[0001] 本发明涉及酿酒技术领域，具体涉及一种分枝横梗霉及其在制备黄水酯化液中的应用。

[0002] 黄水中含有丰富的残余淀粉、还原糖和大量的有机酸，其中乙酸、丁酸和乳酸的含量最为丰富，若不经过处理直接排放，不仅会污染环境，而且会造成资源浪费。目前黄水可通过大曲制备出酯化液，然后利用串蒸工艺混合在酒体中。然而黄水中的大部分有机酸、糖、淀粉的有机物没有得到高效益的利用，并且目前常常存在酯化液中己酸乙酯含量低且含乳酸乙酯的特点。因此有必要开发出在黄浆水环境高效催化合成己酸乙酯的菌株及处理黄水的方法。所以浓香型白酒企业怎样获得高酯化力菌株以及黄水高效转化是企业目前亟待解决的问题。

[0003] 为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种分枝横梗霉及其在制备黄水酯化液中的应用，该菌株能够将酿酒黄水中有益物质高效转化为可再利用产品，高效利用黄水中的有机酸、糖和淀粉等有机物，处理时间短，对资源的充分利用起到重要作用。

[0004] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种分枝横梗霉(Lichtheimia ramosa)，命名为分枝横梗霉HG，于2023年07月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.40770。

[0005] 上述分枝横梗霉HG在制备黄水酯化液中的应用。

[0006] 一种黄水酯化液，由上述分枝横梗霉HG发酵制得。

[0007] 一种纯种麸皮菌剂，包括上述分枝横梗霉HG。

[0008] 进一步，将分枝横梗霉HG经培养后接种至产酶培养基中，分别放置在30‑37℃的培养箱中培养，5‑7d后取出在40℃烘箱中烘干水分，得到纯种麸皮菌剂。

[0009] 本发明具有以下有益效果：

[0010] 1、本发明提供的菌株能够将酿酒黄水中有益物质高效转化为可再利用产品，高效利用黄水中的有机酸、糖和淀粉等有机物，处理时间短，对资源的充分利用起到重要作用；可提升浓香型白酒中酯类含量，并一定程度上提升了白酒质量，可用于白酒生产，提高白酒酿造过程中副产物的利用率。

[0011] 2、本发明的分枝横梗霉利用白酒酿造过程中黄水为原料，降低了己酸乙酯等酯类物质生产的成本；并且本发明采用高酯化力菌株进行黄水有效转化，提高对白酒副产物的利用率有效的实现酯类物质的高效释放；该方法培养周期短，发酵条件更易控制，便于实施，有利于工业化生产。附图说明

[0012] 图1为α‑萘酚标准曲线图；

[0013] 图2为酯酶酶活测定结果；

[0014] 图3为菌株系统发育树；

[0015] 图4为粗酶温度耐受性；

[0016] 图5为粗酶乙醇耐受性；

[0017] 图6为粗酶pH耐受性。

[0018] 以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

[0019] 实施例1分枝横梗霉M16的分离纯化、筛选和鉴定

[0020] 分枝横梗霉的获取方法，具体步骤如下：

[0021] 1.产酯化酶菌株的筛选

[0022] 1.1培养基的制备

[0023] ①马铃薯琼脂固体培养基(PDA固体培养基)

[0024] 马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃灭菌20min。

[0025] ②LB固体培养基

[0026] 胰蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化钠1g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃灭菌20min。

[0027] ③筛选培养基

[0028] NaCl 0.1‑0.4g，(NH4)2SO4 1.0‑2.0g，MgSO4·7H2O 0.1‑0.5g，K2HPO40.1‑0.5g，琼脂粉20g，丁酸甘油三酯2‑5mL，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃灭菌20min。

[0029] ④产酶培养基

[0030] 在250mL三角瓶中称取20‑30g麸皮，2‑5g高粱，1‑3g大米，再加入20‑30mL蒸馏水，于121℃灭菌30min。

[0031] ⑤马铃薯葡萄糖水培养基(PDB液体培养基)

[0032] 马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃灭菌20min。

[0033] ⑥LB液体培养基

[0034] 胰蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化钠1g，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃灭菌20min。

[0035] 1.2产酯化酶菌株平板初筛

[0036] (1)富集

[0037] 准确称取25g经过破碎的大曲、糟醅、丢糟(来自宜宾某酒厂)，分别加入到含有250mL已灭菌的LB液体培养基和PDA液体培养基的锥形瓶中，放入摇床(180rpm)37℃和32℃富集培养24h。

[0038] (2)稀释涂布

[0039] 从大曲、糟醅、丢糟的富集液中分别取1mL上清液并加入9mL无菌生理盐水，配置成‑1 ‑2 ‑610 菌悬液。依次类推，按10倍梯度稀释成10 ‑10 的菌悬液，各取100μL涂布于固体LB和PDA培养基上，将接种好的固体培养基倒置于恒温培养箱中，37℃和32℃培养24‑72h，观察菌落周围是否有透明圈出现。

[0040] (3)分离纯化

[0041] 挑选菌落周围有透明圈的菌株用“平板划线法”在初筛培养基上进行多次分离纯化，直至平板培养基上为一种菌且为单菌落，挑选单菌落4℃斜面保存。

[0042] (4)透明圈实验

[0043] 将来自浓香型白酒糟醅以及浓香型大曲中的68株与浓香型白酒生产相关的真菌和细菌作为产酯化酶菌株筛选来源，甘油和斜面管取出解冻活化后，在PDA(真菌)和LB(细菌)固体培养基上进行划线活化，分别放置在30℃与37℃培养箱中培养。培养2‑3天后，挑取单菌落点在筛选培养基上，分别放入30℃与37℃培养箱中培养，观察透明圈变化。3‑5天后取出，有明显透明圈的菌落为产酯化酶的菌株，其结果见表1。

[0044] 表1平板初筛结果

[0045]

[0046]

[0047] 由表1可知，部分菌株没有分解丁酸甘油三酯的能力，因此将产生透明圈的菌株进行酯化力测定分析。

[0048] 1.3高酯化酶菌株复筛

[0049] 菌群酯化力的分析

[0050] 将初筛得到的有透明圈的菌株，以1％接种量接入LB液体培养基和YPD液体培养基中，置于37℃，32℃下培养48h，将培养好的菌液10％接种量接入产酶培养基中置于30‑40℃下培养5‑7d，将发酵结束的麸皮醅置于烘箱中35‑40℃烘干或者置于阳光下暴晒晾干，保存备用。酯化力测定具体操作参考QB/T4257‑2011《酿酒大曲通用分析方法》；复筛结果见表2。

[0051] 表2菌株复筛结果

[0052]

[0053] 注：“‑‑”代表未检测到酯化力

[0054] 由表2可知，酯化力达到40mg/g·100h的菌株只有X9、J14、M16三株菌，其中M16菌株酯化力最高达到90mg/g·100h以上，因此将三株酯化力高的菌株进行进一步酶活测定。

[0055] 1.4分光光度法测定菌株酯酶酶活

[0056] 将复筛阶段得到的三株高酯化力菌株(X9、J14、M16)接种至液体种子培养基中，35℃、160r/min培养48h，每瓶产酶培养基中接入6‑10mL种子液，霉菌需将孢子球全部接种至产酶培养基中，35‑45℃、静置培养6天后进行酶活测定。

[0057] 粗酶液提取：将发酵三角瓶中加入50‑100mL磷酸缓冲液(pH 6.0)，搅拌均匀后，40℃水浴25min，过滤，滤液4℃、10000r/min离心15min，上清即为粗酶液。

[0058] α‑萘酚标准曲线的建立

[0059] 具体方法如下：取7支试管编号为0、1、2、3、4、5；加入3mL pH6.0、0.2mol/L磷酸氢二钠一磷酸二氢钠缓冲液后、依次分别加入1.5mmol/Lα‑萘酚标准乙醇溶液0mL，0.01mL，0.02mL，0.04mL，0.06mL，0.08mL，37℃振荡反应15min，取出试管，在其中加0.4mL固兰B盐溶液，振荡混匀，放入37℃的恒温水浴10min后，取出试管在528nm波长处比色，测其光密度，以
0管调零。以吸光值为纵坐标，α‑萘酚浓度为横坐标，制作标准曲线。标准溶液吸光度值测定
2
结果如表3，绘制标准曲线如图1所示，图1中标准曲线R＝0.9959满足酶活计算要求，可用于菌株酯化酶酶活的计算。

[0060] 表3标准溶液吸光度值

[0061]α‑萘酚浓度(mL) 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08
OD528 0 0.168 0.271 0.417 0.624 0.771

[0062] 移取0.5mL粗酶液加入磷酸缓冲液3.0mL、然后加入2.5mmol/Lα‑乙酸萘酯溶液0.1mL于37℃恒温水浴定时反应10min再加入0.4mL 0.8％的固兰B盐溶液显色混匀计时30s时加入0.25mL 1:1的盐酸溶液使显色稳定混匀，以高温处理后的粗酶液作空白用分光光度检测并记录数据。

[0063] 酶活计算：在37℃，PH 6.0条件下，1min水解α‑乙酸萘酯产生1.0nmolα‑萘酚所需的酶量定义为一个酶活单位(U)。

[0064]

[0065] 其中，m‑生成α‑萘酚的量，nmol；

[0066] a‑酶液稀释的倍数；

[0067] t‑反应时间，min；

[0068] V‑酶液体积，mL。

[0069] 上述实验结果如图2所示。

[0070] 由图2可知，M16菌株酶活最高。X9、J14两菌株酶活相差不大，但是较M16菌株偏低，因此将M16菌株确定为高酯化力高酶活菌株进行应用评价。

[0071] 1.5对M16菌株进行分子生物学鉴定

[0072] 利用真菌试剂盒提取M16菌株基因组，以提取的基因组DNA为模板，采用ITS1、ITS4为引物进行PCR扩增，PCR扩增体系(40μL):Taq Master Mix20μL，ITS1、ITS4以提取的霉菌基因组DNA为模板，DNA模板2μL，加入双蒸水(ddH2O)16μL补足。PCR扩增条件：94℃预变性4min、94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，循环28次。然后将PCR扩增产物送至北京擎科生物科技有限公司(成都)进行测序，测序结果拼接后上传至美国国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information，NCBI)的BLAST数据库中，进行同源性比对搜索，选取序列相似性较高的菌株，采用MEGA7.0软件中的邻接
(neighborjoining，NJ)法构建系统发育树，结果如图3所示。

[0073] 由图3可知，将其鉴定菌株M16命名为HG，鉴定结果为该菌株HG为分枝横梗霉(Lichtheimia ramosa)。

[0074] 1.6菌株酯化酶耐受力测定

[0075] 由于在酯化过程中，温度是影响酯类物质合成的主要环境因素，所以对粗酶液的最适温度进行初步探究，明确其最佳温度；在菌株应用过程酯化体系中有酒精度较高，pH低等因素，对酯化酶的耐受力有较高的要求，因此需要对HG菌株粗酶液耐受力进行测定，明确其酯化液中酒度和酸度的含量并进行相应调节。

[0076] 温度对酯化酶活性的影响：分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，pH 7.0的条件下将酯化酶接入到2.5mmol/Lα‑乙酸萘酯溶液0.1mL中测定其反应活力，比较得出最适的酯化酶反应温度。所有实验做三次重复，实验结果如图4所示。

[0077] 由图4可知，该酯化酶在25℃‑40℃温度范围内酶活较高，在30℃时的相对酶活为64.92％比20℃的42.89％有了明显的上升，而且在40℃时相对酶活最高。50℃后相对酶活为75.31％开始急剧下降，60℃的时候只有43.98％的相对酶活，在70℃的时候更是下降到了27.96％的酶活，由此可知酯化酶最适反应温度40℃。

[0078] 乙醇对酯化酶活性的影响：乙醇对酯化酶活性影响的测定范围为1％‑9％的范围，在不同乙醇浓度的缓冲液中反应。将酯化酶接入到2.5mmol/Lα‑乙酸萘酯溶液0.1mL中，37℃反应10min。酯化酶活性的计算为消耗α‑乙酸萘酯的量相对起始含量的百分比(35℃，10min，pH6.0)。所有实验做三次重复，实验结果如图5所示。

[0079] 由图5可知，随乙醇浓度的增大菌株酯酶活性逐渐降低，由最初乙醇浓度在1％时相对酶活为76.34％逐渐下降到乙醇浓度为9％时的8.22％。因此，乙醇浓度对酯化酶的活性影响较大。

[0080] pH对酯化酶活性的影响：pH对酯化酶活性影响的测定范围为pH2.0‑10.0的范围，在50mmol/L不同pH的缓冲液中反应。将酯化酶接入到2.5mmol/Lα‑乙酸萘酯溶液0.1mL中，37℃反应10min。酯化酶活性的计算为消耗α‑乙酸萘酯的量相对起始含量的百分比(35℃，
10min，pH6.0)。所有实验做三次重复，其结果如图6所示。

[0081] 由图6可知，在pH 5.0‑9.0范围内，酯化酶均有活性呈先增大后降低的趋势。且在pH为7.0时，酶活性达到最高。pH 3.0‑7.0的时候酶活呈上升趋势，pH 3的时候相对酶活为5.51％，上升至pH 4.0的时候相对酶活为8.97％，pH 5.0时的酶活17.95％上升到pH 6.0时，保持64％的相对酶活，pH 7.0时，保持83.32％的酶活，pH 8‑9的时候酶活力开始下降，pH 8的时候下降至酶活力72.86％，pH 9.0的时候酶活力仅有61％。因此，该菌酯化酶最适反应pH为7.0，在中性条件下有最大酶活力。

[0082] 实施例2菌株黄水酯化能力验证

[0083] 将分枝横梗霉HG在制备黄水酯化液中的应用，具体步骤如下：

[0084] 2、高酯化力菌株黄水酯化能力验证

[0085] 2.1微生物纯种菌剂制备

[0086] 将筛选得到的株菌分别在PDA(真菌)和LB(细菌)固体培养基上进行划线活化，分别放置在30℃与37℃培养箱中培养。培养2‑3天后，在无菌操作台中将培养皿盖子打开，每个培养皿中倒入10mL无菌水，轻轻晃动培养皿使菌体/孢子与水混匀，吸取1mL菌液接种至[0087] 产酶培养基中，分别放置在30℃与37℃培养箱中培养，57天后取出在40‑45℃烘箱中烘干水分。即为纯种麸皮菌剂。

[0088] 2.2黄水酯化体系的配置

[0089] 取某酒厂正常发酵的新鲜黄水，静置一周后除去上层悬浮物及下层沉淀物，对经以上处理的黄水进行总酯、总酸、酒精度、pH的测定和气相色谱‑质谱分析。

[0090] 气相色谱‑质谱(GC‑MS)条件

[0091] GC条件：DB‑WAX(30m×0.25mm×0.25μm)色谱柱；载气为氦气(99.999％)，恒定流量为1mL/min，进样方式为不分流，进样口温度250℃；升温程序：起始温度40℃保持3min，以5℃/min升温至230℃，保持7min。

[0092] MS条件：离子源口温度250℃；升温程序：起始温度40℃保持3min，以5℃/min升温至230℃，保持7min，(EI)温度230℃，电子能量70eV；质量扫描范围m/z 35～350。进样量：1μL。

[0093] 黄水基础指标分析表如表4所示。

[0094] 表4黄水基础指标分析表

[0095]

[0096] 注：“‑‑”代表未检测到

[0097] 黄水酯化液酯化力测定及组成分析

[0098] 反应基础液配制：量取处理后的黄水500 mL(pH调至4.5‑6.53)，加入9％‑13％乙醇配成酯化反应基础液。在反应基础液中加入纯种麸皮菌剂样品20‑35g，在35℃恒温培养箱中酯化7天后，将浓香型白酒糟醅按10％‑20％的比例加入黄水酯化液中在30‑45℃下放置24h过滤备用，对黄水酯化液进行酯化力测定及主要微量成分色谱分析。参照QB/T 4257‑2011《酿酒大曲通用分析方法》对黄水酯化液进行蒸馏，取940μL馏出液，再加60μL乙酸异戊酯内标物进行GC‑MS半定量分析，其结果如表5所示。

[0099] 表5黄水与酯化液主要微量成分含量分析表

[0100]

[0101] 注：“‑‑”代表未检测到

[0102] 由表5可知，黄水酯化液中酯类物质较黄水中有很大提升，其中己酸乙酯含量是黄水中的10.5倍，乳酸乙酯的含量较黄水中明显下降；其次，黄水酯化液中酸类物质大幅下降，杂醇类物质的含量有所下降。实验结果体现出该菌株具有较强的酯合成能力，对乳酸乙酯和乳酸有一定的分解转化能力；该酯化液中己酸乙酯含量的大幅度增加能对黄水进行有效转化提高了黄水利用率，使得浓香型白酒副产物黄水资源化利用成为可能。

[0103] 实施例3

[0104] 从实施例2获取的酯化液的应用方法，具体包括以下步骤：

[0105] 3、黄水酯化液串糟蒸馏

[0106] 将实施例2中得到的黄水酯化液应用于白酒蒸馏过程中，对其酒的风味进行分析，评价其黄水酯化液在蒸馏过程中对白酒风味的影响程度。

[0107] 将发酵结束刚出窖的新鲜糟醅(宜宾某酒企)取回，密封放4℃冰箱保存备用，对实施例2中得到的酯化液再次进行低温静置过滤弃下层沉淀操作，将得到的上层酯化液以一定量置于蒸馏装置底部，再将从酒厂取回的糟醅按要求放入蒸馏装置中进行蒸馏取酒(J3)；将蒸馏装置中的黄水酯化液换成相同量的黄水加入新鲜糟醅进行相同蒸馏操作(J2)；再将蒸馏装置中黄水酯化液换成纯净水加入新鲜糟醅进行相同蒸馏操作(J1)；每100ml分段取酒测其酒精度，密封4℃保存备用。按实施例2中气相色谱质谱仪联用仪(GC‑MS)进样条件，对其三种不同底锅水蒸馏得到的酒进行分析，其结果如表6所示。

[0108] 表6三种不同底锅水蒸馏酒样微量成分分析

[0109]

[0110]

[0111] 注：“‑‑”代表未检测到

[0112] 由表6可知，将黄水酯化液进行串糟蒸馏后，J3中己酸乙酯含量较J2和J1中有明显提高，乳酸乙酯的含量较J2和J1中下降明显，乙酸乙酯含量变化不大，丁酸乙酯的含量较微量，符合优质浓香型白酒中四大酯的量比关系。J3中杂醇类物质较J2和J1中有明显下降，对于降低浓香型白酒中杂醇类物质起着促进作用，对于白酒品质的改变呈积极作用。

[0113] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。