一种提升磷脂酶C热稳定性的方法 |
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| 申请号 | CN201811524482.5 | 申请日 | 2018-12-13 | 公开(公告)号 | CN111321130B | 公开(公告)日 | 2024-04-05 |
| 申请人 | 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司; | 发明人 | 顾思天; 牛其文; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供一种提升磷脂酶C热 稳定性 的方法。本发明提供的方法将磷脂酶C浓缩液于50‑70℃孵育10‑40min；所述 热稳定性 为磷脂酶C于37℃保藏时的稳定性。本发明的方法可提升磷脂酶C在37℃保藏时的稳定性。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种提升磷脂酶C热稳定性的方法，其特征在于，将磷脂酶C浓缩液于50‑70℃孵育 |
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| 说明书全文 | 一种提升磷脂酶C热稳定性的方法技术领域背景技术[0002] 磷脂酶具备水解一个或多个甘油磷脂酯键的能力，它代表着一类脂肪酶、酰基水解酶和磷酸酯酶。磷脂酶根据该酶在磷脂分子上作用位点的不同，可以分为磷脂酶A1(PLA1)、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)和磷脂酶D(PLD)。 [0003] [0004] 其中，磷脂酶C(Phospholipase C，简称PLC)，是一种能够水解甘油磷脂 C3位点磷脂酰键生成甘油二酯和磷酸胆碱、磷酸肌醇、磷酸乙醇胺等的脂类水解酶。磷脂酶C广泛存在于动植物和微生物中，动植物来源PLC一般位于细胞膜上，结构较为复杂，属于内源性磷脂酶C，难以分离。微生物来源的磷脂酶C结构一般较为简单，这些酶已经从各种微生物中分[1]离得到，细菌来源的较多包括产气荚膜梭菌Clostridium perfringens 、双酶梭菌C.bifermentans、Burkholderia pseudomallei、Bacillus cereus、蕈状芽孢杆菌Bacillus mycoiddes、苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis、单核细胞增多性李斯特氏菌Listeria monocytogenes、铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa、荧光假单胞菌P.fluorescens、葡萄球菌Straphylococus aureus、鲍氏不动杆菌Acinetobacter baumannii、链霉菌Streptomyces clavuligerus、伯克氏菌属Burkholderi等等。来自放线菌的有八丈岛链霉菌Streptomyces hachijyoensis等。还有来自酵母菌的白色念珠菌[2] [3] Candia albicans 、酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 等。 [0005] 目前，磷脂酶C主要应用于酶法脱胶。在制造大豆、菜籽等食用油时，未经精炼的毛油主要含有甘油三酯、磷脂、甾醇、生育酚、游离脂肪酸、痕量金属以及其它微量化合物的复杂混合物。其中磷脂会造成色泽及口味变差、保质期变短并且影响后续的精炼效果。目前，主要的脱胶方式有水化脱胶、深度脱胶和酶法脱胶。酶法脱胶由于条件温和、无污染、油耗低，越来越受到人们的青睐。 [0006] 由于磷脂酶C作用于甘油磷脂可以生成甘油二酯，因此，在酶法脱胶过程中使用磷脂酶C可以显著提升油脂的得率，从而提高生产经济效益。 [0007] 酶制剂一般要求在4℃条件下保藏，但在酶法脱胶的实际应用中，磷脂酶C 常被置于单独的储罐中备用，由于环境温度较高，容易导致磷脂酶C的活力损失。因此，提高磷脂酶C的热稳定性就具有非常重要的生产实践意义。 [0008] 参考文献 [0009] [1]Yun T,Siebel C.Cloning and expression of the PLC gene from Clostridium perfringens and Clostridium bifermentants[J].Infection and immunity,1989,2:468‑476. [0010] [2]Analuz E,Juan‑Jose R,Rosario Cueva.Sequencing of a 4.3kbp region of chromosome 2of Candida albicans reveals the presence of homologues of SHE9from Saccharomyces cerevisiae and of bacterial phosphatidylinostiol‑phospholipase C[J]. Yeast,2001,18(8):711‑721. [0011] [3]Payne W,Fitzgerald‑Hayes M.A mutation in PLC1,a candidate phosphoinositide specific phospholipase C gene from Saccharomyces cerevisiae, causes aberrant mitotic chromosome segregation[J].Molecular and Cellular Biology, 1993,13:4351‑4364. 发明内容[0012] 本发明提供了一种提升磷脂酶C热稳定性的方法，所述热稳定性为磷脂酶C 于37℃保藏时的稳定性。 [0013] 本发明提供的方法包括：将磷脂酶C浓缩液于50‑70℃孵育10‑40min。 [0014] 在本发明的一个或多个优选方案中，该方法包括将磷脂酶C浓缩液于60‑70℃孵育10‑40min。 [0017] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述磷脂酶C浓缩液通过以下方法制备： [0018] A)用超滤膜对磷脂酶C的微滤清液进行超滤浓缩，获得磷脂酶C的超滤浓缩液； [0019] B)使用pH 5.0‑7.0的缓冲液对步骤A)的超滤浓缩液进行透析置换，获得磷脂酶C浓缩液。 [0020] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述缓冲液为：10‑100mM的磷酸氢二钠‑柠檬酸缓冲液、柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲液、磷酸氢二钠‑磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钠‑磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钾‑氢氧化钠缓冲液。 [0021] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述超滤浓缩为使用截留分子量为 1‑10KDa的超滤膜对微滤清液进行超滤浓缩。 [0022] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述磷脂酶C的微滤清液为用微滤膜将磷脂酶C发酵液或发酵上清液进行微滤获得，所述磷脂酶C发酵上清液为将磷脂酶C发酵液离心分离获得。在本发明的一个或多个优选方案中，所述微滤为使用孔径为50‑500nm的微滤膜对发酵离心上清液进行微滤。 [0023] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述方法还包括向孵育后的磷脂酶C浓缩液中加入多羟基化合物和防腐剂的步骤。在本发明的一个或多个优选方案中，所述多羟基化合物为山梨醇和/或甘油；在本发明的一个或多个优选方案中，所述防腐剂为山梨酸钾和/或苯甲酸钠。 [0024] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述磷脂酶C为来源于蜡样芽胞杆菌的磷脂酶C。 [0025] 本发明还提供了一种制备磷脂酶C制剂的方法。 [0026] 本发明提供的方法包括以下步骤： [0027] a)磷脂酶C发酵液离心，收集上清液； [0028] b)将步骤a)的上清液进行微滤，获得微滤清液； [0029] c)将步骤b)的微滤清液进行超滤浓缩，获得超滤浓缩液； [0030] d)将步骤c)的超滤浓缩液进行透析置换，获得磷脂酶C浓缩液； [0031] e)向孵育后的磷脂酶C浓缩液中加入多羟基化合物和防腐剂的步骤。 [0032] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述离心为于6000‑12000g下离心 15‑45min。 [0033] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述微滤用孔径为50‑500nm的微滤膜对发酵离心上清液进行微滤。 [0034] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述超滤浓缩为使用截留分子量为 1‑10KDa的超滤膜对微滤清液进行超滤浓缩。 [0035] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述透析置换为使用pH 5.0‑7.0的缓冲液进行透析置换。 [0036] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述缓冲液为：10‑100mM的磷酸氢二钠‑柠檬酸缓冲液、柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲液、磷酸氢二钠‑磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钠‑磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钾‑氢氧化钠缓冲液。 [0037] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述多羟基化合物为山梨醇和/或甘油。 [0038] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述防腐剂为山梨酸钾和/或苯甲酸钠。 [0039] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述磷脂酶C为来源于蜡样芽胞杆菌的磷脂酶C。 [0040] 本发明还提供了采用前述方法制备的磷脂酶C制剂。 [0041] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述磷脂酶C制剂在37℃下保存15天，其脱胶活力残留率大于65％。 [0042] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述磷脂酶C制剂在37℃下保存15天，其脱胶活力残留率大于70％。 [0043] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述磷脂酶C制剂在37℃下保存15天，其脱胶活力残留率大于75％。 [0044] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述磷脂酶C制剂在37℃下保存15天，其脱胶活力残留率大于80％。 [0045] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述磷脂酶C制剂在37℃下保存15天，其脱胶活力残留率大于85％。 [0046] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述磷脂酶C制剂在37℃下保存15天，其脱胶活力残留率大于90％。 [0047] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述磷脂酶C制剂在37℃下保存30天，其脱胶活力残留率大于45％。在本发明的一个或多个优选方案中，所述磷脂酶C 制剂在37℃下保存30天，其脱胶活力残留率大于50％。 [0048] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述磷脂酶C制剂在37℃下保存30天，其脱胶活力残留率大于55％。 [0049] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述磷脂酶C制剂在37℃下保存30天，其脱胶活力残留率大于60％。 [0050] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述磷脂酶C制剂在37℃下保存30天，其脱胶活力残留率大于65％。 [0051] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述磷脂酶C制剂在37℃下保存30天，其脱胶活力残留率大于70％。 [0052] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述磷脂酶C为来源于蜡样芽胞杆菌的磷脂酶C。 [0053] 本发明还提供了采用前述方法制备的磷脂酶C制剂用于酶法脱胶的用途。 [0055] 图1为不同保存时间样品中目标蛋白的变化情况，其中，泳道1为蛋白marker；泳道2为磷脂酶C初始样品；泳道3为37℃保存30天后的磷脂酶C样品。 具体实施方式[0056] 本文所公开的“范围”以下限和上限的形式。可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的。选定的下限和上限限定了特别范围的边界。所有可以这种方式进行限定的范围是包含和可组合的，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。例如，针对特定参数列出了60‑120和80‑110的范围，理解为60‑110和80‑120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1和2，和如果列出了最大范围值3，4和5，则下面的范围可全部预料到：1‑3、1‑4、1‑5、2‑3、2‑4和2‑5。 [0057] 在本发明中，除非有其他说明，组合物的各组分的含量范围以及其优选范围之间可以相互组合形成新的技术方案。 [0058] 在本发明中，除非有其他说明，“其组合”表示所述各元件的多组分混合物，例如两种、三种、四种以及直到最大可能的多组分混合物。 [0059] 在本发明中，除非有其他说明，所有“份”和百分数(％)都指重量百分数。 [0060] 在本发明中，除非有其他说明，所有组合物中各组分的百分数之和为100％。 [0061] 在本发明中，除非有其他说明，数值范围“a‑b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“0‑5”表示本文中已经全部列出了“0‑5”之间的全部实数，“0‑5”只是这些数值组合的缩略表示。 [0063] 如果没有特别指出，本发明所述的百分数(包括重量百分数)的基准都是所述组合物的总重量。 [0064] 在本文中，除非另有说明，各组分的比例或者重量都指干重。 [0065] 在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方式可以相互组合形成新的技术方案。 [0066] 在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。 [0067] 在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有步骤可以顺序进行，也可以随机进行，但是优选是顺序进行的。例如，所述方法包括步骤(a)和(b)，表示所述方法可包括顺序进行的步骤(a)和(b)，也可以包括顺序进行的步骤 (b)和(a)。例如，所述提到所述方法还可包括步骤(c)，表示步骤(c)可以任意顺序加入到所述方法，例如，所述方法可以包括步骤(a)、(b)和(c)，也可包括步骤(a)、(c)和(b)，也可以包括步骤(c)、(a)和(b)等。 [0068] 在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的“包括”表示开放式，也可以是封闭式。例如，所述“包括”可以表示还可以包含没有列出的其他元件，也可以仅包括列出的元件。 [0069] 在本发明中，如果没有特别的说明，本文实施例中的具体数值以及具体物质可与本文描述部分的其他特征结合。例如，本文描述部分提到反应的温度为 10‑100℃，而实施例提到的反应温度为20℃，那么可以认为本文已经具体公开了10‑20℃的范围，或者20‑100℃的范围，且该范围可以描述部分的其他特征结合起来形成新的技术方案。又例如，本文描述部分提到一类化合物醇，而实施例提到的具体的醇为乙醇，那么乙醇可以与描述部分的其他特征结合起来形成新的技术方案。 [0070] 提升磷脂酶C热稳定性的方法。 [0071] 在本发明中，术语“热稳定性”指的是磷脂酶C于37℃保藏时的稳定性。 [0072] 本发明提供的方法包括：将磷脂酶C浓缩液于50‑70℃，例如，50℃、55℃、 60℃、65℃、70℃孵育10‑40min，例如10min、15min、20min、25min、30min、 35min、40min。 [0073] 在本发明的一个或多个优选方案中，该方法包括将磷脂酶C浓缩液于60‑70℃孵育10‑40min。 [0074] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述磷脂酶C浓缩液为磷脂酶C发酵液和/或发酵上清液的浓缩液。 [0075] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述磷脂酶C浓缩液通过硫酸铵沉淀蛋白后复溶或有机溶剂沉淀蛋白后复溶制备。 [0076] 在本领域中，通过硫酸铵沉淀蛋白后复溶或有机溶剂沉淀蛋白后复溶以制备蛋白浓缩液的方法为本领域的常规方法，其工艺条件、所能达到的效果也都为本领域的技术人员所熟知。通过硫酸铵沉淀蛋白后复溶以制备蛋白浓缩液的方法，例如可参考文献：(田亚平等.生化分离技术[M].北京:化学工业出版社,2006:31‑36.)；通过硫酸铵沉淀蛋白后复溶或有机溶剂沉淀蛋白后复溶以制备蛋白浓缩液的方法，例如可参考文献：(田亚平等.生化分离技术[M].北京:化学工业出版社,2006:36‑38.)。 [0077] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述磷脂酶C浓缩液通过以下方法制备： [0078] A)用超滤膜对磷脂酶C的微滤清液进行超滤浓缩，获得磷脂酶C的超滤浓缩液； [0079] B)使用pH 5.0‑7.0的缓冲液对步骤A)的超滤浓缩液进行透析置换，获得磷脂酶C浓缩液；所述缓冲液优选为：10‑100mM的磷酸氢二钠‑柠檬酸缓冲液、柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲液、磷酸氢二钠‑磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钠‑磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钾‑氢氧化钠缓冲液。 [0080] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述超滤浓缩为使用截留分子量为1‑10KDa的超滤膜对微滤清液进行超滤浓缩。 [0081] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述磷脂酶C的微滤清液为用微滤膜将磷脂酶C发酵液或发酵上清液进行微滤获得，所述磷脂酶C发酵上清液为将磷脂酶C发酵液离心分离获得。在本发明的一个或多个优选方案中，所述微滤为使用孔径为50‑500nm的微滤膜对发酵离心上清液进行微滤。 [0082] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述方法还包括向孵育后的磷脂酶C浓缩液中加入多羟基化合物和防腐剂的步骤。在本发明的一个或多个优选方案中，所述多羟基化合物为山梨醇和/或甘油；在本发明的一个或多个优选方案中，所述防腐剂为山梨酸钾和/或苯甲酸钠。 [0083] 本发明还提供了一种制备磷脂酶C制剂的方法。 [0084] 本发明提供的方法包括以下步骤： [0085] a)磷脂酶C发酵液离心，收集上清液； [0086] b)将步骤a)的上清液进行微滤，获得微滤清液； [0087] c)将步骤b)的微滤清液进行超滤浓缩，获得超滤浓缩液； [0088] d)将步骤c)的超滤浓缩液进行透析置换，获得磷脂酶C浓缩液； [0089] e)向孵育后的磷脂酶C浓缩液中加入多羟基化合物和防腐剂的步骤。 [0090] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述离心为于6000‑12000g下离心 15‑45min。 [0091] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述微滤用孔径为50‑500nm的微滤膜对发酵离心上清液进行微滤。 [0092] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述超滤浓缩为使用截留分子量为 1‑10KDa的超滤膜对微滤清液进行超滤浓缩。 [0093] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述透析置换为使用pH 5.0‑7.0的缓冲液进行透析置换。在本发明的一个或多个优选方案中，所述缓冲液为：10‑100mM 的磷酸氢二钠‑柠檬酸缓冲液、柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲液、磷酸氢二钠‑磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钠‑磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钾‑氢氧化钠缓冲液。 [0094] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述多羟基化合物为山梨醇和/或甘油。 [0095] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述防腐剂为山梨酸钾、苯甲酸钠。 [0096] 本发明还提供了采用前述方法制备的磷脂酶C制剂。 [0097] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述磷脂酶C制剂在37℃下保存15天，其脱胶活力残留率大于65％，优选大于70％，更优选大于75％，更优选大于80％，更优选大于85％，更优选大于90％。 [0098] 在本发明的一个或多个优选方案中，所述磷脂酶C制剂在37℃下保存30天，其脱胶活力残留率大于45％，优选大于50％，更优选大于55％，更优选大于60％，更优选大于65％，更优选大于70％。 [0099] 本发明还提供了采用前述方法制备的磷脂酶C制剂用于酶法脱胶的用途。 [0100] 在本发明的实施例中，所使用的磷脂酶C为来源于蜡样芽胞杆菌的磷脂酶C，但同样的，本发明的方法也可以同样用于来源于：产气荚膜梭菌Clostridium perfringens、双酶梭菌C.bifermentans、艰难梭菌Clostridioides difficile、蕈状芽孢杆菌Bacillus mycoiddes、苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis、土杨芽孢杆菌Bacillus toyonensis、假丝芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides、单核细胞增多性李斯特氏菌Listeria monocytogenes、铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa、荧光假单胞菌P.fluorescens、葡萄球菌Straphylococus aureus、鲍氏不动杆菌Acinetobacter baumannii、链霉菌Streptomyces clavuligerus、结核分歧杆菌Mycobacterium tuberculosis、脓肿分枝杆菌Mycobacteroides abscessus、肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae、本州伯克霍尔德菌Burkholderia ubonensis、假马氏伯克霍尔德菌Burkholderia pseudomallei、新洋葱伯克霍尔德菌Burkholderia cenocepacia、洋葱伯克霍尔德菌Burkholderia cepacia、副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus、肠道沙门氏菌Salmonella enterica、嗜肺军团菌Legionella pneumophila、八丈岛链霉菌 Streptomyces hachijyoensis、白色念珠菌Candia albican、酿酒酵母Saccharomyces cerevisia的磷脂酶C。 [0101] 下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施仅仅是阐述性的，并非限制本发明的保护范围。 [0102] 实施例中使用的磷脂酶C发酵液通过以下方法获得： [0103] 菌株：参考CN201510946696.1的方法，将磷脂酶C基因序列转入毕赤酵母 SMD1168(购自INVITROGEN公司)而获得，磷脂酶C基因序列来源于蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus的磷脂酶C，其核苷酸序列如 GenBank:CP008712.1_REGION:769265..769999所示，编码的氨基酸序列如NCBI Reference Sequence:WP_000731014.1所示。 [0104] 发酵工艺： [0105] (1)甘油分批培养阶段扩增菌体：7.5L发酵罐，初始装液量3L，接种量3.5％，设定初始参数：30℃，pH 5.5，180rpm，167L/min,0.05MPa。过程中调节搅拌转数、通气量使DO维持在20‑35％。当DO陡然上升，反升大于80％时，第一阶段结束。此时，发酵18h左右，转数增加至320rpm,通风增加至200L/min，菌体湿重150‑160g/L。 [0106] (2)甘油补料分批培养阶段以进一步扩增菌体。以大约15mL/h/L初始发酵液的速率流加50％甘油到发酵罐中，使DO维持在20‑35％左右。维持约3.5h，湿重达到200～220g/L时，停止加甘油，使DO上升至大于80％时，转入甲醇诱导表达阶段。 [0107] (3)甲醇补料分批诱导表达PLC阶段 [0108] 适应阶段：甲醇的流加速率控制DO在60‑70％，50‑60％，40‑50％维持各2h。 [0109] 稳定阶段DO维持在20％以上约6h，然后缓慢增加甲醇流速，控制过程中OUR 在180‑200mmol/L/h左右。过程中，采用DO‑spikes，确保甲醇未积累。整个甲醇补料阶段总共持续约120小时。发酵培养结束时，细胞的湿重可以达到420‑440 g/L。 [0110] 实施例中使用的微滤膜购自：PALL公司，微滤方法参考厂商提供的方法。 [0111] 使用的超滤膜购自：PALL公司，超滤方法参考厂商提供的方法。 [0112] 微滤方法和超滤方法具体参见Membrane Cassette Care and Use Procedures, Pall Corporation. [0113] 蛋白含量检测方法如下：Marion M.Bradford.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein‑dye binding[J].Analytical Biochemistry,1976,72:248‑254.[0114] 脱胶活力检测方法如下：取大豆毛油100g，检测其DAG含量，加热至55℃；分别加入3％水和200ppm磷脂酶C样品；高速剪切(10000r/min)1分钟；在55℃条件下搅拌(750r/min)反应2小时；升温至85℃保持5分钟；12000rpm离心10 分钟，取10g上层油样，检测其DAG含量，从而确定DAG增量； [0115] 其中，DAG含量检测方法参考AOCS Official Method Cd 11d‑96,Mono‑and Diglycerides Determination by HPLC‑ELSD的方法。 [0116] SDS‑PAGE检测方法参考诸葛健,王正祥.工业微生物实验技术手册[M].北京: 中国轻工业出版社,1994:284‑289.的方法。 [0117] 实施例1 [0118] 将磷脂酶C发酵液在4℃下10000×g离心30min，收集上清液；用孔径为0.2μm 的微滤膜对发酵离心上清液进行微滤，除去杂质颗粒和残留的细胞碎片，得到微滤清液。 [0119] 使用截留分子量为10KDa的超滤膜对微滤清液进行超滤浓缩，浓缩至一定体积后，使用缓冲液(20mM乙酸钠缓冲液，pH5.5)透析置换。缓冲液置换结束后，得到的磷脂酶C浓缩液的蛋白含量为40mg/ml。 [0120] 向磷脂酶C浓缩液中加入50％甘油和0.3％山梨酸钾(以获得的磷脂酶C制剂的总质量为100％计)，获得磷脂酶C制剂，待全部溶解后置于37℃下保存。分别检测其保存0天、15天和30天后的脱胶活力，并以第0天的脱胶活力为100％，计算第15天和30天的脱胶活力残留率，结果如表1所示。采用SDS‑PAGE检测不同保存时间样品(初始样品和保存30天的样品)中目标蛋白的变化情况，结果如图1所示。 [0121] 表1 [0122] 37℃保藏时间 0天 15天 30天甘油二酯增加量％ 0.710 0.390 0.284 脱胶活力残留率％ 100 55 40 [0123] 注：甘油二酯增加量％为PLC处理后增加的甘油二酯质量占PLC处理后油脂总质量的百分比。 [0124] 根据表1结果，磷脂酶C成品在37℃保存30天后，脱胶活力的残留率仅剩 40％，但是，根据图1结果，目标酶蛋白没有出现明显的降解现象，由此可见，磷脂酶C成品在37℃保藏的失活与蛋白酶的降解作用关系不大，而更可能是因为其本身蛋白结构的热稳定性差导致的。 [0125] 实施例2 [0126] 将磷脂酶C发酵液在4℃下10000×g离心30min，收集上清液；用孔径为0.2μm 的微滤膜对发酵离心上清液进行微滤，除去杂质颗粒和残留的细胞碎片，得到微滤清液。 [0127] 使用截留分子量为10KDa的超滤膜对微滤清液进行超滤浓缩，浓缩至一定体积后，使用缓冲液(20mM乙酸钠缓冲液，pH5.5)透析置换。缓冲液置换结束后，得到的磷脂酶C浓缩液的蛋白含量为40mg/ml。 [0128] 磷脂酶C浓缩液在50℃水浴条件下孵育10min，再加入50％甘油和0.3％山梨酸钾(以获得的磷脂酶C制剂的总质量为100％计)，获得磷脂酶C制剂，待全部溶解后置于37℃下保存。分别检测其保存0天、15天和30天后的脱胶活力，并以第0天的脱胶活力为100％，计算第15天和30天的脱胶活力残留率，结果见表2。 [0129] 表2 [0130]37℃保藏时间 0天 15天 30天 甘油二酯增加量％ 0.699 0.405 0.287 脱胶活力残留率％ 100 58 41 [0131] 注：甘油二酯增加量％为PLC处理后增加的甘油二酯质量占PLC处理后油脂总质量的百分比。 [0132] 实施例3 [0133] 将磷脂酶C发酵液在4℃下10000×g离心30min，收集上清液；用孔径为0.2μm 的微滤膜对发酵离心上清液进行微滤，除去杂质颗粒和残留的细胞碎片，得到微滤清液。 [0134] 使用截留分子量为10KDa的超滤膜对微滤清液进行超滤浓缩，浓缩至一定体积后，使用缓冲液(20mM乙酸钠缓冲液，pH5.5)透析置换。缓冲液置换结束后，得到的磷脂酶C浓缩液的蛋白含量为20‑60mg/ml。 [0135] 磷脂酶C浓缩液在50℃水浴条件下孵育30min，再加入50％甘油和0.3％山梨酸钾(以获得的磷脂酶C制剂的总质量为100％计)，获得磷脂酶C制剂，待全部溶解后置于37℃下保存。分别检测其保存0天、15天和30天后的脱胶活力，并以第0天的脱胶活力为100％，计算第15天和30天的脱胶活力残留率，结果见表3。 [0136] 表3 [0137] 37℃保藏时间 0天 15天 30天甘油二酯增加量％ 0.697 0.474 0.221 脱胶活力残留率％ 100 68 32 [0138] 注：甘油二酯增加量％为PLC处理后增加的甘油二酯质量占PLC处理后油脂总质量的百分比。 [0139] 实施例4 [0140] 将磷脂酶C发酵液在4℃下10000×g离心30min，收集上清液；用孔径为0.2μm 的微滤膜对发酵离心上清液进行微滤，除去杂质颗粒和残留的细胞碎片，得到微滤清液。 [0141] 使用截留分子量为10KDa的超滤膜对微滤清液进行超滤浓缩，浓缩至一定体积后，使用缓冲液(20mM乙酸钠缓冲液，pH5.5)透析置换。缓冲液置换结束后，得到的磷脂酶C浓缩液的蛋白含量为40mg/ml。 [0142] 磷脂酶C浓缩液在50℃水浴条件下孵育40min，再加入50％甘油和0.3％山梨酸钾(以获得的磷脂酶C制剂的总质量为100％计)，获得磷脂酶C制剂，待全部溶解后置于37℃下保存。分别检测其保存0天、15天和30天后的脱胶活力，并以第0天的脱胶活力为100％，计算第15天和30天的脱胶活力残留率，结果见表4。 [0143] 表4 [0144]37℃保藏时间 0天 15天 30天 甘油二酯增加量％ 0.710 0.497 0.249 脱胶活力残留率％ 100 70 35 [0145] 注：甘油二酯增加量％为PLC处理后增加的甘油二酯质量占PLC处理后油脂总质量的百分比。 [0146] 实施例5 [0147] 将磷脂酶C发酵液在4℃下10000×g离心30min，收集上清液；用孔径为0.2μm 的微滤膜对发酵离心上清液进行微滤，除去杂质颗粒和残留的细胞碎片，得到微滤清液。 [0148] 使用截留分子量为10KDa的超滤膜对微滤清液进行超滤浓缩，浓缩至一定体积后，使用缓冲液(20mM乙酸钠缓冲液，pH5.5)透析置换。缓冲液置换结束后，得到的磷脂酶C浓缩液的蛋白含量为40mg/ml。 [0149] 磷脂酶C浓缩液在60℃水浴条件下孵育10min，加入50％甘油和0.3％山梨酸钾(以获得的磷脂酶C制剂的总质量为100％计)，获得磷脂酶C制剂，待全部溶解后置于37℃下保存。分别检测其保存0天、15天和30天后的脱胶活力，并以第0天的脱胶活力为100％，计算第15天和30天的脱胶活力残留率，结果见表5。 [0150] 表5 [0151] 37℃保藏时间 0天 15天 30天甘油二酯增加量％ 0.677 0.542 0.271 脱胶活力残留率％ 100 80 40 [0152] 注：甘油二酯增加量％为PLC处理后增加的甘油二酯质量占PLC处理后油脂总质量的百分比。 [0153] 实施例6 [0154] 将磷脂酶C发酵液在4℃下10000×g离心30min，收集上清液；用孔径为0.2μm 的微滤膜对发酵离心上清液进行微滤，除去杂质颗粒和残留的细胞碎片，得到微滤清液。 [0155] 使用截留分子量为10KDa的超滤膜对微滤清液进行超滤浓缩，浓缩至一定体积后，使用缓冲液(20mM乙酸钠缓冲液，pH5.5)透析置换。缓冲液置换结束后，得到的磷脂酶C浓缩液的蛋白含量为40mg/ml。 [0156] 磷脂酶C浓缩液在60℃水浴条件下孵育30min，再加入50％甘油和0.3％山梨酸钾(以获得的磷脂酶C制剂的总质量为100％计)，获得磷脂酶C制剂，待全部溶解后置于37℃下保存。分别检测其保存0天、15天和30天后的脱胶活力，并以第0天的脱胶活力为100％，计算第15天和30天的脱胶活力残留率，结果见表6。 [0157] 表6 [0158]37℃保藏时间 0天 15天 30天 甘油二酯增加量％ 0.665 0.569 0.275 脱胶活力残留率％ 100 86 41 [0159] 注：甘油二酯增加量％为PLC处理后增加的甘油二酯质量占PLC处理后油脂总质量的百分比。 [0160] 实施例7 [0161] 将磷脂酶C发酵液在4℃下10000×g离心30min，收集上清液；用孔径为0.2μm 的微滤膜对发酵离心上清液进行微滤，除去杂质颗粒和残留的细胞碎片，得到微滤清液。 [0162] 使用截留分子量为10KDa的超滤膜对微滤清液进行超滤浓缩，浓缩至一定体积后，使用缓冲液(20mM乙酸钠缓冲液，pH5.5)透析置换。缓冲液置换结束后，得到的磷脂酶C浓缩液的蛋白含量为40mg/ml。 [0163] 磷脂酶C浓缩液在60℃水浴条件下孵育40min，再加入50％甘油和0.3％山梨酸钾(以获得的磷脂酶C制剂的总质量为100％计)，获得磷脂酶C制剂，待全部溶解后置于37℃下保存。分别检测其保存0天、15天和30天后的脱胶活力，并以第0天的脱胶活力为100％，计算第15天和30天的脱胶活力残留率，结果见表7。 [0164] 表7 [0165]37℃保藏时间 0天 15天 30天 甘油二酯增加量％ 0.685 0.548 0.295 脱胶活力残留率％ 100 80 43 [0166] 注：甘油二酯增加量％为PLC处理后增加的甘油二酯质量占PLC处理后油脂总质量的百分比。 [0167] 实施例8 [0168] 将磷脂酶C发酵液在4℃下10000×g离心30min，收集上清液；用孔径为0.2μm 的微滤膜对发酵离心上清液进行微滤，除去杂质颗粒和残留的细胞碎片，得到微滤清液。 [0169] 使用截留分子量为10KDa的超滤膜对微滤清液进行超滤浓缩，浓缩至一定体积后，使用缓冲液(20mM乙酸钠缓冲液，pH5.5)透析置换。缓冲液置换结束后，得到的磷脂酶C浓缩液的蛋白含量为40mg/ml。 [0170] 磷脂酶C浓缩液在70℃水浴条件下孵育10min，再加入50％甘油和0.3％山梨酸钾(以获得的磷脂酶C制剂的总质量为100％计)，获得磷脂酶C制剂，待全部溶解后置于37℃下保存。分别检测其保存0天、15天和30天后的脱胶活力，并以第0天的脱胶活力为100％，计算第15天和30天的脱胶活力残留率，结果见表8。 [0171] 表8 [0172] 37℃保藏时间 0天 15天 30天甘油二酯增加量％ 0.698 0.565 0.475 脱胶活力残留率％ 100 81 68 [0173] 注：甘油二酯增加量％为PLC处理后增加的甘油二酯质量占PLC处理后油脂总质量的百分比。 [0174] 实施例9 [0175] 将磷脂酶C发酵液在4℃下10000×g离心30min，收集上清液；用孔径为0.2μm 的微滤膜对发酵离心上清液进行微滤，除去杂质颗粒和残留的细胞碎片，得到微滤清液。 [0176] 使用截留分子量为10KDa的超滤膜对微滤清液进行超滤浓缩，浓缩至一定体积后，使用缓冲液(20mM乙酸钠缓冲液，pH5.5)透析置换。缓冲液置换结束后，得到的磷脂酶C浓缩液的蛋白含量为40mg/ml。 [0177] 磷脂酶C浓缩液在70℃水浴条件下孵育30min，再加入50％甘油和0.3％山梨酸钾(以获得的磷脂酶C制剂的总质量为100％计)，获得磷脂酶C制剂，待全部溶解后置于37℃下保存。分别检测其保存0天、15天和30天后的脱胶活力，并以第0天的脱胶活力为100％，计算第15天和30天的脱胶活力残留率，结果见表9。 [0178] 表9 [0179] 37℃保藏时间 0天 15天 30天甘油二酯增加量％ 0.678 0.511 0.421 脱胶活力残留率％ 100 75 62 [0180] 注：甘油二酯增加量％为PLC处理后增加的甘油二酯质量占PLC处理后油脂总质量的百分比。 [0181] 实施例10 [0182] 将磷脂酶C发酵液在4℃下10000×g离心30min，收集上清液；用孔径为0.2μm 的微滤膜对发酵离心上清液进行微滤，除去杂质颗粒和残留的细胞碎片，得到微滤清液。 [0183] 使用截留分子量为10KDa的超滤膜对微滤清液进行超滤浓缩，浓缩至一定体积后，使用缓冲液(20mM乙酸钠缓冲液，pH5.5)透析置换。缓冲液置换结束后，得到的磷脂酶C浓缩液的蛋白含量为40mg/ml。 [0184] 磷脂酶C浓缩液在70℃水浴条件下孵育40min，再加入50％甘油和0.3％山梨酸钾(以获得的磷脂酶C制剂的总质量为100％计)，获得磷脂酶C制剂，待全部溶解后置于37℃下保存。分别检测其保存0天、15天和30天后的脱胶活力，并以第0天的脱胶活力为100％，计算第15天和30天的脱胶活力残留率，结果见表10。 [0185] 表10 [0186]37℃保藏时间 0天 15天 30天 甘油二酯增加量％ 0.698 0.475 0.384 脱胶活力残留率％ 100 68 55 [0187] 注：甘油二酯增加量％为PLC处理后增加的甘油二酯质量占PLC处理后油脂总质量的百分比。 [0188] 实施例11 [0189] 将磷脂酶C发酵液在4℃下10000×g离心30min，收集上清液；用孔径为0.2μm 的微滤膜对发酵离心上清液进行微滤，除去杂质颗粒和残留的细胞碎片，得到微滤清液。 [0190] 使用截留分子量为10KDa的超滤膜对微滤清液进行超滤浓缩，浓缩至一定体积后，使用缓冲液(20mM乙酸钠缓冲液，pH5.5)透析置换。缓冲液置换结束后，得到的磷脂酶C浓缩液的蛋白含量为40mg/ml。 [0191] 磷脂酶C浓缩液在80℃水浴条件下孵育10min，再加入50％甘油和0.3％山梨酸钾(以获得的磷脂酶C制剂的总质量为100％计)，获得磷脂酶C制剂，待全部溶解后置于37℃下保存。分别检测其保存0天、15天和30天后的脱胶活力，并以第0天的脱胶活力为100％，计算第15天和30天的脱胶活力残留率，结果见表11。 [0192] 表11 [0193] 37℃保藏时间 0天 15天 30天甘油二酯增加量％ 0.670 0.342 0.322 脱胶活力残留率％ 100 51 48 [0194] [0195]注：甘油二酯增加量％为PLC处理后增加的甘油二酯质量占PLC处理后油脂总质量的百分比。 [0195] 实施例12 [0196] 取磷脂酶C浓缩液，在不同条件下热处理(50℃10min、50℃30min、50℃ 40min、60℃10min、60℃30min、60℃40min、70℃10min、70℃30min、80℃10min) 后，分别在4℃，10000×g离心30min，所有样品中都未出现蛋白沉淀。 [0197] 取磷脂酶C浓缩液，分别在不同条件下热处理(50℃10min、50℃30min、50℃40min、60℃10min、60℃30min、60℃40min、70℃10min、70℃30min、80℃ 10min)后，分别检测不同样品中的蛋白含量，并以未经热处理的磷脂酶C浓缩液为对照，结果见表12。 [0198] 表12 [0199]热处理条件 热处理后离心样品中的蛋白含量mg/ml 50℃、10min 44.60 50℃、30min 44.35 50℃、40min 44.72 60℃、10min 45.13 60℃、30min 44.80 60℃、40min 44.65 70℃、10min 44.75 70℃、30min 45.03 70℃、40min 44.60 80℃、10min 44.58 对照 44.73 [0200] 以上结果表明，经过热处理后的磷脂酶C浓缩液样品中没有蛋白沉淀产生。 [0201] 实施例13 [0202] 磷脂酶C发酵液，在不同条件下热处理(50℃10min、50℃30min、50℃40min、 60℃10min、60℃30min、60℃40min、70℃10min、70℃30min、80℃10min)后，再加入50％甘油和 0.3％山梨酸钾(以获得的磷脂酶C制剂的总质量为100％计)，分别获得磷脂酶C制剂，待全部溶解后置于37℃下保存。分别检测其保存0天、 15天和30天后的脱胶活力，结果显示，对磷脂酶C发酵液进行热处理，其在第 0天(即完成热处理后)就产生较大损失，结果如表13所示，因此，未再继续对保存15和30天的酶液进行脱胶活力检测。根据表13的结果，采用该方法不能提升磷脂酶C发酵液的热稳定性。 [0203] 表13 [0204] [0205] [0206] 注：甘油二酯增加量％为PLC处理后增加的甘油二酯质量占PLC处理后油脂总质量的百分比。 [0207] 实施例14‑24 [0208] 与实施例1‑11相同，其区别在于： [0209] 使用孔径为0.1μm的微滤膜对发酵离心上清液进行微滤，除去杂质颗粒和残留的细胞碎片，得到微滤清液。 [0210] 使用截留分子量为5KDa的超滤膜对微滤清液进行超滤浓缩，浓缩至一定体积后，使用缓冲液(20mM磷酸氢二钠‑磷酸二氢钠缓冲液，pH6.0)透析置换。 [0211] 使用50％山梨醇和0.3％苯甲酸钠代替50％甘油和0.3％山梨酸钾(以获得的磷脂酶C制剂的总质量为100％计)，获得磷脂酶C制剂，结果见表14。 [0212] 表14 [0213] [0214] [0215] 注：甘油二酯增加量％为PLC处理后增加的甘油二酯质量占PLC处理后油脂总质量的百分比。 [0216] 实施例25 [0217] 将磷脂酶C发酵液在8℃下8000×g离心40min，收集上清液；用孔径为0.1μm 的微滤膜对发酵离心上清液进行微滤，除去杂质颗粒和残留的细胞碎片，得到微滤清液。 [0218] 使用截留分子量为5KDa的超滤膜对微滤清液进行超滤浓缩，浓缩至一定体积后，使用缓冲液(20mM乙酸钠缓冲液，pH5.5)透析置换。缓冲液置换结束后，得到的磷脂酶C浓缩液的蛋白含量为40mg/ml。 [0219] 磷脂酶C浓缩液在65℃水浴条件下孵育20min，再加入50％甘油和0.3％山梨酸钾(以获得的磷脂酶C制剂的总质量为100％计)，获得磷脂酶C制剂，待全部溶解后置于37℃下保存。分别检测其保存0天、15天和30天后的脱胶活力，并以第0天的脱胶活力为100％，计算第15天和30天的脱胶活力残留率，结果见表15。 [0220] 表15 [0221] [0222] [0223] 注：甘油二酯增加量％为PLC处理后增加的甘油二酯质量占PLC处理后油脂总质量的百分比。 [0224] 上述结果显示，磷脂酶C浓缩液经过50‑70℃孵育10‑40min后，其在37℃保藏条件下的稳定性可以得到显著改善，其中，优选的热处理工艺是60‑70℃处理 10‑40min。 [0225] 经过热处理后的磷脂酶C浓缩液样品中没有蛋白沉淀产生，表明磷脂酶C浓缩液经过热处理后稳定性得到改善并不是因为样品中的杂蛋白产生沉淀导致目标蛋白的纯化(实施例12)。 [0226] 在37℃保藏过程中，磷脂酶C的脱胶活力发生了下降，但是目标酶蛋白却没有出现明显的降解现象，由此可见，磷脂酶C在37℃保藏的失活与蛋白酶的降解作用关系不大，而是因为其本身蛋白结构的热稳定性差导致的(实施例1)。 [0227] 磷脂酶C发酵液经过相同条件的热处理后，其脱胶活力立即就产生了较大的损失，表明该热处理方法不适用于磷脂酶C发酵液的热稳定性提升(实施例13)。 |
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