[0001] 乙醛酸和其它酮酸例如丙酮酸是生产各种农用化学品、药物和香料的重要中间体。通常商业上生产乙醛酸采用氧化化学或电化学。电化学生产包括将草酸还原或将乙二醛阳极氧化以形成乙醛酸，而化学氧化一般包括在存在强酸例如HNO3的情况下将乙二醛氧化。这些商业化过程的结果是产生含有各种有毒的酸和重金属的废料流。

[0002] 乙醇酸氧化酶是从各种来源获得的酶，所述来源包括绿叶植物和哺乳动物细胞，该酶催化乙醇酸氧化为乙醛酸，伴随产生过氧化氢。例如，Tolbert等人，J.Biol.Chem.，181：905(1949)报道了一种从烟草叶子中提取的酶，其通过乙醛酸的中间体形成而催化乙醇酸氧化为甲酸和CO2。添加某些化合物，例如1，2-乙二胺，限制中间体乙醛酸的进一步氧化。氧化在pH大约为8时进行，通常使用浓度大约为3-40mM(毫摩)的乙醇酸。据报道乙醇酸盐氧化的最佳pH为pH 8.9。据报道草酸(100mM)抑制乙醇酸氧化酶的催化作用。类似地，Richardson和Tolbert，J.Biol.Chem.，236：1280(1961)报道：使用从烟草、甜菜、瑞士甜菜、菠菜或大鼠肝脏中分离的酶，在乙醇酸氧化酶催化的乙醇酸氧化为乙醛酸过程中形成了草酸。Richardson和Tolbert，J.Biol.Chem.，236：1280(1961)还表明含有三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)的缓冲剂抑制乙醇酸氧化酶催化的乙醇酸氧化过程中草酸的形成。
Clagett等人，J.Biol.Chem.，78：977(1949)报道：乙醇酸氧化酶催化的使用氧气氧化乙醇酸的最佳pH为大约7.8-8.6，最佳温度为35-40℃。

[0003] 重组DNA技术的最新进展以及编码菠菜乙醇酸氧化酶的cDNA的分离(见Volokita等人，J.Biol.Chem.，262：15825(1987))使得能够构建意欲用作备选的经济性的酶来源的微生物菌株。例如，酵母提供了在商业应用上超过大肠杆菌和其它细菌的几个优点。酵母一般可以生长至比细菌更高的密度，并且容易适合于连续发酵处理。例如，已经报道巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)可以生长至超过100g/L的细胞密度(美国专利号4,414,329)。酵母宿主的其它优点包括以下事实：生物的很多关键功能，例如氧化磷酸化，位于细胞器内，因此不暴露于外源酶产物过表达的可能有害效应。此外，酵母看来能够将表达的多肽产物糖基化，其中这样的糖基化对于多肽产物的生物活性是重要的。

[0004] Zelitch和Ochoa，J.Biol.Chem.，201：707(1953)，和Robinson等 人，J.Biol.Chem.，237：2001(1962)报道了在菠菜乙醇酸氧化酶催化的乙醇酸氧化过程中由于H2O2与乙醛酸的非酶促反应引起的甲酸和CO2的形成。他们观察到加入过氧化氢酶(催化H2O2的分解的酶)，通过抑制甲酸和CO2的形成极大地提高了乙醛酸的收率。关于在酵母中生产乙醛酸，当乙醇酸和氧在存在氨基甲基磷酸和催化剂(遗传工程化的微生物酵母转化体，其表达来自菠菜的酶乙醇酸氧化酶((S)-2-羟基-酸氧化酶，EC 1.1.3.15)和过氧化氢酶(EC1.11.1.6))的情况下在水溶液中反应时，产生乙醛酸(见美国专利号5,693,490)。

[0005] 发明概述

[0006] 本发明提供了适合用于生物催化的微生物细胞(例如细菌和酵母细胞)或其裂解液或粗提物的喷雾干燥制剂。微生物细胞，例如毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)或大肠杆菌的喷雾干燥使得细胞适合用于生物催化：通过在不存在渗透试剂的情况下打开细胞壁或细胞膜以允许底物和产物自由地移入和移出细胞。因此，可以在微生物中表达(例如重组表达)用于生物催化的一种或多种酶，并且那些细胞可以被喷雾干燥。喷雾干燥产生多孔的但具备结构完整性的微生物细胞，例如酶不轻易从喷雾干燥的细胞中浸出(leach out)，产生在室温下稳定的酶，并且允许在水中而不是在特定pH的缓冲液中处理。稳定性以及不从喷雾干燥的微生物细胞中浸出酶使得能够在一段时间内重复使用细胞，例如连续并延长使用喷雾干燥的细胞的单一制剂。在一个实施方式中提供了具有用于偶联反应的至少两种酶的喷雾干燥的微生物细胞。在一个实施方式中提供了适合生产丙酮酸盐或乙醇酸盐的喷雾干燥的微生物细胞，例如酵母细胞，诸如表达乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶的那些。在一个实施方式中，适合生产丙酮酸盐或乙醇酸盐的喷雾干燥的微生物细胞，例如酵母细胞具有重组乙醇酸氧化酶，例如异源乙醇酸氧化酶。在一个实施方式中，适合生产丙酮酸盐或乙醇酸盐的喷雾干燥的微生物细胞具有重组过氧化氢酶，例如异源过氧化氢酶。例如，在一个实施方式中，喷雾干燥的毕赤酵母属的细胞具有菠菜乙醇酸氧化酶和酵母属过氧化氢酶T。但是，本发明不局限于特定的微生物和/或特定的酶催化的反应，因为考虑到微生物，不论是重组的还是非重组的，一般都可以被喷雾干燥并产生用于生物催化的稳定的(一种或多种)酶的来源。

[0007] 使用喷雾干燥的微生物细胞可以减少基于生物催化剂的产物生产的处理步骤的数目。例如，使用喷雾干燥的微生物细胞，用于乙醇酸氧化酶介导的几种产物的生产步骤的数目已经减少了至少2-3倍，从而提供更简单的过程和显著的成本优势。在一个实施方式中，可以直接从发酵罐将微生物细胞悬浮液喷雾干燥，从而省略固体/液体分离步骤。例如，可以将直接来自发酵罐的含有细胞的溶液(不用分离)喷雾干燥或者在喷雾干燥之前首先进行细胞分离和重悬，例如重悬于水或缓冲液中。

[0008] 本发明提供了制备完整的微生物细胞生物催化剂制剂的方法。该方法包括：提供微生物细胞悬浮液并在有效产生适合于生物催化的喷雾干燥的微生物细胞制剂的条件下将微生物细胞悬浮液喷雾干燥。在一个实施方式中，提供了酵母的喷雾干燥制剂。在一个实施方式中，提供了毕赤酵母属或酵母属(Saccharomyces)的喷雾干燥制剂。在一个实施方式中，酵母的喷雾干燥制剂具有至少一种由表达盒编码的重组酶，所述表达盒具有可操作连接到所述酶的开放读框的启动子。令人惊奇的是，制备喷雾干燥的微生物细胞生物催化剂的方法不需要洗涤剂或其它膜渗透化试剂处理，例如，不需要阳离子表面活性剂(例如苯扎氯铵(benzylalkonium chloride)(BAC))处理或酶稳定剂，例如蔗糖、海藻糖、硫醇或其它多羟基化合物。

[0009] 还提供了制备酶反应的产物的方法。该方法包括将本发明的喷雾干燥制剂与水溶液在生成酶催化反应的一种或多种产物的条件下合并，所述水溶液包含喷雾干燥制剂中存在的酶的底物。在一个实施方式中，产物是丙酮酸或其盐，其可用于食品、药物和农用化学产品，例如膳食补剂、化妆品或加氧溶剂，以及生产氨基酸、腙、茚虫威(indoxocarb)和吲哚-3-丙酮酸。

[0010] 例如，将具有重组乙醇酸氧化酶的酵母的喷雾干燥制剂与包含所述酶的底物的水溶液在生成酶催化反应产物的条件下合并。然后，从水性介质中分离反应的产物，例如丙酮酸盐、乙醛酸盐、酮酸或手性羟基酸。

[0011] 在一个实施方式中，本发明提供了具有酶的微生物的喷雾干燥制剂，所述酶提供手性拆分或对映异构体选择性。附图说明

[0012] 图1.乙醇酸氧化酶反应。

[0013] 图2A.使用酵母和苯扎氯铵(BAC)处理生产乙醇酸氧化酶反应产物的过程。

[0014] 图2B.使用喷雾干燥的酵母细胞生产乙醇酸氧化酶反应产物的过程。

[0015] 图3.乙醇酸氧化酶活性相对于温度。

[0016] 图4.乙醇酸氧化酶活性相对于进料速率。

[0017] 图5.乙醇酸氧化酶活性相对于进料浓度。

[0018] 图6.过氧化氢酶活性相对于温度。

[0019] 图7.过氧化氢酶活性相对于进料速率。

[0020] 图8.过氧化氢酶活性相对于进料浓度。

[0021] 图9.乙醇酸氧化酶活性相对于温度。

[0022] 图10.乙醇酸氧化酶活性相对于进料浓度。

[0023] 图11.乙醇酸氧化酶活性相对于温度*进料浓度。

[0024] 图12.过氧化氢酶活性相对于温度。

[0025] 图13.过氧化氢酶活性相对于进料浓度。

[0026] 图14.过氧化氢酶活性相对于温度*进料浓度。

[0027] 图15.喷雾干燥的酵母细胞中的乙醇酸氧化酶活性。

[0028] 图16.喷雾干燥的酵母细胞中的过氧化氢酶活性。

[0029] 图17.喷雾干燥的酵母细胞中的乙醇酸氧化酶稳定性。

[0030] 图18.喷雾干燥的酵母细胞中的过氧化氢酶稳定性。

[0031] 图19.经过洗涤剂渗透化的喷雾干燥的酵母细胞中的乙醇酸氧化酶活性。

[0032] 图20.经过洗涤剂渗透化的喷雾干燥的酵母细胞中的过氧化氢酶活性。

[0033] 图21.测试存在或不存在从喷雾干燥的酵母细胞中浸出的乙醇酸氧化酶。

[0034] 图22.测试存在或不存在从喷雾干燥的酵母细胞中浸出的过氧化氢酶。

[0035] 图23.具有乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶的喷雾干燥的酵母细胞的对映异构体特异性。

[0036] 图24.大肠杆菌裂解液的分析。泳道1)Rosetta gami B(DE3)/pET-GO#11的0.5μL*的不可溶组分 ；泳道2)MW标记；泳道3)是Rosetta gami B(DE3)/pET-GO#11的2.0μL的细胞提取物(7.4μg蛋白质)；泳道4)Rosettagami B(DE3)/pET-GO#11的2.0μL的不可溶组分；泳道5)对照菌株Rosetta gami B(DE3)/pET-32a的5.3μL的细胞提取物(7.4μg蛋白质)；泳道6)Rosetta gami B(DE3)/pET-32a的5.3μL的不可溶组分。*是指通过弗氏压碎器(French Press)裂解细胞之后，将裂解液在25,800×g离心10分钟，将得到的上清液(大约10mL)保存作为细胞提取物。将沉淀悬浮于10mLPBS中并认为是不可溶组分。

[0037] 图25A-B.A)Rosetta gami B(DE3)/pET-GO#11细胞提取物中的乙醇酸氧化酶活性。B)Rosetta gami B(DE3)细胞提取物中的乙醇酸氧化酶活性。

[0038] 图26.喷雾干燥的或吸干的Rosetta gami B(DE3)/pET-GO#11细胞中的乙醇酸氧化酶活性。

[0039] 图27.喷雾干燥的或对照的酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞中的过氧化氢酶活性。

[0040] 发明详述

[0041] 定义

[0042] 本文所用的术语“核酸分子”、“多核苷酸”或“核酸序列”是指包含生产多肽或蛋白质前体必需的编码序列的核酸，DNA或RNA。编码的多肽可以是全长多肽、其片段(小于全长)、或全长多肽或其片段与另一个多肽的融合体，产生融合多肽。

[0043] 本文所用的“核酸”是共价连接的核苷酸序列，其中一个核苷酸的戊糖的3’位通过磷酸二酯键连接到紧邻的核苷酸的戊糖的5’位，并且其中核苷酸残基(碱基)以特定序列连接，即核苷酸的线状顺序。本文所用的“多核苷酸”是在长度上含有大约100个核苷酸以上的序列的核酸。本文所用的“寡核苷酸”或“引物”是短的多核苷酸或多核苷酸的一部分。寡核苷酸通常含有大约2个至大约100个碱基的序列。有时使用词语“寡(oligo)”替代词语“寡核苷酸”。

[0044] 核酸分子被称为具有“5’-端”(5’末端)和“3’-端”(3’末端)，因为核酸磷酸二酯键产生于取代的单核苷酸的戊糖环的5’碳和3’碳。多核苷酸的末端(该末端上的新键将连接到5’碳)是其5’端核苷酸。多核苷酸的末端(该末端上的新键将连接到3’碳)是其3’端核苷酸。本文所用的末端核苷酸是在3’或5’端的末位的核苷酸。

[0045] DNA分子被称为具有“5’末端”和“3’末端”，因为单核苷酸以如下方式反应以形成寡核苷酸：一个单核苷酸戊糖环的5’磷酸盐通过磷酸二酯键以一个方向与其相邻的3’氧连接。因此，如果寡核苷酸的5’磷酸盐不连接到单核苷酸的戊糖环的3’氧，则寡核苷酸的末端被称作“5’末端”；如果它的3’氧不连接到随后的单核苷酸的戊糖环的5’磷酸盐，则被称作“3’末端”。

[0046] 如本文所用，即使核酸序列在较大的寡核苷酸或多核苷酸内部，也可以被称作具有5’和3’末端。在线状或环状DNA分子中，不连续的元件被称作“下游”或3’元件的“上游”或5’。这个命名法反映出以下事实：转录沿着DNA链以5’至3’方式进行。通常，指导连接的基因(例如开放读框或编码区域)转录的启动子或增强子元件一般位于编码区域的5’或上游。但是，即使当位于启动子元件和编码区域的3’时，增强子元件仍然可以显示其效应。转录终止和多腺苷化信号位于编码区域的3’或下游。

[0047] 本文所用的术语“密码子”是基础遗传编码单元，其由三个核苷酸的序列组成，指明引入到多肽链中的特定氨基酸，或起始或终止信号。当用于指称结构基因时，术语“编码区域”是指作为mRNA分子翻译的结果，编码新生多肽中发现的氨基酸的核苷酸序列。通常，编码区域通过编码起始子蛋氨酸的核苷酸三联体“ATG”结合在5’侧上，并且通过终止密码子(例如，TAA、TAG、TGA)结合在3’侧上。在一些情况下，还已知编码区域由核苷酸三联体“TTG”起始。

[0048] 术语“基因”是指包含编码序列并且任选包含从DNA序列产生多肽所需的控制序列的DNA序列。

[0049] 本文所用的术语“异源的”核酸序列或蛋白质是指相对于参考序列具有不同来源的序列，例如，起源于外源物种；或者，即使来源于同一物种，其可以从最初形式经过了实质性修饰。

[0050] 已知核酸具有不同类型的突变。“点”突变是指在来自野生型序列的单一碱基位置的核苷酸序列的改变。突变还可以指一个或多个碱基的插入或缺失，从而核酸序列不同于参考序列，例如野生型序列。

[0051] 本文所用的术语“杂交(hybridize)”和“杂交(hybridization)”是指对于靶核酸互补的序列的退火，即，两个含有互补序列的核酸聚合物(多核苷酸)通过碱基配对退火的能力。术语“退火”和“杂交”在全文中可相互替换使用，并且意欲包括互补序列与靶核酸之间的任何特异的和可再生的相互作用，包括仅有部分互补性的区域的结合。一些通常不存在于天然核酸中的碱基可以包括在本发明的核酸中，并且包括，例如，肌苷和7-脱氮鸟嘌呤(7-deazaguanine)。核酸技术领域的技术人员可以通过考虑一些变量，包括，例如，互补序列的长度、寡核苷酸的碱基组成和序列、离子强度和错配碱基对的发生率，凭经验确定双链的稳定性。核酸双链的稳定性根据熔解温度或“Tm”测定。特定核酸双链在特定条件下的Tm是指平均半数碱基对已经解离的温度。

[0052] 术语“载体”用于指DNA片段可以被插入或克隆进入其中的核酸分子，并且可用于将(一个或多个)DNA片段转移进入细胞并能在细胞中复制。载体可以源自质粒、噬菌体、病毒、柯斯载体(cosmid)等等。

[0053] 本文所用的术语“重组载体”和“表达载体”是指这样的DNA或RNA序列：其含有想要的编码序列和可操作连接的编码序列在特定宿主生物中表达所必需的合适的DNA或RNA序列。原核表达载体包括启动子、核糖体结合位点、用于在宿主细胞中自主复制的复制起始点，还可能包括其它序列，例如可选的操纵子序列、可选的限制性酶切位点。启动子定义为指导RNA聚合酶结合到DNA并启动RNA合成的DNA序列。真核表达载体包括启动子、可选的多腺苷化信号和可选的增强子序列。

[0054] 具有编码蛋白质或多肽的核苷酸序列的多核苷酸是指包含基因的编码区域的核酸序列，或者换言之，核酸序列编码基因产物。编码区域可以以cDNA、基因组DNA或RNA的形式存在。当以DNA的形式存在时，寡核苷酸可以是单链的(即，有义链)或双链的。如果需要进行转录的合适起始和/或初级RNA转录物的正确加工，可以将合适的控制元件，例如增强子/启动子、剪接点、多腺苷化信号等，置于靠近基因的编码区域。备选地，用于本发明的表达载体中的编码区域可以包含内源增强子/启动子、剪接点、间插序列、多腺苷化信号等。在其它实施方式中，编码区域可以包含内源和外源控制元件的组合。

[0055] 术语“转录调控元件”或“转录调控序列”是指控制(一个或多个)核酸序列表达的一些方面的遗传元件或序列。例如，启动子是促进可操作连接的编码区域的转录起始的调控元件。其它的调控元件包括但不限于转录因子结合位点、剪接信号、多腺苷化信号、终止信号和增强子元件。

[0056] 真核生物细胞中的转录控制信号包括“启动子”和“增强子”元件。启动子和增强子由DNA序列的短序列(arrays)组成，其与参与转录的细胞蛋白质特异性地相互作用。已经从多种真核来源，包括酵母、昆虫和哺乳动物细胞中的基因中分离出了启动子和增强子元件。还从病毒中分离出了启动子和增强子元件，并且在原核生物中也发现了类似的控制元件，例如启动子。特定启动子和增强子的选择取决于用于表达目标蛋白质的细胞类型。一些真核启动子和增强子具有广泛的宿主范围，而其它的只在有限的细胞类型亚类中是有功能的。例如，SV40早期基因增强子在来自许多哺乳动物物种的众多细胞类型中是非常活跃的，并且已经被广泛用于哺乳动物细胞中蛋白质的表达。在众多哺乳动物细胞类型中活跃的启动子/增强子元件的另外两个例子是来自人类延伸因子1基因以及劳氏肉瘤病毒和人类巨细胞病毒的长末端重复的那些。

[0057] 术语“启动子/增强子”代表这样的DNA片段：其含有能够同时提供启动子和增强子功能(即，由如上所述的启动子元件和增强子元件提供的功能)的序列。例如，逆转录病毒的长末端重复同时具有启动子和增强子功能。增强子/启动子可以是“内源的”或“外源的”或“异源的”。“内源的”增强子/启动子是与基因组中给定基因天然连接的增强子/启动子。“外源的”或“异源的”增强子/启动子是通过遗传操作(即分子生物学技术)方式被置于毗邻基因的增强子/启动子，从而该基因的转录由连接的增强子/启动子所指导。

[0058] 表达载体上“剪接信号”的存在通常引起真核宿主细胞中重组转录物的较高水平的表达。剪接信号介导从初级RNA转录物中除去内含子，并且由剪接供体和受体位点组成。通常使用的剪接供体和受体位点是来自SV40的16S RNA的剪接点。

[0059] 在真核细胞中有效表达重组DNA序列需要指导产生的转录物的有效终止和多腺苷化的信号的表达。转录终止信号一般在多腺苷化信号的下游发现，并且在长度上是几百个核苷酸。本文所用的术语“poly(A)位点”或“poly(A)序列”代表同时指导新生RNA转录物的终止和多腺苷化的DNA序列。重组转录物的有效多腺苷化是理想的，因为缺少poly(A)尾巴的转录物是不稳定的并迅速降解。表达载体中所用的poly(A)信号可以是“异源的”或“内源的”。内源的poly(A)信号是在基因组的给定基因的编码区域的3’末端天然发现的那些。异源的poly(A)信号是从一个基因中分离出来并被置于另一个基因的3’的那些。通常使用的异源的poly(A)信号是SV40 poly(A)信号。SV40 poly(A)信号包含于237bp BamH I/Bcl I限制片段中并同时指导终止和多腺苷化。

[0060] 真核表达载体还可以包含“病毒复制子”或“病毒复制起点”。病毒复制子是允许载体在表达合适复制因子的宿主细胞的染色体外复制的病毒DNA序列。在表达合适的病毒4
T抗原的细胞中，含有SV40或多瘤病毒复制起点的载体复制至高拷贝数目(多达10 个拷贝/细胞)。相反，含有来自牛乳头瘤病毒或Epstein-Barr病毒的复制子的载体在染色体外以低拷贝数目复制(大约100个拷贝/细胞)。

[0061] 术语“体外”是指人工环境以及在人工环境内发生的过程或反应。体外环境包括但不限于，试管和细胞裂解液。术语“体内”是指天然环境(例如动物或细胞)和在天然环境内发生的过程或反应。

[0062] 术语“表达系统”是指用于确定(例如检测)目标基因的表达的任何检验或系统。分子生物学领域技术人员将理解：可以使用众多表达系统中的任意一个。可以从众多来源(例如American Type Culture Collection，Rockland，MD)获得众多合适的哺乳动物细胞。
转化或转染方法和表达载体的选择将取决于所选的宿主系统。转化和转染方法在本领域是熟知的。表达系统包括体外基因表达检验，其中将目标基因(例如，报道基因)连接到调控序列，并且用抑制或诱导基因表达的试剂处理之后监视基因的表达。可以通过任何合适的方法检测基因表达，所述方法包括但不限于，检测表达的mRNA或蛋白质(例如，报道基因的可检测产物)或通过表达目标基因的细胞的表型的可检测的变化进行。表达系统还包括这样的检验：在其中检测切割事件或其它核酸或细胞变化。

[0063] 本文所用的术语“野生型”是指具有从天然产生的来源分离而来的基因或基因产物的特征的基因或基因产物。野生型基因是在群体中最常见到的，因此被人为指定为该基因的“野生型”形式。相反，术语“突变体”是指：与野生型基因或基因产物相比时表现出序列和/或功能特征上的改变(即改变的特征)的基因或基因产物。应当注意，天然产生的突变体可以被分离；这通过以下事实鉴别：与野生型基因或基因产物相比时，它们具有改变的特征。

[0064] 当涉及核酸使用时，如在“分离的寡核苷酸”或“分离的多核苷酸”中的术语“分离的”是指从至少一个污染物中鉴别并分离出来的核酸序列，所述核酸序列在其来源中通常与该污染物结合。因此，分离的核酸以不同于其自然态中发现的形式或状态存在。相反，非分离的核酸(例如DNA和RNA)以其在自然态中的存在状态被发现。例如，给定DNA序列(例如基因)被发现存在于靠近相邻基因的宿主细胞染色体上；RNA序列(例如编码特定蛋白质的特定mRNA序列)作为与许多其它的编码多种蛋白质的mRNA的混合物被发现于细胞中。但是，分离的核酸包括，例如，处于通常表达该核酸的细胞中的这样的核酸，其中该核酸位于不同于天然细胞中的染色体位置上；或者其两侧是不同于自然态中发现的核酸序列。分离的核酸或寡核苷酸可以以单链或双链的形式存在。当分离的核酸或寡核苷酸用于表达蛋白质时，寡核苷酸至少包含有义链或编码链(即寡核苷酸可以是单链的)，但是可以包含有义链和反义链两者(即，寡核苷酸可以是双链的)。

[0065] “肽”、“蛋白质”和“多肽”是指任意的氨基酸链，不论其长度或翻译后修饰(例如糖基化或磷酸化)。本发明的核酸分子还可以编码天然产生的蛋白质或其多肽片段的变体，所述变体具有与其所来源的天然产生的(原态或野生型)蛋白质的氨基酸序列至少85％、90％、95％或99％相同的氨基酸序列。术语“融合多肽”或“融合蛋白”是指含有参考蛋白质(例如荧光素酶)的嵌合蛋白，所述嵌合蛋白在N-和/或C-端连接到一个或多个异源序列(例如非荧光素酶多肽)。在一些实施方式中，本发明的经修饰的多肽、融合多肽或全长多肽的一部分可以至少保留相应的全长功能性(非嵌合的)多肽的一些活性。在其它实施方式中，在不存在外源试剂或目标分子的情况下，本发明的经修饰的多肽、融合多肽或全长功能性多肽的一部分相对于相应的全长功能性多肽可能缺少活性。在其它实施方式中，在存在外源试剂的情况下，本发明的经修饰的多肽、融合多肽或全长功能性多肽的一部分相对于相应的全长功能性多肽可能保留至少一些活性或具有实质上相同的活性，或者备选地，缺少活性。

[0066] 由于肽键产生在第一个氨基酸残基的骨架氨基基团和第二个氨基酸残基的骨架羧基基团之间，所以说多肽分子具有“氨基端”(N-端)和“羧基端”(C-端)。当提及多肽序列时，术语“N-端”和“C-端”是指多肽的区域，其分别包括多肽的N-端和C-端区域的部分。包括多肽的N-端区域的部分的序列包括主要来自多肽链的N-端这一半的氨基酸，但不限于这样的序列。例如，N-端序列可以包括多肽序列的内部部分，所述内部部分同时包括来自多肽的N-端这一半和C-端这一半的碱基。C-端区域同样适用。N-端和C-端区域可以包括，但不必一定包括，限定多肽的N-端和C-端各自的最末尾的氨基酸。

[0067] 本文所用的术语“重组蛋白质”或“重组多肽”是指从重组DNA分子表达的蛋白质分子。相反，术语“原态蛋白质”在本文中用于指从天然产生的(即非重组)来源分离的蛋白质。可以使用分子生物学技术产生与蛋白质的原态形式相比具有相同特征的重组形式的蛋白质。

[0068] 本文所用的术语“细胞”、“细胞系”、“宿主细胞”相互替换使用，全部这些名称包括这些名称的子代或潜在的子代。“转化的细胞”意思是其中导入了本发明的核酸分子的细胞(或导入其祖先中)。可选地，可以将本发明的核酸分子导入合适的细胞系以产生稳定转染的能够产生该基因编码的蛋白质或多肽的细胞系。用于构建这样的细胞系的载体、细胞和方法在本领域是熟知的。术语“转化体”或“转化的细胞”包括源自最初转化的细胞的初级转化的细胞，而不考虑转移次数。由于有意或无意的突变，全部的子代可能在DNA内容上并不完全相同。尽管如此，具有与最初转化的细胞中所筛选的相同功能性的突变子代包括在转化体的定义中。

[0069] 术语“同源性”是指两个或多个序列之间互补性的程度。可以有部分同源性或完全同源性(即，同一性)。通常使用序列分析软件(例如，Genetics Computer Group.University of Wisconsin Biotechnology Center.1710University Avenue.Madison，WI53705的序列分析软件包)测定同源性。这样的软件通过向各种取代、缺失、插入和其它修饰分配同源性程度而匹配相似序列。保守性取代通常包括下列组内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。

[0070] 当关于多肽使用时，如“分离的蛋白质”或“分离的多肽”中的术语“分离的”是指从至少一个污染物中鉴别并分离出来的多肽，所述多肽在其来源中通常与该污染物结合。因此，分离的多肽以不同于其自然态中发现的形式或状态存在。相反，非分离的多肽(例如蛋白质和酶)以其在自然态中的存在状态被发现。

[0071] 术语“纯化的”或“纯化”意思是从目标成分，例如蛋白质或核酸中除去一些污染物的任意过程的结果。因此样品中纯化成分的百分比得以增加。

[0072] 本文所用的“纯的”意思是目标品种是存在的主要品种(即，在摩尔基准上，其比组合物中任何其它单独品种更加丰富)，优选地，基本上纯化的组分是指这样的组合物：其中目标品种包含至少约50％(基于摩尔基准)的存在的全部大分子品种。一般地，“基本上纯的”组合物将包含大约80％以上的存在于该组合物中的全部大分子品种，更优选大约85％、大约90％、大约95％和大约99％以上。最优选地，目标品种被纯化至基本上为同质(通过常规检测方法无法在组合物中检测到污染品种)，其中组合物基本上由单一大分子品种组成。

[0073] 本文所用的术语“可操作连接”是指核酸序列按照产生能够指导给定基因的转录和/或想要的蛋白质分子的合成的核酸分子的方式连接。该术语还指编码氨基酸的序列按照产生功能性(例如，酶学上有活性的、能够与结合伴侣结合、能够抑制等等)蛋白质或多肽的方式连接。

[0074] 本文所用的“标记基因”或“报道基因”是赋予表达基因的细胞不同表型从而允许将具有该基因的细胞与不具有该基因的细胞区分开来的基因。这样的基因可以编码可选择的或可筛选的标记，这取决于该标记是否赋予可以通过化学方式“选择”的特性，即，通过使用选择性试剂(例如，除草剂、抗生素等等)，或者，其是否简单地是可以通过观察或测试，即通过“筛选”而鉴别的“报道分子”特性。通过使用特定的标记基因详细地例示了本公开的要素。当然，合适的标记基因或报道基因的很多例子在本领域是已知的，可用于实施本发明。因此应当理解：以下讨论是示例性的而非穷举。根据本文公开的技术和本领域已知的一般性重组技术，本发明使改变任意基因成为可能。示例性的修饰的报道分子蛋白质由包含修饰的报道基因的核酸分子编码，所述基因包括但不限于下列基因的修饰：neo基因、β-gal基因、gus基因、cat基因、gpt基因、hyg基因、hisD基因、ble基因、mprt基因、bar基因、腈水解酶基因、吡喃半乳糖苷基因、木糖苷酶基因、胸苷激酶基因、阿拉伯糖苷酶基因、突变的乙酰乳酸合成酶基因(ALS)或乙酸(acetoacid)合成酶基因(AAS)、氨甲蝶呤抗性dhfr基因、茅草枯脱卤酶基因、赋予对于5-甲基色氨酸抗性的突变的氨基苯甲酸盐合成酶基因(WO 97/26366)、R-基因座基因、β-内酰胺酶基因、xylE基因、α-淀粉酶基因、酪氨酸酶基因、荧光素酶(luc)基因(例如海肾(Renilla reniformis)荧光素酶基因、萤火虫荧光素酶基因或磕头虫荧光素酶(点击甲虫(Pyrophorusplagiophthalamus))基因)、水母素基因、红色荧光蛋白基因、或绿色荧光蛋白基因。

[0075] 本文所列的全部氨基酸残基均为天然L-构型。与标准的多肽命名法一致，在以下对应表中显示了氨基酸残基的缩写。

[0076] 对应表

[0077] 单字符 三字符 氨基酸

[0078] Y Tyr L-酪氨酸

[0079] G Gly L-甘氨酸

[0080] F Phe L-苯丙氨酸

[0081] M Met L-蛋氨酸

[0082] A Ala L-丙氨酸

[0083] S Ser L-丝氨酸

[0084] I Ile L-异亮氨酸

[0085] L Leu L-亮氨酸

[0086] T Thr L-苏氨酸

[0087] V Val L-缬氨酸

[0088] P Pro L-脯氨酸

[0089] K Lys L-赖氨酸

[0090] H His L-组氨酸

[0091] Q Gln L-谷氨酰胺

[0092] E Glu L-谷氨酸

[0093] W Trp L-色氨酸

[0094] R Arg L-精氨酸

[0095] D Asp L-天冬氨酸

[0096] N Asn L-天冬酰胺

[0097] C Cys L-半胱氨酸

[0098] 用于喷雾干燥的细胞的来源及制备和使用方法

[0099] 本发明提供了适合用于生物催化的微生物细胞或其裂解液或粗提物的喷雾干燥制剂，以及在生物催化中使用那些细胞、其裂解液或粗提物的较简单的方法。在本发明的一个实施方式中，本发明提供了适合用于生物催化的原核细胞或其裂解液或粗提物的喷雾干燥制剂，以及在生物催化中使用那些细胞、其裂解液或粗提物的较简单的方法。在一个实施方式中，原核细胞是大肠杆菌细胞。在另一个实施方式中，原核细胞是假单胞菌属的细胞。

[0100] 本发明还提供了适合用于生物催化的酵母的喷雾干燥制剂以及在生物催化中使用那些细胞的较简单的方法。例如，在通过具有乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶的重组巴斯德毕赤酵母生产丙酮酸盐和乙醛酸盐之前，收集细胞、洗涤、以苯扎氯铵(BAC)处理以使细胞对于底物例如乳酸盐和乙醇酸盐为多孔的，洗涤几次以除去任何残余的BAC，并用于生产丙酮酸盐和乙醛酸盐(大约6至8个步骤)。

[0101] 本发明提供了喷雾干燥微生物细胞以使其多孔并适合于生物催化而不浸出用于生物催化的酶的方法。因此，细胞可直接用于生产。因此，从发酵罐取出生物催化剂放入反应器的过程被简化了数个步骤。喷雾干燥细胞还可以使那些细胞中的酶稳定。如本文对于具有乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶的重组细胞的描述，喷雾干燥不引起酶的浸出或者需要以BAC处理。同样，喷雾干燥使酶稳定并且不破坏乙醇酸氧化酶针对多种α-羟基酸的选择性，因为喷雾干燥的酶对于S-酸是有活性的(即氧化S-酸)，但对于R-酸没有活性，即喷雾干燥的酶对于S-酸而非R-酸具有选择性。因此，使用本文描述的喷雾干燥制剂还可以进行手性化合物，例如外消旋α-羟基酸的动力学拆分。因此，本发明提供了用于生产多种化学物质和拆分对映异构体的微生物细胞，例如酵母细胞，例如毕赤酵母属或酵母属的细胞，以及重组微生物细胞，例如重组毕赤酵母属、假单胞菌属或大肠杆菌细胞。喷雾干燥的细胞易于制备、储存和使用。

[0102] 可用于本发明的酵母细胞选自：子囊菌门(Ascomycota)，酵母菌亚门(Saccharomycotina)，酵母纲(Saccharomycetes)，酵母目(Saccharomycetales)或裂殖酵母目(Schizosaccharomycetales)，酵母科(Saccharomycetaceae)，酵母属或毕赤酵母属(汉逊酵母属)，例如以下种：P.anomola、P.guilliermondiii、P.norvegenesis、P.ohmeri和巴斯德毕赤酵母。用于本发明的酵母细胞可以是原态(非重组)细胞或重组细胞，例如那些经过外源的(重组)具有一个或多个表达盒的DNA(每个表达盒具有多核苷酸，多核苷酸具有启动子和编码在生物催化中有用的一种或多种酶的开放读框)转化的细胞。外源DNA编码的酶被称为“重组子”，该酶可以来自于相同物种或者可以是异源的(来自不同物种)。例如，重组巴斯德毕赤酵母细胞可以重组表达巴斯德毕赤酵母酶或植物、微生物(例如曲霉属(Aspergillus)或酵母属)或哺乳动物的酶。

[0103] 在一个实施方式中，将本发明方法所用的微生物细胞用重组DNA转化，例如在载体中。用于转化细胞的载体、质粒、柯斯载体、YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)和DNA片段一般包含编码酶的DNA，以及想要导入细胞中的其它DNA。按照需要，这些DNA构建体还包括元件，例如：启动子、增强子、聚合接头、标记或可选择的基因，乃至调控基因。例如，选择用于细胞导入的DNA片段或基因之一通常编码在所获得的转化的(重组子)细胞中表达的蛋白质，从而产生可筛选的或可选择的特性和/或赋予转化的细胞改进的表型。但是，情况不一定总是如此，本发明还包括导入了非表达的转基因的转化细胞。

[0104] 用于导入细胞中的DNA包括从任意来源得到或分离的DNA，然后可以进行结构、大小和/或功能上的鉴定，经过化学改变，然后被导入细胞。从来源“得到”的DNA的例子是：经鉴别为给定生物体中有用的片段的DNA序列，然后以基本上纯的形式进行化学合成。从来源“分离”的这样的DNA的例子是：通过生物化学方法(例如酶学方法，如通过使用限制性内切酶)从所述来源切除或除掉的有用的DNA序列，以便它可以通过遗传工程的方法被进一步操作，例如扩增，以用于本发明。这样的DNA通常被称作“重组DNA”。

[0105] 因此，有用的DNA包括完全合成的DNA、半合成的DNA、从生物来源分离的DNA和源自所导入的RNA的DNA。所导入的DNA可以是最初位于作为DNA(原态或异源)受体的宿主细胞基因型中的DNA，或者不是这样的DNA。本发明的范围包括从给定基因型中分离基因，然后将该基因的多个拷贝导入相同的基因型，例如，为了增加给定基因产物的生产。

[0106] 导入的DNA包括但不限于，来自基因的DNA，所述基因例如细菌、酵母、真菌、植物或脊椎动物例如哺乳动物的基因。导入的DNA可以包括修饰的或合成的基因，例如“进化的”基因，基因的部分或嵌合基因，包括来自相同或不同基因型的基因。术语“嵌合基因”或“嵌合DNA”定义为这样的基因或DNA序列或片段：其包含至少两个来自于在天然条件下不组合DNA的物种的DNA序列或片段，或者，DNA序列或片段按照在非转化的细胞的原态基因组中通常不发生的方式放置或连接。

[0107] 用于本文的转化的导入的DNA可以是环状或线状的，双链或单链的。一般地，DNA是嵌合DNA的形式，例如质粒DNA，其还可以含有两侧具有调控序列的编码区域，所述调控序列促进转化细胞中存在的重组DNA的表达。例如，DNA可以包括在细胞中有活性的启动子，所述启动子的来源不是该细胞，或者可以使用已经存在于作为转化靶的细胞中的启动子。

[0108] 一般地，导入的DNA相对较小，即，小于大约30kb以使任何对物理、化学或酶学降解的敏感性最小化，已知所述敏感性随着DNA大小的增加而增加。导入细胞中的蛋白质、RNA转录物或其混合物的数目优选是预先选定和确定的，例如，可以形成1个至大约5-10个这样的导入的DNA的产物。

[0109] 合适的表达载体的选择将取决于宿主细胞。表达载体可以包含，例如：(1)原核DNA元件，其编码细菌复制起点和抗生素抗性基因以提供在细菌宿主中的表达载体的扩增和选择；(2)控制转录起始的DNA元件，例如启动子；(3)控制转录物加工的DNA元件例如内含子、转录终止/多腺苷化序列；和(4)可操作连接到控制转录起始的DNA元件的目标基因。所用的表达载体可以是能够在宿主细胞中自主复制的载体或能够整合进入染色体的载体，最初在能够使连接的基因转录的位点上包含启动子。

[0110] 酵母或真菌表达载体可以包含复制起点、合适的启动子和增强子，还有任何必需的核糖体结合位点、多腺苷化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列和5’侧翼非转录序列。几个良好表征的酵母表达系统在本领域是已知的，并且描述在例如美国专利号4,446,235和欧洲专利申请103,409和100,561中。众多不同的具有酵母启动子的穿梭载体在本领域也是已知的。但是，只要在宿主中可以复制并且存活，也可以使用任何其它质粒或载体。

[0111] 根据本公开内容，可以连同本发明使用的载体的构建对于本领域技术人员将是已知的(参见例如Sambrook和Russell，Molecular Biology：ALaboratory Manual，2001)。本发明的表达盒可以包含一个或多个限制性位点以允许放置编码酶的多核苷酸。表达盒还可以包含可操作连接到多核苷酸的终止信号以及多核苷酸的正确翻译所需要的调控序列。含有本发明的多核苷酸的表达盒可以是嵌合的，意思是它的至少一个成分相对于其它成分中的至少一个是异源的。表达盒中多核苷酸的表达可以受组成型启动子、可诱导启动子、调控启动子、病毒启动子或合成启动子的控制。

[0112] 表达盒可以在5’-3’的转录方向上包括转录和翻译起始区域、本发明的多核苷酸和在体内和/或在体外有功能的转录和翻译终止区域。终止区域可以是与转录起始区域本源的，或者与多核苷酸是本源的，或者可以源自另一个来源。调控序列可以位于编码序列的上游(5’非编码序列)、内部(内含子)或下游(3’非编码序列)，并影响转录、RNA加工或稳定性，和/或相关的编码序列的翻译。调控序列可以包括但不限于，增强子、启动子、抑制子结合位点、翻译引导序列、内含子和多腺苷化信号序列。它们可以包括天然和合成序列以及可以是合成和天然序列的组合的序列。

[0113] 本发明中使用的载体还可以包括合适的用于扩增表达的序列。

[0114] 启动子是通过提供RNA聚合酶和正确转录所需的其它因子的识别而控制编码序列的表达的核苷酸序列。启动子包括最简启动子，其仅由转录起始所需的全部基本元件组成，例如TATA-盒和/或起始子，所述起始子为短的DNA序列，其包含TATA-盒和其它用于指定转录起始位点(向该位点添加调控元件以控制表达)的序列。启动子可以完全来源于原态基因，或由源自不同的天然发现的启动子的不同元件组成，或者甚至可以包含合成的DNA片段。启动子还可以包含参与蛋白因子结合的DNA序列，所述蛋白因子控制响应于生理或发育条件的转录起始的有效性。启动子还可以包括最简启动子加调控元件或能够控制编码序列或功能RNA表达的元件。这种启动子序列含有近端的和更远端的元件，后者元件通常被称为增强子。

[0115] 启动子的代表性的例子包括但不限于，已知在原核或真核细胞或它们的病毒中控制基因表达的启动子。例如，任何能够在酵母宿主中表达的启动子可以用作本发明中的启动子，例如，可以使用GAL4启动子。可用于在酵母细胞中表达的另外的启动子在本领域中有完备的描述。其例子包括编码糖酵解酶的基因(例如TDH3)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、GAPDH的缩短版本(GAPFL)、3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶、转化酶和葡糖激酶基因和糖酵解途径中的类似基因的启动子，热休克蛋白启动子，MFa-1启动子，CUP 1启动子，MET，TRP1基因的启动子，AOX(醇氧化酶)基因启动子(例如AOX1或AOX2启动子)，ADC1基因(编码醇脱氢酶I)或ADR2基因(编码醇脱氢酶II)，酸性磷酸酶(PHO5)基因，异细胞色素c基因，编码a或α-因子的酵母交配信息素基因的启动子，或GAL/CYC1杂合启动子(GAL1-GAL10基因/细胞色素1基因的基因间区域)(Guarente等人，1982)。具有可以因生长条件变化而开启或关闭的转录控制的启动子包括，例如，PHO5、ADR2和GAL/CYC1启动子。例如，PHO5启动子可以仅仅通过增加或减少培养基中无机磷酸盐的浓度而被任意抑制或解除抑制。一些启动子，例如ADH1启动子，允许目标基因的高水平组成型表达。

[0116] 可以使用任何能够在丝状真菌中表达的启动子。例子有：通过淀粉或纤维素强烈诱导的启动子，例如葡糖淀粉酶或来自曲霉属的a-淀粉酶或来自木霉属(Trichoderma)的纤维素酶(纤维二糖水合酶)的启动子，糖酵解途径中的酶的启动子，例如磷酸甘油酸激酶(pgk)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(gpd)等。

[0117] 具体的细菌启动子包括但不限于，大肠杆菌lac或trp、噬菌体λPL、LacI、lacZ、T3、T7、gpt和λPR启动子。

[0118] 已知有两种主要的控制表达的方法，即：诱导，其引起过表达；和抑制，其引起低表达。可以通过将强启动子插入在可操作连接到靶基因的位置上，或者通过插入所选基因的一个或多个多余拷贝而实现过表达。例如，目标基因的多余拷贝可以置于自主复制的质粒上，例如pYES2.0(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)，其中在向培养基中加入半乳糖之后通过GAL4启动子控制过表达。

[0119] 几种可诱导启动子在本领域是已知的。在Gatz，Curr.Op.Biotech.，7：168(1996)的综述中描述了很多(还参见Gatz，Ann.Rev.Plant.Physiol.Plant Mol.Biol.，48：89(1997))。例子包括：四环素阻抑物系统、Lac阻抑物系统、铜可诱导系统、水杨酸盐可诱导系统(例如PR1a系统)、糖皮质激素可诱导的(Aoyama T.等人，1997)、醇可诱导系统(例如AOX启动子)和蜕皮激素(ecdysome)可诱导系统。还包括苯磺胺可诱导系统(美国专利号5364,780)和醇可诱导(WO 97/06269和WO 97/06268)可诱导系统和谷胱甘肽S-转移酶启动子。

[0120] 除了使用特定启动子之外，其它类型的元件也可以影响转基因的表达。特别地，已经证明内含子增强转基因表达的潜能。

[0121] 其它元件包括那些可以被内源或外源试剂，例如被锌指蛋白，包括天然产生的锌指蛋白或嵌合锌指蛋白调节的元件。参见，例如美国专利号5,789,538；WO 99/48909；WO 99/45132；WO 98/53060；WO 98/53057；WO98/53058；WO 00/23464；WO 95/19431；和 WO
98/54311。

[0122] 增强子是可以刺激启动子活性的DNA序列，并且可以是启动子的固有元件或被插入以增强特定启动子的水平或组织特异性的异源元件。增强子以两个方向(5’至3’和3’至5’，相对于编码目标基因的序列)均能运行，并且甚至当被移动到启动子上游或下游时也能够发挥作用。增强子和其它上游启动子元件都与调节其效应的序列特异性的DNA结合蛋白结合。

[0123] 可以将用于本发明的载体构建为包括增强子元件。本发明的构建体还将包括带有3’末端DNA序列的目标基因，所述3’末端DNA序列作为终止转录的信号并允许所产生的mRNA的多腺苷化。

[0124] 由于转录起始位点和编码序列起始点之间的DNA序列，即未翻译的前导序列，可以影响基因表达，所以人们还可能希望使用特定的前导序列。优选的引导序列意欲包括这样的序列：其包括被预测为指导所连接基因的最优化表达的序列，即，包括可以增加或维持mRNA稳定性并阻止不正确的翻译起始的优选的共有前导序列。本领域技术人员根据本公开内容将知晓这样的序列的选择。

[0125] 为了改进鉴别转化体的能力，作为可表达的目标基因或除了可表达的目标基因之外，人们可以希望应用可选择或可筛选的标记基因。“标记基因”是赋予表达该标记基因的细胞不同的表型从而允许将这样的转化细胞与不具有该标记的细胞区分开来的基因。这样的基因可以编码可选择的或可筛选的标记，这取决于标记是否赋予可以通过化学方式“选择”的特性，即，通过使用选择性试剂(例如，抗生素等等)，或者，其是否是简单的可以通过观察或测试(即通过“筛选”)加以鉴别的特性。当然，合适的标记基因的很多例子在本领域是已知的，可用于实施本发明.

[0126] 术语可选择的或可筛选的标记基因还包括编码“可分泌标记”的基因，可以检测其分泌作为鉴别或选择转化的细胞的方法。例子包括编码可分泌的抗原的标记，所述抗原可以通过抗体相互作用而被鉴别，或者甚至是可分泌的酶，其可以通过其催化活性而被检测。可分泌的蛋白质归为几类，包括可以通过例如ELISA检测的小的、可分散蛋白质和可以在细胞外溶液中检测的小的活性酶。

[0127] 可以使用的可筛选标记包括但不限于，β-葡糖醛酸酶或编码已知有多种生色底物的酶的uidA基因(GUS)；β-内酰胺酶基因(Sutcliffe，1978)，其编码已知有多种生色底物(例如PADAC，一种生色的头孢菌素)的酶；xylE基因(Zukowsky等人，1983)，其编码能够转化生色儿茶酚的儿茶酚双加氧酶；α-淀粉酶基因(Ikuta等人，1990)；酪氨酸酶基因(Katz等人，1983)，其编码能够将酪氨酸氧化为DOPA和多巴醌的酶(DOPA和多巴醌继而缩合形成可以容易地检测的化合物黑色素)；β-半乳糖苷酶基因，其编码具有生色底物的酶；荧光素酶(lux)基因(Ow等人，1986)，其允许进行生物发光检测，或者甚至是水母素基因(Prasher等人，1985)，其可用于钙敏感的生物发光检测，或绿色荧光蛋白基因(Niedz等人，1995)。还可以使用可选择的营养标记，例如HIS3、URA3、TRP-1、LYS-2和ADE2。

[0128] 可以使用产生可用于生物催化的重组细胞的任何编码基因产物的构建体。在一个实施方式中，构建体编码酶。酶的基因来源包括选自属于曲霉属、根霉属、木霉属、脉孢菌属、毛霉属、青霉属的真菌细胞，属于克鲁维酵母属(Kluyvermyces)、酵母属、裂殖酵母属、丝孢酵母属、许旺酵母属的酵母，植物，脊椎动物等的那些。在一个实施方式中，构建体位于适合于染色体外复制和保持的质粒上。在另一个实施方式中，同时或依次将两个构建体导入细胞中从而引起构建体稳定整合进入基因组。

[0129] 生物催化中有用的酶包括但不限于全部六类酶，包括：水解酶、裂合酶、异构酶、连接酶、氧化还原酶和转移酶，例如酰胺酶、醇氧化酶、羧化酶、双加氧酶、歧化酶、脱甲基酶、脱卤酶、脱氢酶、脱酰胺酶、脱羧酶、脱硫酶、环氧化酶、氢化酶、羟化酶、水合酶、激酶、漆酶、内酰胺酶、变位酶、腈水解酶、固氮酶、氧化酶、过氧化酶、磷酸酶、还原酶、消旋酶、合成酶、硫醇氧化酶、硫解酶和脲酶，以及包括但不限于，淀粉酶、氨基肽酶、淀粉葡糖苷酶、菠萝蛋白酶、羧基肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、胶原酶、酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、乙醇酸氧化酶、半纤维素酶、转化酶、乳糖酶、脂肪酶、麦芽糖酶、木瓜蛋白酶、胰酶制剂、胰脂肪酶、果胶酶、果胶裂合酶、戊聚糖酶、胃蛋白酶、肽酶、磷脂酶A2、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、蔗糖酶、胰蛋白酶、木糖聚酶和木糖聚酶。例如，转酮酶和转氨酶可用于制备手性氨基醇，酮可以被醇脱氢酶转化为仲醇，己酮可可碱(dentoxifyiline)可以被醇脱氢酶转化为利索茶碱，3-烷基环酮可以被环戊酮氧化酶(cyclopentanene oxygenase)转化为4-和5-取代的内酯。

[0130] 在一个实施方式中，本发明的微生物细胞表达4-羟基苯基乙酸盐3-羟化酶，并且在存在L-酪氨酸、NADH和氧的情况下，产生L-二羟基苯丙氨酸。在一个实施方式中，本发明的微生物细胞表达葡萄糖、醇或甲酸脱氢酶和需要NAD(P)或NAD(P)H的加氧酶。例如，表达甲酸脱氢酶的细胞可以与CO2混合以产生甲酸；表达葡萄糖脱氢酶的细胞可以与葡糖酸内酯混合以产生葡萄糖；表达醇脱氢酶的细胞可以与乙醛混合以产生乙醇；表达亚磷酸盐脱氢酶的细胞可以与亚磷酸盐混合以产生磷酸盐。在一个实施方式中，生物催化反应包括两种不同的酶(“偶联”反应)。在一个实施方式中，表达腈水合酶和青霉素G酰基转移+酶的细胞可以用于产生头孢氨苄；表达醇脱氢酶和NAD 依赖性的甲酸脱氢酶的细胞可用于从甲基乙酰乙酸盐产生甲基(R)-3-羟基丁酸盐；表达醇或甲酸脱氢酶和单加氧酶的细胞可用于内酯的区域和立体选择性生物转化(参见，例如Grogan等人，Biotech.Lett.，14：
1125(1992))。在一个实施方式中，本发明的细胞表达NAD(P)H-黄素氧化还原酶和4-羟基苯基乙酸盐3-单加氧酶，其可用于抗生素的生物合成。

[0131] 在一个实施方式中，微生物细胞例如酵母细胞(例如毕赤酵母属的细胞)是喷雾干燥的并用于产生丙酮酸盐、乙醛酸盐、外消旋羟基酸的拆分、和/或产生其它的乙醇酸氧化酶能够氧化的酮酸。在一个实施方式中，微生物细胞表达重组乙醇酸氧化酶。乙醇酸氧化酶包括羟基酸氧化酶A和羟基酸氧化酶B(L-α-羟基酸氧化酶、L-2-羟基酸氧化酶、(S)-2-羟基酸；氧2-氧化还原酶)。乙醇酸氧化酶是黄素蛋白(FMN)，并且A形式优先氧化短链脂肪族羟基酸，而B形式优先氧化长链和芳香族羟基酸。本发明范围内的乙醇酸氧化酶包括但不限于：来自植物的那些，例如，包括但不限于，来自茄属(Solanum)、拟南芥属(Arabidopsis)、苜蓿属(Medicago)、草莓属(Fragiaria)、菠菜属(Spinacia)和大麦属(Hordeum)的那些；或其它来源，例如来自大肠杆菌、布鲁斯氏菌属(Brucella)、Ralsoria属、假单胞菌属、弗兰克氏菌(Frankia)、根瘤菌属(Bradyrhizobium)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、聚球蓝细菌属(Synechococcus)、嗜热蓝细菌属(Thermosynechococcus)、粘杆菌属(Gloeobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、农杆菌属(Agrobacterium)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、蓝细菌属(Synechocytis)、曲霉属；或脊椎动物，包括哺乳动物，例如牛、大鼠、人、小鼠和大鼠。

[0132] 在一个实施方式中，微生物细胞，例如酵母细胞，可选地除了重组乙醇酸氧化酶之外还表达重组过氧化氢酶。过氧化氢酶可以同时表现出过氧化氢酶和过氧化物酶活性。本发明范围内的过氧化氢酶包括但不限于来自酵母属、德巴利酵母属(Debaromyces)、耶罗维亚酵母属(Yarrowsia)或克鲁维酵母属的过氧化氢酶，以及在以下NCBI登录号中公开的那 些：P83657，CAT1_COMTR；Q9C168，CAT1_NEUCR；P81138，CAT1_PENJA；Q8X182，CAT2_NEUCR；Q9C169，CAT3_NEUCR；Q96528，CATA1_ARATH；Q27487，CATA1_CAEEL；P48350，CATA1_CUCPE；P17598，CATA1_GOSHI；P55307，CATA1_HORVU；P18122，CATA1_MAIZE；P49315，CATA1_NICPL；P0C549，CATA1_ORYSI；Q0E4K1，CATA1_ORYSJ；Q01297，CATA1_RICCO；P30264，CATA1_SOLLC；P49284，CATA1_SOLTU；P29756，CATA1_SOYBN；P49319，CATA1_TOBAC；Q43206，CATA1_WHEAT；P25819，CATA2_ARATH；O61235，CATA2_CAEEL；P48351，CATA2_CUCPE；P30567，CATA2_GOSHI；P55308，CATA2_HORVU；P12365，CATA2_MAIZE；P49316，CATA2_NICPL；A2YH64，CATA2_ORYSI；Q0D9C4，CATA2_ORYSJ；P49318，CATA2_RICCO；Q9XHH3，CATA2_SOLLC；P55312，CATA2_SOLTU；P55313，CATA2_WHEAT；Q42547，CATA3_ARATH；P48352，CATA3_CUCPE；P18123，CATA3_MAIZE；P49317，CATA3_NICPL；O48560，CATA3_SOYBN；O48561，CATA4_SOYBN；O28050，CATA_ARCFU；P90682，CATA_ASCSU；P78574，CATA_ASPFU；Q9AXH0，CATA_AVIMR；P45737，CATA_BACFR；P14412，CATA_BACST；P26901，CATA_BACSU；P0A324，CATA_BORBR；P0A325，CATA_BORPA；P0A323，CATA_BORPE；P55304，CATA_BOTCI；P00432，CATA_BOVIN；P0A327，CATA_BRUAB；P0A326，CATA_BRUME；Q8FWU0，CATA_BRUSU；Q2I6W4，CATA_CALJA；Q59296，CATA_CAMJE；O13289，CATA_CANAL；Q96VB8，CATA_CANBO；O97492，CATA_CANFA；P07820，CATA_CANTR；Q9M5L6，CATA_CAPAN；O31066，CATA_CAUCR；Q64405，CATA_CAVPO；Q9PT92，CATA_DANRE；Q59337，CATA_DEIRA；O9ZN99，CATA_DESVM；O77229，CATA_DICDI；P17336，CATA_DROME；P13029，CATA_ECOLI；P55305，CATA_EMENI；Q8X1P0，CATA_ERYGR；P44390，CATA_HAEIN；O59651，CATA_HALMA；O73955，CATA_HALSA；P45739，CATA_HELAN；Q9ZKX5，CATA_HELPJ；P77872，CATA_HELPY；P04040，CATA_HUMAN；P07145，CATA_IPOBA；P30265，CATA_LACSK；Q9WXB9，CATA_LEGPN；Q926X0，CATA_LISIN；Q8Y3P9，CATA_LISMO；P24168，CATA_LISSE；O93662，CATA_METBF；P29422，CATA_MICLU；P24270，CATA_MOUSE；P46817，CATA_MYCBO；O08404，CATA_MYCFO；Q04657，CATA_MYCIT；A0R609，CATA_MYCS2；P0C580，CATA_MYCSM；Q08129，CATA_MYCTU；Q59602，CATA_NEIGO；Q27710，CATA_ONCVE；P25890，CATA_PEA；P11934，CATA_PENJA；P32290，CATA_PHAAU；P30263，CATA_PICAN；O62839，CATA_PIG；Q5RF10，CATA_PONPY；P42321，CATA_PROMI；O52762，CATA_PSEAE；Q59714，CATA_PSEPU；
Q9PWF7，CATA_RANRU；P04762，CATA_RAT；P95631，CATA_RHIME；P37743，CATA_RHOCA；
Q8Z303，CATA_SALTI；P17750，CATA_SALTY；P55306，CATA_SCHPO；P55310，CATA_SECCE；
O24339，CATA_SOLAP；P55311，CATA_SOLME；Q2FH99，CATA_STAA3；Q2FYU7，CATA_STAA8；
Q2YXT2，CATA_STAAB；Q5HG86，CATA_STAAC；Q99UE2，CATA_STAAM；Q7A5T2，CATA_STAAN；
Q6GH72，CATA_STAAR；Q6G9M4，CATA_STAAS；Q9L4S1，CATA_STAAU；Q8NWV5，CATA_STAAW；
Q2PUJ9，CATA_STAEP；Q5HPK8，CATA_STAEQ；Q8CPD0，CATA_STAES；Q4L643，CATA_STAHJ；
Q49XC1，CATA_STAS1；Q9KW19，CATA_STAWA；Q9EV50，CATA_STAXY；Q9Z598，CATA_STRCO；
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Q9Y7C2，CATB_AJECA；Q92405，CATB_ASPFU；Q877A8，CATB_ASPOR；P78619，CATB_EMENI；
Q59635，CATB_PSEAE；P46206，CATB_PSESY；Q66V81，CATB_STAXY；Q9RJH9，CATB_STRCO；
O87864，CATB_STRRE；P30266，CATE_BACPF；P42234，CATE_BACSU；P21179，CATE_ECOLI；
P50979，CATE_MYCAV；Q9I1W8，CATE_PSEAE；P95539，CATE_PSEPU；Q9X576，CATE_RHIME；
P55303，CATR_ASPNG；P06115，CATT_YEAST；P94377，CATX_BACSU；P80878，MCAT_BACSU；
Q97FE0，MCAT_CLOAB；P60355，MCAT_LACPL；Q9LRS0，GOX1_ARATH；Q9LRR9，GOX2_ARATH；
P05414，GOX_SPIOL；Q9UJM8，HAOX1_HUMAN；Q9WU19，HAOX1_MOUSE；Q3ZBW2，HAOX2_BOVIN；
Q9NYQ3，HAOX2_HUMAN；Q9NYQ2，HAOX2_MOUSE；Q07523，HAOX2_RAT，其公

[0133] 开内容通过引用并入本文。

[0134] 在一个实施方式中提供了适合于生物催化的毕赤酵母属的喷雾干燥制剂。在另一个实施方式中，提供了适合于生物催化的酵母属的喷雾干燥制剂。但是，由于酵母具有细胞壁，所以预见到除毕赤酵母属和酵母属之外的酵母的喷雾干燥制剂可用于生物催化。在一个实施方式中，酵母包含至少一种重组酶。例如，重组酶可以是异源乙醇酸氧化酶或异源过氧化氢酶。在一个实施方式中，酵母包含异源乙醇酸氧化酶和异源过氧化氢酶。在一个实施方式中，酵母不表达重组酶，例如，野生型(或另外的非重组)酵母，例如可用于生物催化的酵母属。

[0135] 在一个实施方式中，提供了用于生物催化的原核细胞例如大肠杆菌的喷雾干燥制剂。例如，重组大肠杆菌菌株包含至少一种重组酶。在一个实施方式中，将大肠杆菌菌株用源自pET32的原核载体转化，所述载体中插入了植物乙醇酸氧化酶的开放读框。

[0136] 为了制备微生物重组菌株，将微生物基因组扩充(augment)或用表达盒替换基因组的一部分。为了生物催化，表达盒包含启动子，其可操作地连接到至少一个介导生物催化的酶的开放读框。例如，表达盒可以编码异源乙醇酸氧化酶。在一个实施方式中，将微生物基因组用至少两个表达盒转化，例如，一个表达盒编码异源乙醇酸氧化酶，另一个编码异源过氧化氢酶。可以将表达盒导入相同的或单独的质粒，或者导入相同或不同的载体以进行稳定整合转化。

[0137] 将表达一种或多种介导特定酶反应的酶的重组或原态(非重组)微生物扩大以提供微生物细胞悬浮液。在一个实施方式中，可以在喷雾干燥之前通过例如离心或使用膜将悬浮液分成液体组分和含有细胞的固体组分。微生物细胞悬浮液在有效产生适合用于生物催化的喷雾干燥的微生物细胞制剂的条件下进行喷雾干燥。在一个实施方式中，喷雾干燥包括将一定数量的细胞悬浮液流经孔隙(aperature)加热。以下实施例中描述的条件是基于小规模设备能力设定的，例如低蒸发能力(例如，1.5Kg水/小时)。因此，以下的范围仅为示例性的，并且在蒸发能力可以达到1000Kg水/小时以上的生产规模的情况下可以是不同的。例如，对于小规模设备而言，进料(流)速率可以是大约1mL/分钟至大约30mL/分钟，例如，大约2mL/分钟直至大约20mL/分钟。对于大规模过程而言，流速可以达到1L/分钟或更高。在一个实施方式中，在大约50℃直至大约225℃干燥悬浮液，例如大约100℃直至大约200℃。在喷雾干燥前，细胞悬浮液可以是大约5mg/L直至大约800mg/L，例如大约20mg/L直至大约700mg/L，或直至2000mg/L以上。所用的细胞浓度的上限由细胞的粘性和设备决定。微生物细胞悬浮液可以是大肠杆菌细胞悬浮液、假单胞菌属的细胞悬浮液、毕赤酵母属的细胞悬浮液、或酵母属的细胞悬浮液。在一个实施方式中，空气流是大约500L/小时至大约800L/小时，例如大约700L/小时。制备喷雾干燥的微生物细胞悬浮液的过程可以包括本文描述的任意流速、任意温度和任意细胞浓度，以及其它流速、温度和细胞浓度。

[0138] 一旦想要的原态或重组微生物细胞被喷雾干燥，可以将它们在基本不影响用于生物催化的酶的活性或细胞位置的条件下储存任意一段时间。储存时间段包括数小时、数天、数周或直至至少2个月。

[0139] 在一个实施方式中，待喷雾干燥并用于生物催化的酵母细胞是具有从Aox1启动子表达的菠菜乙醇酸氧化酶DNA的毕赤酵母属的细胞(单重组子)，或具有从Aox1和Aox2启动子表达的菠菜乙醇酸氧化酶DNA和酵母属过氧化氢酶T DNA的毕赤酵母属的细胞(双重组子)，所述重组细胞是强烈的单细胞甲基营养型酵母。表现出原核生长速率的那些细胞在细胞内产生异源酶，具有高生产率(克/升)，具有可控的表达(由MeOh诱导/被甘油抑制)，并且其发酵可以容易地按比例增加至100L。以下描述了那些细胞的使用。

[0140] 进一步通过以下非限制性实施例描述本发明。

[0141] 实施例1

[0142] 喷雾干燥

[0143] 设备

[0144] 全部喷雾干燥程序使用带有空气喷嘴清洁器的Buchi B-190喷雾干燥器。控制的操作参数包括：进料浓度、进料速率、空气流、温度和真空度。对于全部实验，将空气流设定为700L/小时，真空度恒定在-50mbar，实验进料浓度范围从30至600mg/mL，进料速率介于5至15mL/分钟，所测的操作温度为120至195℃。

[0145] 程序

[0146] 将巴斯德毕赤酵母细胞(称为单或双重组子)洗涤、离心并储存于-80℃。这些细胞获自冰箱，使其在室温解冻，通过将细胞在滤纸上吸干而除去多余的水。将吸干的细胞称重到几个容器中，稀释至固定体积以产生想要的细胞浓度。使用去离子水将吸干的细胞稀释至100mL的总体积。振荡容器，在指定的浓度形成细胞悬浮液以用作加入到喷雾干燥器中的进料。

[0147] 以700L/小时将空气流启动通向喷雾干燥器，将抽吸器设定到-50mbar，打开加热器。将去离子水泵送通过喷雾喷嘴以代替细胞悬浮液。将进料速率设定到需要的实验值，调节加热器以产生合适的操作温度。达到温度平衡之后，用指定的细胞悬浮液替换去离子水进料。基于所用的进料速率，喷雾干燥过程持续6至20分钟。当100mL细胞悬浮液处理完毕时，停止进料泵和加热器，容许空气流将机器冷却至70℃。然后，关闭吸气器和空气供给。除去收集容器，将毕赤酵母属的细胞转移至闪烁管。将这些管在环境温度储存于干燥器中。使用去离子水冲洗进料管道，在进行其它条件的喷雾干燥之前漂洗玻璃器具。

[0148] 酶检验

[0149] 乙醇酸氧化酶检验

[0150] 1.称取大约40mg喷雾干燥的细胞(记录准确重量)，放入10mL离心管中。

[0151] 2.加入8.0mL DCIP检验溶液(0.12mM 2，6-二氯靛酚和80mM Tris，pH 8.3)。储存于4℃的DCIP溶液可以使用达2周。

[0152] 3.混合以使细胞悬浮，然后取出50μL悬浮液(大约0.25mg干细胞)并置于带有搅拌子的3.0mL石英杯中。加入2.0mL DCIP检验溶液。以隔膜封口并以氮气鼓泡3分钟。

[0153] 4.通过注射器向杯中加入40μL 1.0M的L-乳酸/1.0M的Tris(pH 8.3)，并且在搅拌情况下将606nm处的吸光度变化测定30秒( )。

[0154]

[0155]

[0156] 过氧化氢酶检验

[0157] 1.将大约40mg喷雾干燥的细胞(记录准确重量)称到10mL离心管中。

[0158] 2.加入8.0mL过氧化氢酶检验缓冲液(0.0167M磷酸盐缓冲液，pH7)。

[0159] 3.混合以使细胞悬浮，然后取出50μL悬浮液(大约0.25mg干细胞)并置于带有搅拌子的3.0mL石英杯中。加入2.0mL过氧化氢酶检验缓冲液。

[0160] 4.加入1.0mL过氧化氢溶液(67μL 30％过氧化氢置于10mL检验缓冲液中，pH7.0)，在搅拌情况下将240nm处的吸光度变化测定30秒( )。

[0161]

[0162]

[0163] 实验#1

[0164] 本实验研究喷雾干燥的转化的毕赤酵母属的细胞对于乙醇酸氧化酶(GO)和过氧化氢酶活性的可行性，因为与喷雾干燥过程相关的温度偏移可能打开毕赤酵母属的细胞膜并且迅速的水分损失可以使重组酶稳定。使用表达重组GO和原态过氧化氢酶的单重组子巴斯德毕赤酵母(NRRLY-21001)。将本研究设计为按照对于GO和过氧化氢酶活性的相对效应而筛选进料浓度、进料速率和操作温度。

[0165] 设计了全因素实验，其具有三个因素(进料浓度、进料速率和操作温度)。对于这三个因素中的每一个均研究高值和低值。这产生了如表1所示的总共8个实验运行。

[0166] 表1

[0167]运行 模式 温度 进料速率 进料浓度
[C] [mL/分钟] [mg/mL]
601 --- 120 5 30
602 --+ 120 5 100
603 -+- 120 15 30
604 -++ 120 15 100
605 +-- 150 5 30
606 +-+ 150 5 100
607 ++- 150 15 30
608 +++ 150 15 100

[0168] GO和过氧化氢酶活性是用于筛选这些喷雾干燥器的操作参数的两个响应。制备好用于酶检验的喷雾干燥的样品之后，取三个吸光度测定。

[0169] 软件

[0170] 使用JMP统计软件(SAS公司)设计筛选实验并分析数据。构建的模型包括进料浓度、进料速率、温度和全部三个相互作用参数(进料浓度*进料速率、进料浓度*温度和进料速率*温度)。使用标准最小二乘分析法以使残差最小化。在统计分析中包括每个实验条件(一式两份)的三个吸光度测定。显示了杠杆图以度量喷雾干燥参数对GO和过氧化氢酶活性的相对影响。

[0171] 结果

[0172] 全部三个喷雾干燥操作参数对于GO活性均是显著的，如跨越水平轴的95％置信区间所示。将温度从120℃提高至150℃对于GO活性具有轻微的消极影响，而将进料速率从5mL/分钟提高至15mL/分钟具有最陡的杠杆斜率并且对于GO活性具有最显著的影响(图
3-4)。将进料浓度从30mg/mL提高至100mg/mL也增加了GO活性(图5)。温度*进料速率相互作用图(未显示)提示增加进料速率将使在较高温度进行喷雾干燥时产生的GO活性损失最小化。

[0173] 喷雾干燥操作参数对于过氧化氢酶活性也是显著的。将温度从120℃提高至150℃对于过氧化氢酶活性的降低比GO活性更加强烈(图6)。与GO的结果一致，将进料速率从5mL/分钟提高至15mL/分钟对于过氧化氢酶活性具有最大的影响(图7)。将进料浓度从30mg/mL提高至100mg/mL增加了过氧化氢酶活性(图8)。温度*进料速率和温度*进料浓度相互作用图(未显示)提示增加进料速率和进料浓度将使在较高温度进行喷雾干燥时的过氧化氢酶活性损失最小化。

[0174] 实验#2

[0175] 证明了喷雾干燥的转化的毕赤酵母属的细胞用于生物催化的可行性之后，第二个实验着眼于增加GO和过氧化氢酶的活性。当考虑来自实验#1的关于两个酶的结果时：a)升高温度显示出活性的降低；b)提高进料速率对活性具有最大的积极影响；和c)增加进料浓度提高了活性。基于这些结果，对于第二个实验，将进料速率设定到15mL/分钟(设备最大值)。没有研究较低的温度，因为当在较高的进料速率操作时，在120℃时喷雾干燥产生“结块”的粉末(由于残余水分)。作为备选，研究了在120℃以上喷雾干燥时较高的进料浓度以保持酶活性。使用了双重组子巴斯德毕赤酵母，其表达GO、原态过氧化氢酶和来自酿酒酵母的过氧化氢酶T。

[0176] 设计了全因素实验，其具有两个因素(温度和进料浓度)。测试了三个不同的温度和三个不同的进料浓度。这产生了如表2所示的总共9个实验运行。

[0177] 表2

[0178]运行 模式 温度 进料浓度
[C] [mg/mL]
702 11 120 100
703 12 120 200
704 13 120 400
705 21 150 100
706 22 150 200
707 23 150 400
708 31 195 100
709 32 195 200
710 33 195 400

[0179] 再次，GO和过氧化氢酶活性是用于筛选这些喷雾干燥器的操作参数的两个响应。制备好用于酶检验的喷雾干燥的样品之后，完成6个吸光度测定。

[0180] 使用JMP统计软件开发基于温度、进料浓度和一个相互作用参数(温度*进料浓度)的模型。运行702(120℃，100mg/mL)和运行705(150℃，100mg/mL)是从第一个实验重复的操作参数。测试了更高的进料浓度和更高的操作温度。最大控制温度(在指定的进料速率)是195℃。研究了这个温度上限以增强通过增加进料浓度而获得的结果并且确定温度最适值。在统计分析中包括了每个实验条件(一式五份)的6个吸光度测定。显示了GO和过氧化氢酶活性相对于喷雾干燥参数的杠杆图。

[0181] 结果

[0182] 对于第二个实验，在195℃进行喷雾干燥产生了显著低于120和150℃条件时的GO活性(图9)。通过观察进料浓度杠杆图，在较高进料浓度进行喷雾干燥的好处不明显(图10)。95％置信区间没有跨越水平轴，并且提高进料浓度没有显示出统计学上显著的GO活性变化。但是，提高进料浓度具有两个好处：a)每单位体积可以处理更多的巴斯德毕赤酵母细胞；和b)温度*进料浓度相互作用图显示，更高的进料浓度帮助120和150℃时的运行达到可比较的GO活性(图11)。这些结果是重要的，因为150℃时的喷雾干燥比120℃时的操作产生更均一的具有更少残余水分的生物催化剂粉末。

[0183] 按照GO结果，相对于较低操作温度，195℃时的喷雾干燥显著降低过氧化氢酶活性(图12)。在120和150℃时的喷雾干燥产生可比较的过氧化氢酶活性。提高进料浓度没有产生过氧化氢酶活性统计学上的变化，由进料浓度图和温度*进料浓度相互作用图所证明(图13-14)。在较高的进料浓度喷雾干燥时过氧化氢酶没有获得与GO相同的好处。过氧化氢酶可以对于温度从120℃升高至150℃具有更好的恢复性，因此不需要更高的进料浓度以保持酶活性。可以实现多达400mg细胞/mL(湿细胞重)的喷雾干燥的巴斯德毕赤酵母细胞而不损失GO或过氧化氢酶活性。

[0184] 实验#3

[0185] 第一个实验证明提高进料速率保持了喷雾干燥的细胞中的GO和过氧化氢酶活性。将实验#2的进料速率设定为设备最大值(15mL/分钟)，其中测试了更高的温度和进料浓度。120和150℃的温度产生了相似的酶活性，但是150℃的条件提供了更均一和干燥的生物催化剂粉末。研究了195℃的最大操作温度，显然，对于最佳酶活性存在温度上限。从第二个实验无法确定进料浓度的上限，其中测试了达400mg/mL的进料，无任何酶活性的统计学变化。

[0186] 对于第三个实验，使用了以上研究中的最佳进料速率(15mL/分钟)和最佳温度(150℃)。如果使用150℃以上的温度进行喷雾干燥，提高进料浓度可以是有益的，因为减少处理体积并帮助保持酶活性。重复了200和400mg/mL的进料浓度，还研究了600mg/mL。600mg/mL浓度的粘性将进料速率降低至13mL/分钟。没有测试600mg/mL以上的浓度，因为较早的实验证明高进料速率比提高进料浓度更有益于酶活性。以下的表3是实验#3所用的条件的总结。

[0187] 表3

[0188]运行 进料浓度
[mg/mL]
712 200
713 400
714 600

[0189] 进一步研究

[0190] 还进行了酶稳定性研究、细胞渗透性研究、酶浸出研究和对映异构特异性研究。

[0191] 酶稳定性 将喷雾干燥的细胞在室温储存于干燥器中(以防止水分污染)。在17天的时期内分析这些细胞的酶活性以观测可能的活性损失并对酶的稳定性进行定量。

[0192] 细胞渗透性 在最初的工作中(无喷雾干燥)，发酵之后，通过固体/液体分离回收细胞，使用苯扎氯铵(BAC)洗涤剂使细胞渗透以进行酶反应。但是，来自以上实验#1的结果显示了使用喷雾干燥的细胞对于GO和过氧化氢酶活性的可行性。因此，另一个实验(见下)比较了喷雾干燥的细胞和几种其它方法的细胞制剂：a)不进行喷雾干燥且不进行BAC处理；b)不进行喷雾干燥但进行BAC处理；和c)进行喷雾干燥和BAC处理。在喷雾干燥之后使用BAC处理喷雾干燥的细胞以确定喷雾干燥是否完全使细胞渗透。

[0193] 酶浸出 将GO和过氧化氢酶包含于完整生物催化剂之内是有益的。细胞提供免受反应器中剪切力的保护，使酶在空间上靠近从而它们可以一起发挥作用，并且促进酶的回收以重复利用。由于这些原因，研究了GO和过氧化氢酶从喷雾干燥的细胞中的浸出。

[0194] 方法

[0195] 洗涤剂使细胞渗透

[0196] 1.在室温制备10重量％细胞/体积50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)的混合物。加入0.1％(w/v)苯扎氯铵。

[0197] 2.在室温25℃搅拌或缓慢混合60分钟。

[0198] 3.离心(9950xg，10分钟，5℃)，去上清，在5℃将细胞在50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中重悬三次(10％w/v)，离心，去上清。

[0199] 4.可以立即使用渗透的细胞或使用前储存于-80℃达1年。

[0200] 乙醇酸氧化酶浸出检验

[0201] 1.将大约40mg喷雾干燥的细胞(记录准确重量)称入10mL离心管中。

[0202] 2.加入8.0mL DCIP检验溶液(0.12mM 2，6-二氯靛酚和80mM Tris，pH 8.3)。

[0203] 3.混合以使细胞悬浮，然后取出50μL悬浮液(大约0.25mg干细胞)并置于带有搅拌子的3.0mL石英杯中。加入2.0mL DCIP检验溶液。以隔膜封口并以氮气鼓泡3分钟。

[0204] *当测试上清液时(用于酶浸出)，使用2.05mL的上清液，并且不用检验缓冲液进一步稀释。

[0205] 4.通过注射器向杯中加入40μL 1.0M的乙醇酸(或L-乳酸)/1.0M的Tris(pH8.3)，在搅拌情况下将606nm处的吸光度变化测定30秒( )。

[0206] 5.计算总的乙醇酸氧化酶活性。

[0207] 6.在9950xg离心细胞悬浮液10分钟。测定上清液的酶活性(不用缓冲液稀释)。

[0208] 7.将细胞沉淀重悬于6.0mL检验缓冲液，以细胞悬浮液和上清液重复酶检验。

[0209] 过氧化氢酶浸出检验

[0210] 1.将大约40mg喷雾干燥的细胞(记录准确重量)称入10mL离心管中。

[0211] 2.加入8.0mL过氧化氢酶检验缓冲液(0.0167M磷酸盐缓冲液，pH7)。

[0212] 3.混合以使细胞悬浮，然后取出50μL悬浮液(大约0.25mg干细胞)并置于带有搅拌子的3.0mL石英杯中。加入2.0mL过氧化氢酶检验缓冲液。

[0213] *当测试上清液时(用于酶浸出)，使用2.05mL的上清液，并且不用检验缓冲液进一步稀释。

[0214] 4.加入1.0mL过氧化氢溶液(67μL 30％过氧化氢置于10mL检验缓冲液中，pH7.0)，在搅拌情况下将240nm处的吸光度变化测定30秒( )。

[0215] 5.计算总的过氧化氢酶活性。

[0216] 6.在9950g离心细胞悬浮液10分钟。测定上清液的酶活性(不用缓冲液稀释)。

[0217] 7.将细胞沉淀重悬于6.0mL检验缓冲液，以细胞悬浮液和上清液重复酶检验。

[0218] 结果

[0219] 酶活性

[0220] 将进料速率固定于15mL/分钟，温度设定在150℃。条件712、713和714的进料浓度分别为200、400和600mg细胞/mL。每个条件获取6个吸光度测定(一式五份)并用于计算酶活性。将6个酶活性以及调整平均值绘图。调整平均值是四个中间酶活性(除去最高和最低值)的平均值。所测的全部三个条件具有重叠的GO活性，但是随着每个连续进料浓度的增加，调整平均值略有上升(图15)。过氧化氢酶检验显示出较小的可变性，600mg/mL的条件显然产生了最高的过氧化氢酶活性(图16)。达600mg/mL的进料浓度进行的喷雾干燥产生高的酶活性和低的处理体积。没有研究更高的进料浓度，因为其粘性使进料速率下降至15mL/分钟的最佳值以下。

[0221] 酶稳定性

[0222] 最初的工作使用BAC洗涤剂以使细胞渗透而不是进行喷雾干燥，BAC处理的细胞需要储存于-80℃以保持酶活性。在室温将喷雾干燥的细胞储存于干燥器中。在17天的时期内对喷雾干燥的细胞进行三次取样以测定酶活性。对于每个取样条件，获取6个吸光度测定。将平均值作图，误差条代表一个标准偏差。对于GO和过氧化氢酶，在17天的取样时期内没有观察到显著的活性损失(图17-18)。

[0223] 细胞渗透

[0224] 将喷雾干燥细胞的本方法的酶活性与使用BAC洗涤剂进行渗透的最初工作相比较。再次，每个条件具有6个吸光度测定。将平均值作图，误差条显示一个标准偏差。全部的BAC处理的细胞均为渗透的，根据“BAC洗涤剂渗透”进行洗涤。由于BAC处理涉及磷酸盐缓冲液，所以使用40mg吸干的(湿)细胞进行全部渗透细胞的检验。使用40mg干细胞重检验喷雾干燥的未渗透的细胞，所以每个给定细胞质量具有更多的酶。虽然不能在渗透细胞和喷雾干燥的细胞之间进行直接比较，但是可以理解两个重要结论。未经过喷雾干燥的细胞需要BAC渗透以达到有用的GO和过氧化氢酶活性水平，但是全部的未添加洗涤剂的喷雾干燥的细胞均具有合适水平的酶活性(图19-20)。第二，喷雾干燥后进行渗透的细胞显示出较低的GO活性，但是提供可比较的/更高的过氧化氢酶活性，这说明BAC洗涤剂可能对GO酶是有毒性的。

[0225] 表4

[0226] 苯扎氯铵对于喷雾干燥(SD)后的巴斯德毕赤酵母的GO活性的影响

[0227]

[0228] *这些检验在存放了4天的DCIP检验溶液中进行

[0229] 浸出

[0230] 研究浸出的操作条件为150℃，600mg细胞/mL和13mL/分钟(由于进料粘性高，所以进料速率低)。取三个吸光度读数，将产生的酶活性作图，显示了组平均值或统计学平均值。在三次单独洗涤之后重复该过程，测试细胞悬浮液和洗涤上清液的酶活性。细胞悬浮液的酶活性图显示于图21-22中。三次洗涤的每一次之后，均没有观察到GO或过氧化氢酶活性的统计学上的变化。此外，在洗涤上清液中没有检测到可测量的酶活性(未显示)。这强烈表明：喷雾干燥的细胞将不会浸出GO和过氧化氢酶，并且可以在酶反应环境中回收。

[0231] 特异性

[0232] 乙醇酸氧化酶对于各种底物和对映异构体的特异性显示于表5和图23。

[0233] 表5

[0234] 相对GO活性的比较，其中乳酸为100％

[0235]

[0236] 总之，毕赤酵母属的细胞的喷雾干燥使其对于生物催化变成多孔的，不需要任何酶纯化或处理。此外，无需使用多孔性试剂处理，以很多底物达到了最大活性，喷雾干燥的细胞和酶在室温多达30天的时间内是稳定的。此外，反应对于乙醇酸氧化酶是完全对映异构选择性的。

[0237] 实施例2

[0238] 大肠杆菌中GO的表达

[0239] 将GO基因克隆进入大肠杆菌表达质粒pET-32a(Novagen)。使用正向PCR引物(GO-AseI-F，5′GGCTCGGATTAATGGAGATCACAAATGTGAACG-3′；SEQ ID NO：1)和反向PCR引物(GO-XhoI-R，5′-GCATGCCTCGAGTTATAATCTGGCAACAGCACG-3′；SEQ ID NO：2)从质粒pPM1(Payne等人，Gene，167：215(1995))通过PCR扩增GO基因。首先以AseI和XhoI消化1.1kb的PCR产物，然后与从NdeI-XhoI消化获得的pET-32a的5.4kb片段连接。产生的重组质粒命名为pET-GO#11。pET-GO#11的DNA测序显示克隆的GO基因具有单一的点突变(可能由PCR扩增引起)，其不改变GO蛋白的序列。因此，将pET-GO#11转化进入大肠杆菌Rosetta-gami B(DE3)细胞(Novagen)以表达蛋白质。

[0240] 将5mL Rosetta-gami B(DE3)/pET-GO#11的种子培养物在37℃在补充了氨苄青霉素(100μg/mL)和氯霉素(34μg/mL)的LB培养基中生长16小时。种子培养物用于接种250mL LB氨苄青霉素-氯霉素培养基以达到0.01OD600(在600nm处的光密度)单位的最初细胞密度。在30℃在230rpm振荡的情况下温育培养物，直至OD600值达到0.3。继续在
24℃在230rpm振荡的情况下温育，直至OD600值达到0.5至0.6。然后向培养物中加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)(终浓度为0.2mM)以诱导GO蛋白的产生。将诱导的培养物在24℃在230rpm振荡的情况下温育16小时。通过在4℃10,000xg离心10分钟收集细胞。然后将细胞沉淀重悬于10mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)加1mM二硫苏糖醇和1mM苯甲磺酰氟中。将细胞在260MPa通过冷的弗氏压碎器(French pressure cell)两次，从而使细胞破碎。在4℃25,800xg将裂解液离心10分钟，将含有3.7mg蛋白质/mL(按照Bradford检验法测定，BSA作为标准)上清液保存，用作GO活性检验(图25)和SDS-PAGE分析(图
24)的细胞提取物。

[0241] 按照如上所述测定Rosetta-gami B(DE3)/pET-GO#11细胞提取物的GO活性。Rosetta-gami B(DE3)/pET-GO#11细胞提取物的GO活性这样测定：(a)有底物(乳酸盐)，(b)无底物，和(c)有底物和热变性的提取物(将提取物在110℃煮沸10分钟)。将这些结果与相同检验条件下的来自于不含pET-GO#11质粒的Rosetta-gami B(DE3)细胞的对照提取物进行比较。结果以酶活性单位(U)/mg蛋白质作图。

[0242] Rosetta-gami B(DE3)/pET-GO#11可溶组分具有足够的GO活性以产生更多用于喷雾干燥的细胞质量。将100mL Rosetta-gami B(DE3)/pET-GO#11细胞的种子培养物在37℃在补充了氨苄青霉素(100μg/mL)和氯霉素(34μg/mL)的LB培养基中生长16小时。种子培养物用于接种500mL LB-氨苄青霉素-氯霉素培养基以达到0.01 OD600(在600nm处的光密度)单位的最初细胞密度。在29℃在180rpm振荡情况下温育培养物，直至OD600值达到0.3。继续在25℃在230rpm振荡情况下温育，直至OD600值达到0.5至0.6。然后向培养物中加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)(终浓度为0.2mM)以诱导GO蛋白的产生。
将诱导的培养物在25℃在230rpm振荡情况下温育16小时。通过在4℃10,000xg离心10分钟收集细胞。然后将细胞沉淀储存于-80℃，同时重复以上生长步骤以产生总共11g的湿细胞重以用于喷雾干燥研究。

[0243] 将Rosetta-gami B(DE3)/pET-GO#11细胞在4℃解冻。将11g细胞沉淀分成两部分：10g进行喷雾干燥，其余1g保持为对照。使用去离子水将10g细胞稀释至40mL的总体积。这产生用于喷雾干燥器进料的250mg/mL的细胞浓度。喷雾干燥器操作条件为：15mL/分钟进料速率，600L/小时空气流速和150℃入气温度。收集产生的生物催化剂粉末用于GO活性分析。将其余1g Rosetta-gami B(DE3)/pET-GO#11细胞(未喷雾干燥的)在Whatman#2滤纸上吸干以除去多余水分。按照如上所述检验喷雾干燥的细胞和吸干的细胞(对照)的GO活性。喷雾干燥的细胞和吸干的细胞的结果分别显示为U/mg干细胞重和U/mg吸干的细胞重。对于每个细胞制备方法测定3个细胞质量，并且基于每克计算GO活性。最低的细胞质量(0.25mg)接近分光光度计的灵敏度极限，这对于最初的数据点产生较高的误差。喷雾干燥的Rosetta-gami B(DE3)/pET-GO#11细胞保持接近10活性单位/克干细胞(图26)。使用另外的喷雾干燥参数即，操作温度、进料速率和进料细胞浓度的优化，可以在喷雾干燥的Rosetta-gami B(DE3)/pET-GO#11细胞中达到进一步的GO活性。

[0244] 将另一种生物，含有原态过氧化氢酶的酿酒酵母进行喷雾干燥并测试其过氧化氢酶活性。酿酒酵母获自SAF-Instant Company，作为粒状的自由流动的酵母以用于以短的发酵过程烘焙面团。使用去离子水将10g粒状酿酒酵母细胞稀释至100mL的总体积。这产生用于喷雾干燥器进料的100mg/mL的细胞浓度。喷雾干燥器操作条件为：15mL/分钟进料速率，600L/小时空气流速和150℃入气温度。收集产生的生物催化剂粉末用于过氧化氢酶活性分析。另外40mg粒状酿酒酵母(未经喷雾干燥)用作对照。按照如上所述检验喷雾干燥的细胞和对照细胞的过氧化氢酶活性。喷雾干燥的细胞和对照细胞的结果按照U/mg干细胞重作图。对于每个细胞制备方法测定3个细胞重量，并且基于每克计算过氧化氢酶活性。最低的细胞重量(0.25mg)接近分光光度计的灵敏度极限，这对于最初的数据点产生较高的误差。喷雾干燥的SAF-Instant粒状酿酒酵母细胞保持25,000至30,000活性单位/克干细胞。未经喷雾干燥的酿酒酵母可能经过了生产商的加工条件处理以产生粒状酵母，那些条件可能使细胞膜部分渗透并增加了未经喷雾干燥的样品中的过氧化氢酶活性。

[0245] 通过引用将全部的出版物、专利和专利申请并入本文。虽然在前述说明书中已经根据其某些优选的实施方式描述了本发明，并且为了解释说明的目的设定了很多细节，但是对本领域技术人员而言显而易见的是，本发明可以允许另外的实施方式，并且可以在不脱离本发明的基本原理的情况下显著改变本文中的某些细节。