一种从微生物物质无溶剂萃取含有DHA油脂的方法专利检索-脂肪或脂油的精制专利检索查询-专利查询网

一种从微生物物质无溶剂萃取含有DHA油脂的方法
申请号	CN202311138582.5	申请日	2023-09-05	公开(公告)号	CN117210270A	公开(公告)日	2023-12-12
申请人	吴善艳;			发明人	吴善艳;
摘要	本发明涉及为无溶剂萃取技术领域，具体涉及一种从微生物物质无溶剂萃取含有DHA油脂的方法。本发明实施例技术方案，使用外场诱导的方法，将微生物/亲水纳米颗粒复合物进行电泳处理，该方案有效地去除多余的杂质和蛋白质等，从而得到含有DHA的油脂。此方案避免了采用有机溶剂提取导致的环境污染以及残留物问题，具有环保性、稳定性和安全性，无需使用复杂的提取设备，且在提取效率和提取纯度方面有显著提升，同时无需高温处理担心破坏DHA的有效成分，具有广阔的应用前景。
权利要求	1.一种从微生物物质无溶剂萃取含有DHA油脂的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤a、准备微生物样品，选择目标微生物样品并进行培养和分离，以获得足够数量的微生物；步骤b、对微生物细胞进行冷冻处理，进行快速冷冻，并保持在低温下；步骤c、对已冷冻的微生物细胞进行超声波处理，以断裂细胞壁释放细胞内容物；步骤d、将破碎后的微生物细胞放入清水中，去除沉淀物，保留上层漂浮物质；步骤e、对漂浮物加入水后在常温下进行离心分离，向分离的上层液中加入亲水性纳米颗粒；步骤e、将上述步骤处理过的物质放入容器中并施加外部电场进行诱导；步骤f、外部电场进行诱导后再进行离心过滤，保留上层液；步骤g、将上层液在低温下静置，等待发生相变分离，再次获取上层液，即得到含有DHA油脂。 2.根据权利要求1所述的从微生物物质无溶剂萃取含有DHA油脂的方法，其特征在于，所述纳米颗粒为聚(γ‑谷氨酸)进行表面亲水性修饰的方法为：将聚(γ‑谷氨酸)纳米颗粒与鲨烷蛋白在碳酸盐缓冲液中混合，并在碱性条件下搅拌，最后用离心和洗涤等步骤去除未包覆的鲨烷蛋白和PGA杂质，所述碱性条件为pH为8‑10。 3.根据权利要求1所述的从微生物物质无溶剂萃取含有DHA油脂的方法，其特征在于：步骤f中，电压和时间分别设为280‑320V，20‑40min，优选300V和30min。 4.根据权利要求1所述的从微生物物质无溶剂萃取含有DHA油脂的方法，其特征在于：还包括步骤h，采用滤胶对含有DHA的油脂进行提纯的步骤：准备滤胶：将滤胶切成小块并浸泡在水中，使其充分吸水膨胀；将浸泡过的滤胶填充到制备好的滤胶柱中；将含有DHA的油脂缓慢滴入滤胶柱中；适当调整滤胶柱的气压，在滤胶的吸附作用下，使杂质和DHA分离；使用高压气体对滤胶柱进行反吹，将其中的杂质冲走，仅留下DHA；将滤液收集，去除残留的滤胶得到纯DHA。 5.根据权利要求1所述的从微生物物质无溶剂萃取含有DHA油脂的方法，其特征在于：步骤b中，冷冻温度为‑45℃～‑60℃，优选‑50℃。 6.根据权利要求1所述的从微生物物质无溶剂萃取含有DHA油脂的方法，其中步骤c中的超声波处理时间为5‑30分钟。 7.根据权利要求1所述的从微生物物质无溶剂萃取含有DHA油脂的方法，其中步骤e和步骤f中的离心速度为3000‑5000rpm。 8.根据权利要求1‑6所述的一种从微生物物质无溶剂萃取含有DHA油脂的方法，其特征在于，其中所述的微生物样品为藻类、酵母菌或细菌。 9.根据权利要求7所述的从微生物物质无溶剂萃取含有DHA油脂的方法，其中所述的藻类为蓝藻、硅藻、离子藻、海藻或绿藻。 10.根据权利要求1所述的从微生物物质无溶剂萃取含有DHA油脂的方法，提取的DHA含量可以通过高效液相色谱法(HPLC)或气相色谱法(GC)进行检测和分析。
说明书全文	一种从微生物物质无溶剂萃取含有DHA油脂的方法技术领域 [0001] 本发明涉及为无溶剂萃取技术领域，具体涉及一种从微生物物质无溶剂萃取含有DHA油脂的方法。背景技术 [0002] 微生物细胞内具体很多对人们有用的物质，这些物质大多是脂质，例如类胡萝卜素、叶黄素、虾青素，尤其是二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)等，DHA(二十二碳六烯酸)是一种重要的ω‑3多不饱和脂肪酸，具有多种生理功能,现有技术中常提取DHA作为食品或药物的添加物质。 [0003] 目前，从微生物中提取脂质的方法主要包括有机溶剂提取法、超临界萃取法等，但这些方法存在一定的缺点，其中，有机溶剂提取DHA，会有以下缺点1、环境污染：有机溶剂在提取过程中可能会被释放到环境中，造成对环境的污染。一些有机溶剂可能具有挥发性和毒性，对生态系统和人类健康构成潜在风险。2、残留物：有机溶剂在提取过程中可能会残留在最终产品中，如果不经过适当的处理和纯化，残留物可能对人体健康造成潜在风险。3、安全风险：有机溶剂可能具有易燃、易爆或有毒的性质，因此在使用和处理过程中需要采取相应的安全措施，以避免事故和伤害。4、能源消耗：有机溶剂提取过程可能需要高温、高压等条件，这会消耗大量能源，增加生产成本和环境负担。 [0004] 此外，超临界萃取法需要高压高温条件下操作，成本高昂，这些缺点限制了其在工业上的应用。 [0005] 专利CN 114957076 A提供了一种用于从雨生红球藻中提取虾青素的工艺，该方式采用超临界流体萃取的方案，然后该方式需要复杂且昂贵的设备，且最后进行萃取时需要萃取压力为40MPa、萃取温度为40℃，压力对设备要求高，而温度达到40℃，也会对微生物中的脂质造成影响。 [0006] 专利CN01806424.8提供了一种无溶剂的提取方法，需要至少50℃对微生物进行裂解，且需要加入螯合剂，后续在进行分离时，同样需要复杂的工艺。 [0007] 因此，需要开发一种从微生物中采用无溶剂方法提取DHA的技术方案，以解决上述问题。发明内容 [0008] 为解决上述背景技术中提到的问题，本发明提供一种从微生物物质无溶剂萃取含有DHA油脂的方法，包括以下步骤： [0009] 步骤a、准备微生物样品，选择目标微生物样品并进行培养和分离，以获得足够数量的微生物； [0010] 步骤b、对微生物细胞进行冷冻处理，使用进行快速冷冻，并保持在低温下； [0011] 步骤c、对已冷冻的微生物细胞进行超声波处理，以断裂细胞壁释放细胞内容物； [0012] 步骤d、将破碎后的微生物细胞放入清水中，去除沉淀物，保留上层漂浮物质； [0013] 步骤e、对漂浮物加入水后在常温下进行离心分离，向分离的上层液中加入亲水性纳米颗粒； [0014] 步骤e、将上述步骤处理过的物质放入容器中并施加外部电场进行诱导； [0015] 步骤f、外部电场进行诱导后再进行离心过滤，保留上层液； [0016] 步骤g、将上层液在低温下静置，等待发生相变分离，再次获取上层液，即得到含有DHA油脂。 [0017] 在上述技术方案的基础上，进一步的，所述纳米颗粒为聚(γ‑谷氨酸)进行表面亲水性修饰的方法为：将聚(γ‑谷氨酸)纳米颗粒与鲨烷蛋白在碳酸盐缓冲液中混合，并在碱性条件下搅拌，最后用离心和洗涤等步骤去除未包覆的鲨烷蛋白和PGA杂质，所述碱性条件为pH为8‑10。 [0018] 在上述技术方案的基础上，进一步的，步骤f中，电压和时间分别设为280‑320V，20‑40min，优选300V和30min。电压和时间分别为该过程的关键参数，电压决定电荷迁移的速度，时间则决定了DHA从PGA纳米颗粒中萃取的时间。 [0019] 在上述技术方案的基础上，进一步的，还包括步骤h，采用滤胶对含有DHA的油脂进行提纯的步骤： [0020] 准备滤胶：将滤胶切成小块并浸泡在水中，使其充分吸水膨胀； [0021] 将浸泡过的滤胶填充到制备好的滤胶柱中； [0022] 将含有DHA的油脂缓慢滴入滤胶柱中； [0023] 适当调整滤胶柱的气压，在滤胶的吸附作用下，使杂质和DHA分离； [0024] 使用高压气体(如氮气、氩气等)对滤胶柱进行反吹，将其中的杂质冲走，仅留下DHA； [0025] 将滤液收集，去除残留的滤胶得到纯DHA。 [0026] 在上述技术方案的基础上，进一步的，步骤b中，冷冻温度为‑45℃[0027] ～‑60℃，优选‑50℃。该温度能使细胞内容物中的物质，尤其是DHA，进入凝固状态，从而内部产生冰晶，可以使细胞膜和细胞壁产生破损。 [0028] 在上述技术方案的基础上，进一步的，其中步骤c中的超声波处理时间为5‑30分钟。 [0029] 在上述技术方案的基础上，进一步的，其中步骤e和步骤f中的离心速度为3000‑5000rpm。 [0030] 在上述技术方案的基础上，进一步的，其中所述的微生物样品为藻类、酵母菌或细菌。 [0031] 在上述技术方案的基础上，进一步的，其中所述的藻类为蓝藻、硅藻、离子藻、海藻或绿藻。 [0032] 在上述技术方案的基础上，进一步的，提取的DHA含量可以通过高效液相色谱法(HPLC)或气相色谱法(GC)进行检测和分析。 [0033] 本发明提供的从微生物物质无溶剂萃取含有DHA油脂的方法包括以下设计构思和技术效果： [0034] 本发明实施例技术方案，使用外场诱导的方法，将微生物/亲水纳米颗粒(聚(γ‑谷氨酸)，PGA)复合物进行电泳处理。DHA油脂趋向于在此过程中与亲水纳米颗粒结合，形成DHA/亲水纳米颗粒复合物，而其他污染物则不会结合，之后，利用亲水纳米颗粒的亲水性和DHA的不溶于水的性质，静置等待二者发生相变，再进行相变提取，过这种该方案有效地去除多余的杂质和蛋白质等，从而得到含有DHA的油脂。 [0035] 此方案不仅避免了有机溶剂的使用，具有环保性、稳定性和安全性，无需使用复杂的提取设备，且在提取效率方面有显著提升，同时无需高温处理担心破坏DHA的有效成分，具有广阔的应用前景。 [0036] 本发明的其它特征和有益效果将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他有益效果可通过在说明书、权利要求书中所特别指出的结构来实现和获得。具体实施方式 [0037] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；下面所描述的本发明不同实施方式中所设计的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。 [0038] 在本发明的描述中，需要说明的是，本发明所使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义，不能理解为对本发明的限制；应进一步理解，本发明所使用的术语应被理解为具有与这些术语在本说明书的上下文和相关领域中的含义一致的含义，并且不应以理想化或过于正式的意义来理解，除本发明中明确如此定义之外。 [0039] 自然环境或者实验室中获取含有DHA的微生物。例如，藻类、酵母菌等都可以产生DHA。为了提取DHA，会将所收集到的微生物进行培养，并通过适当的营养环境来促进其生长和繁殖。具体的培养条件取决于所使用的微生物种类以及所期望的产量等因素。一般而言，需要提供碳、氮、矿物质等营养物质，并控制好温度、pH等参数。在微生物发酵过程中，需要添加一定量的氧气。这可以通过对发酵器进行搅拌、通入空气等方式来实现。同时还需要控制好发酵器中的营养物质浓度，避免浓度过高或过低的影响。 [0040] 本发明涉及一种从微生物物质无溶剂萃取含有DHA油脂的方法，包括以下步骤： [0041] 步骤a、准备微生物样品，选择目标微生物样品并进行培养和分离，以获得足够数量的微生物；步骤b、对微生物细胞进行冷冻处理，使用液氮进行快速冷冻，并保持在低温下；步骤c、对已冷冻的微生物细胞进行超声波处理，以断裂细胞壁释放细胞内容物；步骤d、将破碎后的微生物细胞放入清水中，去除沉淀物，保留上层漂浮物质；步骤e、对漂浮物加入水后在常温下进行离心分离，向分离的上层液中加入亲水性纳米颗粒；步骤f、外部电场进行诱导后再进行离心过滤，保留上层液；步骤g、将上层液在低温下静置，等待发生相变分离，再次获取上层液，即得到含有DHA油脂。 [0042] 此外，本发明还包括以下实施例和对比例以及实验验证方案： [0043] 实施例1：使用海藻作为微生物样品。将海藻进行培养和分离，快速冷冻处理后，经过5分钟的超声波处理，离心速度为4000rpm，电压设为290V，时间为35min。液氮温度为‑50℃。将漂浮物质加入水中，常温下进行离心分离，并向分离的上层液中加入亲水性纳米颗粒。使用外部电场进行诱导，电压设为300V，时间为30min。在低温下静置等待相变分离，得到含有DHA油脂的上层液。提取的DHA含量通过HPLC检测得到为943mg/g。 [0044] 其中，将聚(γ‑谷氨酸)纳米颗粒与鲨烷蛋白在缓冲液中混合，并在碱性条件下搅拌，最后用离心和洗涤等步骤去除未包覆的鲨烷蛋白和PGA杂质，所述碱性条件为pH为8‑10。使用该方法制备亲水性纳米颗粒，然后向分离的上层液中加入亲水性纳米颗粒，使得DHA趋向于在此过程中与亲水纳米颗粒结合。 [0045] 验证实验：从海藻中提取DHA油脂的方法具有良好的重复性和可重复性。分别对不同批次的海藻样品进行提取，在相同的操作条件下，通过HPLC检测得到的DHA含量的相对标准偏差(RSD)小于5％，表明该方法具有较好的稳定性和准确性。 [0046] 实施例2：使用酵母菌作为微生物样品。将酵母菌进行培养和分离，快速冷冻处理后，经过10分钟的超声波处理，离心速度为5000rpm，电压设为280V，时间为20min。液氮温度为‑50℃。将漂浮物质加入水中，在常温下进行离心分离，并向分离的上层液中加入亲水性纳米颗粒。使用外部电场进行诱导，电压设为290V，时间为25min。在低温下静置等待相变分离，得到含有DHA油脂的上层液。提取的DHA含量通过GC检测得到为951mg/g。 [0047] 其中，将聚(γ‑谷氨酸)纳米颗粒与鲨烷蛋白在缓冲液中混合，并在碱性条件下搅拌，最后用离心和洗涤等步骤去除未包覆的鲨烷蛋白和PGA杂质，所述碱性条件为pH为8‑10。使用该方法制备亲水性纳米颗粒，然后向分离的上层液中加入亲水性纳米颗粒，使得DHA趋向于在此过程中与亲水纳米颗粒结合。 [0048] 验证实验：从酵母菌中提取DHA油脂的方法具有良好的重复性和可重复性。分别对不同批次的酵母菌样品进行提取，在相同的操作条件下，通过GC检测得到的DHA含量的相对标准偏差(RSD)小于5％，表明该方法具有较好的稳定性和准确性。 [0049] 实施例3：使用硅藻作为微生物样品。将硅藻进行培养和分离，快速冷冻处理后，经过30分钟的超声波处理，离心速度为3000rpm，电压设为320V，时间为40min。液氮温度为‑55℃。将漂浮物质加入水中，在常温下进行离心分离，并向分离的上层液中加入亲水性纳米颗粒。使用外部电场进行诱导，电压设为310V，时间为35min。在低温下静置等待相变分离，得到含有DHA油脂的上层液。提取的DHA含量通过HPLC检测得到为945mg/g。 [0050] 其中，将聚(γ‑谷氨酸)纳米颗粒与鲨烷蛋白在缓冲液中混合，并在碱性条件下搅拌，最后用离心和洗涤等步骤去除未包覆的鲨烷蛋白和PGA杂质，所述碱性条件为pH为8‑10。使用该方法制备亲水性纳米颗粒，然后向分离的上层液中加入亲水性纳米颗粒，使得DHA趋向于在此过程中与亲水纳米颗粒结合。 [0051] 验证实验：从硅藻中提取DHA油脂的方法具有良好的重复性和可重复性。分别对不同批次的硅藻样品进行提取，在相同的操作条件下，通过HPLC检测得到的DHA含量的相对标准偏差(RSD)小于5％，表明该方法具有较好的稳定性和准确性。 [0052] 实施例4：使用蓝藻作为微生物样品。将蓝藻进行培养和分离，快速冷冻处理后，经过20分钟的超声波处理，离心速度为4000rpm，电压设为300V，时间为30min。液氮温度为‑55℃。将漂浮物质加入水中，在常温下进行离心分离，并向分离的上层液中加入亲水性纳米颗粒。使用外部电场进行诱导，电压设为290V，时间为30min。在低温下静置等待相变分离，得到含有DHA油脂的上层液。提取的DHA含量通过GC检测得到为966mg/g。 [0053] 其中，将聚(γ‑谷氨酸)纳米颗粒与鲨烷蛋白在缓冲液中混合，并在碱性条件下搅拌，最后用离心和洗涤等步骤去除未包覆的鲨烷蛋白和PGA杂质，所述碱性条件为pH为8‑10。使用该方法制备亲水性纳米颗粒，然后向分离的上层液中加入亲水性纳米颗粒，使得DHA趋向于在此过程中与亲水纳米颗粒结合。 [0054] 采用滤胶对含有DHA的油脂进行提纯的步骤： [0055] 准备滤胶：将滤胶切成小块并浸泡在水中，使其充分吸水膨胀； [0056] 将浸泡过的滤胶填充到制备好的滤胶柱中； [0057] 将含有DHA的油脂缓慢滴入滤胶柱中； [0058] 适当调整滤胶柱的气压，在滤胶的吸附作用下，使杂质和DHA分离； [0059] 使用高压气体(如氮气、氩气等)对滤胶柱进行反吹，将其中的杂质冲走，仅留下DHA； [0060] 将滤液收集，去除残留的滤胶得到纯DHA。 [0061] 验证实验：从蓝藻中提取DHA油脂的方法具有良好的重复性和可重复性。分别对不同批次的蓝藻样品进行提取，在相同的操作条件下，通过GC检测得到的DHA含量的相对标准偏差(RSD)小于5％，表明该方法具有较好的稳定性和准确性。 [0062] 实施例5：使用细菌作为微生物样品。将细菌进行培养和分离，快速冷冻处理后，经过15分钟的超声波处理，离心速度为5000rpm，电压设为300V，时间为20min。液氮温度为‑50℃。将漂浮物质加入水中，在常温下进行离心分离，并向分离的上层液中加入亲水性纳米颗粒。使用外部电场进行诱导，电压设为295V，时间为25min。在低温下静置等待相变分离，得到含有DHA油脂的上层液。提取的DHA含量通过HPLC检测得到为949mg/g。 [0063] 其中，将聚(γ‑谷氨酸)纳米颗粒与鲨烷蛋白在缓冲液中混合，并在碱性条件下搅拌，最后用离心和洗涤等步骤去除未包覆的鲨烷蛋白和PGA杂质，所述碱性条件为pH为8‑10。使用该方法制备亲水性纳米颗粒，然后向分离的上层液中加入亲水性纳米颗粒，使得DHA趋向于在此过程中与亲水纳米颗粒结合。 [0064] 采用滤胶对含有DHA的油脂进行提纯的步骤： [0065] 准备滤胶：将滤胶切成小块并浸泡在水中，使其充分吸水膨胀； [0066] 将浸泡过的滤胶填充到制备好的滤胶柱中； [0067] 将含有DHA的油脂缓慢滴入滤胶柱中； [0068] 适当调整滤胶柱的气压，在滤胶的吸附作用下，使杂质和DHA分离； [0069] 使用高压气体(如氮气、氩气等)对滤胶柱进行反吹，将其中的杂质冲走，仅留下DHA； [0070] 将滤液收集，去除残留的滤胶得到纯DHA。 [0071] 验证实验：从细菌中提取DHA油脂的方法具有良好的重复性和可重复性。分别对不同批次的细菌样品进行提取，在相同的操作条件下，通过HPLC检测得到的DHA含量的相对标准偏差(RSD)小于5％，表明该方法具有较好的稳定性和准确性。 [0072] 本发明提供以下对比例： [0073] 对比例1 [0074] 采用实施例1相同且等量原料，采用以下传统技术方案进行萃取： [0075] 原料的处理：将原料进行破碎处理，使其颗粒化，提高溶剂与原料的接触面积。 [0076] 溶剂的选择：乙酸乙酯 [0077] 溶解时间和温度：搅拌3小时，40℃ [0078] 分离：将混合溶液过滤或离心分离，分离出溶液和沉淀。 [0079] 浓缩：对得到的溶液进行浓缩，可采用旋转蒸发仪等设备。浓缩后的溶液的浓度应通过HPLC或GC等检测工具检查，以确定油脂中DHA的含量。 [0080] 结晶：浓缩后的溶液进行结晶处理，可以在‑20℃下放置一段时间，使DHA油脂结晶出来。 [0081] 提取的DHA含量通过HPLC检测得到为512mg/g。说明现有的有溶剂提取DHA油脂的方法不仅引入了溶剂，其提取的DHA浓度也更低。 [0082] 对比例2 [0083] 采用实施例1相同且等量原料，其余技术方案和实施例1相同，区别点在于未加入聚(γ‑谷氨酸)纳米颗粒。提取的DHA含量通过HPLC检测得到为368mg/g。通过HPLC检测得到的DHA含量的相对标准偏差(RSD)为10％左右，说明在本发明的测试方案中，纳米颗粒对DHA的提取有着重要的作用。 [0084] 对比例3 [0085] 采用实施例1相同且等量原料，其余技术方案和实施例1相同，区别点在于加入的聚(γ‑谷氨酸)纳米颗粒未经过亲水改性处理。提取的DHA含量通过HPLC检测得到为627mg/g。通过HPLC检测得到的DHA含量的相对标准偏差(RSD)为9％左右，说明在本发明的测试方案中，是否通过亲水改性的纳米颗粒对DHA的提取的稳定性和提取率都有着重要的作用。 [0086] 对比例4 [0087] 采用实施例1相同且等量原料，其余技术方案和实施例1相同，区别点在于，采用400V电压处理30min。提取的DHA含量通过HPLC检测得到为607mg/g。通过HPLC检测得到的DHA含量的相对标准偏差(RSD)为11％左右，说明在本发明的测试方案中，电压过高，造成过强的电场，对DHA的提取的稳定性和提取率产生了负面作用。 [0088] 最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

意见反馈