[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种应答转录调节因子基因及其应用。

[0002] 葡萄酒酿制主要包含两大发酵过程：酒精发酵和苹果酸乳酸发酵，分别由不同的微生物主导完成。酒精发酵过程主要由酿酒酵母完成，将葡萄糖等有机糖类分解产生乙醇并形成CO2。苹果酸乳酸发酵主要由酒酒球菌完成，该过程是生产高品质葡萄酒所必需的，因为经过苹果酸乳酸发酵，会降低葡萄酒的酸度，增强微生物稳定性，减弱苦涩感，且该过程可以改变葡萄酒的香味结构，增加其果香味，另外酒酒球菌在代谢过程中会产生双乙酰等香味化合物，增加葡萄酒口感风味。

[0003] 苹果酸乳酸发酵过程通常在酒精发酵后期启动，此时发酵液环境比较恶劣，pH较低，在3.0～3.5之间。较低的pH值通常影响细菌胞内pH稳定性，增加细胞从胞内外排含质子难度，当胞内pH值降低时会影响胞内各种酶类及DNA稳定性，从而影响细胞生长分裂。多数乳酸菌无法在这种胁迫条件形成的严苛环境中生存，酒酒球菌因其长期适应性进化成为葡萄酒酿制过程中的主要菌种，并成为苹果酸乳酸发酵主要完成者。因此，对酒酒球菌为何可以适应葡萄酒酿制过程中的酸胁迫条件的机制探究具有重要意义。

[0004] 本发明提供了一种应答转录调节因子基因，该基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

[0005] 本发明同时提供了上述应答转录调节因子基因的突变型，该突变型基因的核酸序列如

[0006] SEQ ID NO:2所示。

[0007] 本发明还提供了含有上述应答转录调节因子基因和/或其突变型的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。

[0008] 本发明还提供了上述应答转录调节因子基因和/或其突变型在提高菌种耐酸性能中的应用。

[0009] 在上述应用中，所述菌种包括但不限于酒酒球菌、植物乳杆菌等菌种。

[0010] 本发明提供了一种提高菌种耐酸性的方法，是将上述应答转录调节因子基因或其突变型构建到表达载体中形成重组表达载体，然后将重组表达载体转化菌株，获得含有应答转录调节因子基因或其突变型的重组菌株，并最终通过应答转录调节因子基因或其突变型的表达，以提高菌株的耐酸性能。

[0011] 在上述方法中，所述表达载体包括但不限于大肠杆菌pIB184质粒等载体。

[0012] 本发明提供了上述应答转录调节因子基因和/或其突变型在提高苹果酸乳酸发酵过程由酒酒球菌主导的葡萄酒发酵品质中的应用。

[0013] 在上述应用中，所述酒酒球菌被转化有外源的上述应答转录调节因子基因和/或其突变型。

[0014] 本发明的有益效果为：

[0015] 酒酒球菌中的orf00404编码基因被本发明首次证实与菌种的耐酸性调控相关。这一耐酸性能的开发，有利于提高酒酒球菌在葡萄酒苹果酸乳酸发酵中的发酵性能，从而进一步提高葡萄酒的品质，具有重要的应用前景。附图说明

[0016] 图1为orf00404目的基因扩增条带；其中，泳道1为SD‑2a来源，泳道2为DEa3来源；

[0017] 图2为重组质粒构建过程示意图；

[0018] 图3为酶切产物琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道1代表BamH I和EcoR I双酶切后pIB184质粒，泳道2～5均代表pIB184质粒；

[0019] 图4为大肠杆菌菌落转化PCR电泳图；其中，泳道0代表pIB184质粒空载体菌落PCR产物电泳，泳道1～5代表酒酒球菌DEa3来源orf00404基因重组质粒菌落PCR电泳图，泳道6‑10代表酒酒球菌SD‑2a来源orf00404基因重组质粒菌落PCR电泳图；

[0020] 图5为野生型酒酒球菌SD‑2a来源orf00404基因的电转培养结果图；

[0021] 图6为突变型酒酒球菌DEa3来源orf00404基因菌落的PCR产物电泳图；

[0022] 图7为野生型酒酒球菌SD‑2a来源orf00404基因菌落的PCR产物电泳图；

[0023] 图8为重组菌株与对照菌株在不同pH条件下的生长曲线；其中，A～E的pH值分别为3.2、3.4、3.6、3.8、4.0；

[0024] 图9为胞内pH值标准曲线测定图；

[0025] 图10为重组菌株与对照菌株胞内和胞外pH值在不同时间段的测定结果；

[0026] 图11为酸胁迫处理不同时间下重组菌株与对照菌株的Ka值测定图，其中，不同字母表示具有显著性差异，p＜0.05；

[0027] 图12为酸胁迫处理不同时间下重组菌株与对照菌株细胞膜通透性测定图，其中，不同字母表示具有显著性差异，p＜0.05；

[0028] 图13为酸胁迫处理不同时间下重组菌株与对照菌株细胞膜完整性测定值，其中，不同字母表示具有显著性差异，p＜0.05；

[0029] 图14为蛋白含量标准曲线测定图；

[0030] 图15为酸胁迫处理不同时间下重组菌株与对照菌株胞内蛋白含量测定图，其中，不同字母表示具有显著性差异，p＜0.05；

[0031] 图16为酸胁迫处理不同时间下重组菌株与对照菌株胞内ATP的含量测定图；其中，不同字母表示具有显著性差异，p＜0.05；

[0032] 图17为苹果酸的消耗与乳酸的生成量。

[0033] 本发明的试验材料如下：

[0034] 菌株：野生型酒酒球菌SD‑2a、突变型酒酒球菌DEa3、大肠杆菌Top10、质粒pIB184、植物乳杆菌WCFS1。其中，突变型酒酒球菌DEa3由本实验室通过筛选获得。

[0035] 试剂：AG SteadyPure质粒DNA提取试剂盒、AG SteadyPure细菌基因组DNA提取试剂盒、AG SteadyPure PCR反应液纯化试剂盒、PCR高保真酶、AG 2000bp DNA Marker、AG 5000bp DNA Marker、QuickCut EcoR I、QuickCut BamH I、无缝克隆连接试剂盒、红霉素、荧光探针BCECF AM，HEPES‑K(pH 8.0)、不同浓度的磷酸缓冲液、甲醛、嵌二萘探针、pNPG、pI，Solarbio BCA蛋白浓度测定试剂盒，Solarbio ATP含量检测试剂盒。

[0036] 仪器：超净工作台(SW‑CJ‑2D，苏州净化设备有限公司)、高压灭菌锅(GT‑180，致微(厦门)仪器有限公司)、PCR仪(T100TM Thermal Cycler，北京六一生物科技有限公司)、电泳仪(DYY‑6D，北京六一生物科技有限公司)、凝胶成像仪(GenoSens 1860，上海勤翔科学仪器有限公司)、生化培养箱(LRH‑250‑A，韶关市泰宏医疗器械有限公司)、微量分光光度计(MD2000D，英国Biofuture公司)、高速冷冻离心机(Sorvall ST 16R，北京世贸远东科学仪器有限公司)、电转仪(SCIENTZ‑2C，宁波新芝生物科技股份有限公司)、紫外可见分光光度计(UV‑5500，上海元析仪器有限公司)、酶标仪(INFINITE 200PRO，TECAN)、高效液相色谱仪(1220Infinity LC，Agilent Technologies Inc)、荧光分光光度计(F‑4700，日本株式会社日立高新技术那珂事业所)。

[0037] 培养基：LB培养基：蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母浸粉5g、水1000g、琼脂15g，pH为7.2～7.4，灭菌条件：121℃，20min。MRS培养基：牛肉膏10g、酵母膏5g、葡萄糖20g、K2HPO4 
2g、醋酸钠5g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、吐温80 1mL、柠檬酸三铵2g、水1000mL、琼脂15g，pH为6.2，灭菌条件：115℃，15min。

[0038] 本发明所采用的其它材料，如无特殊声明，均可通过市售渠道获得。本发明所使用的其它术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

[0039] 本实验室前期通过定向进化技术获得了酸胁迫条件下生长情况明显优于野生型的酒酒球菌SD‑2a的突变株DEa3。

[0040] 前期定向进化试验，如下：

[0041] 在进行实验之前，先将酒酒球菌SD‑2a用接种环接种到pH为4.8的ATB培养基上进行活化。将活化后的菌液接种到pH为3.2的ATB培养基上，在25℃下静置培养，培养大约五代。再将其转接到pH为3.1的ATB培养基上，再继续培养五代。重复上述过程，一直转接到pH为2.8的ATB培养基上为止。然后准备进行各项指标检测的实验。菌种经过长达四个多月的定向进化实验后，由于受到酸性环境的胁迫以及多种因素的影响，自身产生在适应性的同时，也可能会发生有利突变。本实验在定向进化过程中获得了耐酸的酒酒球菌菌株。经基因组测序发现该菌株中响应转录调节因子orf00404编码基因在331bp处发生点突变，碱基由G突变为T。

[0042] 野生型酒酒球菌SD‑2a的orf00404编码基因序列，如下：

[0043] ATGGTAAAACCAATCATTCTTATAATCGAAGATGAGACAGCTATTGTAGCTTATTTACAGACGGAACTTAAATTTGAAGATTATATTGTTTTGACAGCTAGTGATGGCGAAATGGGCCTTTCAGTTTTTGAACAGAATTCAAACCGAATTAATGTAGTTTTGCTTGATTGGATGTTGCCAAAACGAGATGGGCTCGAAGTTTTACGGCGCATTAGAAAATTAAATAGTCAGGTTTCTATAATTCTTATGACCGCTAAAAGTGATATTGGCGATAAAGTAGCTGCATTAGATTCTGGTGCAGATGACTATATTACGAAGCCTTTTGAAATTGAAGAACTTTTAGCACGTTTAAGAGTGACGATTCGTCATCAAAATAAGCCACGCCCAAAACTATATCAGGTATCTAACTTAGTGCTGGATTTAGACGCACACCGTGTTACAAGGGATGGACAGGTTATTGATTTAACGCAAAGAGAGTTCCAACTTTTAACATATTTAATTGAAAATGCAGGCAAAACGCTTACTCGCGATGATTTACTTGATAATGTTTGGGGAGTTGATTTTAACGGTCAATATAATACAGCTGATGTTTATATACGCTATCTTCGTCAAAAGATAGATGATCATTTTTATCCGAAGCTTATTCATACGGTTCGTAGTGTTGGATATGTCTTAAGGGCAAAATAA(SEQ ID NO:1)

[0044] 突变型酒酒球菌DEa3的orf00404编码基因序列，如下：

[0045] ATGGTAAAACCAATCATTCTTATAATCGAAGATGAGACAGCTATTGTAGCTTATTTACAGACGGAACTTAAATTTGAAGATTATATTGTTTTGACAGCTAGTGATGGCGAAATGGGCCTTTCAGTTTTTGAACAGAATTCAAACCGAATTAATGTAGTTTTGCTTGATTGGATGTTGCCAAAACGAGATGGGCTCGAAGTTTTACGGCGCATTAGAAAATTAAATAGTCAGGTTTCTATAATTCTTATGACCGCTAAAAGTGATATTGGCGATAAAGTAGCTGCATTAGATTCTGGTGCAGATGACTATATTACGAAGCCTTTTGAAATTTAAGAACTTTTAGCACGTTTAAGAGTGACGATTCGTCATCAAAATAAGCCACGCCCAAAACTATATCAGGTATCTAACTTAGTGCTGGATTTAGACGCACACCGTGTTACAAGGGATGGACAGGTTATTGATTTAACGCAAAGAGAGTTCCAACTTTTAACATATTTAATTGAAAATGCAGGCAAAACGCTTACTCGCGATGATTTACTTGATAATGTTTGGGGAGTTGATTTTAACGGTCAATATAATACAGCTGATGTTTATATACGCTATCTTCGTCAAAAGATAGATGATCATTTTTATCCGAAGCTTATTCATACGGTTCGTAGTGTTGGATATGTCTTAAGGGCAAAATA(SEQ ID NO:2)

[0046] 因酒酒球菌遗传转化体系不够成熟，本实验室利用重组质粒及转化技术获得含有酒酒球菌野生型菌株SD‑2a和突变株DEa3来源的orf00404编码基因的植物乳杆菌WCFS1重组菌株及含有空载体的对照菌株，通过测量重组菌株和对照菌株在胁迫条件下的细胞膜流动性、细胞膜完整性、细胞膜通透性、胞内pH值等指标来确定orf00404编码基因发挥作用的途径，为最终阐释orf00404编码基因在酒酒球菌SD‑2a中的功能奠定基础。

[0047] orf00404编码基因功能验证，具体试验如下：

[0048] 1、重组质粒的构建

[0049] (1)基因组提取和引物合成

[0050] 取少量酒酒球菌SD‑2a和DEa3菌液，划线于FT80固体平板上，30℃静置培养，待菌落长出后挑取单菌落扩大培养，再提取基因组DNA。orf00404引物及转化子验证引物序列如表1所示：

[0051] 表1

[0052]

[0053] 注：斜体加粗序列为pIB184质粒同源臂序列，用于无缝克隆

[0054] (2)目的基因PCR扩增

[0055] 分别以SD‑2a和DEa3基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系如下：模板1μL、正向引物1μL、反向引物1μL、高保真酶12.5μL、ddH2O 9.5μL，PCR扩增反应条件如下：预变性(94℃，30s，循环1次)、变性(98℃，10s，循环34次)、退火(57℃，30s，循环34次)、延伸(72℃，1min，循环34次)、最终延伸(72℃，2min，循环1次)。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，比对扩增片段是否符合设计长度。

[0056] 电泳结果如图1所示：电泳条带清晰单一且大小正确，因此PCR扩增产物可以用于后续实验。

[0057] (3)目的基因片段纯化

[0058] 将大小正确的扩增片段按照纯化试剂盒说明进行纯化。

[0059] (4)pIB184质粒的提取

[0060] 将E.coli Top10(含pIB184质粒)菌液划线于含有红霉素的LB平板上(终浓度100μg/mL)，提取质粒。

[0061] (5)pIB184双酶切

[0062] 用EcoR I、BamH I双酶切pIB184质粒得到线性化载体。方法参照EcoR I、BamH I说明书。对酶切产物进行纯化，测定浓度后于‑35℃冻存。

[0063] (6)构建重组质粒

[0064] 重组质粒构建程序图谱如图2所示。用PCR仪于37℃育孵30min，最后降至4℃完成无缝克隆。重组反应体系如下：线性化载体XμL、插入片段YμL、5×CEⅡBuffer 4μL、ExnaseⅡ2μL、ddH2O加至20μL。最适克隆片段使用量按照Vazyme使用说明书添加。

[0065] 双酶切产物验证结果如图3所示：电泳条带清晰单一，同时酶切产物长度大于原pIB184质粒。纯化后测得浓度为102.0251ng/μL且产物中蛋白和RNA残留较少。因而此线性载体可用于后续重组实验。

[0066] (7)E.coli Top10感受态细胞的制备

[0067] E.coli Top10感受态细胞的制备方法详见参考文献：刘璐，等.乳酸乳球菌NZ9000中增强型绿色荧光蛋白报告系统的构建[J].食品与发酵工业,2020,46(11):46‑5.[0068] 2、重组产物转化

[0069] 重组产物转化方法详见Vazyme使用说明书。

[0070] 3、验证转化子

[0071] 挑取单菌落作为模板，按照下述体系添加反应液，PCR反应体系：模板1μL、pIB184‑BDYZ‑F 1μL、pIB184‑BDYZ‑R 1μL、2X Accurate Taq Master Mix 12.5μL、ddH2O加至25μL。按照下述程序进行菌落PCR，PCR反应程序：预变性(94℃，30s，循环1次)、变性(98℃，10s，循环34次)、退火(57℃，30s，循环34次)、延伸(72℃，1min，循环34次)、最终延伸(72℃，2min，循环1次)。PCR反应程序结束后，取2μL的PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳电压100V，电泳时间30min。电泳结束后经凝胶成像仪通过紫外透视观察条带大小。将序列长度比对正确的转化子提取质粒并测序。最后冻存基因序列比对正确的质粒。

[0072] 重组转化验证结果如图4所示：条带清晰单一，根据目的基因长度比对电泳条带大小，泳道2、3、4、5、7、8、9、10检测条带大小符合目的条带长度，其对应菌落为成功转入重组质粒的菌落。

[0073] 将电泳验证正确的转化子培养并保藏，活化转接后提取质粒并送公司测序。经测序后比对基因序列，确定测序正确的转化子作为后续实验材料。

[0074] 4、重组质粒转入植物乳杆菌WCFS1

[0075] 将构建成功的重组质粒以及pIB184质粒分别电转至植物乳杆菌WCFS1感受态细胞中，电转方法参考如下文献：Teresa A M,Carmen R M,Mesas J M.Transformation of Lactobacillus plantarum by electroporation with in vitro modified plasmid DNA[J].Fems Microbiology Letters,2010,241(1):73‑77。然后在FT80固体培养基上培养。

[0076] 电转后培养结果如图5所示：平板上的单菌落符合植物乳杆菌菌落形态。

[0077] 5、验证转化子

[0078] 转化子验证方法同上述第3步：“验证转化子”。挑取单菌落进行菌落PCR实验，1％琼脂糖凝胶电泳检测菌落PCR产物。

[0079] 电泳结果如图6和图7所示：

[0080] 电泳条带清晰明亮，无双峰无拖尾，且条带长度符合目的基因长度，所培养的转化子均可用于后续实验。待培养的转化子菌液生长至浑浊状态后于‑35℃甘油管藏。

[0081] 6、重组耐受试验

[0082] (1)酸胁迫耐受实验

[0083] 分别活化WCFS1(pIB184)、WCFS1(pIB184‑wild)、WCFS1(pIB184‑mutant)菌株，按照1％量分别接种于pH为3.2、3.4、3.6、3.8、4.0的MRS培养基中，37℃下每12h测定OD600nm值并绘制生长曲线。分析orf00404基因对植物乳杆菌酸胁迫耐受性的影响，选出重组菌株与对照菌株生长情况差异最大的培养条件。理化指标测定条件参见如下文献：赵文英，李华，王华.乙醇胁迫处理对酒酒球菌SD‑2a生理特性的影响[J].微生物学通报,2011,38(01):51‑56。

[0084] 菌株在不同酸胁迫条件下的生长曲线如图8所示：

[0085] 在5个不同pH的酸胁迫环境中，重组菌株生长速度均显著快于对照菌株，pH 3.2及pH3.4条件下，重组菌株在对数生长期及稳定生长期生物量均显著高于对照菌株，且重组菌株WCFS1(pIB184‑mutant)生长略快于WCFS1(pIB184‑wild)，说明在pH 3.2与pH 3.4条件下，重组菌株相较于对照菌株有更强的耐酸胁迫能力，且重组菌株WCFS1(pIB184‑mutant)的耐酸胁迫能力优于重组菌株WCFS1(pIB184‑wild)。在pH 3.6、pH 3.8、pH 4.0的条件下，重组菌株和对照菌株生物量均显著高于pH 3.2、pH 3.4酸胁迫条件，且对数生长期重组菌株生长速度显著快于对照菌株，进入稳定期后因为培养基营养条件限制等因素对照菌株生物量逐渐接近重组菌株或与对照菌株无显著差异。生长曲线测量结果表明重组菌株在酸胁迫条件下的生长性能均优于对照菌株。

[0086] (2)理化性质的测定

[0087] a、胞内pH

[0088] 胞内pH值作为细胞内部环境的一个基本的参数，在维持细胞内各种酶促反应中发挥着重要的作用。胞内pH值与胞外pH值稳定也是植物乳杆菌抵御酸胁迫的一种重要机制。pH标准曲线的测定及样品组胞内pH的测定和计算参照如下文献：张梦汝.DNA修复蛋白RecO及亮氨酸代谢对乳酸菌多种胁迫抗性的影响[D].江南大学,2014。

[0089] 用含有空载体的植物乳杆菌WCFS1绘制胞内pH值标准曲线，如图9所示，R的平方值为0.9943，结果表明该标准曲线线性关系良好，可用于后续重组菌株与对照菌株胞内pH值的测定。

[0090] 重组菌株与对照菌株胞内pH值在不同时间段的测定结果如图10所示，酸胁迫处理后，重组菌株和对照菌株的胞内pH经历波动后均有所下降，其中重组菌株WCFS1(pIB184‑mutant)的胞内pH稳定在6.62，重组菌株WCFS1(pIB184‑wild)的胞内pH稳定在6.47，而对照菌株胞内pH值稳定在6.42。通过比较，重组菌株与对照菌株酸胁迫处理108h后的胞内pH值大小无显著差异，但重组菌株酸胁迫处理108h后胞内pH下降幅度(相较于0h)低于对照菌株。酸胁迫处理后，重组菌株和对照菌株的胞外pH值逐渐下降，重组菌株WCFS1(pIB184‑mutant)的胞外pH降至3.58，重组菌株WCFS1(pIB184‑wild)的胞外pH降至在3.65，对照菌株降至3.79。不同于胞内pH，重组菌株的胞外pH的下降幅度均高于对照菌株，将其结合图8的实验结果可知，在胞外pH的下降幅度高于对照组的情况下，重组菌株生长情况还优于对照菌株，这说明重组菌株的耐酸性能比对照菌株要好。

[0091] b、细胞膜流动性

[0092] 细胞膜是细菌抵御细胞外部胁迫环境的首道屏障，酸胁迫培养会促使细胞膜硬化。在酸胁迫处理菌株不同的时间段后，用嵌二萘作细胞膜探针，根据所测荧光强度比值Ka来表示菌体细胞膜流动性，比值越大表明流动性越差。调节菌体浓度为OD600nm＝0.6(菌体收集时间同上述步骤a)，细胞膜流动性参照如下文献：吴重德.干酪乳杆菌抵御酸胁迫的生理机制解析[D].江南大学,2012。

[0093] 重组菌株与对照菌株细胞膜流动性结果如图11所示，经酸胁迫处理60h后，重组菌株和对照菌株所测得的Ka值相较于0h显著上升，表明此阶段菌体为抵御外界酸性环境而导致细胞膜硬化，细胞膜流动性下降。酸胁迫处理72h所测得的Ka值较于60h又显著下降，而经酸胁迫培养108h各菌株的Ka值又显著上升。重组菌株在酸胁迫处理72h、108h时Ka值均小于对照菌株，表明重组菌株在这两个时间点的细胞膜流动性要优于对照菌株，且酸胁迫处理72h、108h时重组菌株WCFS1(pIB184‑wild)的细胞膜流动性均优于重组菌株WCFS1(pIB184‑mutant)(P＜0.05)。

[0094] c、细胞膜通透性

[0095] 植物乳杆菌细胞内也含有β‑D‑半乳糖苷酶，该酶会在细胞内膜的通透性升高到特定水平时渗透到细胞外。β‑D‑半乳糖苷酶的底物是pNPG，pNPG在波长420nm处有吸收峰值，因此可根据处理后的细胞在420nm的吸光值表示细胞内膜的通透性变化。

[0096] 离心收集菌体细胞(3000rpm,15min)重悬于10mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.4)中并调整OD600nm为1(菌体收集时间同上述步骤a)，加入10μL的5mmol/L pNPG，置于37℃处理，2h后于420nm下读数。

[0097] 试验结果如图12所示：

[0098] 酸胁迫处理60h时，细胞膜的通透性显著性降低；各菌株在经过一段时间对酸胁迫的适应后，耐受性得到增强，72h时细胞膜的通透性显著性增加，随着酸胁迫处理时间延长，108h时细胞膜的通透性又显著性降低。酸胁迫处理60h、72h时重组菌株细胞膜的通透性均高于对照菌株。

[0099] d、细胞膜完整性

[0100] 酸胁迫处理会影响菌株的细胞膜完整性，PI探针只会对细胞膜破损的细胞进行染色处理，所测得的荧光值越大表明细胞膜完整性越差。离心收集菌体细胞(菌体收集时间同上述步骤a)。样品组细胞膜完整性测定参照如下文献： da Silveira M,Vitória SanM,Loureiro‑Dias Maria C,Rombouts Frans M,Abee T.Flow cytometric assessment of membrane integrity of ethanol‑stressed Oenococcus oeni cells[J].Applied and environmental microbiology,2002,68:6087‑6093。

[0101] 试验结果如图13所示：

[0102] 0h时未经酸胁迫处理的重组菌株与对照菌株的细胞膜完整性并无显著差异(P＞0.05)；经酸胁迫处理60h时，重组菌株与对照菌株的细胞膜完整性降至最低，随着酸胁迫处理时间延长，各菌株细胞膜完整性逐渐恢复。在酸胁迫处理60h和72h时，重组菌株的细胞膜完整性均优于对照菌株。不过，在胁迫处理108h时，重组菌株WCFS1(pIB184‑mutant)细胞膜完整性低于另外两个菌株(P＜0.05)。

[0103] e、胞内蛋白浓度的测定

[0104] 菌株胞内蛋白浓度主要用于辅助胞内ATP含量的表示。低温离心收集菌体后，用PBS(pH 7.0)洗涤菌体并重悬(菌体收集时间同上述步骤a)，超声破碎菌体细胞，取上清液。超声条件：40％功率，20min，工作5s，间歇5s。测定方法按照Solarbio BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书步骤进行。

[0105] 胞内蛋白含量标曲结果如图14所示，R的平方值为0.99937，表明该标准曲线有较好的线性关系，可用于后续实验。

[0106] 重组菌株与对照菌株胞内蛋白含量结果图15所示，重组菌株与对照菌株在未经酸胁迫处理时，胞内蛋白含量维持在一个较高水平且重组菌株WCFS1(pIB184‑mutant)与对照菌株没有显著性差异(P＞0.05)；在经酸胁迫处理后的第60h，对照菌株没有发生明显的上下调，但是重组菌株WCFS1(pIB184‑mutant)胞内蛋白含量显著增加，重组菌株WCFS1(pIB184‑wild)胞内蛋白含量显著下降。在酸胁迫处理72h后，重组菌株与对照菌株胞内蛋白含量均显著降低。在酸胁迫108h时，重组菌株与对照菌株胞内蛋白含量相较于第72h均有所上升。在酸胁迫处理的三个时间段内，重组菌株与对照菌株蛋白含量均有显著性差异(P＜0.05)，同时在酸胁迫处理后期(第72h及108h)时，重组菌株的胞内蛋白含量显著高于对照菌株(P＜0.05)。

[0107] f、胞内ATP含量测定

[0108] 在酸胁迫环境下，细胞内的质子会逐渐消耗与排出，菌株细胞膜内外会逐渐形成质子梯度驱动的跨膜电动势，用以驱动菌株细胞膜上的ATPase合成ATP，为菌株细胞提供生存所必须的能量。

[0109] 超声破碎细胞，菌体收集时间同上述步骤a，破碎条件同上述步骤e，测定方法参照Solarbio ATP含量检测试剂盒说明书。

[0110] 试验结果如图16所示：

[0111] 重组菌株与对照菌株细胞内ATP在酸胁迫处理前均处于一个较高的水平，但是重组菌株WCFS1(pIB184‑wild)与对照菌株没有显著性差异。在酸胁迫处理60h后，重组菌株与对照菌株胞内ATP含量均显著下降，在经历酸胁迫处理后，两个重组菌株与对照菌株胞内ATP含量均出现显著性差异(P＜0.05)，同时在此阶段，对照菌株胞内ATP含量下调量显著高于两个重组菌株。随着菌株对酸胁迫处理的适应，各菌株胞内ATP含量逐渐恢复或增加。酸胁迫处理下，重组菌株的胞内ATP含量均显著高于对照菌株(P＜0.05)，且重组菌株WCFS1(pIB184‑mutant)胞内ATP含量显著高于重组菌株WCFS1(pIB184‑wild)(P＜0.05)。这表明酸胁迫条件下重组菌株胞内ATP合成能力较对照菌株更强。

[0112] g、苹果酸的消耗及乳酸的生成量的测定

[0113] 分别在0h、60h、72h、108h时菌液2mL，4℃条件下12000r/min离心2min，取上清液，采用高效液相色谱法检测苹果酸及乳酸的含量。

[0114] 高效液相色谱条件参照如下文献：莫润明，等.陈香型铁观音陈化过程中特征有机酸变化分析[J].食品研究与开发,2021,42(20):21‑27。方法稍作调整：水相改为99％的超纯水(pH2.5，用高氯酸调节pH)，柱温设置为55℃。

[0115] 试验结果如图17所示：

[0116] 随着酸胁迫的时间不断延长，重组菌株与对照菌株培养基中的苹果酸含量呈递减趋势。根据各菌株的培养基质在第0h、60h、72h、108h的苹果酸含量对比可知，重组菌株WCFS1(pIB184‑wild)、WCFS1(pIB184‑mutant)对苹果酸降解能力均高于对照菌株，在第108h时，重组菌株的苹果酸含量分别是对照菌株的42.358％和86.145％。与此相对应，重组菌株与对照菌株培养基中的乳酸含量的变化规律与苹果酸相反，随着培养时间的延长，培养基质中乳酸含量逐渐增加，培养至第108h时重组菌株培养基中乳酸含量显著高于对照菌株。以上数据表明酸胁迫条件下重组菌株苹果酸乳酸发酵活性显著强于对照菌株。

[0117] 综上所述，根据上述重组菌株与对照菌株酸胁迫耐受性测定结果，重组菌株在酸胁迫条件下的生长性能均优于对照菌株，这说明异源表达转录调控因子orf00404基因能够提高植物乳杆菌的酸胁迫耐受性能。也同时表明，orf00404基因可以调控菌种的耐酸性能。

[0118] 酒酒球菌作为启动葡萄酒苹果酸乳酸发酵过程的菌种之一，苹果酸降解能力以及乳酸生成量是评价酒酒球菌的发酵性能的关键性指标。orf00404基因的功能开发，有利于提高酒酒球菌在葡萄酒苹果酸乳酸发酵中的发酵性能，从而进一步提高葡萄酒的品质，具有重要的应用前景。

[0119] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。