | 公开(公告)号 | CN117887704A | 公开(公告)日 | 2024-04-16 |
| 申请人 | 合肥工业大学; | 发明人 | 李沛军; 潘琼; 罗慧婷; 蔡克周; 周辉; 肖晴; 徐宝才; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种促进芽孢萌发的方法和应用；所述促进芽孢萌发的方法包括将芽孢热激活处理后再采用脉冲 磁场 处理，进一步刺激芽孢萌发，打破芽孢休眠状态，诱导更多的芽孢萌发形成营养细胞。该方法具有操作方法简单、成本低廉的特点，而且芽孢萌发率高，分别是未处理和仅热激活处理的31.5倍和3.6倍。尤其地，通过采用本发明的技术方案，能够进一步提高芽孢的萌发量，以更低的能耗和成本取得对产芽孢有害细菌更好的杀菌效果；或提升产芽孢有益菌含量，为食品的贮藏期及其品质 风 味和营养成分的保持、 发酵 剂的利用率和 饲料 中有益菌的增殖和益生作用提供了一种新型的、极具实际应用意义的芽孢控制方法。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种促进芽孢萌发的方法，包括采用脉冲磁场处理的方法对激活后的细菌芽孢进行二次激活以促进芽孢萌发。 |
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| 说明书全文 | 一种促进芽孢萌发的方法和应用技术领域背景技术[0002] 芽孢主要是芽孢杆菌属和梭状芽孢杆菌属在缺乏营养的环境条件下形成的一种休眠体，广泛存在于自然界中，比如空气、土壤、动物肠道。芽孢由于其特殊的结构，对外界逆境比如热、酸、碱、盐、氧化、水分和营养缺失都具有极强的抗性，这种特性使芽孢可存活数年，甚至数百万年。因此，广泛存在且具有极强抗性的芽孢会不可避免地进入到食品加工链中，并对各种食品杀菌手段都具有很强的抗性，能在食品杀菌过程中存活。食品中的芽孢能感知外界环境的变化，一旦条件合适，芽孢会开始萌发生长，消耗食品中的营养成分，产生代谢产物，引起食品腐败变质或导致食源性疾病。可见，对于有害细菌来说，高抗性芽孢的有效杀灭是食品安全的一个关键问题。目前，为了避免食品受高温影响而品质劣变，“萌发‑失活”策略已被开发用于温和杀死芽孢，即先打破芽孢的休眠状态，削弱其抗逆性后再将其杀灭，从而用更低的能耗和成本取得更好的杀菌效果，使食品货架期延长。因此，为延长食品货架期、保证食品安全，深入探究诱导芽孢萌发的机理和条件，开发促进芽孢萌发新技术，从而进一步提高杀灭效果，是行业亟待解决的技术问题。此外，作为一些发酵食品的发酵剂和饲料中抗生素的替代品，有益芽孢杆菌在食品加工和动物生产中具有多种优势，如何诱导芽孢的萌发促进益生菌的增殖并发挥其积极作用也具有重要意义。 [0003] 为了提高芽孢的萌发率，中国发明专利CN109619182A提供一种芽孢萌发剂，所述萌发剂包括如下重量份的组分：氨基酸0.1‑5份，低聚糖0.1‑2.5份，无机盐0.1‑1份和分散剂0.1‑1份。该发明提供的芽孢萌发剂可迅速打破芽孢休眠状态，诱导芽孢萌发形成营养细胞，在发酵类主食、奶制品、罐头等易受芽孢杆菌污染且经历高温加热的食品中具有广泛的应用价值，而且该发明所述的芽孢萌发剂制备过程简单，有利于大范围推广。但这些方法不仅萌发率低，还需要额外添加萌发剂，易改变食品原有的品质和营养成分构成，不适用于多数的食用产品。 [0004] 中国发明专利CN116286783A提出了一种提高超高压深休眠芽孢萌发速率的方法，所述方法包括：对样品进行超高压处理，收集未萌发的深休眠芽孢，得到深休眠芽孢液；将所述深休眠芽孢液与十二胺进行共孵育。利用该发明的方法可以有效地促进超高压深休眠芽孢萌发，提高萌发速率，具有操作简便、用时短、效率高等优点。但该方法中一方面会破坏食品中压敏性成分，不利于食品营养成分的保持；另一方面，十二胺作为有毒化学试剂，在食品、饲料领域中限制使用，因此限制了该技术在芽孢萌发中的应用，不具有普遍适用性。 [0005] 作为一种非热处理技术，脉冲磁场已被广泛证明能有效杀死细菌营养细胞，应用于食品保鲜。脉冲磁场杀菌是将食品放置到产生脉冲磁场的线圈中进行处理，从而达到杀灭微生物的一种方法。磁场包括静磁场和动磁场，前者的磁场强度和方向保持不变，也称恒磁场，后者的磁场方向、强度及间歇时间有规律地发生变化，如脉冲磁场、振荡磁场等。脉冲磁场处理不仅可以在常温常压下进行，还克服了超高压杀菌破坏食品中压敏性成分的缺点，也克服了微波以及脉冲强光过程中热效应引起食品颜色变化等缺点，较好地保持了食品中原有的营养成分和风味物质。使用脉冲磁场处理时，食品的物理性质、化学性质改变很小，而且适用范围更广。脉冲磁场本身和瞬时磁场感应电流之间的相互作用可以引起铜绿假单胞菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等细菌正常形态、结构和功能的破坏，并导致其死亡。然而，由于芽孢极强的耐抗性，脉冲磁场对芽孢的灭活作用有限，使芽孢经脉冲磁场处理后仍然能够存活，并在环境适宜情况时萌发成正常营养细胞，对食品安全造成重大隐患。进一步地，由于脉冲磁场作为杀菌手段的认知，技术人员对脉冲磁场形成了技术偏见，并不能够将其应用于芽孢萌发的技术领域中来。 [0006] 因此，基于现有技术中存在的问题，在如何保证食品质量的同时促进芽孢的萌发，是提高芽孢杀菌效果和促进有益菌繁殖发挥作用亟待解决的问题，虽然脉冲磁场能够杀灭微生物，但本领域技术人员不能够从现有技术想到采用脉冲磁场促进芽孢萌发的方法。由于脉冲磁场操作简单方便，且能在常温常压下进行，因此本发明利用脉冲磁场开发诱导芽孢萌发的新方法，不仅能够促进芽孢的萌发量，还改进了现有的萌发手段，也极具实际应用意义和价值，使其能够进一步地进行推广和应用。 发明内容[0007] 本发明的主要目的在于提供一种促进芽孢萌发的方法和应用，将脉冲磁场处理技术应用于芽孢诱导萌发中，促进其萌发，该技术方案简单易操作，普适性强。 [0008] 为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案。 [0009] 本发明的一个方面提供了一种促进芽孢萌发的方法，包括采用脉冲磁场处理的方法对激活后的细菌芽孢进行二次激活以促进芽孢萌发。 [0010] 优选地，促进芽孢萌发的方法，包括以下步骤： [0011] S1.芽孢激活：将细菌芽孢配置成芽孢悬液后进行激活，得到一次激活芽孢悬液； [0012] S2.脉冲磁场二次激活：将S1得到的所述一次激活芽孢悬液在25～55℃下用脉冲磁场处理20～60min，得到二次激活芽孢悬液； [0013] S3.萌发：将S2得到的所述二次激活芽孢悬液在15～55℃下萌发处理10～60min，得到萌发芽孢悬液。 [0014] 优选地，所述的脉冲磁场，其波形为方形波，频率为30～80Hz，强度为6～30mT。强度过低的脉冲磁场处理对诱导芽孢萌发的作用无显著影响，而强度过大的脉冲磁场处理易损伤芽孢，使其更难萌发，在长时间修复后仍能萌发，带来食品安全隐患。因此，选择合适的脉冲磁场处理条件对促进芽孢萌发具有重要的影响。 [0015] 优选地，所述芽孢激活的方法包括热激活和超高压激活中的一种或两种组合。 [0017] 进一步地，所述热激活的条件包括将细菌芽孢悬液在70～85℃热处理10～30min。 [0018] 优选地，S1中所述芽孢悬液的制备方法包括以下步骤： [0019] (1)提供芽孢粗液；将活化的细菌接种至培养基中培养，洗涤并收集得到所述芽孢粗液； [0020] (2)提供芽孢泥；将步骤(1)得到的所述芽孢粗液离心洗涤15min，得到所述芽孢泥； [0021] (3)制备所述芽孢悬液；将步骤(2)得到的所述芽孢泥重悬后即得到所述芽孢悬液。 [0022] 作为优选的实施方式之一，步骤(1)中，将活化的所述细菌接至8～12mL含0.3～2+ 1.5μmol/L Mn 的营养琼脂培养基中，35～38℃下培养6～8d，用2～8mL无菌去离子水振荡、洗涤并收集，得到所述芽孢粗液。 [0023] 作为优选的实施方式之一，步骤(2)中，所述芽孢粗液用10～30mL无菌去离子水在8000r/min下离心洗涤15min，重复3～6次，得到所述芽孢泥。 [0024] 作为优选的实施方式之一，步骤(3)中，将所述芽孢泥重悬在30～60mL无菌去离子水得到所述芽孢悬液。 [0025] 进一步地，所述细菌芽孢为芽孢杆菌属(Bacillus)细菌。 [0026] 一般来说，生物体内有顺磁性和反磁性物质，每一个生物细胞都可以看作是一个+ + 2+微型电池或者一个小磁极。各种带电离子(Na、K 、Ca 和其他离子)和生物大分子(核酸、蛋白质和其他聚合物)以偶极子的形式存在于细胞中。这些生物体中的局部电荷或偶极子响应于所施加的脉冲磁场而产生生物电流、洛伦兹力效应和电离效应，引起不同带电离子和偶极子的不规则运动和电动势差，导致细胞被破坏，细胞膜通透性、酶和蛋白质活性的改变，同时产生不同的生物效应。芽孢萌发伴随着带电离子的流动、细胞内膜通透性和大分子蛋白质活性的改变等，本发明人发现通过施加脉冲磁场，可以进一步改善芽孢萌发过程中和大分子蛋白质活性、细胞膜通透性和带电离子的流动性，进而促进更多芽孢的萌发。 [0027] 基于上述技术方案，在对芽孢进行了热激活的基础上，进一步利用脉冲磁场处理+ +能刺激芽孢外壳萌发受体，增强细胞内膜渗透性，打开蛋白质通道，使Na、K以及2，6‑吡啶二羧酸钙等离子更快释放并在细胞膜外积累。这些积累的离子刺激未萌发芽孢，打破其休眠状态，诱导更多的芽孢萌发形成营养细胞。 [0028] 与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果： [0029] 1.本发明提供的一种促进芽孢萌发的方法，该方法操作简单且高效，尤其地，芽孢萌发率分别是未处理和仅热激活处理的31.5倍和3.6倍以上，为芽孢的诱导萌发提供了一种新型有效且适用度更高的技术。 [0030] 2.将本发明所述促进芽孢萌发的方法应用于食品杀菌领域，提高芽孢的萌发量，再对已经萌发的芽孢进行杀灭，能够以更低的能耗和成本取得更好的杀菌效果，为食品的贮藏期及其品质风味和营养成分的保持提供了一种新型的、极具实际应用意义的芽孢控制方法。 [0032] 图1为本发明实施例1‑2和对比例1制备的芽孢悬液的芽孢萌发率。 [0033] 图2为本发明实施例1‑2和对比例1制备的芽孢悬液的折光性。 [0034] 图3为本发明实施例1‑2和对比例1制备的芽孢悬液中的2，6‑吡啶二羧酸(DPA)荧光值。 具体实施方式[0035] 以下结合若干实施例对本发明的技术方案进行更为详细的解释说明。 [0036] 如下实施例及对比例中使用的部分原料的来源及制备方法如下： [0037] (1)枯草芽孢杆菌，保藏号CICC 24225，中国微生物菌种保藏中心。 [0038] (2)PCA培养基：PCA培养基购于广东环凯微生物科技有限公司，用于枯草芽孢杆菌的计数。 [0039] (3)LB培养基：LB培养基购于青岛海博生物技术有限公司，用于枯草芽孢杆菌的活化和传代培养。 [0040] (4)含0.91μmol/L Mn2+的营养琼脂培养基：将0.91μmol Mn2+加入到1L的营养琼脂培养基中，经121℃杀菌15min后冷却，制成斜面后使用。营养琼脂培养基购于广东环凯微生2+ 物科技有限公司；Mn 来源于MnCl2·4H2O，购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；该培养基用于芽孢的制备。 [0041] (5)枯草芽孢杆菌的活化：无菌条件下用接种环挑取枯草芽孢杆菌，接入10～15mL LB培养基中，涡旋振荡，37℃培养16～18h后得到活化枯草芽孢杆菌。 [0042] 实施例1 [0043] 本实施例提供一种芽孢的制备方法，能够进一步地促进芽孢萌发，具体的制备方法包括以下步骤： [0044] (1)将活化的枯草芽孢杆菌接至10mL含0.91μmol/L Mn2+的营养琼脂培养基中，37℃下培养7d，用3mL无菌去离子水振荡、洗涤并收集，得到芽孢粗液； [0045] (2)将步骤1得到的芽孢粗液用20mL无菌去离子水在8000r/min下离心洗涤15min5次，得到芽孢泥； [0046] (3)将步骤2得到的芽孢泥重悬在50mL无菌去离子水，调节芽孢悬液OD600为1.0，得到芽孢悬液。 [0047] 实施例2 [0048] 本实施例提供的芽孢的萌发方法，步骤如下： [0049] S1.热激活：将实施例1得到的芽孢悬液在75℃热处理30min，得到一次激活芽孢悬液； [0050] S2.脉冲磁场二次激活：将步骤S1得到的一次激活芽孢悬液在37℃下用脉冲磁场处理30min，得到二次激活芽孢悬液；所述的脉冲磁场波形为方形波，频率为50Hz，强度为8mT； [0051] S3.萌发：将S2得到的所述二次激活芽孢悬液在37℃下萌发处理30min，得到萌发芽孢悬液。 [0052] 实施例3 [0053] 本实施例提供一种促进芽孢萌发的方法，步骤如下： [0054] S1.超高压激活：将实施例1得到的芽孢悬液在200MPa压力和37℃温度条件下处理10min，得到一次激活芽孢悬液； [0055] S2.脉冲磁场二次激活：将步骤S1得到的一次激活芽孢悬液在37℃下用脉冲磁场处理30min，得到二次激活芽孢悬液；所述的脉冲磁场波形为方形波，频率为50Hz，强度为8mT； [0056] S3.萌发：将S2得到的所述二次激活芽孢悬液在37℃下萌发处理30min，得到萌发芽孢悬液。 [0057] 实施例4 [0058] 本实施例提供的一种促进芽孢萌发的方法与实施例2基本相同，区别在于，在步骤S1中，是将实施例1得到的芽孢悬液在70℃热处理30min，得到一次激活芽孢悬液。 [0059] 实施例5 [0060] 本实施例提供的一种促进芽孢萌发的方法与实施例2基本相同，区别在于，在步骤S1中，是将实施例1得到的芽孢悬液在85℃热处理10min，得到一次激活芽孢悬液。 [0061] 实施例6 [0062] 本实施例提供的一种促进芽孢萌发的方法与实施例3基本相同，区别在于，在步骤S1中，是将实施例1得到的芽孢悬液在100MPa的压力和85℃的温度条件下处理10min。 [0063] 实施例7 [0064] 本实施例提供的一种促进芽孢萌发的方法与实施例3基本相同，区别在于，在步骤S1中，是将实施例1得到的芽孢悬液在600MPa的压力和5℃的温度条件下处理30min。 [0065] 实施例8 [0066] 本实施例提供一种芽孢的制备方法与实施例1基本相同，区别在于，在步骤(1)中，使用的菌株为蜡样芽孢杆菌。 [0067] 实施例9 [0068] 本实施例提供的一种促进芽孢萌发的方法与实施例2基本相同，区别在于，在步骤S1中，使用实施例8制备得到的芽孢悬液。 [0069] 实施例10 [0070] 本实施例提供的一种促进芽孢萌发的方法与实施例2基本相同，区别在于，在步骤S2中，所述的脉冲磁场波形为方形波，频率为50Hz，强度为30mT。 [0071] 对比例1 [0072] 本对比例提供一种促进芽孢萌发的方法，步骤如下： [0073] (1)热激活：将实施例1得到的芽孢悬液在75℃热处理30min，得到激活芽孢悬液； [0074] (2)萌发：将步骤(1)得到的激活芽孢悬液在37℃下萌发60min，得到萌发芽孢悬液。 [0075] 对比例2 [0076] 本对比例提供的一种促进芽孢萌发的方法与实施例2基本相同，区别在于，在步骤S2中，所述的脉冲磁场波形为方形波，频率为50Hz，强度为100μT。 [0077] 测试例 [0078] 将实施例和对比例的芽孢萌发量、折光性以及荧光强度进行测试，测试方法分别包括： [0079] 芽孢萌发量的测定：分别取1mL实施例1‑2和对比例1制备的样品，置于9mL 0.9％NaCl溶液中梯度稀释，选取合适的梯度涂布至PCA培养基上，在37℃下培养12h后计数以测9 定芽孢萌发量。芽孢总数约为2.9×10 CFU/mL。芽孢萌发率为芽孢萌发数和芽孢总数的比值，结果如图1所示。 [0080] 折光性的测定：取实施例1‑2和对比例1制备的样品100μL，分别用紫外分光光度计在波长600nm处测定折光性，结果如图2所示。 [0081] 2，6‑吡啶二羧酸(DPA)的测定：将实施例1‑2和对比例1制备的样品分别与1.5mL 50μmol/L pH5.6的TbCl3溶液混合，冰浴10min，用荧光分光光度计测定荧光强度，激发波长为270am，发射波长545nm，结果如图3所示。 [0082] 数据统计分析：所有的实验重复三次，结果表示为平均值±标准差。实验数据统计采用Statistix8.1软件包中的Linear Models程序，差异显著性(P＜0.05)分析使用Tukey HSD程序进行。图1‑3中不同小写字母表示不同处理组之间差异显著(P＜0.05)。 [0083] 结果分析： [0084] 如图1所示，实施例1芽孢悬液中芽孢萌发率仅为2.8％，而对比例1的芽孢悬液中萌发的芽孢率高达24.0％，是实施例1的8.65倍，说明热激活能诱导很多芽孢萌发。经过脉冲磁场处理后，实施例2的芽孢萌发率更是显著高于实施例1和对比例1(P＜0.05)。这说明热激活处理仅能激活小部分芽孢萌发，而经脉冲磁场处理进行二次激活后能够使大部分芽孢萌发，可见，脉冲磁场对芽孢萌发具有显著的促进作用。 [0085] 如图2所示，芽孢萌发后，OD600值呈下降趋势。当芽孢萌发后，其折光性会显著下降，整体变澄清，芽孢悬液的折光性通常用OD600表示。具体地，与实施例1相比，对比例1热激活后的芽孢悬液折光性显著下降(P＜0.05)，而经过脉冲磁场二次激活的实施例2能进一步使芽孢悬液的折光性降低，说明脉冲磁场二次激活能让更多的芽孢萌发，使其生理状态改变，降低了折光性。 [0086] 实施例2和实施例3‑7及实施例9‑10分别采用不同的激活方法和菌株，诱导芽孢萌发后，再使用脉冲磁场处理，得到的芽孢悬液的萌发率及折光性结果均相似，这里不再赘述。 [0087] 进一步地，本发明在上述优选的实施例中分别以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)为例进行了说明，可以推及，本发明采用其他为芽孢杆菌属(Bacillus)细菌也能够实现相同或相似的结果。 [0088] 对比例2与实施例2相比仅脉冲磁场处理的强度不相同，对比例2采用100μT强度的脉冲磁场处理芽孢悬液，其结果与对比例1结果相似，说明强度过低的脉冲磁场处理对诱导芽孢萌发的作用无显著影响。因此，选择合适的脉冲磁场处理条件对促进芽孢萌发具有重要的影响。 [0089] 芽孢的萌发伴随着DPA的释放。DPA属于芽孢中一种重要物质，芽孢萌发过程中一个事件就是DPA的释放，DPA释放后会激发芽孢萌发的后续事件相继发生，因此DPA的释放成为萌发的一项重要评价指标。DPA的荧光值越高说明DPA释放的越多。如图3所示，与实施例1相比，实施例2和对比例1的芽孢悬液释放的DPA均显著增加(P＜0.05)，实施例2施加脉冲磁场处理的芽孢悬液释放的DPA更是显著高于对比例1(P＜0.05)。这可能是由于热激活后，芽孢萌发受体活化，将萌发信号传递到活化的萌发受体下游，增强了细胞内膜渗透性或打开+ +了蛋白质通道，使Na 、K以及Ca‑DPA释放。经过脉冲磁场二次激活后，进一步影响了细胞内+ + 膜渗透性和蛋白质通道，使Na、K以及Ca‑DPA等这些离子更快释放并在膜外积累，刺激未萌发芽孢，促进大部分芽孢都能萌发，释放更多的DPA，降低其折光性，这有利于提高产芽孢有害细菌的杀菌效果，或产芽孢有益菌含量，为食品的贮藏期及其品质风味和营养成分的保持、发酵剂的利用率和饲料中有益菌的增殖和益生作用提供了一种新型的、极具实际应用意义的芽孢控制方法。 |
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