一种高耐受氨、酚类的小球藻及用途和制备方法 |
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| 申请号 | CN202210904371.7 | 申请日 | 2022-07-29 | 公开(公告)号 | CN115786125B | 公开(公告)日 | 2024-05-14 |
| 申请人 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所; | 发明人 | 宋晓金; 崔球; 刘亚君; 万伟建; 张跃冬; 冯银刚; | ||||
| 摘要 | 本 发明 利用诱变结合实验室定向进化技术进行筛选，获得一种能耐受高酚 醛 及 氨 水 浓度的小球藻株（Chlorella sorokiniana SD501），已保藏于位于湖北省武汉市武昌区武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2022876，保藏日期为2022年6月13日。所述小球藻可以使用高浓 氨水 及酶 水解 后的糠醛渣处理液进行培养，获得高蛋白的小球藻培养物，填补了 现有技术 的空白。所述的糠醛渣处理液中，酚醛浓度为0.5‑2%，氨浓度为1‑1.5%。所述的小球藻在利用糠醛渣处理液 发酵 培养的应用，不但解决了糠醛生产过程中产生的糠醛渣污染问题，环境友好；还实现了糠醛渣废料的高值化利用，具有重要的经济效益前景；也无需对预处理液进行稀释或额外添加小球藻生长必需的其他元素，一举三得，应用前景广阔。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种高耐受氨、酚类的小球藻SD501，其特征在于：所述小球藻SD501的分类命名为索罗金小球藻（Chlorella sorokiniana），保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），其保藏编号为CCTCC NO：M 2022876，保藏日期2022年6月13日。 |
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| 说明书全文 | 一种高耐受氨、酚类的小球藻及用途和制备方法技术领域背景技术[0002] 糠醛渣是生物质类物质(如玉米芯、玉米秆、稻壳、棉籽壳)中的聚戊糖成分水解生产糠醛产生的生物质类废弃物。作为生物质水解过程中产生的废弃物，糠醛渣中的盐分含量高、呈酸性，因此大量堆积会对大气、土壤和河流产生污染。但与此同时，糠醛渣中还含有大量的纤维素、木质素，具有良好的再利用价值。因此，如何合理地利用糠醛渣，在消除环境污染的同时，增加其经济附加效益，是糠醛渣资源化利用的关键所在。目前，糠醛渣的资源化利用方向主要包括：制取多孔吸附碳材料、改良碱性土壤、矿区土壤修复、农作物培育和化学加工等方向。 [0003] 发明人对糠醛渣进行化验分析发现，糠醛渣中含有大量微生物生长需要的营养物质，具体包括：有机质含量764.50～781.30g/kg,全氮4.50～5.20g/kg,全磷0.72～0.74g/kg,全钾12.20～15.48g/kg，碱解氮328～533mg/kg，P2O5 109～393mg/kg，K2O 700～750mg/kg，有效硼、锰、锌、铁含量分别是1.50、9.80、1.24、14.20μg/g。然而，由于糠醛渣中的酚醛类含量高达2‑3％，严重限制了其在这方面的应用。 [0004] 藻类植物的种类繁多，范围极广，对环境条件要求不严，适应性较强，在只有极低的营养浓度、极微弱的光照强度和相当低的温度下也能生活。其中，小球藻是世界公认的“绿色黄金”，蛋白质含量高达干细胞质量的50％以上，是优质的蛋白质来源。此外，小球藻还含有丰富的不饱和脂肪酸、多种维生素及矿物质，不但具有提高机体免疫力、抗肿瘤等重要生理及医疗作用，而且营养价值极高，可以广泛用于人体的营养保健领域及动物养殖行业。为了降低小球藻的生产成本，人们尝试采用廉价的原料、多种培养方式来培养小球藻。发明专利201610976321.4公开了“一种利用秸秆纤维水解液培养微藻的方法及其应用”。该发明以秸秆为原料，采用机械法、碱法或亚硫酸铵法处理秸秆，去除木质素，添加纤维素酶后制得纤维素水解液。在此基础上，通过添加必需无机营养元素后用作小球藻的异养培养基质。发明专利申请201710248657.3公开了“一种利用秸秆培养异养小球藻的方法”。该发明采用物理法如汽爆法或球磨法破碎秸秆，采用纤维素酶、半纤维素进行酶解产糖，作为小球藻异养培养的碳源。发明专利201811569914.4公开了“一种低成本、高生物量和高蛋白含量的蛋白核小球藻培养方法”。该发明利用碳重离子诱变菌株，并用诱变菌株进行秸秆糖化、以秸秆糖化液作为廉价原料培养小球藻。但目前，还没有采用糠醛渣发酵培养小球藻的相关报道。 发明内容[0005] 为了解决糠醛生产过程中产生的糠醛渣污染问题，同时实现糠醛渣废料的高值化利用。本发明首先利用诱变结合实验室定向进化技术筛选获得一种能耐受高酚醛及氨水浓度的小球藻株，并使用经过高浓氨水及酶水解后的糠醛渣处理液对该小球藻株进行培养，获得高蛋白的小球藻培养物。 [0006] 本发明的技术方案包括： [0007] 一种高耐受氨、酚类的小球藻(Chlorella sorokiniana SD501)，已保藏于位于湖北省武汉市武昌区武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M2022876，保藏日期为2022年6月13日。 [0008] 如前所述的小球藻株SD501在利用糠醛渣处理液发酵培养的应用。所述的应用具体为：以小球藻株SD501为出发藻株，利用糠醛渣处理液进行发酵培养，获得小球藻培养物。其中，所述的糠醛渣处理液为：糠醛渣经氨水处理及纤维素酶酶解后获得的液体。所述的糠醛渣处理液中，酚醛浓度为0.5‑2％，氨浓度为1‑1.5％。 [0009] 利用糠醛渣处理液高密度发酵培养小球藻的方法，包括以下步骤： [0010] (1)将小球藻藻株SD501按照3‑5％(v/v)的接种量，接种于BG11培养基中,然后在20‑30℃的温度条件、150‑200rpm转速条件下培养48‑72h，获得种子液。BG11培养基为商业途径购买得到。 [0011] (2)将步骤(1)得到的种子液按照5‑10％(v/v)的接种量，接入糠醛渣处理液中，在25‑35℃、通气量0.5‑2vvm、搅拌转速300‑800rpm下发酵120‑144h，得到发酵小球藻。 [0012] 其中，所述糠醛渣处理液采用下述方法处理得到：(1)氨水处理：将糠醛渣和氨水按一定的重量体积比装入密闭装置中，在105‑110℃的温度条件下处理90‑120min。反应结束后，去除溶解有木质素的氨水黑液，保留固体渣；固体渣中氨含量为1‑1.5％，总酚含量为0.5‑2％。所述糠醛渣和氨水的重量体积比为1:3‑1:8。所述的氨水是浓度为25％的市售氨水。(2)纤维素酶酶解：将步骤(1)得到的固体渣转移至厌氧装置中，添加适量纤维素酶，然后在pH5.5，温度50℃的条件下反应时间12h，即得到糠醛渣处理液。所述纤维素酶的添加量为5‑10FPU。 [0013] 一种获得前述高耐受氨、酚类的小球藻SD501的方法，包括以下步骤： [0015] (2)定向进化I：将重离子诱变后的细胞接种到葡萄糖和氨浓度分别为60g/L和0.3％的BG11培养基中；当细胞生长进入稳定期，将2％(v/v)培养物重新接种到新鲜的前述BG11培养基中，重复5轮；然后将2％(v/v)的培养物接种到氨浓度为0.5％的BG11培养基中，重复5轮；如此反复直至BG11培养基中氨浓度达到1.5％；得到终点藻株小球藻M。 [0016] (3)定向进化II：将小球藻M藻株接种到葡萄糖和总酚浓度分别为60g/L和0.1％的BG11培养基中；采用与定向进化I相似的进化方案，每次将总酚浓度提高0.2％，如此反复直至BG11培养基中总酚浓度达到2％；最终获得高耐受氨、酚类的小球藻SD501。 [0017] 本发明的有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优势： [0018] (1)本发明利用诱变结合实验室定向进化技术进行筛选，获得一种能耐受高酚醛及氨水浓度的小球藻株，填补了现有技术的空白。所述的小球藻藻株使用高浓氨水及酶水解后的糠醛渣处理液进行培养，获得高蛋白的小球藻培养物。 [0019] (2)本申请所述的小球藻在利用糠醛渣处理液发酵培养的应用，不但解决了糠醛生产过程中产生的糠醛渣污染问题，环境友好；还同时实现了糠醛渣废料的高值化利用，具有重要的经济效益前景。 [0020] (3)本发明所述的耐受高氨、酚类的小球藻株用于糠醛渣处理液发酵培养，有效解决了现有技术中需要对预处理液进行稀释或在培养体系中额外添加小球藻生长必需的其他元素的问题，不但成本低，而且操作简单，降低了工艺的复杂度，应用前景广阔。 具体实施方式[0021] 实施例1：高耐受氨、酚类小球藻的定向选育 [0022] (1)重离子诱变：使用BG11培养基培养小球藻Chlorella sorokiniana 4天，随后12 6+ 进行重离子束 C 辐射诱变，离子束能量为80Mev/u，辐射强度为120Gy。 [0023] (2)定向进化：将重离子诱变后的细胞接种到含有葡萄糖和氨浓度分别为60g/L和0.3％的BG11培养基中。当细胞生长进入稳定期时，将2％(v/v)培养物重新接种到新鲜上述培养基中，如此重复5轮。然后将2％(v/v)的培养物接种到氨浓度提升至0.5％的前述培养基中，再次重复5轮。如此反复直至培养基中氨浓度达到1.5％。实验进化进行了大约35轮循环，持续大约150天，终点藻株被命名为Chlorella sorokiniana M，即小球藻M。 [0024] (3)第二阶段定向进化：将小球藻M藻株接种到含有葡萄糖和总酚浓度分别为60g/L和0.1％的BG11培养基中。采用与第一阶段相似的进化方案，每次将总酚浓度提高0.2％，如此反复直至培养基中总酚浓度达到2％。本轮实验进化进行了50轮循环，持续约210天。最终获得一株高耐受氨、酚类小球藻Chlorella sorokiniana SD501，即小球藻SD501。 [0025] 实施例2：糠醛渣处理液的处理方法 [0026] (1)氨水处理：将50kg糠醛渣装入蒸球中，向蒸球中注入15％浓度的氨水400L。向蒸球内通入热蒸汽，使温度在105℃维持90min。反应结束后，去除溶解有木质素的氨水黑液，保留固体渣。使用滴定法测量该固体渣中氨含量为1％，利用福林‑酚比色法测定总酚含量(李巨秀，食品科学，2009(30)，292)，根据测定结果，总酚类(愈创木酚、紫丁香酚、对羟基苯酚)的含量为0.5％。 [0027] (2)纤维素酶酶解：将氨水预处理后的固体渣转移至厌氧罐中，纤维素酶添加量为10FPU，pH5.5，温度50℃，反应时间12h，得到以葡萄糖为主的糠醛渣处理液，用高效液相色谱测定的葡萄糖浓度达到35g/L。 [0028] 实施例3：糠醛渣处理液对于不同小球藻生长的影响 [0029] 对野生型小球藻和本申请获得的高耐受氨、酚类的小球藻SD501分别进行自养培养和异养培养，并比较其获得的小球藻生物量(详见表1)。具体培养方式如下：①将藻株接种于BG11培养基中，接种量5％(v/v)，在30℃，以200rpm的转速，培养48h，获得种子液。②将种子液接入糠醛渣处理液或其它培养基中，接种量10％(v/v)，在30℃，通气量2vvm，搅拌转速800rpm，发酵120h。 [0030] 其中，对照组1，采用野生型小球藻和自养培养方式，步骤②采用BG11培养基，光强5000‑7000lux。 [0031] 对照组2，采用野生型小球藻和异养培养方式，步骤②采用添加10g/L葡萄糖的BG11培养基，避光培养。 [0032] 实验组1，采用野生型小球藻和自养培养方式，步骤②采用糠醛渣处理液作为培养基，光强5000‑7000lux。 [0033] 实验组2：采用野生型小球藻和异养培养方式，步骤②采用实施例2获得的糠醛渣处理液作为培养基，避光培养。 [0034] 实验组3：采用本申请获得DE高耐受氨、酚类的小球藻SD501和异养培养方式，步骤②采用实施例2获得的糠醛渣处理液作为培养基，避光培养。 [0035] 表1.糠醛渣处理液对于不同小球藻生长的影响 [0036] 组别 培养时间(天) 生物量(g/L)对照组1 10d 1.3 对照组2 5d 6.4 实验组3 10d ‑ 实验组4 5d ‑ 实验组5 5d 18 [0037] 由表1可知，野生型小球藻可以在以BG11培养基中进行自养或异养生长，生物量分别为1.3g/L和6.4g/L。然而，无论采用自养还是异养方式，野生型小球藻均不能在糠醛渣处理液中生长。而本发明获得的高耐受氨、酚类的小球藻，则可以在糠醛渣处理液中正常生长，且培养5天后，生物量可以达到18g/L，远超过野生型小球藻在以BG11培养基中的生物量，这说明，本申请获得的高耐受氨、酚类的小球藻，不但实现了小球藻在糠醛渣处理液中的正常生长，填补了现有技术的空白，而且生物量也得到了显著的提升，取得了意料不到的技术效果。 [0038] 实施例4：利用糠醛渣处理液培养高耐受氨、酚类的小球藻 [0039] 与实施例3不同的是， [0040] 糠醛渣的处理方法：(1)氨水处理：将100kg糠醛渣装入蒸球中，向蒸球中注入25％浓度的市售氨水800L。向蒸球内通入热蒸汽，使温度在110℃维持120min。反应结束后，去除溶解有木质素的氨水黑液，保留固体渣。该固体渣中氨含量为1.5％，总酚含量(愈创木酚、紫丁香酚、对羟基苯酚)为2％。(2)纤维素酶酶解：将氨水预处理后的固体渣转移至厌氧罐中，纤维素酶添加量为10FPU，pH5.5，温度50℃，反应时间12h，得到以葡萄糖为主的糠醛渣处理液，用高效液相色谱测定的葡萄糖浓度达到83g/L。 [0041] 培养高耐受小球藻的方法： [0042] ①将保存的藻株接种于BG11培养基中，接种量3％(v/v)，在20℃，以150rpm的转速，培养72h，获得种子液。 [0043] ②将种子液接入糠醛渣处理液中，接种量5％(v/v)，在25℃，通气量0.5vvm，搅拌转速300rpm，发酵144h，生物量为43g/L。 [0044] 实施例5：利用糠醛渣处理液培养高耐受氨、酚类的小球藻 [0045] 与实施例3不同的是， [0046] 其糠醛渣氨水处理方法为：(1)氨水处理：将95kg糠醛渣装入蒸球中，向蒸球中注入20％浓度的市售氨水700L。向蒸球内通入热蒸汽，使温度在108℃维持110min。反应结束后，去除溶解有木质素的氨水黑液，保留固体渣。该固体渣中氨含量为1.2％，总酚含量(愈创木酚、紫丁香酚、对羟基苯酚)为1.5％。(2)纤维素酶酶解：将氨水预处理后的固体渣转移至厌氧罐中，纤维素酶添加量为5FPU，pH5.5，温度50℃，反应时间12h，得到以葡萄糖为主的糠醛渣处理液，用高效液相色谱测定的葡萄糖浓度达到75g/L。 [0047] 培养高耐受小球藻的方法： [0048] ①将保存的藻株接种于BG11培养基中，接种量4％(v/v)，在25℃，以180rpm的转速，培养60h，获得种子液。 [0049] ②将种子液接入糠醛渣处理液中，接种量8％(v/v)，在30℃，通气量1vvm，搅拌转速500rpm，发酵130h，生物量为36g/L。 [0050] 实施例6：利用糠醛渣处理液培养高耐受氨、酚类的小球藻 [0051] 与实施例3不同的是， [0052] 其糠醛渣氨水处理方法为：(1)氨水处理：将80kg糠醛渣装入蒸球中，向蒸球中注入15％浓度的市售氨水400L。向蒸球内通入热蒸汽，使温度在106℃维持100min。反应结束后，去除溶解有木质素的氨水黑液，保留固体渣。该固体渣中氨含量为1％，总酚含量(愈创木酚、紫丁香酚、对羟基苯酚)为2.0％。(2)纤维素酶酶解：将氨水预处理后的固体渣转移至厌氧罐中，纤维素酶添加量为8FPU，pH5.5，温度50℃，反应时间12h，得到以葡萄糖为主的糠醛渣处理液，用高效液相色谱测定的葡萄糖浓度达到63g/L。 [0053] 培养高耐受小球藻的方法： [0054] ①将保存的藻株接种于BG11培养基中，接种量5％(v/v)，在30℃，以200rpm的转速，培养48h，获得种子液。 [0055] ②将种子液接入糠醛渣处理液中，接种量6％(v/v)，在35℃，通气量1.5vvm，搅拌转速800rpm，发酵120h，生物量为32g/L。 [0056] 实施例7：利用糠醛渣处理液培养高耐受氨、酚类小球藻 [0057] 与实施例3不同的是， [0058] 其糠醛渣氨水处理方法为：(1)氨水处理：将60kg糠醛渣装入蒸球中，向蒸球中注入25％浓度的市售氨水180L。向蒸球内通入热蒸汽，使温度在105℃维持90min。反应结束后，去除溶解有木质素的氨水黑液，保留固体渣。该固体渣中氨含量为1.1％，总酚含量(愈创木酚、紫丁香酚、对羟基苯酚)为1.8％。(2)纤维素酶酶解：将氨水预处理后的固体渣转移至厌氧罐中，纤维素酶添加量为10FPU，pH5.5，温度50℃，反应时间12h，得到以葡萄糖为主的糠醛渣处理液，用高效液相色谱测定的葡萄糖浓度达到47g/L。 [0059] 培养高耐受小球藻的方法： [0060] ①将保存的藻株接种于BG11培养基中，接种量3％(v/v)，在30℃，以150rpm的转速，培养72h，获得种子液。 [0061] ②将种子液接入糠醛渣处理液中，接种量10％(v/v)，在30℃，通气量2vvm，搅拌转速300rpm，发酵144h，生物量为24g/L。 [0062] 综上可知，本发明利用诱变结合实验室定向进化技术筛选，获得一种能耐受高酚醛及氨水浓度的小球藻株Chlorella sorokiniana SD501。所述小球藻使用经过高浓氨水及酶水解后的糠醛渣处理液对所述小球藻株SD501进行培养，能够获得高蛋白的小球藻培养物。根据实施例4‑7可知，其生物量可达24‑43g/L，主要与糠醛渣处理液中的葡萄糖浓度有关。与野生型小球藻不能在糠醛渣处理液中生长相比，所述小球藻株SD501不仅能够在糠醛渣处理液中的正常生长，填补了现有技术的空白，而且生物量也得到了显著的提升，取得了意料不到的技术效果。 [0063] 此外，采用糠醛渣处理液培养小球藻株SD501不需要对预处理液进行稀释，也不需要在培养体系中额外添加小球藻生长所必需的其他元素，降低了工艺的复杂度。同时，采用本申请所述的小球藻株SD501，实现了糠醛渣废料的高值化利用，减少了糠醛生产过程中产生的糠醛渣污染问题，具有极为重要的产业化应用价值。 |
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